ASOCIACIÓN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

CURSO DE BIOQUÍMICA Y NUTRICION

GUIA DE PRACTICAS

Dr. Carlos Ramírez VelascoDr. José Chuquipiondo Ludeña

Dr. Jesús Díaz FrancoDr. Félix Tipacti Alvarado

LIMA – PERU

2005

NORMAS DE SEGURIDAD Y BIOSEGURIDAD

Todo el personal que trabaje en un laboratorio de Bioquímica, Fisiológico, Microbiológico, Biológico en general, o ingresa a él, debe seguir reglas de seguridad y bioseguridad. Las normas de seguridad son obligatorias y son esenciales no solamente para la para la acreditación académica, sino porque consisten en practicas que otorgan seguridad y protección al personal, alumnos e investigadores que trabajan en los laboratorios bioquímicos, fisiológicos, bacteriológicos, biológicos, químicos, etc. Muy especialmente en el campo médico donde trabajamos con muestras ó material biológico que es considerado potencialmente infeccioso o infeccioso. La máxima seguridad y protección es necesaria en estos casos.

PRACTICAS GENERALESSe prohíbe fumar, comer y aplicarse cosméticos, para evitar la diseminación de agentes infecciosos o productos químicos tóxicos de las manos hacia la boca. Con el fin de evitar el contacto con agentes infecciosos o diseminarlos, debe utilizarse alguna prenda protectora sobre la ropa, como el guardapolvo, mandil, ó la bata de laboratorio. Estas prendas de protección externa no deben usarse fuera del laboratorio. Los zapatos han de ser de punta y talón cerrado. No es conveniente que las personas que trabajan en el laboratorio usen lentes de contacto debido al desprendimiento de vapores y a las salpicaduras que pueden producirse. Los lentes de contacto inhiben el lagrimeo y permiten que las sustancias permanezcan más tiempo en la córnea.

Se recomienda el uso de lentes de protección o protectores para la cara a las personas que usan lentes de contacto, en particular si hay alto riesgo de vapores, aerosoles o salpica-duras. La joyería de tipo colgante, el cabello largo y barba son riesgosos, ya que es posible que entren en contacto con muestras u otras superficies, o se enreden o queden atrapados en instrumentos con movimiento, como máquinas rotatorias o centrífugas . Se prohíbe estrictamente pipetear con la boca todo tipo de muestra, reactivo, agua o cualquier otra sustancia biológica.

LAVADO DE MANOS

El lavado de manos es una de las principales maneras de evitar la diseminación de agentes infecciosos. Aunque se utilicen guantes, el lavado de manos es necesario. porque es posible que éstos tengan huecos microscópicos. Al tratar con pacientes, es necesario lavarse las manos tras atender a cada uno de ellos aunque se utilicen guantes.

LIMPIEZA

No debe permitirse que la basura, los desperdicios biológicos, infecciosos, y el material de vidrio sucio se acumulen en grandes cantidades en el laboratorio. Los recipientes con muestras de desecho y agentes etiológicos deben taparse cuando no se estén empleando. Es necesario limpiar con frecuencia las superficies de trabajo con algún desinfectante al comenzar y terminar cada turno. El personal de laboratorio fisiològico es responsable de mantener el área de trabajo limpia y sanitaria, aunque haya servicio de limpieza adicional por parte de la institución.

ETIQUETAS Y SEÑALES

Todos los recipientes que contienen productos químicos deben etiquetarse con claridad, indicando el nombre del producto y cualquier precaución para su manejo. Las áreas en que se almacenan productos inflamables, peligrosos o tóxicos y carcinógenos, o en las cuales se utilizan, deben estar marcadas claramente. Las áreas en que se almacenan o analizan sangre o líquidos corporales deben estar marcadas claramente con el signo de riesgo biológico.

DESECHO DE DESPERDICIOS

Existen normas de la OSHA con respecto al desecho de productos biològicos. El desecho de materiales biológicos, como desperdicios infecciosos, se examina y regula en la actualidad por leyes específicas del Ministerio de Salud Pública. AGUJAS Y OBJETOS PUNTIAGUDOS

Las agujas y otros objetos puntiagudos constituyen un riesgo físico y de infección potencial para el personal de laboratorio fisiològico.. Todas las agujas desechables y demás objetos punzantes deben colocarse en un recipiente resistente a la perforación y a prueba de fugas, marcado con el símbolo de riesgo biológico.

Estos recipientes se descartan, siguiendo las políticas de la institución, cuando están llenos hasta la mitad o las tres cuartas partes. La mayoría de las instituciones incineran los recipientes que contienen objetos punzantes.Inmediatamente después de usada una aguja deberá incinerarse y para ello existen en la actualidad equipos especiales incineradores de agujas llamados destructores de agujas. Nunca deberá volverse a colocar la tapa de las agujas a menos que se utilice algún dispositivo como pinzas, diseñadas para este fin, para evitar la punción cutánea accidental. Las agujas nunca deben cortarse, ya que esto puede provocar salpicaduras de sangre o de otros líquidos al medio.

SEGURIDAD CONTRA INCENDIOS

TIPOS DE INCENDIOS

En el laboratorio Bioquímico Fisiológico u otros laboratorios biológicos se requieren líquidos inflamables y combustibles para ciertos procedimientos y en ellos también existe el riesgo potencial de incendios eléctricos y de basura. El científico del laboratorio debe comprender estos peligros y la manera de afrontarlos en caso de urgencia. Los incendios se clasifican de la clase A hasta la D.

Los incendios de clase A ocurren con combustibles ordinarios, como madera o papel; los de la clase B ocurren con líquidos inflamables; en los de la clase C participan circuitos eléctricos energetizados, sin importar el combustible, y los de la clase D, son producidos por metales combustibles como el sodio. Para cada tipo de incendio se requiere un extinguidor diferente y adecuado, con el fin de controlar de manera eficiente el fuego y evitar que se éste se extienda.

EXTINGUIDORES

Los EXTINGUIDORES contra incendios contienen diferentes sustancias y están marcados según el tipo de incendio para el que deben emplearse. Los extinguidores clase A están llenos de agua y nunca deben utilizarse para incendios de tipo eléctrico, ya que el agua puede conducir la electricidad de regreso a la persona que tiene el extintor en las manos. Los extinguidores clase B contienen productos químicos secos, espuma acuosa que forma una capa (AFFF) o dióxido de carbono. Los extinguidores clase C están llenos de dióxido de carbono o Halon; los de la clase D de un polvo seco especial que contiene un enlazante termoplástico que permite que el agente forme una corteza sólida al calentarse. Hay extinguidotes que pueden emplearse para incendios de clases A a C.

Contienen un polvo seco y pueden utilizarse con eficacia y seguridad para las tres clases de incendios. Generalmente este tipo de extinguidores es el que se compra para uso en el hogar o en las oficinas. Sin embargo, si se emplea para incendios de equipo eléctrico en el laboratorio, es probable que sea difícil o imposible eliminar posteriormente dicho polvo de los instrumentos. Por tanto, se recomiendan los extinguidores de dióxido de carbono o Halon para incendios de equipo eléctrico.

CAUSAS Y PREVENCIONLas causas fundamentales de incendios en el laboratorio son descuido, falta de conocimiento acerca de los productos químicos que se utilizan, permitir que se efectúen procedimientos sin la vigilancia adecuada, sobrecarga de circuitos y llamas de gas abiertas. Es necesario impartir periódicamente conferencias para instrucción sobre seguridad en el trabajo, con el fin de recordar a los empleados la manera segura de proceder para evitar incendios y otros tipos de accidentes así como refrescarles buen el uso del extinguidor.

En caso de que se produzca un incendio es necesario ponerse en contacto con el departamento de bomberos o solici tar ayuda antes de intentar extinguirlo, Se pierde tiempo vaso cuando se trata de apagar el incendio primero, se ve e es imposible y después se solicita ayuda. Los pasos que deben seguirse en caso de incendio son:

1. Rescatar a cualquier persona que se encuentre en peligro.

2. Aislar el incendio cerrando alguna puerta.3. Solicitar ayuda.4. Intentar extinguido.5. Evacuar las instalaciones en caso de que no se pueda apagar el fuego.

Por supuesto, cuando hay varias personas presentes, estos pasos pueden llevarse a cabo de manera simultánea en un es fuerzo conjunto . Es necesario adiestrar al personal de labora-torio en el uso de los extintores centra incendios. En general, el departamento de incendios de la localidad o el comité de seguridad de la institución proporciona este entrenamiento.Revisar con frecuencia la fecha de expiración de los extinguidotes y renovarlos.

SEGURIDAD QUIMICA

HOJA DE DATOS SOBRE SEGURIDAD DE MATERIALES

En agosto de 1987 la OSHA enmendó la norma Federal Hazard Communication Standard -29CFR 1919.1200 (Right to Know/HCS Standard), haciéndola extensiva a todas las in-dustrias, incluyendo las instalaciones para el cuidado de la salud. Esta norma establece que los responsables de cada área determinen si se utilizan productos químicos peligrosos en el trabajo y proporcionen a los empleados hojas con datos de seguridad en el uso del material riresgoso y marquen adecuadamente los recipientes que contienen el producto, indicando el riesgo, y se mantendrá una lista de productos químicos peligrosos , es decir, un inventario de productos químicos, y proporcionen al empleado información y entrenamiento, y desarrollen un programa de comunicación de riesgos por escrito.

.

Información que contiene la hoja de datos de seguridad para cada material ó grupo de sustancias relacionadas ,de uso en Laboratorio fisiológico y otros Laboratorios biológicos:

1. Identificación del producto químico ( nombre químico,y sinónimo y/o nombre vulgar.)2. Ingredientes peligrosos3. Datos físicos4. Datos de incendios y explosiones5. Información de riesgos para la salud 6. Datos de reactividad7. Procedimientos para derrames, fugas y desecho 8. Información de protección personal9. Precauciones especiales y comentario

SEGURIDAD BIOLOGICA

PROTECCION PERSONAL

La dispersión epidémica del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) ha revivido la preocupación acerca de las enfermedades que se transmiten por la sangre entre las per-sonas que trabajan en el laboratorio. Se sabe que las personas que laboran en los laboratorios médicos en general, fisiológicos, ó biológicos y otros relacionados con la salud en general, conforman un grupo de alto riesgo para infecciones por virus de hepatitis B (RBV) relacionadas con el trabajo y virus de inmunodeficiencia humana (HIV). En 1987 los Centros para el Control de las Enfermedades Trasmisibles (CDC) de USA., publicaron recomendaciones para proteger a las personas que trabajan al cuidado de la salud y a otras de adquirir la infección por HIV y se actualizaron nuevamente en 1988. Entre las recomendaciones se aconseja que "se tomen precauciones congruentes al manejar sangre y líquidos corporales de todos los pacientes y las muestras que se obtengan".

Esto se conoce como precauciones universales. Las recomendaciones incluyen el uso de equipo para protección personal, como guardapolvos, mandiles, batas, guantes descartables y protectores para los ojos al manipular sangre y líquidos corporales en el laboratorio. La revisión de los CDC en 1988 recomendó usar equipo de protección personal para manejar todas las sustancias biológicas y animales. Deben tratarse todas las secreciones y excre-ciones corporales como potencialmente infecciosas, ya que hay otras enfermedades además de HBV y HIV que se trans miten a través de diversas sustancias del organismo y de los animales.. En 1991 la OSHA ( Occupational Safety and and Health Administration, de USA.) publicó una Norma final en relación a la exposición ocupacional a patógenos que se transmiten por la sangre (Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens). Esta regla indica que el patrón debe proporcionar equipo de protección personal que no permita que los materiales potencialmente infecciosos entren en contacto con la ropa, la piel, los ojos y la boca del trabajador en condiciones normales de uso. La regla también indica la manera correcta de disponer de objetos punzantes y otros desperdicios con riesgo biológico y señala la necesidad de administrar la vacuna de HBV y el tratamiento tras alguna exposición a todos los empleados que corran este riesgo. Además de describir equipo de protección personal, dicha norma incluye instrucciones para el lavado de manos, transporte de muestras, uso de pipetas, forma de recoger derrames, desecho de desperdicios y descontaminación del equipo.DERRAMES Es muy importante desarrollar y tener políticas escritas y procedimientos para instruir a los alumnos y a los empleados acerca de la manera de manejar derrames químicos y biológicos. Existen en el comercio estuches con insumos para ambos tipos de derrames.. Si no existen tales normas en la institución, el laboratorio debe desarrollarlas con el fin de asegurar el ambiente de trabajo.Es necesario que las personas que limpian algún derrame biológico utilicen guantes descartables y bata de laboratorio. Se colocan toallas desechables sobre el derrame y se echa desinfectante ( puede ser lejía diluida al 10% ó sol de fenol al 3% sobre ellas. Tras dejarlo reposar 30 minutos, se recoge la sustancia y el desinfectante con material absorbente (los cojinetes absorbentes son útiles para derrames grandes). A continuación se coloca el material contaminado en un recipiente para desechos biológicos : bolsas de plástico resistente de color rojo .Después de absorber la mayor parte de material, el área se limpia con un desinfectante de fuerza intermedia o alta, por ejemplo, dilución de Lejía

1:10. La solución desinfectante se absorbe con material desechable. El área se enjuaga con agua y se seca para evitar que quede resbalosa. Es conveniente preparar un conjunto de utensilios para limpiar derrames con riesgo biológico que contenga todos los materiales necesarios para efectuar la limpieza de este tipo y tenerlo a la mano en el laboratorio en que se manejan dichas muestras.

NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO DURANTE LAS PRACTICAS DE LABORATORIO

1. Realizar las prácticas de laboratorio con el debido interés y responsabilidad.

2. Presentarse vestido correctamente con su correspondiente guardapolvo y distintivo de la Universidad.

3. Poner maletines y mochilas en el estante, llevar a las mesas solo lapiceros y cuadernos.

4. Está terminantemente prohibido beber o comer dentro del laboratorio.5. Leer cuidadosamente la guía de práctica y tener en cuenta las

indicaciones de los profesores de práctica sobre el uso del material y equipos de laboratorio, así como el orden, limpieza y seguridad que debe mantenerse.

6. Por cada práctica de laboratorio cada mesa de trabajo presentará un único informe, el cual consta de las siguientes partes:

- Carátula.- Objetivos.- Marco Teórico.- Desarrollo Experimental.- Discusión de los resultados.- Conclusiones. - Cuestionario.- Bibliografía

Dicho informe se presentará en la siguiente práctica en el horario y grupo respectivo.

7. El inicio de la práctica es en la hora exacta programada. Se tendrá una tolerancia de 10 minutos, luego de ese lapso de tiempo no se podrá ingresar al laboratorio, por lo tanto se le considerará como una inasistencia y no tendrá derecho a nota de informe de prácticas.

8. Las inasistencias en las prácticas no son recuperables en ninguno de los grupos, calificándose al alumno con nota cinco (05). Aquel alumno que acumule 30% de inasistencias no tiene derecho a nota práctica.

9. Cada alumno será integrante de una mesa de trabajo, a la cual pertenecerá a lo largo del semestre académico.

10. Por cada mesa de trabajo, será nombrado un responsable que se hará cargo del material y equipos recibidos así como de la presentación de los informes.

11. En caso de daño, deterioro o pérdida del material y/o equipos, el responsable de mesa informará del hecho al profesor de prácticas, TODO El GRUPO ES RESPONSABLE DEL DAÑO CAUSADO, y deberá repararlo a la brevedad posible, no más de una (01) semana después del incidente.

12. Al final de la práctica, se procederá a limpiar el material usado, con el fin de entregarlo en las mismas condiciones en las que fueron recibidos, caso contrario se le descontará un punto en la nota de informe a todo el grupo.

13. Una vez limpio el material, el responsable de mesa lo devolverá a la persona encargada del laboratorio.

14. El laboratorio deberá quedar completamente limpio, las mesas secas y limpias, debiendo arrojar todos los desechos al tacho de basura.

Practica No. 2

ESPECTROFOTOMETRIA

GENERALIDADES:

Se denomina Análisis Espectrofotométrico al conjunto de métodos de análisis cuantitativos que se fundamentan en la medición de la intensidad de la luz transmitida a través de una solución coloreada, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas o que se han hecho de tal calidad mediante reacciones químicas adecuadas.

Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la radiación queda absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una reducción de su intensidad (Luz transmitida, It), proporcional a la capacidad de absorción de dichas moléculas.

Io It

Luz incidente Luz transmitida

Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en forma selectiva determinadas radiaciones luminosas unas mas que otras dejándolas pasar. La longitud de onda en la que las moléculas de dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la luz, se denomina “longitud de máxima absorción” o “lambda máximo”.

Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el aumento del número de moléculas que se interpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este número varía de acuerdo con la concentración del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solución, estos factores están considerados en la “Ley de Lambert y Beer”, que rige los principios de la colorimetría y cuyas formas de expresión son:

Log (Io/It) = E I c = A = D.O.

Donde:Io = Intensidad de la luz incidente.It = Intensidad de la luz transmitida. E = Coeficiente de extinción molar, valor constante dependiendo de la

naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda.I = Espesor del recipiente en cm.C = Concentración de la solución.A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la

Transmitancia (T) y la relación entre ambas es logarítmica.

CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCION PROBLEMA:

Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo de un fotocolorìmetro, existen dos formas:

- Método de la curva standard o curva de calibración.- Factor de calibración.

a) CURVA STANDARD.- Este método consiste en utilizar varios standares de concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un gráfico en un sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y las concentraciones en las abcisas (Eje X). En la recta obtenida (Función lineal), se puede extrapolar la absorbancia o densidad óptica de la muestra problema, hallando la concentración de la misma en el eje de las abcisas.

b) FACTOR DE CALIBRACIÓN.- (Fc), El factor de calbraciòn es un tèrmino que se relaciona con la concentración de una sustancia con su absorbancia, es decir la intensidad que absorbe una sustancia de concentración conocida (Standard o Patrón).

Asì tenemos:

Donde:Fc = factor de calibración.A = absorbancia del tubo standard.

Fc = [ Standard ] / A

[ Standard ] = concentración del standard.

Con el factor de calibración se puede fácilmente determinar la concentración de una muestra desconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia.Si la muestra problema y el standard son procesados de la misma manera (diluciones) se podrá usar directamente la siguiente fórmula:

[ MP ] = A mp . Fc

Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrará el factor de dilución (Fd) que es matemáticamente la inversa de la dilución (dil) y esta a su vez es:

Dil = Vol mp / Vol t

Donde:Vol mp = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilución.Vol t = Volumen total.

Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentración de una muestra problema se procederá usando la siguiente fórmula:

[ MP ] = A mp . Fc . Fd

Donde:A mp = Absorbancia de la muestra problema.Fc = Factor de calibración.Fd = Factor de dilución.[ MP ] = Concentración de la muestra.

EXPERIMENTO

1. Preparar la siguiente batería de tubos:

Tubo I Tubo II Tubo III Tubo IV Bicromato de K 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml Agua destilada 9 ml 8 ml 7 ml 6 mlConcentración (mg %)

Solución stock: Bicromato de Potasio 40 mg%. Calcular la concentración en mg% de bicromato de K en cada uno de los tubos. Leer las absorbancias de los cuatro tubos a 530 nm de longitud de onda (ג) en el espectrofotómetro.2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la

gràfica de absorbancia vs concentración de bicromato de K .3. Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de

la muestra problema que el profesor le hará entrega.4. Obtener el factor de calibración (Fc) promedio con las soluciones

standard utilizadas para construir las curvas de calibración ajustadas.

5. Calcular la concentración de la muestra problema por los siguientes métodos:

- Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibración.

- Analíticamente, multiplicando su absorbancia por el factor de calibración del standard.

CUESTIONARIO:1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotómetro.2.- ¿Qué diferencias existen entre un fotocolorìmetro y un espectrofotómetro?.3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus respectivas longitudes de ondas.4.- Qué relación matemática existe entre Absorbancia y Transmitancia.5.- Construya una curva de calibración con los siguientes valores:

Standard 1

Standard 2

Standard 3

Standard 4

Standard 5

Concentraciòn

5 mg/dl 10 mg/dl 20 mg/dl 30 mg/dl 40 mg/dl

Absorbancia 0.025 0.050 0.100 0.150 0.200Con la curva obtenida hallar la concentración de las siguientes muestras, sabiendo que sus absorbancias fueron: Muestra A........................0.015

Muestra B........................0.125 Muestra C........................0.350

PRACTICA No 3

LOS AMINOÁCIDOS Y LAS PROTEINAS COMO ELECTROLITOS: SU CAPACIDAD

AMORTIGUADORA EN EL ORGANISMO HUMANO

FUNDAMENTO BIOQUIMICO:Una propiedad importante de los aminoácidos, consecuencia del hecho de que todos ellos tienen grupos carboxilo (-COOH) y grupos amino (-NH2) es su conducto como electrolitos. Es costumbre considerar los grupos COOH como de naturaleza acídica y los grupos NH2 como de carácter básico.Hemos estudiado en las clases teóricas el comportamiento de los aminoácidos como iones dipolares y la conducta de ellos durante su titulación con ácido y álcalis de modo que se comportan como verdaderas sustancias tampones, amortiguadores ò buffers, para el sostenimiento del pH del medio interno dentro de estrechos límites (7.35 a 7.45). Explicamos también el comportamiento amortiguador del ion dipolar glicina al añadirle iones H+ o al añadirle OH- impidiendo las variaciones bruscas del pH sanguíneo. La representación de un

aminoácido tal como la glicina por la fórmula NH2CH2COOH sugiere que se trata de una sustancia en la que el grupo amino actúa como una base conjugada y el grupo COOH como un ácido. Se ha observado, sin embargo, que esta formulación no es la correcta del estado iónico de un aminoácido en solución acuosa. La verdadera representación es aquella que dimos del ion dipolar (A) y que es la siguiente: (Estructura A)

H H R C COO- R C COOHEstructura (A) NH3 Estructura (B) NH2

Y que es la forma en la cual se encuentran en el torrente circulatorio, es decir, al pH fisiológico (7.4) los grupos carboxilo existen como la base conjugada, esto es, como Ion carboxilato R-COO-; y al mismo pH, la mayoría de los grupos amìnicos estàn predominantemente en la forma protónica R-NH3+La estructura (A) iónica es la prevalente en la sangre y en la mayoría de los tejidos. La estructura (B) no puede existir a ningún pH. La conveniencia nos enseña sin embargo que la estructura (B) se use por razones didácticas y para explicar la mayoría de las ecuaciones que entrañan reacciones distintas a las de los equilibrios protónicos. La contribución más importante a la conducta de una proteína como electrolito procede de los grupos ionizables existentes en las cadenas laterales de los aminoácidos. La curva de titulaciòn de una proteína ò aminoácido con ácido ò álcali vendrá determinada en gran medida por el nùmero de cada uno de estos grupos ionizables de las cadenas laterales de sus unidades de aminoácidos. Por estas razones las soluciones de proteínas tienen una poderosa capacidad tampón.Esta propiedad amortiguadora es de importancia decisiva en los sistemas biológicos y ha sido estudiada con especial cuidado con relación a los amortiguadores de la sangre humana cuyo pH es controlado dentro de estrechos límites, tal como les expliqué en la clase teórica. Les dije que los valores de pH sanguíneo varían dentro de lo normal entre 7.35 a 7.45, cuando la sangre alcanza valores por debajo de 7.35 se produce acidosis; y cuando los valores de pH se elevan por encima de 7.45 se produce alcalosis. La sangre contiene otros dos sistemas tampones que son:

1) El Sistema bicarbonato/Acido carbónico (pK: 6,1)2) El sistema fosfato monosódico/disódico (pK:6,8)

La proteína más importante de la sangre del ser humano es la Hemoglobina que tiene gran capacidad tampón en la proximidad del pH 7.4, lo cual se debe a su elevado contenido de histidina (grupo imidazol)

Aproximadamente el 60% de la capacidad tampón de la sangre total se debe a la Hb, y un 20% es atribuible a las proteínas del plasma (seroalbúminas y globulinas).Recordemos que según lo propuesto por Bronsted: un ácido es una sustancia que al ionizarse genera iones Hidrógeno, H+, una base es toda sustancia capaz de aceptar estos iones hidrógeno. Como los ácidos ceden protones y las bases los captan, a cada ácido le corresponde, como es lógico, una base conjugada. Es decir, si un ácido cede un protón, el ion, así formado, puede captarlo de nuevo comportándose como base. Por lo tanto, los procesos de cesión ò captura de protones transcurren de forma reversible:

Cesión de protones AH A- + H+ Acido captación de protones base

El ácido y la base conjugada forman un par ácido/base.Las soluciones que contienen ácidos débiles y sus sales se llaman soluciones tampón, buffers ò amortiguadores. Su finalidad es impedir ò amortiguar las bruscas variaciones del pH.El pH de una solución amortiguadora puede calcularse utilizando la ecuación de Henderson-Haselbach: SAL pH = pK + log ------------ ACIDO

A partir de esta ecuación se deduce que el pH de una disolución tampón depende de la naturaleza del ácido que la integra y de la proporción entre la sal y el ácido (logaritmo de la relación entre ambos) y no de las concentraciones absolutas de cada uno de estos componentes. La eficacia amortiguadora es máxima cuando el cociente de la relación sal/ácido es próximo a la unidad.El objetivo de la presente práctica es demostrar la capacidad tampón de un sistema amortiguador empleando un ácido débil y la sal del ácido débil y estudiar la curva de titulaciòn ò valoración de un ácido débil HA, como el ácido acético (0.1N) y una base fuerte NaOH 0.1N y las variaciones del pH con respecto a diferentes proporciones relativas entre la sal y el ácido de una solución tampón. (el pKa del ácido acético es 4.76) antes de agregar la base, el pH se debe solamente a la presencia del ácido. Pero tan pronto como se añade algo de la base (NaOH 0.1N), èsta reacciona con una cantidad equivalente del ácido y forma una cantidad equivalente de sal y agua. El ácido débil más su sal disuelta constituyen una solución tampón (par amortiguador), cuyo pH

puede calcularse mediante el uso de la ecuación de H-H: pH = pK – log Sal/ácido.Se determinará el pH con el potenciómetro y se evaluarán los cambios en el pH con la adición de volúmenes definidos de una base conocida (NaOH 0.1N). Graficaremos en un sistema de coordenadas cartesianas los valores de pH vs los ml de base agregados y obtendremos así la curva de titulaciòn para el ácido.Se empleará el equipo potenciómetro para determinar el pH, instrumento que determina el pH en función de la fuerza electromotriz (p de Nernst) de una celda formada por un electrodo de referencia, la solución problema y un electrodo de vidrio muy sensible a los hidrogeniones.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:Potenciómetro.Beakers de 50 ml de vidrio (11 para cada mesa de trabajo).Baguetas de vidrio (3 por cada mesa).Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 (3 por cada mesa).Agua destilada.Solución de CH3-COOH 0.1N.Solución de NaOH 0.1N.Papel milimetrado ò cuadriculado.

PARTE EXPERIMENTAL:Mezclar los volúmenes de CH3-COOH 0.1N y de NaOH 0.1N con agua destilada señalados en la tabla siguiente, mezclar bien y luego medir el pH en cada uno de los 11 beakers con el potenciómetro:

Beaker Nº Acido acètico 0.1 N (ml)

NaOH 0.1N (ml)

Agua destilada (ml)

PH

1 20 0 202 20 2 183 20 4 164 20 6 145 20 8 126 20 10 107 20 12 88 20 14 69 20 16 410 20 18 211 20 20 0

En cada mesa los alumnos construirán su gràfica de valoración colocando en las ordenadas los valores de pH en orden creciente y en el

eje de las abscisas los volúmenes de sol. NaOH 0.1N añadidos en cada beaker.

pH

ml NaOH añadidoCUESTIONARIO:

1.- Graficar la curva de valores del pH vs. NaOH 0.1N. 2.- Identificar el punto de semi-valoración y máxima capacidad tampón. 3.- Explique que es un par tampón, como funciona y porqué las proteínas sanguíneas son amortiguadores. 4.- Describa las principales sustancias amortiguadoras del ser humano.

PRACTICA No 4

FACŢORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones biológicas, acelerando la velocidad de reacción hasta alcanzar su punto de equilibrio. Las enzimas son sumamente especìficas en las reacciones que catalizan y en los compuestos (llamados sustratos) sobre los que actúan.La cinética enzimàtica es el estudio del comportamiento de la velocidad en reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de la cinética proporcionan una herramienta bioquímica muy útil para calcular la concentración de una enzima en una muestra biológica y comparar su actividad catalítica con la de otras enzimas. Además, las mediciones cinéticas permiten describir de manera cuantitativa los tipos de inhibición enzimática y el efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima.

La velocidad a la que procede una reacción enzimàtica está controlada en parte por las concentraciones de la enzima y el sustrato. A medida que progresa la reacción, aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los correspondientes sustratos, en tanto que la concentración de la enzima no se altere.

La actividad enzimàtica puede expresarse:a) Por la desaparición del sustrato (S).b) Por la aparición de productos (P).c) Por modificación de cofactores (C).

El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse asì:

[E] + [S] [E] + [P]

C C'

Diversos factores modifican la actividad enzimàtica, tales como:1) Concentración de sustrato [S]2) Concentración de la enzima [E] 3) pH del medio4) Influencia de la temperatura5) Efecto de inhibidores y activadores

En la presente práctica estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad enzimàtica de la amilasa salival sobre el almidón.La amilasa es una enzima que degrada moléculas hidrocarbonadas complejas en componentes mas pequeños, tiene un PM de 40,000 a 50,000 daltons. Es producida por el páncreas exocrino y las glándulas salivales para ayudar a digerir el almidón. La amilasa humana se denomina “alfa-amilasa” por su capacidad para romper los enlaces polisacáridos alfa-1,4 al azar. Los enlaces alfa-1,6 de los puntos de ramificación no se alteran. El producto final de la acción de la alfa-amilasa sobre el almidón es la formación de dextrinas, maltosas y algunas moléculas de glucosa. El pH óptimo al cual actúa es 6.9 a 7 y se requiere cloro para su activación.En la práctica la actividad enzimàtica se medirá por la desaparición del sustrato (disminución de la turbidez en los tubos que contienen almidón), la cual se determinará en el espectrofotómetro a 650 nm.

EXPERIMENTO A

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA, DE LA TEMPERATURA Y DEL ION CLORO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

Tubos No. I II III IV V VISolución almidón 1% 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 mlBuffer fosfato pH 6.6 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 mlSolución salina (NaCl 1%) 2.8 ml 2.6 ml 2.4 ml 2.2 ml --- 2.2

mlAgua destilada --- --- --- --- 2.2 ml ---

2) Colocar los tubos I al V en un baño de agua a 37° C, durante 5 minutos. El tubo VI servirá de comparación para ver el efecto de la temperatura sobre la acción enzimàtica por lo que se deja a temperatura ambiente.

3) Agregar la solución de enzima:

Tubos No. I II III IV V VI Solución amilasa 0.4 ml 0.8 ml 1.2 ml 1.6 ml 1.6 ml 1.6

ml

4) Colocar nuevamente los tubos I al V en baño de agua a 37°C durante 20 minutos, el tubo VI se mantiene a temperatura ambiente.

5) Luego hacer el control final de la reacción con el reactivo de yodo, de la siguiente manera:

Tubos No. I II III IV V VIHCl 0.05 N 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 mlde los tubos de reaccióncorrespondientes agregar

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Solución yodada 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

6) Mezclar y dejar en reposo por 10 minutos.7) Leer las absorbancias al espectrofotòmetro a 650 nm.8) La diferencia de las absorbancias entre los tubos nos indicarà la

actividad enzimàtica para cada tubo.9) Graficar en papel milimetrado: Actividad enzimàtica en el eje Y vs

concentración de la enzima [E] en el eje X.

EXPERIMENTO B

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

Tubos No. I II III IV VSolución de almidón 1% 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 mlBuffer fosfato pH 6.6 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 mlSolución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 mlAgua destilada 5 ml 4 ml 3 ml 2 ml 1 ml

2) Mezclar bien los tubos. Hacer un control con la solución yodada con todos los cinco tubos de la misma manera que se hizo en el experimento anterior y leer las absorbancias de dichos controles a 650 nm. Dichas absorbancias se tomaràn como lecturas iniciales.

3) Luego añadir 1 ml de solución de enzima a cada tubo y colocarlos en el baño de agua a 37°C por 20 minutos.

4) Sacar los tubos y hacer un control con solución yodada de cada uno. Las lecturas de absorbancia se tomaràn ahora como lecturas finales.

5) Hacer la diferencia:

Actividad enzimàtica = Lectura inicial – Lectura final

El resultado de esta diferencia se considerarà como actividad enzimàtica.

6) Determinar el Km experimental de la amilasa para el almidón a partir de una gràfica de actividad enzimàtica contra [S] (Ecuación de Michaelis-Menten) y una gràfica de dobles inversas: 1/actividad enzimàtica contra 1/[S] (Ecuación de Lineweaver-Burk). Graficar en papel milimetrado.

EXPERIMENTO C

EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

Tubos No. I II IIISolución de almidón 1% 5 ml 5 ml 5 mlSolución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 mlBuffer fosfato pH 6.6 2 ml --- ---Buffer fosfato pH 3.7 --- 2 ml ---Buffer fosfato pH 8.0 --- --- 2 ml

2) Mezclar y colocar los tubos en baño de agua a 37°C por 5 minutos.3) Añadir a cada tubo 2 ml de solución de enzima (amilasa).4) Colocar nuevamente los tubos a 37°C por 20 minutos.5) Extraer los tubos del baño y realizar el control mediante la solución

yodada, como en el experimento anterior.6) Realizar el estudio crìtico comparativo de ellos. Sacar conclusiones.7) Graficar en papel milimetrado una curva de actividad enzimàtica vs pH.

CUESTIONARIO:

1.- Cuàl es la importancia del Km.2.- Què efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas.3.- Como se clasifican las enzimas?4.- A que se llaman zimògenos e isoenzimas.5.- Que son cofactores y mencione ejemplos.

PRACTICA No 5

EVALUACIÓN NUTRICIONAL BIOQUÍMICA Y ANTROPOMETRICA

 La evaluación nutricional es parte de la evaluación integral del estado de salud de un individuo. Es un requisito indispensable siempre que se desea mejorar, promover o mantener un buen rendimiento físico, un buen estado de salud y nutrición, además de dar una idea más exacta del nivel de rendimiento que se tiene y que se puede alcanzar.El objetivo general de la práctica es determinar el estado nutricional mediante un diagnóstico que permita conocer el nivel nutricional actual y anterior, y los posibles factores socioalimentarios, económicos y de composición corporal, que puedan afectar la participación y rendimiento de una persona. Otros objetivos de realizar esta evaluación son:

        Detectar déficit de nutrientes específicos, riesgo de desnutrición o sobrepeso.

        Brindar educación nutricional       Seleccionar personas de acuerdo a la composición corporal, orientar el

trabajo físico y/o reubicar al niño en una actividad física determinada ESTADO NUTRICIONAL : Es la condición de salud resultante en el tiempo, del balance entre lo consumido y lo requerido. Está determinado por la calidad y cantidad de los nutrientes consumidos y por la utilización de estos en el organismo. EVALUACIÓN NUTRICIONAL: Conjunto de datos antropométricos, dietarios, bioquímicos y clínicos, que correlacionados entre sí, permiten dar un diagnóstico nutricional y por tanto orientar el tratamiento o manejo nutricional. Una evaluación completa debe incluir:

 1. Evaluación antropométrica: Estudio de la forma y composición corporal.         Determina y compara los diferentes componentes (hueso, músculo,

grasa y residuo)        Analiza según patrones ideales o establecidos (edad, sexo, deporte,

nivel de rendimiento)        Indispensable para intervenir en procesos de crecimiento, actividad

física y estado nutricional. - Parámetros incluidos:        Talla actual, talla/edad,         Peso actual, peso usual, peso esperado, peso/talla (Ref. NCHS,

Metropolitan life)        Circunferencias (Volumen muscular)        Diámetros (estructura ósea)        Pliegues (% grasa)  2. Evaluación bioquímica: Permite conocer los niveles sanguíneos de los parámetros bioquímicos, indicadores del estado nutricional.         Confirma datos clínicos y dietarios        Susceptible a variaciones en la interpretación según edad, sexo, factores

hereditarios o consumo inmediato de alimentos. - Parámetros incluidos:        Cuadro hemático (hemoglobina, hematocrito, leucocitos y linfocitos)        Proteínas totales y diferenciales (albúmina / globulinas)

C reatinina urinaria 24hs/ Talla        Trasferrína y Ferritina        Glicemia y Perfil de lípidos 3. Evaluación Clínica: Basada en la evaluación médica.         Observa y analiza signos y síntomas clínicos que puedan indicar deficiencias nutricionales:

 - Parámetros incluidos:        Sueño, fatiga, aspecto físico, piel, cabello, uñas, labios.        Apetito / hambre        Cambios de peso        Frecuencia cardiaca        Cicatrización        Lesiones frecuentes        Tiempo de recuperación de las lesiones        Comportamiento del deportista  4. Evaluación dietaria: Analiza cualitativa y cuantitativamente el consumo dietario actual, comparándolo con la recomendación para la edad, sexo y gasto energético.Permite orientar, prescribir, calcular y diseñar un plan alimentario adecuado, ajustado a las necesidades nutricionales y calóricas, condición socioeconómica y hábitos del deportista. - Parámetros incluidos:        Encuesta nutricional:

- Historia socioalimentaria- Anamnesis alimentaria- Conductas alimentarias- Frecuencia de consumo de alimentos- Antecedentes personales y familiares

 

        Evaluación cualitativa - Número de porciones diarias por grupos de alimentos 

        Evaluación cuantitativa- Cantidad de kcal y nutrientes (grs promedio) consumidos, promedio /

día.            Determinación de la recomendación calórica y de nutrientes

- Comparar con el consumo para determinar excesos o déficit y diseñar fórmula dietaria prescrita.

EXPERIMENTO “A”

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS Y ALBÚMINA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:Los enlaces peptìdicos de las proteínas reaccionan en un medio alcalino con el ion cùprico del reactivo de Biuret, estabilizado por tartrato, para formar un complejo de color violeta cuya máxima absorción se da a 540 nm.

NaOH Cobre + proteína Complejo cupro-proteico

El dosaje de proteínas totales tiene poco valor como prueba aislada porque la alteración en una de las fracciones puede ser balanceada por una alteración opuesta de otra fracción. Por lo tanto, es importante que adicionalmente se determine la concentración de albúmina.La albúmina también va a ser dosada por el método de Biuret, pero previamente al suero se le hace un tratamiento con sulfato de sodio y eter etílico para lograr la separación de las globulinas y permitir solo el dosaje de albúminas.

REACTIVOS:1.- Reactivo para proteínas (Biuret): Solución de sulfato de cobre, hidróxido de sodio y tartrato.2.- Solución de sulfato de sodio al 22.6%.3.- Eter etílico.4.- Standard de proteínas: Solución patrón calibrada y estabilizada equivalente a 10.4 g/dl de proteínas.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS EN SUERO:Preparar tres tubos y agregar en cada uno lo siguiente:

Blanco(ml)

Standard (ml)

Muestra (ml)

Suero diluido 1/20 --- --- 1Standard --- 1 ---Reactiivo Biuret 4 4 4Agua destilada 1 --- ---

Mezclar y esperar 30 minutos.Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm.

CALCULOS: Calcular la concentración de proteínas (en g/dl), utilizando el método del Factor de Calibración.La lectura del tubo blanco debe ser restada de la lectura de los tubos muestra y standard para obtener una absorbancia neta, sin la intervención del color propio del reactivo.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA EN SUERO:Preparar un tubo de la siguiente manera:

- Suero sanguíneo.................................0.3 ml.- Colocar 5 minutos al baño maría a 37ºC.- Solución de sulfato de sodio................5.7 ml.- Mezclar. Éter etílico............................4.0 ml.- Mezclar. Tapar el tubo y centrifugar.

Inclinando el tubo, extraer con una pipeta el suero tratado que se aprecia como un líquido claro que queda debajo del precipitado.

Blanco Standard Muestra

(ml) (ml) (ml)Suero tratado --- --- 1Standard --- 1 ---Reactivo Biuret 4 4 4Sulfato de sodio 1 --- ---

Mezclar y esperar 30 minutos.Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm.

CALCULOS: Calcular la concentración de albúmina (en g/dl) utilizando el método del Factor de Calibración, en forma similar que para el caso de las proteínas totales.

VALORES NORMALES:Proteínas: 6.0 – 8.0 g/dl.Albúmina: 3.5 – 5.5 g/dl.

CUESTIONARIO.-1.- Qué diferencias hay entre desnutrición y malnutrición?2.- Describa todos los tipos de proteínas plasmáticas y cuáles son sus funciones.3.- Cuáles son los tipos de desnutrición que existen y como se valoran?4.- Que son la transferrina, prealbúmina y proteína transportadora de retinol y cual es su rol en la valoración del estado nutricional?5.- Qué es el Índice de Masa Corporal, como se halla y cual es su interpretación?

PRACTICA No 6

DETERMINACIÓN DE LA GLICEMIA, INVESTIGACIÓN DE GLUCOSURIA

    El mantenimiento de la glIicemia, o concentración plasmática de glucosa, en los organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los órganos, al ser la glucosa un metabolito energético principal. La coordinación de los procesos metabólicos implicados en este cometido se lleva a cabo por la relación insulina/glucagón. La ingestión de glucosa o sustancias que la produzcan (almidón, fructosa, galactosa, proteínas, pero no grasas) va seguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este

aumento origina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilización de glucosa (por glucólisis, entre otras), aceleración de la glucogenogénesis y disminución de la glucogenólisis; todo ello ocurre principalmente mediante la secreción de insulina, una hormona pancreática de tipo polipeptídico. En el caso de que la producción de insulina esté disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las células, lo cual ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglicemia); así ocurre en las personas que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo I". El diagnóstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en antecedentes, síntomas clínicos y comprobación de una hiperglicemia significativa.

Experimento A: DETERMINACIÓN DIRECTA DE LA GLICEMIA (concentración de glucosa en suero)

FUNDAMENTO TEÓRICO

    Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento de la concentración de glucosa en sangre (glicemia), que se produce de manera repentina y además es severa. Una hiperglicemia superior a 124 mg/dL detectada en más de una ocasión en ayunas, además se considera tambièn un valor mayor a 200 mg/dl en cualquier momento son indicativos de posible diabetes, diagnóstico que debe confirmarse con otras pruebas.    La determinación de glucosa sanguínea es una prueba muy frecuente en bioquímica y se puede llevar a cabo tanto por métodos químicos como enzimáticos, siendo estos últimos los más específicos.

Hay dos tipos de métodos químicos:

a. Reducimétricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa. Debido a la presencia en la muestra de otros compuestos reductores, estos métodos dan cifras superiores a las correspondientes a la glucosa verdadera. Ejemplos son el método de Folin-Wu y el de Somogy-Nelson.

b. Furfurálicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al sufrir deshidratación en un medio ácido. Un ejemplo es el método que emplea orto-toluidina.

    En cuanto a los métodos enzimáticos: a. Método de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-

6-fosfato deshidrogenasa. Por cada molécula de glucosa se forma una de NADPH, que puede medirse espectrofotométricamente a 340 nm. Es el método de referencia recomendado por las organizaciones internacionales.

b. Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en esta práctica para medir los niveles de glucosa sanguínea de la muestra problema y de los standares. Se explica a continuación:

    En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la D-glucosa a ácido D-glucónico con formación de peróxido de hidrógeno. Éste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La intensidad de color será proporcional a la concentración de glucosa presente inicialmente. El esquema de la reacción es el siguiente:

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 10 ml. Pipetas. Espectrofotómetro. Agua destilada. Solución patrón de glucosa (100 mg/dl). Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa,

peroxidasa, 4-aminofenazona, fenol, tampón fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

La muestra de sangre extraída del paciente será centrifugada y se separarà el suero. Hacer una dilución del suero midiendo exactamente en un tubo de ensayo 0.2 ml de suero y agregar 4.8 ml de agua destilada, mezclar hasta homogenizar. Luego se preparan los siguientes tubos:

Tubos: Blanco Standard Muestra

Suero diluido (ml) --- --- 1Estándar de glucosa (ml) --- 1 ---Reactivo de glucosa (ml) 3 3 3

Incubar los tres tubos en Baño Marìa de 37ºC por 15 minutos. Luego de retirar del Baño Marìa, agregar:

Agua destilada (ml) 2 1 1

Mezclar bien la solución. Leer las absorbancias para cada una de las muestras en el espectrofotómetro a 520 nm.

CALCULOS

Encontrar la concentración de glucosa en la muestra utilizando el método del factor de calibración.

VALORES NORMALES

La glicemia normal en ayunas es de 70 a 110 mg/dl.

Para el diagnóstico de diabetes se considera un valor mayor de glicemia en ayunas de 124 mg/dl ò mayor de 200 mg/dl en cualquier momento. Los pacientes cuyos niveles de glucosa se encuentren entre lo normal y lo diabético, son clasificados en una categoría denominada “tolerancia alterada a la glucosa” y requieren observación y pruebas confirmatorias.

Experimento B: INVESTIGACIÓN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA

FUNDAMENTO TEORICO

En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo menos con los métodos habitualmente utilizados en el laboratorio. La glucosuria (presencia de glucosa en orina) se presenta en la Diabetes Mellitus pero cuando se supera el umbral renal de glucosa que ocurre cuando la glicemia es mayor de 180 mg/dl. La detección cualitativa de glucosa en orina se basa en la acción de la glucosa, que reduce las sales de cobre en medio alcalino por ebullición. Para ello utilizaremos el reactivo de Benedict el cual contiene: sulfato de cobre, citrato de sodio y carbonato de sodio.

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 20 ml, pipetas, mechero Bunsen, Reactivo Benedict, pinzas porta tubos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Tubos: I IIOrina normal (gotas) VIII ---Orina DM (gotas) --- VIIIReactivo de Benedict (ml) 5 5

Calentar directamente a la llama de un mechero durante 2 minutos y se deja enfriar. Si la orina contiene glucosa, se observa un precipitado color verde, amarillo ò rojo ladrillo dependiendo de la cantidad en que se halle presente. De ser negativa la reacción permanecerá de color azul.

CUESTIONARIO:1.- ¿Qué es la Diabetes Mellitus y como se diagnostica desde el punto de vista del

laboratorio?

2.-Explique en que consiste el umbral renal y la tasa de reabsorción de la glucosa.

3.- Describa los métodos que existen para el dosaje de la glicemia.

4.- Explique el mecanismo de acción de los reactivos de Benedict y de Fehling.5.- Que son la hemoglobina glicosilada y la fructosamina y cuál es su importancia en la diabetes?

PRACTICA No 7

TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA POST PRANDIAL

Definición de la Enfermedad Diabetes Mellitas.-

La Diabetes Mellitus es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por la presencia de hiperglIcemia resultante de un defecto en la secreción de insulina, en la acción insulínica, o en ambas.

Clasificación de DM

Diagnóstico

Es muy importante el diagnóstico temprano de la enfermedad debido a que niveles elevados de glucosa, aún cercanos al límite superior normal, producen daños en la microvasculatura de retina y riñón

Existen otras entidades fisiopatológicas relacionadas con hiperglicemia que no llegan a cumplir los criterios de diabetes pero que son muy importantes ya que deben ser vigiladas ya que estos pacientes presentan riesgo elevado de evolucionar a diabetes. Estas son la tolerancia disminuida a la glucosa y la glucosa en ayunas anormal.

Tolerancia disminuida a la glucosa es aquel caso cuando después de una prueba de tolerancia con 75 g de glucosa se obtienen a las dos horas valores mayores a 140 y menores a 200 mg/dl.

La glucosa anormal en ayunas es aquel caso en que los valores en ayunas son mayores a 110 pero menores a 126 mg/dl.

Experimento A: TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA POSTPRANDIAL

FUNDAMENTO TEÓRICO

Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por mucho tiempo para diagnóstico de Diabetes Mellitus o intolerancia disminuida, pero ya no se utilizan de rutina, pero si pueden servir tanto para la Diabetes como para la intolerancia. Importante es recalcar que los niveles importantes en ambos casos son los obtenidos a las dos

horas, y que la cantidad de glucosa a ingerir debe ser de 75 gramos. El disolver 75 gramos en por lo menos 300 ml de agua hace la solución más agradable al paladar y por lo tanto tendrán más aceptación por parte del paciente.

Ayunas

70-110 mg/dl

30 min <200 mg/dl 1

hora<180 mg/dl

2 horas

<140 mg/dl

En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos en

niños se debe utilizar una cantidad de glucosa correspondiente al peso del niño (1,75 g de glucosa por Kg de peso). Es de suma importancia recordar que antes de iniciar cualquier prueba de tolerancia a la glucosa oral, se debe pedir una muestra de orina al paciente, para hacerle un análisis cualitativo glucosa. Esto debido a que si el paciente presenta glucosuria, no se debe realizar la prueba de tolerancia, ya que la glucosuria indica en la gran mayoría de los casos, niveles sanguíneos de glucosa elevados y la ingesta de altas concentraciones de glucosa le podría provocar al paciente un shock hiperglicémico.

Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la Organización Mundial de la Salud como por la American Diabetes Association, estas son las relacionadas con la Diabetes Mellitus Gestacional.

La curva de tolerancia a la glucosa para tamiz de la DMG consiste en la ingesta en ayunas de 50 gramos de glucosa, se mide la glicemia a la hora, si los niveles son menores a 140 mg/dl se desecha la DMG, si los niveles son iguales o mayores a 140 mg/dl se debe proceder a hacer la prueba confirmatoria para DMG. Esta consiste en ingerir en ayunas 100 gramos de glucosa y hacer una curva de tres horas. Si dos de los niveles obtenidos en dicha curva sobrepasan los valores indicados en la siguiente tabla, se hace el diagnóstico de DMG.

Ayunas

105 mg/dl

1 hora 190 mg/dl2

horas165 mg/dl

3 horas

145 mg/dl

La prueba de glucosa postprandial viene a ser una prueba de tolerancia a la glucosa acortada, donde solo se considera el valor basal y el de las dos horas.

Ayunas

70-110 mg/dl

2 horas

<140 mg/dl

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 5 ml. Micropipetas automáticas de 10 uL. Espectrofotòmetro. Solución patrón de glucosa (100 mg/dl). Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa,

peroxidasa, 4-aminofenazona, fenol, tampón fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Se determinarà la glicemia en muestras obtenidas a una persona en forma basal, a los 30 min, 60 min y 120 min. Luego de tomar la muestra sanguínea basal se le dà de tomar al paciente 75 gr de glucosa disuelto en 300 mL de agua con unas gotas de limòn. Las muestras de sangre extraìdas de la persona seràn centrifugadas y se separaràn los sueros. Para la determinación de las glicemias se utilizarà el método de la glucosa oxidasa – peroxidasa (GOD-POD).

Tubos: Blanco Standard

Muestra (0’)

Muestra (30’)

Muestra (60’)

Muestra

(120’)Suero (uL) --- --- 10 10 10 10Estándar de glucosa (uL)

--- 10 --- --- --- ---

Reactivo de glucosa (ml)

1 1 1 1 1 1

Incubar los tres tubos en Baño Marìa de 37ºC por 5 minutos. Mezclar bien. Leer las absorbancias para cada una de los tubos en el espectrofotòmetro a 500 nm.

CALCULOS

Encontrar la concentración de glucosa en cada una de las muestras utilizando el método del factor de calibración.

CUESTIONARIO:

1.- Con los datos de glicemia obtenidos en el experimento construir en un papel milimetrado una gráfica de tiempo vs. Glicemia y apreciar la curva de tolerancia a la glucosa.

2.- Como serìa esta curva en el caso de una persona normal, un diabético y un intolerante a la glucosa.

3.- Que importancia tiene la detección de microalbuminuria en una persona.

4.- Qué son y en que casos se hace un dosaje de péptido C y de insulina en un paciente diabético.

5.- Cuáles son las complicaciones agudas y crónicas de la diabetes?

PRACTICA Nº 8

DOSAJE DE AMILASA SERICA Y URINARIA

La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce principalmente en la fracción exocrina del páncreas y en las glándulas salivales.Su acción se dirige particularmente a escindir los enlaces alfa 1-4 glucosìdicos de los polisacáridos como almidón y glicógeno.En pacientes con pancreatitis aguda, la amilasa sérica empieza a elevarse en las primeras 2 a 3 horas de la enfermedad, alcanzando los valores más elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a los niveles normales entre el 3º y 6º día. También se ve aumentada en este caso la excreción urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego de que la actividad sérica ha alcanzado los niveles normales.También es posible encontrar valores aumentados en pacientes con ulcera gástrica o duodenal perforada, obstrucción intestinal, obstrucción de conductos biliares, pancreatitis crónica, hipertiroidismo, carcinoma de cabeza de páncreas, administración de opiáceos y en general cualquier caso de “abdomen agudo” o intervención quirúrgica en regiones próximas al páncreas.Las parotiditis bacterianas y virales, que producen bloqueo de la secreción de amilasa salival, se asocian también con elevaciones en los niveles de amilasa sérica.

PANCREATITIS AGUDA:

Definición: Es un desorden inflamatorio del páncreas, en el cual la función pancreática normal debe ser restaurada una vez que la causa primaria del evento agudo es superado.

Causas:

-    Pancreatitis por cálculos biliares: 60% (en nuestro medio)-    Pancreatitis alcohólica: 80% (en países Anglosajones)-   Pancreatitis de causa idiopática: 30% -   Pancreatitis por tumores ampulares-coledococele-Pán-creas Divisum-   Pancreatitis por condiciones metabólicas asociadas-   Hipertriacilgliceridemia-   Hiperparatiroidismo-   Hipercalcemia-    Hiperlipoproteinemia Tipo V; también tipos I y IV-    Pancreatitis por Toxinas (Insecticidas)-    Pancreatitis por picadura de escorpión en América del Sur y Central-    Pancreatitis por Metanol-    Pancreatitis traumática (Trauma abdominal)-    Pancreatitis Iatrogénica: ERCP, por corte esfínter de Oddi Cirugía pancreatobiliar, transplante renal-Vasculitis- SIDA-Parasitosis

PANCREATITIS CRÓNICA:

Definición: Es un estado inflamatorio crónico que determina un daño irreversible de la estructura y función pancreática. El curso clínico de la pancreatitis crónica puede consistir en ataques recurrentes agudos o una relativa progresión de síntomas.En 1988 la clasificación Marseilles - Roma de Pancreatitis reconoció la Pancreatitis Crónica Obstructiva subsiguiente a la pancreatitis crónica. Ésta es causada por la lesión obstructiva, es la forma más común de pancreatitis, la que se caracteriza por cambios crónicos irreversibles.

Causas:

-    Pancreatitis Alcohólica-    Pancreatitis Idiopática-    Pancreatitis Crónica Tropical-    Pancreatitis Hereditaria-    Pancreatitis por Hiperparatiroidismo-    Pancreatitis por Lesiones Traumáticas del Conducto Ductal

Experimento A: DETERMINACIÓN DE AMILASA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:

En este método el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la muestra, produciéndose la hidrólisis enzimática. Esta se detiene por el agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de color respecto de un sustrato control (sin muestra) es la medida de la actividad enzimàtica, que se expresa en Unidades Amilolíticas (Smith & Roe)/decilitro (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarogènicas (Somogy)/decilitro.

MATERIALES Y REACTIVOS:- Espectrofotómetro.- Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.- Tubos de ensayo y cubetas de lectura.- Baño maría a 37ºC.- Reloj de intervalos.- Substrato: solución de almidón 500 mg/l, tamponada a pH 7 con

buffer fosfato 0.1 mol/l en NaCl 0.15 mol/l.- Reactivo de yodo: solución 0.01 eq/l de yodo en HCl 0.02 mol/l.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:Preparar los siguientes tubos:

Control MuestraSustrato 1 ml 1 mlDejar unos minutos en baño de agua a 37ºC y agregar:Muestra --- 20 uLIncubar a 37ºC. A los 7’30” exactos, agregar:Reactivo de yodo 1 ml 1 mlMezclar por agitación suave. Retirar los tubos del baño y agregar:Agua destilada 8 ml 8 mlMezclar por inversión.Leer en espectrofotómetro a 640 nm, llevando a cero el aparato con agua destilada.

Experimento B: DETERMINACIÓN DE AMILASA EN ORINA

El procedimiento es igual que el caso anterior, solamente que en este caso la muestra en lugar de suero es orina diluida la cual debe

obtenerse de la siguiente manera:El paciente debe orinar descartando esta micción, dos horas después vuelve a orinar y recoge toda la orina. Esta muestra, que corresponde a dos horas de diuresis, se diluye a 200 ml con agua destilada. La determinación se efectúa con 20 uL de esta dilución, obteniéndose el resultado directamente en Unidades Amilo líticas/hora.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:Para ambos experimentos se empleará la siguiente fórmula:

Abs. Control - Abs. Muestra Amilasa UA/dl = --------------------------------------- x 1000 Abs. Control

Unidades: Una Unidad Amilolìtica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 minutos, en las condiciones de la reacción. En esta técnica se incuban 20 uL de muestra con 0.5 mg de almidón contenidos en 1 ml de Sustrato durante 7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de suero con 10,000 mg de almidón durante 30 minutos. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la muestra sería de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilásica, la fracción de almidón digerido se multiplica por 1000.

VALORES DE REFERENCIA:

Suero(UA/dl)

Orina(UA/hora)

Normal <120 <260Pancreatitis aguda 300 a 12000 Más de 900Pancreatitis crónica Hasta 200 Más de 300Parotiditis 200 a 350 350 a 750Parotiditis con complicación pancreática

Más de 350 Más de 750

Procesos abdominales agudos (sin pancreatitis)

Normal Normal

CUESTIONARIO:

1.- Explique como se produce la activación de las enzimas producidas por el páncreas exocrino ?2.- En una pancreatitis que importancia tiene el dosaje de las enzimas: lipasa, tripsina, elastasa y fosfolipasa A2?3.- Explique como se produce la digestión completa del almidón en nuestro tubo digestivo.4.- Cuál es el cuadro clínico de una pancreatitis aguda?5.- Qué otros exámenes auxiliares se pueden realizar para confirmar el diagnóstico de pancreatitis?

PRACTICA N° 09

CETOACIDOSIS DIABÉTICA

BASE BIOQUÍMICA.La Diabetes Mellitus se caracteriza por hiperglicemia y otros desarreglos que se deben a una inadecuada acción de la Insulina sobre los tejidos corporales, ya sea porque exista un reducido nivel circulante de Insulina ó una resistencia de los tejidos blanco a sus acciones .La Diabetes se divide en dos categorías – a) Diabetes Tipo I ó Diabetes Insulino dependiente ó Diabetes juvenil (llamada así porque se inicia en la juventud) y la Diabetes tipo II ó no insulino dependiente (diabetes de inicio en la edad madura). Puede haber tipos intermedios que se superponen. (A )LA DIABETES TIPO I afecta al 10 % de los pacientes diabéticos y la dependencia de la Insulina significa que no solamente que la insulina es necesaria para el óptimo control de la glucosa sanguínea, que también podría ser cierto para la forma tipo II, sino que “sin Insulina exógena el paciente es mas proclive a desarrollar CETOACIDOSIS diabética.(1) Se sabe que esto refleja una completa ó casi ausencia de insulina en estos pacientes, en contraste con la falta parcial de insulina ó la resistencia a la insulina característico de los pacientes del tipo II.(2) Otra característica clave de los pacientes con Diabetes tipo I es su presencia en niños y adultos jóvenes y su presencia en las personas mas bien delgadas que obesas.( B ) LA DIABETES TIPO II comúnmente afecta a las personas de edad madura, y con sobrepeso.

( 1 ) Como algo de insulina es producida en estos pacientes, no se produce cetoacidosis

( 2 ) Sin embargo puede ser necesario el tratamiento con insulina para prevenir la severa hiperglicemia.Debemos saber desde ahora que se puede producir Diabetes secundaria ó alterarse la tolerancia a la glucosa de modo secundario a ciertas enfermedades que afectan la producción ó la acción de la Insulina, tales como la pancreatitis

crónica, el Síndrome de Cushing, la acromegalia, la alteración de los receptores de insulina y otras.El síntoma mas común que produce la hiperglicemia es la poliuria(Aumento del volumen urinario) y la polidipsia( incremento en la ingesta de agua), lo cual se debe a la diuresis osmótica inducida por la glucosa. El incremento en la ingesta de agua es una respuesta a deshidratación y sed..Se produce disminución de peso corporal, debido a la pérdida de glucosa por la orina y a los efectos catabólicos de la disminución de la acción de la insulina, a pesar de la mayor ingesta de alimentos (Polifagia).La debilidad generalizada refleja las alteraciones metabólicas .Las infecciones de la piel, vulva y tracto urinario son frecuentes sobre todo en los casos no controlados debido a que la hiperglicemia disminuye la resistencia a las infecciones. La alteraciones en la retina son precoces.

CET0ACIDOSIS DIABETICA : Se produce en los diabéticos insulinodependientes cuyo nivel de insulina circulante es insuficiente para permitir una utilización de la glucosa por los tejidos periféricos y para inhibir la producción de glucosa y el catabolismo tisular. El incremento del Glucagon y el aumento de las hormonas que aumentan en respuesta al stress ( como la adrenalina, noradrenalina, cortisol y hormona del crecimiento) contribuyen a los desarreglos metabólicos. La insuficiente cantidad de insulina reduce la utilización periférica de glucosa y junto con el exceso de glucagon incrementan la producción hepática de glucosa a través de la estimulación de la gluconeogénesis y la glucogenolisis y la inhibición de la glicólisis.La degradación de las proteínas en los tejidos periféricos suministra un flujo de aminoácidos hacia el hígado como substrato para la gluconeogénesis.El resultado es la hiperglicemia .La diuresis osmótica resulta de la elevación de la glucosa ( y cuerpos cetónicos ) y genera hipovolemia, deshidratación y pérdida de sodio, fosfato de potasio y otras substancias por la orina. La depleción del volumen estimula la liberación de catecolaminas lo cual se opone a la acción de la insulina en el hígado y contribuye a la LIPOLISIS.

CETOGENESIS: La lipólisis acentuada que resulta de la falta de insulina y del exceso de catecolaminas moviliza los acidos grasos no esterificados desde sus depósitos en el tejido adiposo y en lugar de reesterificarse con el glicerol para formar triacilgliceroles, el hígado desvía sus rutas metabólicas hacia la producción de cuerpos cetónicos. El glucagon incrementa el nivel de carnitina, que capacita a los ácidos grasos a entrar en la mitocondria, donde ellos sufren beta oxidación hacia cuerpos cetónicos. Además el glucagon disminuye el contenido hepático de malonil CoA, que es un inhibidor de la oxidación de acidos grasos.

ACIDOSIS: El incremento de la producción hepática de cuerpos cetónicos( acetoacetato y beta hidroxibutírico) excede la capacidad corporal de metabolizarlos ó excretarlos. Sus H+ son tamponados por el bicarbonato, conduciendo a una caída del bicarbonato sérico y del pH sanguíneo. Se encontrará entonces: hiperglicemia, hipercetonemia, acidosis metabólica, disminución del bicarbonato, disminución del pH sanguíneo y presencia en la orina de glucosa (glucosuria) y cuerpos cetónicos ó cetonuria.

OBJETIVO DE LA PRACTICA.-Aprender a interpretar los niveles de bicarbonato sérico, pH sanguíneo y presencia de cuerpos cetónicos en la orina en presencia de Cetoacidosis Diabética.

EXPERIMENTO A: DOSAJE DE BICARBONATO SÉRICO

Reactivos y materiales: HCl 0.01 NNaOH 0.01 NFenoltaleína 20 mg% solución alcohólicaAlcohol corriente ó caprílico.Muestras problemas de bicarbonato para titularlas..Pipetas de 5 ml graduadas al décimoPipetas de 1 ml graduadas al centésimoBeakers de vidrio de 100 ó 50 mlBaguetas de vidrio Baño María de 37°C Reloj de intervalos

Mètodo:En un beaker de vidrio colocar:5 ml de HCl 0.01 N1 ml de suero2 gotas de alcohol

Agitar y luego reposo 2 min. Añadir 3 gotas del indicador Fenoltaleína. Colocar a 37° C en Baño Marìa por 10 minutos. Titular con NaOH 0.01N, hasta obtener un color rosado

pálido. Anotar la cantidad de NaOH gastado.

Càlculos: ( 5 - X ml gastados de NaOH en la titulación) x 10 = mMol/ Litro de HCO3-

Considerar que:a) 1ml de NaOH 0.01 N equivale 0.01 mEq HCO3 – b)Vol. de muestra usada en la titulación : 1 mlc)Expresar los valores de HCO3- en mMol/Litro

Valores Referenciales (Normales): 22 á 34 mMol/Litro

EXPERIMENTO B: INVESTIGACION DE CUERPO CETONICOS en la ORINA

Test de Rothera.- Esta prueba depende de la reacción entre la Acetona y el nitroprusiato para formar un complejo coloreado púrpura rojizo que indica la presencia de acetoacetato y/o acetona.

Reactivos para el test de la Rothera: Cristales de sulfato de amonioSolución de Nitroprusiato al 10% en soluciòn acuosa, la cual deberá ser fresca.Amoniaco solución ( Hidróxido de amonio concentrado)Muestra problema: orina Tubos de prueba de vidrio de 13x 100 mm aproximadamentePipetas Pasteur capilares ó pipetas de vidrio de 1 ml terminalesEspátulas ó bajalenguas de madera.Baguetas de vidrio.

Procedimiento:NO SE DEBERÁ PIPETAR NINGUN REACTIVO CON LA BOCA. PROHIBIDO HACERLO. Colocar aproximadamente 2 ml de orina en un tubo de prueba y añadirle con la espátula aproximadam.0.5 g de sulfato de amonio en cristales. Disolver con bagueta. Añadir 2 á 3 gotas de sol. Nitroprusiato 10% . Mezclar bien Por la pared lateral del tubo de prueba, sin pipetear con la boca, lentamente, en zona deslizar el amoniaco con una pipeta Pasteur ó pipeta de vidrio. Deberán quedar dos capas bien definidas. Esperar unos minutos y ver la formación de un anillo morado en la interfase en caso positivo para cuerpo cetónicos .Si no aparece este color la prueba es negativa.

CUESTIONARIO:1.- Explique la formación de cuerpos ce tónicos y porque se producen.2.- Explique las diferencias entre cetoacidosis diabética y coma hiperosmolar.3.- Como se diagnostica a un paciente que està en cetoacidosis diabética?4.- A qué se llama: exceso de bases y reserva alcalina.

5.- Explique los diferentes métodos de laboratorio que existen para el dosaje tanto de bicarbonato en sangre como de cuerpos cetónicos en orina.

PRACTICA Nº10

PERFIL LIPIDICO: COLESTEROL TOTAL Y FRACCIONADO

El nivel sèrico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de numerosas investigaciones tanto en individuos sanos como enfermos.

Desde un punto de vista médico la determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnóstica limitada. Sin embargo, su concentración varía de manera más o menos predecible en un gran número de condiciones clínicas. Se ha visto que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación de ateromas dado que las complicaciones arterioscleróticas prevalecen en individuos hipercolesterolèmicos.Diversos estudios epidemiológicos han permitido observar además, que el riesgo de contraer enfermedad cardíaca coronaria (ECC) para los individuos (varones de màs de 40 años) con colesterolemia menor ò igual a 200 mg% es 3 veces menor que entre individuos con más de 230 mg% y 6 veces menor que entre individuos con más de 260 mg%.Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer además la distribución de las lipoproteínas encargadas del transporte: HDL (lipoproteínas de alta densidad), considerada como el “factor protector” y LDL (lipoproteínas de baja densidad), consideradas como el verdadero “factor de riesgo”. Las funciones biológicas inherentes a los distintos grupos de lipoproteínas, las variaciones en su composición y los resultados de los diversos estudios epidemiológicos, indican que los valores aislados de colesterol HDL y colesterol LDL no pueden tomarse como índices

predictivos de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil lipídico con los valores de colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL.

Experimento A: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:El colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasa

(CHOD), previa hidròlisis enzimàtica de los ésteres mediante una lipasa de origen fungal. El agua oxigenada generada en la oxidación, produce la copulaciòn oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por la peroxidasa. El producto es una quinonimina roja con absorbancia máxima a 505 nm.

Lipasa ésteres de colesterol colesterol + ácidos grasos CHOD Colesterol + O2 colesten-3-ona + H2O2

POD H2O2 + 4-AF 4-(p-benzoquinona monoimino)-fenazona + 4 H2O

REACTIVOS:Standard: solución de colesterol 200 mg%Enzimas: suspensión conteniendo lipasa fungal (300 U/ml), colesterol oxidasa (3 U/ml) y peroxidasa (20 U/l).Reactivo 4-AF: solución de 4-aminofenazona (25 mmol/l).Reactivo Fenol: solución de fenol (55 mmol/l).Reactivo de trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo colocar en una probeta 50 partes de agua destilada, 5 partes de reactivo 4-AF, 5 partes de reactivo fenol y llevar a 100 partes con agua destilada. Agregar 2 partes de enzimas previamente homogenizadas. Mezclar por inversión, sin agitar.

PROCEDIMIENTO:En tres tubos colocar:

Tubos Blanco Standard MuestraStandard --- 20 uL ---Muestra --- --- 20 uLReactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULO DE RESULTADOS:Calcular la concentración de colesterol total en suero, aplicando el método del factor de calibración. Recordar que la concentración del standard de colesterol es de 200 mg%

VALORES DE REFERENCIA: Los valores de colesterol en sangre fluctúan según edad, sexo y hábitos de dieta y de ejercicio. Sin embargo, es preferible no hacer referencia a valores “normales”, pues la norma promedio de una población no necesariamente refleja ausencia de riesgo patológico en el caso de colesterol.

Menos de 200 mg% valor deseable 200 a 239 mg% valor frontera Mayor de 240 mg% valor alto

Experimento B: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las lipoproteínas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de Sulfato de Dextrán de PM 500,000 en presencia de iones Mg++.

En el sobrenadante separado por centrifugación, quedan las HDL y se realiza la determinación del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema más conveniente.

REACTIVOS:REACTIVO PRECIPITANTE.- Contiene una solución de Sulfato de Dextrán y de Cl2Mg.H2O

PROCEDIMIENTO:En un tubo medir 0.5 ml de muestra y agregar 0.05 ml de Reactivo Precipitante.Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.Dejar 15 minutos en refrigeración. No colocar en el congelador.Centrifugar a 3000 rpm.Usar el sobrenadante como muestra.

En tres tubos colocar:

Tubos Blanco Standard MuestraStandard --- 20 uL ---Sobrenadante --- --- 100 uLReactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULOS:De acuerdo al método del factor de calibración, considerando que la concentración del standard es de 45.7 mg%.

VALORES NORMALES: 30 – 65 mg%

Experimento C: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL LDL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se separan del suero precipitándolas selectivamente mediante el agregado de polímeros de alto peso molecular. Luego de centrifugar, en el sobrenadante quedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL), el colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema más conveniente.Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el colesterol unido a las LDL.

REACTIVOS:REACTIVO PRECIPITANTE.- Solución de sulfato de polivinilo disuelto en polietilenglicol (PM 600).

PROCEDIMIENTO:En un tubo, colocar 0.2 ml de suero problema y añadir 0.1 ml de Reactivo Precipitante.Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.Dejar 15 minutos en un baño de agua a 20-25°C.Centrifugar a 3000 rpm.Usar el sobrenadante como muestra.En tres tubos colocar:

Tubos Blanco Standard MuestraStandard --- 20 uL ---Sobrenadante --- --- 100 uLReactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULOS:

LDL Colesterol = Colesterol total - (Abs muestra neta x factor de calibración)

La concentración del standard es de 62.4 mg%.

VALORES NORMALES:Riesgo bajo o nulo: Menor de 140 mg%Riesgo moderado : 140 a 190 mg%Riesgo elevado : Mayor de 190 mg%

CUESTIONARIO: 1.- Què es RIESGO CORONARIO y como se calcula?2.- Explique que diferencias hay entre la arterioesclerosis y la ateroesclerosis?3.- Describa como se produce la biosíntesis de colesterol dentro del organismo.4.- Explique que es el colesterol VLDL y como se calcula.5.- Que rol cumplen los triglicéridos y como se realiza su metabolismo.

PRACTICA Nº11

PERFIL LIPIDICO II: TRIACILGLICERIDOS

Los triacilglicéridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo, constituyendo por lo tanto una potente forma de almacenamiento de energía.El movimiento de ácidos grasos entre los distintos compartimientos del organismo, se produce con gran rapidez en respuesta a diversos estímulos (dieta, actividad física, stress, edad, etc.). Por este motivo es de esperar que los triglicéridos (uno de los más importantes vehículos para el transporte de ácidos grasos) varíen también su concentración en respuesta a estos factores fisiológicos.Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado, conduciendo a niveles anormales de triacilglicéridos circulantes. La persistencia de esta condición, se asocia con numerosas patologías, tales como enfermedad hepática, renal, hiperlipidemias esenciales, etc.Un caso que resulta de particular interés es el aumento de traciliglicéridos en individuos obesos, en los cuales tiene importancia pronóstica, respecto a

la probabilidad de desarrollar enfermedad cardíaca coronaria. Alrededor del 50% de los lípidos de las lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias coronarias son triglicéridos, por lo que es posible relacionar a los triacilglicéridos con la patogénesis de la arteriosclerosis coronaria. Este punto de vista está sustentado por el hecho de que un gran porcentaje de pacientes con infarto de miocardio también exhiben hipertriacilgliceridemia.

Para la determinación de triacilglicéridos en suero se usará la determinación enzimàtica de glicerol a partir de glicéridos.Los métodos enzimàticos se basan en la determinación del glicerol contenido en las moléculas de los traciliglicéridos, tras la hidrólisis (química ò enzimática) para remover los àcidos grasos. La determinación enzimático del glicerol ha sido usada durante muchos años; sin embargo, en estos métodos se empleaba la hidrólisis alcalina de los triglicéridos. El reciente desarrollo del uso de enzimas (lipasa, usualmente combinada con una proteasa) para catalizar la hidrólisis, ha posibilitado el empleo de métodos directos, rápidos y específicos. Los sistemas totalmente enzimàticos eliminan el uso de reactivos cáusticos, extracción con solventes, baños de altas temperaturas y mezclas de adsorciòn para la remoción de fosfolípidos. Estudios recientes se han concentrado en desarrollar reactivos con lipasas, que hidrolizan completamente los traciliglicéridos.

Experimento A: DETERMINACIÓN DE TRIACILGLICERIDOS EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:Se producen reacciones químicas basadas en la determinación química de glicerol a partir de glicéridos.La primera etapa consiste en que los triacilglicéridos son hidrolizados enzimàticamente por una lipoprotein lipasa específica, produciendo glicerol y ácidos grasos.

lipoprotein lipasa Triacilglicéridos Glicerol + 3 àcidos grasos

En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de glicerolkinasa.

Glicerol kinasa Glicerol + ATP Glicerol-1-P + ADP

En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol fosfato oxidasa (GPO), con producción de agua oxigenada.

GPO Glicerol-1-fosfato + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato

Finalmente el agua oxigenada asì formada produce la unión oxidativa del fenol y la 4-aminofenazona, en reacción catalizada por la peroxidasa (POD), con formación de una quinonimina roja.

POD 2 H2O2 + 4-AF + clorofenol 4-(p-benzoquinona monoimino)fenazona + 4 H2O

REACTIVOS PROVISTOS:- Standard: solución acuosa de glicerol equivalente a 200 mg% de

triacilglicéridos.- Buffer: solución de buffer conteniendo clorofenol a pH 7,5.- Enzimas: Viales conteniendo lipoprotein lipasa, glicerol kinasa

(GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).

INSTRUCCIONES DE RECONSTITUCION Y MEZCLADO:- Standard: listo para usar.- Reactivo de trabajo: 5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Buffer a un vial de Enzimas.

Mezclar hasta disolución completa. Homogenizar y fechar.4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porción de Buffer y luego transferir al frasco de Buffer enjuagando varias veces. Homogenizar y fechar.

MATERIAL REQUERIDO:- Espectrofotómetro.- Probeta, micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes

indicados.- Frasco de vidrio color ámbar.- Tubos de fotocolorìmetro o cubetas espectrofotométricas.- Baño de agua a 37ºC.- Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO:

Homogenizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos.En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y M (Muestra), colocar:

Tubos Blanco Standard MuestraMuestra --- --- 10 uLStandard --- 10 uL ---Reactivo de Trabajo 1 ml 1 ml 1 ml

Mezclar.Incubar 10 minutos en baño de agua a 37ºC.Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua destilada.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:Corregir las lecturas con el blanco y usar las lecturas corregidas para los cálculos.Para hallar la concentración de traciliglicéridos en el suero problema, se debe utilizar el método del factor de calibración.

Triacilglicéridos (mg%) = M x Fc

Fc = 200 / S

M = Abs muestra – Abs blanco

S = Abs standard – Abs blanco

VALORES DE REFERENCIA:

El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de triglicéridos:Deseable: < 150 mg%.Moderadamente elevado a elevado: 150 – 199 mg%.Elevado: 200 – 499 mg%.Muy elevado: > 500 mg%.

CUESTIONARIO:

1.- Describa las características principales de los lípidos y su clasificación.2.- Explique la importancia biológica de los triacilglicéridos.3.- Como se produce la digestión y absorción de los tracilglicéridos.4.- Mencione la proporción de triacilglicéridos dentro de las lipoproteínas y la acción de la lipasa lipoproteica.5.- Enumere los diferentes métodos tanto químicos como enzimáticos para el dosaje de triacilglicéridos.

PRACTICA Nº12

MASA PROTEICA VISCERAL Y ESQUELÉTICA

Para evaluar el estado nutricional de una persona utilizamos el metabolismo proteico (síntesis y degradación).Las proteínas en el organismo se distribuyen didácticamente en dos compartimientos:

a) Compartimiento Proteico Visceral.b) Compartimiento Proteico Somático esquelético.

Las proteínas del compartimiento visceral se evalúan mediante los niveles de Transferrina, Pre-albùmina, Proteínas totales y Albúmina en suero, que por su relativamente corto tiempo de vida (albúmina es de 20 dìas) rinde una estimación razonable del compartimiento proteico visceral. En esta pràctica utilizaremos la Proteína Total y la Albúmina sèrica.Las proteínas del compartimiento somático esquelético la evaluaremos mediante la relación entre la excreciòn de la creatinina urinaria en 24 horas y la talla de la persona, relación que es un fiel índice de la masa muscular esquelética.Asì mismo mediante el Peso y la Talla se evaluarà la masa corporal total.

Experimento A: DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES Y ALBÚMINA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:

Determinación de Proteínas Totales:Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el iòn cùprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.Determinación de Albúmina:La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica de la Bromo Cresolsulfon Ftaleìna (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto al blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.

REACTIVOS:Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril polièter (AAP).Reactivo BCF: solución de Bromo Cresolsulfon Ftaleìna (en polioxietilèn lauril éter).Suero Patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo con tìtulo conocido de proteínas (Biuret ò Kjeldhal) y albúmina (unión BCF).

MATERIAL REQUERIDO:Espectrofotómetro.Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.Tubos de ensayo.Baño Marìa a 37ºC.Reloj de intervalos

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES:En tres tubos colocar:

Blanco Standard MuestraAgua destilada 50 uL --- ---

Suero Patrón --- 50 uL ---Muestra --- --- 50 uLReactivo EDTA/Cu 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

Mezclar los tubos.Incubar durante 15 minutos en baño marìa a 37ºC.Leer en espectrofotómetro a 540 nm.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA:En tres tubos colocar:

Blanco Standard MuestraSuero Patrón --- 10 uL ---Muestra --- --- 10 uLReactivo BCF 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

Mezclar los tubos.Mantenerlos a temperatura ambiente durante 10 minutos.Leer en espectrofotòmetro a 625 nm.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Proteínas totales (g/dl) = M x fc fc = P.T. (g/dl) / SAlbùmina (g/dl) = M x fc fc = Alb. (g/dl) / S

VALORES DE REFERENCIA:PROTEÍNAS TOTALES : 6,1 a 7,9 g/dl.

ALBÚMINA : 3,5 a 4,8 g/dl.

Experimento B: DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA

FUNDAMENTOS DEL METODO:La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado,

previa desproteinizaciòn con àcido pìcrico, obteniéndose un cromògeno que se mide a 510 nm.

REACTIVOS:Reactivo 1: àcido pìcrico 41,4 mmol/l.Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.Standard: soluciòn de creatinina 2 mg%

MATERIAL REQUERIDO:Espectrofotometro.

Tubos de ensayo.

Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO:Recolectar orina de 24 horas.Medir la diuresis, tomar una alícuota y efectuar una dilución 1:50 de la misma.Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente:

Blanco Standard MuestraStandard --- 0,5 ml ---Orina diluìda (1:50) --- --- 0,5 mlAgua 1 ml 0,5 ml 0,5 mlReactivo 1 2 ml 2 ml 2 mlReactivo 2 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Mezclar por inversión.Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.Leer en espectrofotòmetro a 510 nm.CALCULO DE LOS RESULTADOS:

MCreatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V S

Siendo:V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas.M = Absorbancia neta del tubo muestra.S = Absorbancia neta del tubo standard.

VALORES DE REFERENCIA:900 a 1,500 mg/24 horas.

VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL

PROMEDIO POBLACIONAL

DESNUTRICIÓN

Relación CrU 24h / Talla (mg 24h/m)

Hombres: 830Mujeres: 680

Hombres: < 660Mujeres: < 430

Relación Peso / Talla (Kg/m)

Hombres: 37Mujeres: 34

Hombres: < 30Mujeres: < 29

Proteínas totales (g/dl) 7 < 6Albúmina (g/dl) 4 < 3,5

CUESTIONARIO:

1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoración nutricional de dicha persona sabiendo que es varón, pesa 60 Kg, su talla es 1,56 m y su volumen urinario en 24 horas fuè de 1000 ml.2.- Como hubiera sido la valoración nutricional en el caso que la persona hubiera sido mujer?3.- Mencione las características generales de las proteínas y su clasificación.4.- Què son las globulinas y cuàles son sus clases?5.- Describa los métodos de dosaje tanto químicos como enzimáticos para proteínas totales, albúmina, globulina y creatinina.

PRACTICA N°13

METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA

Base Bioquímica.-La bilirrubina es un pigmento amarillo , que se produce en el ser humano a partir

del Núcleo HEM ( que es una Protoporfirina Tipo IX ó Tetrapirrol macrocíclico, molécula que tiene insertado un átomo de Hierro ).Sobre este núcleo HEM actua la enzima Oxigenasa Heme de los microsomas. Esta Oxigenasa rompe el enlace alfa meteno del anillo tetrapirrólico y se abre la molécula , conviertiéndose en el pigmento verde Biliverdina, el cual es subsecuentemente hidrogenado y forma Bilirrubina .Esta reducciíon la realiza la enzima citosólica biliverdina reductasa que es una enzima NADPH

dependiente. Por cada mol de HEME catabolizado por esta ruta se produce un mol de bilirrubina, de CO2 y de ión férrico.La producción diaria de bilirrubina a partir de todas sus fuentes en el hombre es de 250 a 350 mg. Aproximadamente el 85% de la bilirrubina total producida se deriva de la molécula del HEM de la Hb liberada a partir de los eritrocitos senescentes que son destruídos en el sistema retículo endotelial del hígado, bazo y médula ósea. El 15% remanente se produce a partir de la destrucción de las células precursoras de los eritrocitos en la médula ósea ( llamada “eritropoyesis inefectiva”) y también proviene del catabolismo de otras proteínas que contienen núcleo Hem como la mioglobina,citocromos, peroxidasas y que están distribuídas a través de todo el organismo.Después de su producción en los tejidos periféricos, la bilirrubina es transportada al hígado asociada a la albúmina .La Bilirrubina es rápidamente captada por los hepatocitos , se transporta y se conjuga al acido glucurónico ( UDP – glucuronilo transferasa) para producir mono y diglucuronato de bilirrubina los cuales se excretan en la bilis. y después de ser excretados hacia el intestino delgado . En el tracto intestinal los glucorónidos de bilirrubina se hidrolizan a la forma no conjugada por el pH al alcalino del intestino delgado, y por la acción catalítica de la betaglucuronidasa del hígado, células epiteliales intestinales y las bacterias.La bilirrubina no conjugada es posteriormente reducida por la flora bacteriana anaeróbica intestinal para formar un grupo de tres tetrapirroles incoloros colectivamente llamados Urobilinógenos que luego se reducen y forman tres productos: estercobilinógeno, mesobilinógeno y urobilinógeno.Hasta el 20% de los urobilinógenos producidos diariamente son reabsorvidos desde el intestino hacia la circulación pára ir al hígado(Circulación entero.hepática). La mayor parte del urobilinógeno reabsorvido es capatado por el hígado y es re-excretado en la bilis y solamente un 2 a 5 % entra a la circulación general y aparece en la orina. En la parte mas baja del tracto intestinal, los tres urobilinógenos se oxidan espontáneamewnte y producen los pigmentos estercobilina,mesobilina y urobilina, y así estos pigmentos adquieren color marrón y que son los pigmentos que le dan color a las heces. Existen enfermedades congénitas y enefermedades adquiridas que afectan uno ó mas de los pasos involucrados en la producción,capatación, depósito,metabolismo y excreción de la bilirrubina y la hiprbilirrubinemia es frecuentemente el resultado de estos transtornos.Esta bilirrubinemia puede ser a predominio No conjugado( Indirecta ) ó Conjugado( Directa) dependiendo del tipo de desorden. La hiperbilirrubinemia causa Ictericia. Cuando la cifra de bilirrubina en la sangre excede de l mg % , existe hiperbilirrubinemia .La hiperbilirrubinemia puede deberse a la producción de mas bilirrubina de la que el hígado normal puede excretar o a la insuficiencia de un hígado dañado para excretar la bilirrubina producida en cantidades normales. Ante la ausencia de daño hepático, la obstrucción de los conductos excretorios del hígado , previniendo la excreciónde la bilirrubina, también causará hiperbilirrubinemia. En todos estos transtornos , la bilirrubinase acumula en la sangre y cuando alcanza una cierta concentración( aproximadamente de 2 a 2. 5 mg%) se difunde dentro de los tejidos los cuales adquieren color amarillo, este transtorno se denomina ictericia. La concentracion de bilirrubina en el suero es de gran valor , por eso en la presente practica la emplearemos.

Estado Bilirrubina SéricaMg%

UrobilinogenoUrinario

BilirrubinaUrinaria

Urobilinógeno fecal

NORMAL

IictericiaHemolítica

Hepatitis

Ictericia Obstructiva

Conjug: 0.1 a 0.4 mgNo Conjug 0.2 a 0.7

Elevac.No Conjug

Elevaciónes de Ambas,con pred.Conjug Elecvación de ambas a predominio Conjugada

0.a 4 mg/24 hs

Aumentado

Disminuído

Ausente

Ausente

Ausente

Presente

Prresente

40 a 280 mg/ 24 hs

Aumentado

Disminuído

Escaso o ausente

Dentro de las causa de Ictericia Hemolítica tenemos:Anemias hemolíticas,ictericia fisiológica neonatal( Inmedurez hepática para captación, conjugación y secreción de la bilirrubina), Sindrme de Crigler-Najar ( Alteración de la conjugación de bilirrubina),Enfermedad de Gilbert,Hiperbilirrubinemia tóxica(Agentes farmacológicos).

Experimento A: DOSAJE DE BILIRRUBINA SERICA

FUNDAMENTO:El suero sanguíneo es tratado con el reactivo diazoico (Acido Sulfanílico + Nitrito de sodio) y se produce un complejo coloreado de color rojo violáceo debido a la presencia de bilirrubina conjugada al ac. glucurónico (Directa) color que desarrola directamente.. La Bilirubina no conjugada (Indirecta) requiere además la presencia de cafeína ó alcohol metílico para que se desarrolle el color . Entonces para obtener la producción de color debido a ambas bilirrubinas debemos añadir cafeína ó metanol y tendremos la producción de un color debido a la suma de ambas bilirrubinas que llamamos Bilirrubina Total. Estos colores son comparados espectrofotométricamente con el color producido por una solución standard de bilirrubina de concentración conocida.

REACCTIVOS NECESARIOS:- Acido Sulfanílico en medio ácido- Solución acuosa de nitrito de sodio- Alcohol metílico ó solución de cafeína amortiguada - Agua destilada- Standard de Bilirrubina- Preparación de reactivo Diazo( Sol. Nitrito de sodio + Sol ácido sulfanílico), según intrucciones del profesor.

- Muestras problema

METODOLOGIA.- Colocar los reactivos en tubos de prueba marcados ,según la siguiente tabla:

ReactivosTubo

Blanco

( B )

TuboBilir Directa

( D )

TuboBilir Total

( T )

TuboStandard deBilirrubina

(mg %)Muestra (suero)

200 uL 200 uL 200 uL ---

Agua destilada 2,5 ml 2.5 ml --- ---Sol Cafeína --- --- 2.5 ml 2,5 mlAcido Sulfanílico

200 uL --- --- ---

Reactivo Diazo --- 200 uL 200 uL 200 uLStandard 200 uL

Mezclar de inmediato, cada tubo por inversión.Reposo 5 minutos a temperatura ambiente.Lectura en espectrofotómetro en 530 nanómetros, colocando el espectrofotómetro en cero de Absorbancia con Agua destilada.Anotar los resultados de cada lectura.

CALCULOS:Bilirrubina Total mg% = ( T - B ) x FactorBilirrubina Conjugada (Directa) mg % = ( D – B ) x FactorBilirrubina No Conjugada(Indirecta ó Libre) = (Bilirrub.Total – Bilirrub.Directa)

VALORES DE REFERENCIA:- Adultos = Directa: hasta 0.2 mg/% Total: hasta 1.0 mg/%

- Recièn nacidos = Nacidos a tèrmino Prematuros Sangre de cordòn 2.5 mg% Hasta las 24 horas 6.0 mg% 8.0 mg% Hasta las 48 horas 7.5 mg% 12.0 mg% Del 3º al 5º dìa 12.0 mg% 24.0 mg%Loa valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento.

En los prematuros, los niveles de Bilirrubina tardan màs en alcanzar la normalidad, dependiendo del grado de inmadurez hepàtica

Experimento B: INVESTIGACION DE UROBILINOGENO EN ORINA

El Urobilinógeno se forma en la fase intestinal del metabolismo de la bilirrubina y se encuantra en todas las orinas normales en muy pequeñas cantidades, menores de 4 mg / 24 hs. Se forma en el intestino como hemos señalado en las clases teóricas por la acción de las bacterias sobre los los pigmentos biliares excretados por el hígado.También dijimos que luego que se excreta la bilirrubina conjugada al

conductillo biliar llega al duodeno; la bilirrubina conjugada no es reabsorvida sino que : o bien se excreta como tal en la heces, o bien se transforma en UROBILINOGENO ( y derivados asociados) por acciópn de las bacterias del colon. El urobilinógeno se puede reabsorver en el intestino delgado (Ïleon ) y en el colon y pasa a la circulación portal , llega al Hígado y allí se re-excreta a la bilis y el resto llega al riñón y se excreta con la orina .Cuando existe una alteración en la captación y excreción hepática de urobilinógeno ( como en la enfermedad hepatocelular) ó la síntesis de bilirrubina como en la hemólisis, la excreción diaria del urobilinógeno aumentará en forma significativa Por el contrario,si no pasa bilis al intestino, como en la colostasis u obstrucción biliar extrahepática interfieren en la fase final del catabolismo de la bilirrubina y ocasiona un descenso notable en la producción y excreción urinaria del urobilinógeno. Entonces, la medida del urobilinógeno en la orina resulta muy útil para diferenciar las posibles causa de hiperbilirrubinemia como ocurre en la obstrucción completa de los conductos biliares, la urobilina estará ausente en la orina. La excreción se incrementará en todas aquellas condiciones en que exista una excesiva destrucción de los eritrocitos y en aquellos casos de daño parcial del parénquima hepático. En las nefritis muy avanzadas puede estar ausente la Urobilina

Fundamento de la prueba de Ehrlich para la investigación de Urobilinógeno en orina (Método Cualitativo).:Esta prueba se basa en la reacción entre el urobilinógeno y el reactivo de paradimetil aminobenzaldehido,para rendir un complejo coloreado rojo cerezaReactivo de Ehrlich: Disolver 10 gm de Paradimetilaminobenzaldehido en una mixtura de 75 ml de agua y y 75 ml de HCl concentrado.P rocedimiento :A 2 ml de orina en un tubo de prueba , añadirle 0.5 ml del Reactivo de Ehrlich y mexclar bien. Observar el color de la mixtura.Interpretación. Cantidades normales de Urobilinógeno en la orina no producirán color. Cantidades aumentadas(patológicas) del piegmento urobilinógeno producirán un color rojizo cereza que se observa bien mirando el tubo desde arriba del tubo(boca del tubo) contra un fondo blanco.En la actualidad usamos para la investigación de Urobilina en orina el método de las tiras reactivas que se introducen directamente en la muestra de orina. Estas cintas están impregnadas en el área correspondiente de una sal de metoxibenceno diazonio estable que produce con el urobilinógeno, casi instantáneamente un complejo de color rojo azoico.Se considera normal que en la zona reactiva para urobilinógeno no se produzca decoloración alguna o que los colores que aprezcan sean mas claros que los observados para l mg % .Esta prueba es específica para el urobilinógeno.

CUESTIONARIO:1.- Explique la formación de la bilirrubina.2.- En que casos se produce una elevación de la bilirrubina total , tanto a expensas de la bilirrubina directa como de la indirecta.3.- Como se forma el urobilinógeno y qué importancia tiene?4.- Qué es la ictericia y como se evalúa.5.- Cuáles son los métodos conocidos para el dosaje de bilirrubina.

PRACTICA Nº 14

TRANSAMINACION

IMPORTANCIA CLINICA:Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un cetoàcido, en una de las màs importantes reacciones del metabolismo proteico. El interés

clìnico està centrado especialmente en dos de ellas: TGO (transminasa glutámico oxalacètica) y TGP (transaminasa glutámico pirùvica).Estas enzimas tienen acciòn eminentemente intracelular, por lo que la actividad sèrica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de la actividad serà evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran, de los cuales resultan particularmente importantes corazón e hígado.Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de la TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima, tan abundante en músculo cardìaco.En este caso no existirà aumento en la actividad sèrica de TGP ò serà mínimo.En hepatitis virales y otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de tejido, habrà un incremento considerable de la actividad sèrica de transaminasas, incluso antes de la aparición de síntomas clìnicos como ictericia.En este caso, la TGP serà la enzima predominante debido a su gran concentración en el tejido hepático.Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse tambièn en traumas accidentales o quirúrgicos y en distrofias musculares y algunas miopatías.

FUNDAMENTOS DEL METODO:Una reacción de transaminación consiste en la interconversión de un grupo amino (NH2-CH-COOH) de un aminoácido, con un grupo cetónico (O=C-COOH) de un cetoácido. Este intercambio está catalizado por enzimas conocidas con el nombre de transaminasas. En el suero humano, por lo general, se determinan dos tipos principales: la Glutámico Oxalacética (TGO) y Glutámico Pirúvica (TGP).Ellas catalizan las siguientes reacciones: TGO l-aspartato + -cetoglutarato oxalacetato + glutamato

TGP l-alanina + -cetoglutarato piruvato + glutamato

El oxalacetato y el piruvato así formados, reaccionan con el reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4 – DNFH), generando fenilhidrazonas, las cuales en medio alcalino (NaOH) producen un complejo coloreado cuya intensidad es proporcional a la actividad enzimática de transaminasas en la muestra.

REACTIVOS:1.- Sustrato TGO:

Solución conteniendo 100 mmol/l de l-aspartato y 2 mmol-l de alfa-cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.

2.- Sustrato TGP:Solución conteniendo 200 mmol/l de l-alanina y 2 mmol/l de alfa- cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.3.- Reactivo 2,4-DNFH:

Solución conteniendo 1 mmol/l de 2,4-dinitrofenilhidrazina en ácido clorhídrico 1 mmol/l. Esta solución es corrosiva y debe guardarse en frasco oscuro.4.- Standard de Calibración: Solución de piruvato de sodio 2 mmol/l. Para efectuar la curva de calibraciòn. Listo para usar en la curva de TGP. Diluir 1:2 con sustrato par la curva de TGO.5.- Hidróxido de Sodio para Enzimas: Solución de hidròxido de sodio 4 mol/l

Antes de usarse, se deberá diluir el contenido de este frasco a 1 litro de agua destilada para así alcanzar la concentración requerida de NaOH 0.4mol/l.Es importante notar que el hidróxido de sodio debe conservarse en frasco de plástico y no de vidrio. Conservar el frasco lejos del reactivo de color pues los vapores pueden contaminar ambos reactivos.

EXPERIMENTO A DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS (TGO Y TGP) EN SUERO

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR TGO ò TGP EN SUERO:Preparar los tubos:

Blanco MuestraSustrato (TGO ò TGP) 0.5 ml 0.5 mlColocar en baño de agua a 37ºC unos minutos y luego agregar:

Muestra (suero) --- 100 UlAgua destilada 100 uL ---Mezclar por agitación suave e incubar exactamente 30 minutos y agregar:

Reactivo 2,4-DNFH 0.5 ml 0.5 mlMezclar. Dejar 10 minutos a 37ºC. Luego agregar:NaOH 0.4 mol/l 5 ml 5 mlMezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2 minutos leer en el espectrofotòmetro a 505 nm, llevando el aparato a cero de absorbancia con agua destilada. Nota: Para el cálculo de resultados se debe emplear una curva de calibración.( Ver experimento B)

EXPERIMENTO B

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA TRANSAMINASAS

Antes de utilizar por primera vez el juego de reactivos, preparar una curva de calibración para TGO y otra para TGP, de acuerdo a las siguientes indicaciones:Pipetear en dos series de tubos:

Tubo Agua destilada

(ml)

Sustrato (ml)

Standard de calibración

(ml)

TGO (U/l)

TGP (U/l)

I 0.2 1.00 0.00 0 0II 0.2 0.95 0.05 7 9III 0.2 0.90 0.10 12 18IV 0.2 0.85 0.15 20 25V 0.2 0.80 0.20 28 37VI 0.2 0.75 0.25 37 46VII 0.2 0.70 0.30 48 56VIII 0.2 0.60 0.40 81 79IX 0.2 0.50 0.50 --- 113

Nota: Utilizar sustrato TGO para la curva de calibración de TGO y sustrato TGP para la curva de calibración de TGP, respectivamente.

Mezclar y agregar a cada tubo, 1 ml de reactivo 2,4-DNFH.Mezclar. Incubar 10 minutos a 37ºC.Agregar 10 ml de hidróxido de sodio 0.4 mol/l a cada tubo.Mezclar y esperar 10 minutos a temperatura ambiente antes de leer.Leer la tramitancia a 505 nm usando agua destilada como blanco de lectura. El color es estable durante solo 30 minutos.Restar a cada lectura la obtenida con el tubo Nº1, obteniéndose las Absorbancias Netas.Graficar en papel milimetrado los valores de absorbancias netas en el eje vertical, y en el eje horizontal las U/l de TGO ó TGP según sea el caso, que se indica en la tabla superior.Determinar en el gràfico los puntos correspondientes a cada tubo. Uniéndolos se obtienen las curvas respectivas para TGO y TGP.Tener en cuenta que para cada técnica debe utilizarse el gràfico correspondiente.

VALORES DE REFERENCIA:Se consideran valores normales de transaminasas (TGO y TGP) hasta 12 U/l. Si bien se han hallado individuos normales con valores hasta 18 U/l, los niveles de transaminasas que se encuentren entre 12 y 18 U/l deben considerarse sospechosos.

CUESTIONARIO:1.- Explique en que consiste el fenómeno de transaminaciòn y donde se realiza en el organismo?

2.- Que relación existe entre las transaminasas y las enfermedades hepáticas?3.- Como se encuentran las transaminasas en el infarto agudo de miocardio?4.- Señale cuáles son los métodos de análisis conocidos para dosaje de transaminasas?5.- Existe variación de transaminasas con la edad?

PRACTICA Nº 15

BALANCE NITROGENADO

El objetivo de esta pràctica es evaluar el metabolismo proteico empleando el Balance Nitrogenado. Explicaremos los parámetros mas representativos de la excreta nitrogenada en general.Se evalúa los egresos de N mediante el nitrógeno ureico urinario en 24 horas y la excreción de nitrógeno creatinìnico urinario en 24 horas empleando la fòrmula de nitrógeno total estimado (NTE), según Ramírez Velasco.

FORMULA: BN = INGESTA N – (NTE + 2)

NTE = N. UREICO + N. CREATININICO

Excreción fecal : 2 gr/24 horas.

N Ingerido: gr de proteínas/6.25

Nota: Si el paciente presenta albuminuria, añadir a la excreta: Proteína urinaria/6.25

EXPERIMENTO A : DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA

La creatinina se forma endógenamente en el metabolismo muscular y es removida de la sangre por filtración glomerular y excretada en la orina sin ser reabsorbida en los túbulos. Por lo tanto, es el riñón el que regula, como ùnico órgano excretor, el nivel de creatinina en la sangre. Si se restringe la función renal aumenta la creatinina en el plasma, proporcionalmente a la lesión orgánica. Un aumento continuo aunque escaso del nivel de creatinina en suero debe considerarse como un signo de pronóstico desfavorable, ya que puede tratarse de una irreparable restricción de la función renal.Como se forma en el organismo, los factores exógenos no pueden influir su nivel sèrico. Por este motivo la determinación simultánea de la creatinina en suero y orina permite el cálculo del clearence o depuración de creatinina y representa un método excelente de la medida de la filtración glomerular.

FUNDAMENTOS DEL METODO:

En un medio alcalino que contiene picrato, la creatinina presente en la muestra, reacciona con éste formando un complejo rojizo, cuya mayor absorción se dà a 530 nm.

Creatinina + picrato Complejo creatinina-picrato

REACTIVOS:Reactivo 1.- Solución de ácido pícrico 0.05MReactivo 2.- Solución de hidróxido de sodio 0.75N

PROCEDIMIENTO:Recolectar orina de 24 horas.Diluir la orina completando a 2000 ml con agua destilada.Nota: Si el volumen de la orina recolectada durante las 24 horas supera los 2000 ml la prueba debe realizarse sin diluirla, pero en el momento de realizar los cálculos en vez de multiplicar el resultado por 2000, debe multiplicarse por el volumen total (ml).Preparar los siguientes tubos:

Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)Orina diluida --- --- 0.02Standard --- 1.0 ---Agua 2.5 1.5 2.5Reactivo 1 3.5 3.5 3.5Reactivo 2 1.0 1.0 1.0

Mezclar bien.Después de transcurridos 20 minutos leer la absorbancia a una longitud de onda de 530 nm contra el blanco.

CALCULOS: Abs muestra Creatinina en orina (mg/24 h) = ------------------ x 2000 Abs standard

VALORES NORMALES: 500 – 1500 mg/24 h.

Dato: Creatinina x 0.37 = Nitrógeno creatinìnico.

EXPERIMENTO B : DETERMINACIÓN DE UREA URINARIA

El producto final màs importante del metabolismo proteico es la UREA. Esta es excretada en la orina en mayor cantidad que cualquier otra sustancia.Concentraciones elevadas de urea en sangre son indicador de una inadecuada función excretora y por consiguiente de la función renal.La urea sanguínea puede aumentar por otras razones además de excreciòn renal insuficiente, dichas causas se clasifican en: Pre-renal, son los estados en los cuales se altera la circulación por el riñòn y Post-renal por obstrucción de las vìas urinarias. Por ello la información màs exacta con respecto a la habilidad excretora de la urea por los riñones requiere de una comparación de la concentración de urea en sangre

(BUN) y en la orina. Fisiológicamente la urea se eleva debido a una dieta hiperproteica o con la edad y disminuye durante una dieta de bajo valor proteico.

FUNDAMENTOS DEL METODO:La urea presente en la muestra es hidrolizada hasta amonìaco y dióxido de carbono, mediante una reacción catalizada por la enzima ureasa:

Ureasa Urea + H2O CO2 + 2 NH3

El amonìaco en presencia de una base reacciona con fenol e hipoclorito de sodio formando azul de indofenol. La intensidad de color azul es proporcional a la cantidad de urea en la muestra.

REACTIVOS:Reactivo 1.- Solución de fenol y nitroprusiato de sodio.Reactivo 2.- Solución de hipoclorito de sodio en NaOH 0.625NEnzima.- Solución de ureasa.

PROCEDIMIENTO:Se diluye la orina a 1:50 con agua destilada.Preparar los siguientes tubos:

Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)Standard --- 0.01 ---Orina diluida --- --- 0.01Enzima 2 gotas 2 gotas 2 gotas

Mezclar e incubar los tubos en un baño marìa a 37°C por 5 minutos.Asegurarse que los reactivos no se hayan quedado en las paredes de los tubos.Luego agregar en cada tubo, 1 ml del Reactivo 1, y posteriormente 1 ml del Reactivo 2.Mezclar el contenido de los tubos e incubarlos en un baño de agua a 37°C por 5 minutos.Transcurrido este tiempo agregar 4 ml de agua destilada en cada tubo.Mezclar los tubos por inversión y proceder a leer la absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm vs el blanco.

CALCULOS: Abs muestra Urea (mg/dl) = --------------------- x 60 x Factor de dilución

Abs standard

Dato: Urea x 0.466 = Nitrógeno ureico.

VALORES NORMALES: Nitrógeno ureico.- 7 a 14 gr/24 hrs.Urea.- 15 a 30 gr/24 hrs.

BN = Ingesta nitrogenada – (N ureico + N creatinìnico + 2)

BN = ...................... gr/24 hrs.

CUESTIONARIO:1.- Con los datos obtenidos en la práctica , calcular el balance nitrogenado del paciente sabiendo que ingirió 8 gr de proteínas en 24 horas .2.- De donde proviene la creatinina?3.- A que se denomina uremia y que consecuencias trae?4.- A que se llama BUN y que representa?5.- Para que sirve la depuración de creatinina en orina de 24 horas?6.- Que mide el índice Creatinina Urinaria 24 hs/ Talla, y porqué.