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how to manage samples during preanalytic phase of flow cytometry
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MC BénéGrenoble, 19 Janvier 2010
GC FaureGrenoble 12/12/2011
IMMUNOPHENOTYPAGE EN CYTOMETRIE DE FLUXIdentifier les sous-populations
leucocytairesEvaluer leurs proportionsEvaluer leur nombre absolu
CONTRAINTESSuspension cellulaireSans amasAvec le moins de débris
possibleCellules viables sauf
exceptionVérification des
caractéristiques du cytomètre
Cellules marquéesContraintes des
fluorochromesChoix des combinaisons
Quels échantillons?Sang périphérique
EDTA optimal si <24 heuresCitrate ou héparine possibles
Moelle osseuseAttention à la dilution2 mL maximumAttention à la coagulation
Autres échantillonsLavages broncho-alvéolairesLiquide céphalo-rachidienLiquides d’épanchement, d’ascite, de ponctionCellules éluées de tissus
Lignées cellulaires
Cellules vivantesOn veut rester
en suspension! (EDTA)
• Facteurs nutritionnels
• Prolifération anormale : on a faim!!
• On était bien à 37°!!
Cellules vivantes
• Déchets cellulaires : le vieux sang
• On veut rester en suspension!
• On était bien à 37°!!
• Facteurs nutritionnels
• Prolifération anormale: on a faim!
La suspension cellulaireSang, moelle
Ficoll vs. Lyse…
• Les autres liquidesLBA, LCR, épanchements, ascites, lignées….
– + Lavage– Numération– Ajustement– Cytospin
Ficoll et sélection cellulaire : une vieille énigme!!
Osmolalité 280+15 mOsm (sérum 275-300)
Densité 1.077 + 0.01pH 6-7Cellules normales vs. Cellules fragilesConditions de réalisation du ficoll
Température, Délais de manipulation, Lyse des GR résiduels?
Ficoll is a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide which dissolves readily in aqueous solutions.
In 1968, Bøyum described a method using low viscosity Ficoll™ and sodium metrizoate, of the proper density and osmotic strength, to isolate mononuclear cells (2) 2381 citations mais index h à 5! . Sodium metrizoate has been successfully substituted with sodium diatrizoate by numerous workers (3,4).
Ficoll is a registered trademark owned by GE Healthcare companies.[1]
http://www.scoop.it/t/immunology/p/725527997/ficoll-paque-plus-a-guide-to-isolating-mononuclear-cells-from-whole-blood
Autres méthodes de séparation et d’enrichissementPercoll, Polymorphoprep
Le Percoll par Pertoft et al. comme outil permettant une meilleure séparation par densité1. Il est utilisé pour la séparation de cellules, d'organelles et/ou de virus par centrifugation à densité différentielle. Le Percoll est composé de particules de silicates colloïdales de 15-30 nm de diamètre (23% m/m dans de l'eau) qui sont recouverts de polyvinylpyrrolidone (PVP). Le Percoll est très bien adapté pour la mise en place de gradients de densité puisqu'il possède une faible viscosité comparé à ses alternatives, une faible osmolarité et une non toxicité vis-à-vis des cellules et de leurs constituants.
Gradients discontinus…Cellules adhérentes sur plastique boîte
de PetriRosettes Séparations magnétiques
Lyse et sélection cellulaire : une autre énigme!! Chlorure d’ammoniumRéactifs (10x: impératif pour conservation sinon carbonate
d’ammonium)Chlorure d’Ammonium 82.9 gBicarbonate de Potassium * 10.0 gEDTA 0.37 gEau distillée non désionisée qsp 1.0 liter
Culot cellulaire + 1 ml NH4Cl 1X : maximum 2-3 minutes à température ambiante….
…. Ou jusqu’à 10 minutes….Centrifuger immédiatement à 200 g 5
minutes et enlever complètement le liquide de lyse
Remettre en suspensionNE CONVIENT PAS POUR DES ETUDES
FONCTIONNELLES ULTERIEURES
Autres méthodes de lyseRéactifs hypoosmotiques : eau ou
Zapoglobine Hémolyse complèteAltération des globules blancs si contact prolongé
Acide acétique 3% dans l’eauHémolyse complète70% de perte des globules blancs
Réactifs du commerceComposition mal connueAcide/baseAnhydrase carbonique, plus sélectifAvec ou sans fixation en paraformaldéhyde
Lyse avec ou sans lavageImmunoglobulines, chaînes légèresPréservation de l’ensemble des leucocytes
Les marquagesSurface, Cytoplasme, NoyauQuelques rappels de biologie
cellulaire…
La membraneUne structure moléculaire
complexeAc palmytiqueAzoteAc OléiqueOxygènePhase aqueuse/oxygènePhosphore
H Heller et al. J Phys Chem 1993
La membrane
• Glycosylées• Transmembranai
res• Gpi• Associées• Mobiles….
Une phase fluide et des protéines
Marquages membranaires
CD23
CD20
CD45CD22
Leu13
CD81
CD19
CD21
CD79a/b
sIgM
CD40
•Anticorps vs molécules membranaires
•Une affaire de taille•Une affaire d’accessibilité
•Marquages multiples…•Une affaire de charge•Une relation dynamique…
Patching et capping
Patching et cappping (2)
Récapitulatif
Quelle surface cellulaire?Cellules isolées
• Agrégats
• Exosomes• Microparticul
es• Plaquettes
Les cellules qui se cachent
• Hypergamma protéines de l’inflammation
• On a changé de densité
• On s’est collées au tube
• On est camouflées dans les mucines
• Laissez nous nous réveiller
Fixations non spécifiques?
Récepteurs FcLymphocytes B FR+?????Ratio F/P des fluorochromesSaturation en anticorpsBactéries
Cellules fixéesAprès le marquage
Paraformaldéhyde Neutralisation virale Conservation du marquage
Avant le marquagePrélèvements
anatomopathologiquesCertains épitopes n’y
survivent pas Cellules en suspension :
cytoplasme
Le cytoplasmePas une mer
intérieure!!!....• …. Un vrai
labyrinthe plein de pièges– Membranes des
organelles– Accessibilité– Fixations non
spécifiques
La perméabilisationQuels perméabilisants?
SaponineDigitonineParaformaldéhydeFormolTriton
• Attention on change de taille!!
Perméabilisants du commerce
Fix & PermPerméafixIntrastainE-biosciences…
Et le noyau???AnticorpsIntercalants
Mortes ou vives?Taille/Structure
Nécrose : diminution SS et FS
Apoptose : d’abord FS
Membrane Exclusion de colorants :
IP Inclusion de colorant :
FDA (fluorescein diacetate)
Exposition de la P.sérine : Annexine V
Cytosquelette F-Actine avec la
phalloïdine-FITC
Organites intracellulaires
Rh123 et mitochondries vivantes (charge et potentiel transmembranaire)
Acridine orange et lysosomes (pompe à protons)
Immunofluorescence indirecte ou directe
Première incubationLavageDeuxième incubation+Lavage Incubation des cellules
avec l’anticorps ou le mélange d’anticorpsPas de lavage nécessaireMarquages concomitants
membranaires et intracellulairesMarquage membranaire + lavagePerméabilisationMarquage intracellulaire
Au totalPenser à ses cellules
Elles sont vivantesElles sont pleines de ressources
Les observer est magique!
Amélioration des techniques de cytométrieUtilisation de CD45Marquages multicouleurs
3 couleurs, 4 couleurs, 5 couleurs, 6 couleurs, 8 couleurs, 10 couleurs et plus….
Choix des anticorps, des fluorochromes, des combinaisons
Stratégies de fenêtrageRecherche des combinaisons les plus
sensibles, les plus stables
Les nouveaux fluorochromesAugmentation de la gamme de PMTAugmentation de la gamme de
longueur d’ondeAvec l’utilisation de plusieurs lasersPar mise à profit de l’effet tandem
Sensibilité accrue à la lumièreFlacons noirsManipulations extemporanées et rapidesIncubation dans le noir (+ 4°C)Lecture immédiate ou protection ++
contre la lumière
Attention aux tandemsCertains sont fragiles
LumièreTempérature
Dans un système à plusieurs lasers le receveur peut être excité directement par un autre laser
ExemplePE-Cyanine 5Excitation respective à 488 m et … nmNormalement
Réglages des PMT et compensationsUn équilibre subtilPenser à jouer sur les PMT quand des compensations
semblent « impossibles »Dans les combinaisons complexes, ce n’est pas
toujours le fluorochrome qu’on croit qui « bave » : afficher TOUTES les combinaisons possibles Eh oui, en 5 couleurs ça fait 10 biparamétriques, en 6
couleurs 15 et en 10 couleurs 45!!Attention aux compensations avec des billes
fluorescentes Elles ne se comportent pas comme des cellules Elles ne sont pas co-marquées
Les suspensions cellulaires sont très pléiomorphes Auto-fluorescence différente Récepteurs Fc sur certaines cellules Un bon réglage doit porter sur toutes les sous
populations présentes dans l’échantillon
Règle d’or d’une bonne compensation
Les cellules négatives ont la même MFI sur un axe donnéElles sont préférentiellement dans la première décade
Bad!!!
Bad!!
Analytique : post acquisitionGénérer les histogrammes d’intérêtGarder quelques histogrammes « de
base » pour contrôleS’assurer de la chronologie des
fenêtrages en cascadeUtiliser des codes couleur itératifsJongler avec les modes d’affichagePour les analyses fréquentes utiliser
toujours la même stratégie/le même protocole
Multimarquages…….standardisation nécessaire
Cartographie des suspensions cellulaires en hématologie : le scattergramme SSC/CD45
Stetler Stevenson
Wood
Stachursky
Xu Cherian
GTLLF
Stratégie GTLLF : d’abord les cellules maturesIdentification positive des cellules
matures de la moelle osseuseCode couleurCD45 bright : lymphocytesCD14/CD11b : monocytesCD16/CD11b : granulocytes (NK, B)Le reste : « bermudesbermudes »
CD45
SSC
FSC
SSC
CD14
SSC
CD16
SSC
CD45
CD11b
Analyse
Analyse
Marquages complexes : retour à la cartographie
Détermination systématique de seuils de positivitéBackgatingCrossgatingWalkgating
CD45
SS
C
FLn
SS
C
CD45
SS
C
Stratégie
FLx
FL
y
CD45
SS
C
CD45
SS
C
CD45
SS
C
FLx
FL
y
Granulober
FLx
FL
y
Gating CD11b+ Gating CD117+Granulober
CD11b/CD117/CD34
FLx
FL
y
CD45
SS
C
CD45
SS
C
CD45
SS
C
FLx
FL
y
FLx
FL
y
CD45
SS
C
FLn
SS
C
CD45
SS
C
Stratégie
CD45
SS
C
CD45
SS
C
FL1
FL
2
CD45
SS
C
FL1
FL
3
FL2
FL
3
FL3+ FL2+ FL1+
FLn+
Granulober
Gating CD13 Gating CD34Gating CD33
Crossgating
CD45
SS
C
CD45
SS
C
FL1
FL
2
CD45
SS
C
FL1
FL
3
FL2
FL
3FL3+ FL2+ FL1+
II.12
Walkgating
Walkgating