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BIOspektrum | 06.13 | 19. Jahrgang

MARTIN J. LOHSE, CARSTEN HOFFMANN, DAVIDE CALEBIRO

RUDOLF-VIRCHOW-ZENTRUM UND INSTITUT FÜR PHARMAKOLOGIE UND

TOXIKOLOGIE, UNIVERSITÄT WÜRZBURG

G-protein-coupled receptors have recently been identified at the singlemolecule level using fluorescent labels attached either to receptors them-selves or to their ligands. These studies have revealed a significantheterogeneity of receptors in terms of localization, mobility, and aggrega-tion state (mono-, di- and oligomers). The consequences of this heteroge-neity are still largely unknown, but first data suggest that it may result indistinct functions.

DOI: 10.1007/s12268-013-0358-1© Springer-Verlag 2013

GPCRs in der Arzneitherapieó G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)sind ein entscheidender Weg, um die Funk-tionen von Zellen zu steuern – entsprechendintensiv werden sie von Grundlagenforschernwie auch in der Pharma- und Biotechindustriebearbeitet. Bis über ein Drittel aller Arznei-mittel sollen über GPCRs wirken, manche set-zen diesen Prozentsatz sogar noch höher an.

Auch wenn ein Blick in die tatsächlichen Ver-ordnungen von Arzneimitteln [1] zeigt, dassdiese Zahl übertrieben ist, so sind sie dochdie interessanteste und wichtigste Gruppevon Targets für Arzneimittel. Diesen hervor-gehobenen Status haben sie aus verschiede-nen Gründen: (1) Es gibt eine große Zahl(beim Menschen knapp 1.000) unterschied-licher GPCRs, von denen etwa die Hälfte als

Rezeptoren für Hormone und/oder Trans-mitter fungiert und zumindest prinzipiell fürdie Arzneitherapie geeignet ist, während einGroßteil der anderen Hälfte als olfaktorischeRezeptoren für Geruchsstoffe interessant ist.(2) GPCRs haben eine in aller Regel hoch-spezifische, vom Zelläußeren zugängliche Bin-dungsstelle, sind daher spezifisch und drug-gable. (3) Sie haben die physiologische Funk-tion, Zell- und Organfunktionen zu verändern– und genau das möchte man mit Arzneimit-teln erreichen.

Des Weiteren gibt es zwei wesentlicheGründe für die Annahme, dass das Potenzialder GPCRs für die Arzneitherapie bei Weitemnoch nicht ausgenutzt ist: Einerseits werdenvon den 400 bis 500 für die Arzneitherapiegrundsätzlich nutzbaren GPCRs derzeit nur82 tatsächlich genutzt [2]. Andererseits habenjüngere Daten gezeigt, dass GPCRs viel kom-plizierter funktionieren, als bisher ange-nommen. Dies erweitert aber die möglichenTherapieoptionen ungeheuer: (1) GPCRs fun-gieren oft als Homo- oder gar Heterodimere,das heißt sie setzen sich aus zwei verschie-denen Rezeptoren mit jeweils eigener Beein-flussbarkeit zusammen. (2) Sie können nichtnur an ihrer eigentlichen Ligandenbin-dungsstelle niedermolekulare Liganden bin-den, sondern oft über weitere, allosterischeBindungsstellen beeinflusst werden. (3)GPCRs können offenbar über verschiedeneKonformationen quasi stufenlos an- und abge-schaltet werden durch ein kontinuierlichesSpektrum an Liganden, das von inversen Ago-nisten (volle Abschaltung) über partielleinverse Agonisten zu Antagonisten (keineBeeinflussung) bis hin zu partiellen und vol-len Agonisten (volle Anschaltung) reicht. (4)GPCRs aktivieren oft mehrere Signalwege(z. B. cAMP und Ca2+), und neuere Daten zei-gen, dass spezifische Liganden präferenziellden einen oder anderen aktivieren können(biased agonists). (5) GPCRs können sequen-ziell verschiedene Signalwege aktivieren, z. B.zunächst von der Oberfläche aus G-Protein-abhängig cAMP erhöhen, anschließend über

Schwerpunktthema G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

GPCRs – einzelnen Rezeptorenauf der Spur

˚ Abb. 1: Fluoreszenzmarkierte Liganden (links, Thyreoidea-stimulierendes Hormon, TSH) oderRezeptoren (rechts, Alexa647/SNAP-markiert) erlauben den Nachweis einzelner Rezeptoren. Tracking-Algorithmen ermöglichen die Verfolgung der Rezeptorbewegungen auf der Zellober -fläche (rechts, blaue Linien).

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β-Arrestine „nicht-klassische“ Signalwege,wie die extrazellulär regulierten Protein -kinasen (ERK), stimulieren und schließlichnach Internalisierung wieder von internenVesikeln aus cAMP erhöhen.

Einzelmolekülnachweisevon RezeptorenDiese Erkenntnisse haben die Forschungenan GPCRs neu stimuliert, weil sich sowohl inder Grundlagenforschung als auch für die Ent-wicklung von Arzneimitteln neue Strategienund Felder eröffnen. Dabei konzentrieren sichdie Forschungen derzeit vor allem auf dieexplosionsartig zunehmenden röntgenkris-tallografischen Strukturen von GPCRs, dieneuen Arten von Liganden und auf Untersu-chungen von GPCRs mit stetig zunehmenderEmpfindlichkeit und Auflösung. Diese Tech-niken reichen bis hin zur Analyse einzelnerRezeptormoleküle.

Die Verwendung von Fluorophoren in Kom-bination mit empfindlichen Detektionsme-thoden ermöglicht die mikroskopische Beob-achtung einzelner Proteine. Schnell hinter-einander gemachte Aufnahmen können dannsogar „Filme“ generieren, auf denen sich dieBewegung einzelner Moleküle beobachtenlässt. Dieses auch als single particle trackingbezeichnete Verfahren wurde bereits in den1980er-Jahren konzipiert und in den 1990er-Jahren für einige Proteine angewendet [3, 4].

Für GPCRs wurden analoge Studien erstsehr viel später begonnen, zunächst mit fluo -reszenzmarkierten Liganden und später mitmarkierten Rezeptoren. Die Entwicklung fluo -reszierender Liganden ist für viele Rezeptorennicht einfach, da die Fluorophore die Bin-dungseigenschaften der oft kleinen Ligandenerheblich beeinträchtigen können. Sehr vieleinfacher ist sie für größere Peptidliganden

oder gar ganze Proteine, wie etwa das Thy -reoidea-stimulierende Hormon (TSH). Für Ein-zelmolekülstudien muss die Fluoreszenz aus-reichend stark sein, dass sich einzelne Fluo-rophore nachweisen lassen, und sie muss sostabil sein, dass sie für zumindest zehnsequenzielle Aufnahmen bei den hierfürhohen Lichtintensitäten anhält, ohne auszu-bleichen. Wenn solche Liganden ausreichendlange an Rezeptoren binden, kann man mitihrer Hilfe die Rezeptoren auf der Oberflächeintakter Zellen beobachten (Abb. 1).

Derartige Studien mit fluoreszierendenLiganden wurden kürzlich von zwei Arbeits-gruppen publiziert. Diejenige von Nigel Bird-sall in London [5] nutzte Cy3B-Telenzepin alsLiganden für M1-muskarinische Rezeptoren;die hohe Affinität dieses Antagonisten unddaraus abgeleitet seine langsame Dissozia-tion vom Rezeptor (t1/2: ca. sieben Stunden)machen aus ihm einen – im zeitlichen Maß-stab solcher Experimente – quasi irreversi-blen Liganden. Fest an den Rezeptor gebun-den, zeigt er so die Diffusionsgeschwindig-keit (0,06 bis 0,13 Quadratmikrometer proSekunde), aber auch die Fähigkeit der Rezep-toren, dynamisch reversible Dimere zu bil-den.

Kürzlich wurde von derselben Arbeits-gruppe der gleiche (nicht-selektive) Ligandfür die Beobachtung einzelner M2-Rezepto-ren sowohl auf Herzmuskelzellen wie auchin Schnitten von Mausherzen verwendet [6].In dieser Studie zeigte sich unerwarteter-weise, dass sich die Rezeptoren in Herz-schnitten etwa viermal schneller bewegtenals in isolierten, kultivierten Zellen – das lässtvermuten, dass sich in Zellkultur Artefakteausbilden. Was dies generell für die Inter-pretation von Experimenten an kultiviertenZellen bedeutet, sei hier dahingestellt. Ein

weiterer interessanter Befund dieser Arbeitwar, dass die muskarinischen Rezeptoren imHerzen in Clustern vorkamen, einigezusammenliegende Zellen im Vorhof besaßendie Rezeptoren in erheblicher Anzahl, wäh-rend viele andere Zellen praktisch keine auf-wiesen. Woher diese Heterogenität der Rezep-torexpression kommt und was sie funktionellbedeutet, ist bisher völlig unklar.

Eine weitere Studie wurde von dem Teamum Akihiro Kusumi in Kyoto mit dem fluoreszierenden Liganden AlexaFP für denN-Formyl-Peptidrezeptor (FPR) publiziert [7].Beide Arbeitsgruppen berichten überein-stimmend, dass die Rezeptoren dynamischund sehr schnell zwischen Monomeren undDimeren wechseln, dass sie innerhalb vonZeiträumen unter einer Sekunde zusammen-stoßen und ein Dimer bilden, das dann wiederin seine Monomere zerfällt. Dies lässt denSchluss zu, dass die früher geäußerte Hypo-these nicht korrekt ist, dass GPCRs entwederals Mono- oder (häufiger) als stabile Dimerefunktionieren [8].

Eine zweite Methode für solche Untersu-chungen ist die Markierung der Rezeptorenselbst. Dazu ist wiederum eine stabile Fluo-reszenz nötig, wie sie fluoreszierende Pro-teine nicht bieten – diese bleichen innerhalbzu kurzer Zeit aus [9]. Als derzeit beste Mög-lichkeit bietet sich die Fusion mit Tags an,die sich mit chemischen Fluorophoren mar-kieren lassen. Verschiedene solcher Tags sindkommerziell verfügbar, wie z. B. Halo-Tag,SNAP-Tag und CLIP-Tag. Dabei handelt es sichjeweils um Proteine, die eine kovalente Bin-dung mit spezifischen Fluorophoren einge-hen; dies erlaubt eine Auswahl an Fluoro-phoren, die eine höhere Photostabilität alsfluoreszierende Proteine haben. Der Halo-Tagwurde beispielsweise zur Markierung von

˘ Abb. 2: Fusion zweier β1-adre-nerger Rezeptoren zu einem Dimerund Aufspaltung (nach ca. fünfSekunden) in zwei Monomere.Links: Tracking-Spuren; rechts:Intensitätsmessung.

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cAMP-Rezeptoren von Dictyostelium benutzt[9], während SNAP-Tags zur Markierung ver-schiedener GPCRs in transfizierten Zellliniendienten [10]. Die mittleren Diffusionsge-schwindigkeiten, die damit für β1- und β2-adrenerge und GABAB-Rezeptoren bestimmtwurden, entsprechen in etwa denjenigen, dievon Birdsalls Arbeitsgruppe [5] mit fluores-zierenden Liganden gemessen wurden, undwaren für verschiedene Rezeptoren nicht sehrunterschiedlich (0,03 bis 0,06 Quadratmi-krometer pro Sekunde bei Raumtemperatur).

Große Unterschiede zeigten sich aber beider Tendenz der Rezeptoren, miteinander zuaggregieren: Die β1-adrenergen Rezeptorenwaren meist monomerisch und bildeten nurtransiente, im Mittel für ca. fünf Sekundenandauernde Dimere. Abbildung 2 zeigtsequenzielle Aufnahmen einer solchen tran-sienten Bildung eines Dimers: Zwei einzelnePunkte (Rezeptoren) begegnen einander,befinden sich für ca. fünf Sekunden in einemeinzelnen Punkt (mit doppelter Fluoreszenz-intensität) und bewegen sich anschließendseparat weiter. Bei den β2-adrenergen Rezep-toren liegen dagegen die meisten als Dimerevor, und gelegentlich bilden sich auch kom-plexere Aggregate. GABAB-Rezeptoren sindhingegen obligate Dimere, das heißt sie funk-tionieren nur, wenn ein GABAB1-Protomer(das den Liganden bindet) mit einem GABAB2-Protomer (das an das G-Protein koppelt) einenKomplex bildet; die Einzelmolekülstudienzeigten aber, dass diese Rezeptoren sehr vielhöhermolekulare Aggregate bilden, dass siealso regelrecht in Clustern vorkommen. Inter-essanterweise scheinen diese Cluster mit demZytoskelett verbunden zu sein, und bei geeig-neten Rezeptordichten spiegeln sie an derZelloberfläche die Muster des Zytoskelettswider. Ob diese Cluster die funktionellen Ein-heiten darstellen oder vielleicht ruhende –sozusagen geparkte – Rezeptoren, ist völligunklar.

AusblickWas bedeuten diese Studien für unser Ver-ständnis von Rezeptoren, und was könnte inder Praxis daraus folgen? Überraschend istvor allem, dass Rezeptoren ganz heterogensind: Offenbar exprimieren weder alle Zellenin einem einheitlich wirkenden Gewebe oderOrgan die gleichen Rezeptoren, noch sind alleRezeptoren auf der Zelloberfläche gleich. Viel-mehr sind manche mobil und andere statio-när, manche monomer und andere in Di- oderOligomeren verbunden. Was das für ihreFunktion bedeutet, ist noch weitestgehend

unerforscht. Wir haben jedoch erste Hinweisedarauf, dass eine unterschiedliche Lokalisa-tion von Rezeptoren auf der Zelloberflächeeinen wesentlichen Einfluss auf ihre Signalehaben kann. So lösen β-adrenerge Rezepto-ren in Herzmuskelzellen nur lokal begrenzteSignale aus, wenn sie in den T-Tubuli sitzen,aber generalisierte (einschließlich der Akti-vierung von Genen im Zellkern), wenn siesich auf der Zelloberfläche befinden [11]. Ähn-lich können Rezeptoren intrazellulär cAMP-Signale mit anderen funktionellen Effektenauslösen als an der Zelloberfläche [12]. Die-se ersten Einblicke erlauben die Vermutung,dass Rezeptoren ein noch vielfältigeres Arse-nal an Funktionen haben, als bisher ange-nommen. Wie diese Funktionen im Einzel-nen aussehen und wie man sie schließlichselektiv beeinflussen kann, werden wichtigeThemen zukünftiger Forschung sein.

DanksagungDie hier zitierten eigenen Arbeiten wurdendurch den ERC Advanced Grant TOPAS [MJL]unterstützt. ó

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Korrespondenzadresse:Prof. Dr. Martin LohseUniversität WürzburgInstitut für Pharmakologie und Toxikologie;Rudolf-Virchow- ZentrumVersbacher Straße 9D-97078 WürzburgTel.: 0931-201-48400Fax: 0931-201-48411lohse@toxi.uni-wuerzburg.de

AUTORENMartin J. LohseMedizinstudium an den Universitäten Göttingen, London und Paris. 1981 Promotion.1988 Habilitation für das Fach Pharmakologie und Toxikologie an der Universität Heidelberg. 1988–1990 Research Assistant und Assistant Professor bei Prof. Dr. R. J.Lefkowitz, Howard Hughes Medical Institute (HHMI), Duke University, Durham, NC,USA. 1990–1993 Gruppenleiter am Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried.Seit 1993 Professor und Leiter des Instituts für Pharmakologie und Toxikologie der Uni-versität Würzburg. Seit 2001 Leitung des Rudolf-Virchow-Zentrums für experimentelleBio medizin an der Universität Würzburg.

Carsten HoffmannJahrgang 1967. Chemiestudium an der Universität Bremen. 1996 Promotion. 1997–2000 Postdoc, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA. 2000–2003 Postdocund 2004–2012 Arbeitsgruppenleiter am Institut für Pharmakologie und Toxikologie derUniversität Würzburg. 2011 Habilitation für das Fach Pharmakologie und Toxikologie ander Universität Würzburg. Seit 2012 Professor am Bioimaging-Center/Rudolf-Virchow-Zentrum und Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Universität Würzburg.

Davide CalebiroJahrgang 1975, Medizinstudium, PhD (Molekulare Medizin) und Facharztausbildung(Endokrinologie), Universität Mailand, Italien. 2007–2008 Humboldt-Stipendiat Pharmakologie, Universität Würzburg, 2008–2009 Postdoc und Arzt, Experimentelle Endokrinologie, Universität Mailand; seit 2009 wissenschaftlicher Mitarbeiter undAG-Leiter, Bioimaging-Zentrum/Rudolf-Virchow-Zentrum der Universität Würzburg.