Guida di consultazione dello strumento MiSeq FGx · 2016-11-26 · SOLO A USO DI RICERCA, FORENSE O PER PATERNITÀ DI PROPRIETÀ DI ILLUMINA N. codice 15050524 Rev. C ITA Febbraio

SOLO A USO DI RICERCA, FORENSE O PER PATERNITÀ

DI PROPRIETÀ DI ILLUMINAN. codice 15050524 Rev. C ITAFebbraio 2015

N. di catalogo SY-411-9001DOC

Guida di consultazione dellostrumento MiSeq FGx™

ii N. codice 15050524 Rev. C ITA

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SOLO A USO DI RICERCA, FORENSE O PER PATERNITÀ

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Leggere prima di usare questo prodottoQuesto prodotto, il suo utilizzo e disposizione, sono soggetti ai seguenti termini e condizioni. Se l'acquirente non concorda conquesti termini e condizioni, l'acquirente non è autorizzato da Illumina ad utilizzare questo prodotto e l'acquirente non deveutilizzare questo prodotto.

1 Definizioni. "PI per applicazioni specifiche" indica diritti di proprietà intellettuale controllati o di proprietà di Illuminache riguardano questo prodotto (e il suo utilizzo) solo in relazione ad ambito/i o applicazione/i specifiche. La PI perapplicazioni specifiche esclude ogni proprietà intellettuale controllata o di proprietà di Illumina relativa a elementi ocaratteristiche di questo prodotto (o del suo utilizzo) che siano comuni a tutte le possibili applicazioni e a tutti i possibiliambiti di utilizzo di questo prodotto (di seguito, la "PI base"). La PI per applicazioni specifiche e la PI base sonosottoinsiemi separati e non coincidenti, nemmeno in parte, di tutti i diritti di proprietà intellettuale posseduti o controllatida Illumina. A titolo esemplificativo ma non esaustivo, i diritti di proprietà intellettuale di Illumina per metodi diagnosticispecifici, per metodi forensi specifici, o per biomarcatori del DNA, sequenze o combinazioni di biomarcatori o sequenzespecifiche sono esempi di PI per applicazioni specifiche. "Materiali di consumo" indica i reagenti e i materiali diconsumo a marchio Illumina, destinati a essere utilizzati insieme e in combinazione con l'hardware. "Documentazione"indica il manuale per l'utente Illumina per questo prodotto, inclusi senza limitazioni, foglietti illustrativi e altradocumentazione di accompagnamento per questo prodotto o a cui il prodotto fa riferimento o nella confezione delprodotto in vigore alla data di spedizione del prodotto da Illumina. La documentazione include questo documento."Hardware" indica strumenti, accessori o periferiche Illumina. "Illumina" indica Illumina, Inc. o un'affiliata Illumina,come applicabile. "Prodotto" indica il prodotto che accompagna questo documento (ad esempio, hardware, materiali diconsumo o software). "Acquirente" è la persona o l'entità che acquisisce legittimamente e legalmente questo prodotto daIllumina o da un rivenditore autorizzato Illumina. "Software" indica il software con marchio Illumina, ad esempio,software operativo per l'hardware o software di analisi dei dati. Il software viene concesso in licenza e non venduto e puòessere soggetto a condizioni ulteriori indicate nel contratto di licenza per l'utente finale. "Specifiche" indica le specifichescritte da Illumina per questo prodotto, in vigore alla data di spedizione del prodotto medesimo da parte di Illumina.

2 Diritti per l'utilizzo a solo scopo di ricerca. In conformità con i presenti termini e condizioni e se non altrimenticoncordato per iscritto da un funzionario Illumina, all'acquirente viene concesso esclusivamente un diritto non esclusivo,non trasferibile, personale, che non può essere fatto oggetto di sublicenza, ai sensi della PI base Illumina, esistente alladata di spedizione di questo prodotto da parte di Illumina, a utilizzare unicamente questo prodotto presso l'impiantodell'acquirente a scopo di ricerca interna (il che comprende i servizi di ricerca forniti a terzi) e unicamente in conformitàcon la documentazione di questo prodotto, ma escludendo espressamente qualsiasi uso che (a) richiederebbe diritti ouna licenza da parte di Illumina per PI per applicazioni specifiche, (b) costituisca riutilizzo di un materiale di consumoutilizzato in precedenza, (c) costituisca disassemblaggio, reverse engineering, reverse compiling o reverse assembling diquesto prodotto, (d) costituisca separazione, estrazione o isolamento dei componenti di questo prodotto o altra analisi nonautorizzata del medesimo, (e) determini l'accesso o individui le modalità di funzionamento di questo prodotto, (f)costituisca utilizzo di reagenti/materiali di consumo non forniti da Illumina con l'hardware del medesimo (non applicabilese le specifiche o la documentazione indicano altrimenti) o (g) costituisce cessione a terzi o sublicenza del software, o di

Guida di consultazione dello strumentoMiSeqFGx iii

qualsiasi software di terzi. Il software, che venga fornito separatamente, installato o incorporato in un prodotto, vieneconcesso in licenza all'acquirente e non venduto. A eccezione di quanto espressamente indicato nella presente sezione,nessun diritto o licenza sui diritti di proprietà intellettuale di Illumina viene concessa, espressamente, implicitamente o inbase al principio di inopponibilità.

È esclusiva responsabilità dell'acquirente assicurarsi di disporre di tutti i diritti di proprietà intellettualenecessari per gli usi che intende fare di questo prodotto compresi, a titolo esemplificativo ma non esaustivo,diritti da terzi o diritti sulla PI per applicazioni specifiche. Illumina non garantisce in alcun modo che gli usispecifici previsti dall'acquirente non violino i diritti di proprietà intellettuale di terzi o la PI per applicazionispecifiche.

3 Disposizioni normative. Questo prodotto non è stato autorizzato o approvato da parte della FDA statunitense o diqualsiasi altro ente normativo nazionale o estero per qualsiasi uso specifico, di ricerca, commerciale, diagnostico odiverso. Questo prodotto è etichettato "Solo per l'utilizzo a scopo di ricerca". L'acquirente deve assicurarsi di disporredelle eventuali autorizzazioni di legge necessarie per gli usi previsti di questo prodotto.

4 Utilizzi non autorizzati. L'acquirente accetta quanto segue: (a) di utilizzare ogni materiale di consumo solo una volta e(b) di utilizzare esclusivamente materiali di consumo/reagenti Illumina in combinazione con l'hardware Illumina. Lelimitazioni di cui ai punti (a)-(b) non si applicano se la documentazione o le specifiche di questo prodotto indicanoaltrimenti. L'acquirente concorda di non intraprendere alcuna delle seguenti attività e di non autorizzare terzi a farlo: (i)disassemblare, eseguire il reverse engineering, il reverse compiling o il reverse assembling di questo prodotto, (ii)separare, estrarre o isolare componenti di questo prodotto o sottoporre questo prodotto o suoi componenti a qualsiasianalisi non espressamente autorizzata nella documentazione di questo prodotto, (iii) ottenere l'accesso o tentare dideterminare le modalità di funzionamento di questo prodotto o (iv) trasferire a terzi, o concedere in sublicenza, qualsiasisoftware come sopra definito, o qualsiasi software di terze parti. L'acquirente accetta inoltre che il contenuto e le modalitàdi funzionamento di questo prodotto sono di proprietà di Illumina e che questo prodotto include o incorpora segreticommerciali di Illumina. Le condizioni e le limitazioni incluse nei presenti termini e condizioni sono condizioni di venditanegoziate e, conseguentemente, controllano la vendita e l'utilizzo di questo prodotti da parte dell'acquirente.

5 Limitazione di responsabilità. NEI LIMITI CONSENTITI DALLA LEGGE, IN NESSUN CASO ILLUMINA O ISUOI FORNITORI POTRANNO ESSERE RITENUTI RESPONSABILI NEI CONFRONTI DELL’ACQUIRENTE ODI TERZI PER COSTI DI ACQUISIZIONE DI PRODOTTI O SERVIZI SOSTITUTIVI, LUCRO CESSANTE,PERDITA DI DATI O OPPORTUNITÀ COMMERCIALI, O PER DANNI INDIRETTI, SPECIALI, ACCIDENTALI,ESEMPLARI, CONSEGUENTI O PUNITIVI DI QUALSIASI TIPO DERIVANTI O COLLEGATI, A TITOLOESEMPLIFICATIVO MA NON ESAUSTIVO, CON LA VENDITA DI QUESTO PRODOTTO, IL SUO UTILIZZO,L’ADEMPIMENTO DI ILLUMINA AI SENSI DELLA PRESENTE O CON UNO O PIÙ DEI PRESENTI TERMINIE CONDIZIONI, QUALUNQUE NE SIA LA DERIVAZIONE O LA CAUSA E INDIPENDENTEMENTE DALTITOLO DI RESPONSABILITÀ (CONTRATTUALE, PER ILLECITO (INCLUSA LA NEGLIGENZA),RESPONSABILITÀ OGGETTIVA O ALTRO).

6 LA RESPONSABILITÀ TOTALE E COMPLESSIVA DI ILLUMINA NEI CONFRONTI DELL’ACQUIRENTE O DITERZI, DERIVANTE O IN CONNESSIONE CON I PRESENTI TERMINI E CONDIZIONI INCLUSI, A TITOLOESEMPLIFICATIVO MA NON ESAUSTIVO, QUESTO PRODOTTO (E IL SUO UTILIZZO) E L’ADEMPIMENTODI ILLUMINA AI SENSI DELLA PRESENTE, A TITOLO DI RESPONSABILITÀ CONTRATTUALE, ILLECITO(INCLUSA LA NEGLIGENZA), RESPONSABILITÀ OGGETTIVA O ALTRO, IN NESSUN CASO POTRÀSUPERARE L'IMPORTO CORRISPOSTO A ILLUMINA PER QUESTO PRODOTTO.

7 Limitazioni sulle garanzie fornite da Illumina. NEI LIMITI CONSENTITI DALLA LEGGE E IN CONFORMITÀCON LA GARANZIA ESPLICITA DEL PRODOTTO PREVISTA DAI PRESENTI TERMINI E CONDIZIONI,ILLUMINA NON FORNISCE (ED ESCLUDE ESPRESSAMENTE) QUALSIASI GARANZIA, ESPLICITA,IMPLICITA O DI LEGGE, IN RELAZIONE A QUESTO PRODOTTO COMPRESE, A TITOLOESEMPLIFICATIVO MA NON ESAUSTIVO, GARANZIE IMPLICITE DI COMMERCIABILITÀ, IDONEITÀ PERUN SCOPO SPECIFICO, NON VIOLAZIONE DI DIRITTI ALTRUI, O DERIVANTI DA ADEMPIMENTO,RAPPORTI COMMERCIALI, UTILIZZO O ATTIVITÀ COMMERCIALE. SENZA LIMITAZIONE DELLAGENERALITÀ DI QUANTO SOPRA, ILLUMINA ESCLUDE QUALSIASI DICHIARAZIONE O GARANZIA DIQUALSIVOGLIA TIPO IN RELAZIONE ALL’UTILITÀ DI QUESTO PRODOTTO PER L’IMPIEGO DA PARTEDELL'ACQUIRENTE.

8 Garanzia sul prodotto. Tutte le garanzie sono personali per l'acquirente e non possono essere trasferite o cedute a terzi,inclusi affiliati dell'acquirente medesimo. Tutte le garanzie sono relative a impianti specifici e non vengono trasferite incaso di spostamento del prodotto ad altro impianto dell'acquirente, a meno che non sia Illumina a predisporre talespostamento.a Garanzia sui materiali di consumo. Illumina garantisce che i materiali di consumo, diversi da quelli personalizzati,

saranno conformi alle relative specifiche, fino a (i) 3 mesi dalla data di spedizione da parte di Illumina o (ii) fino alladata di scadenza o al termine del periodo di validità indicato sul materiale di consumo da Illumina, se successivo;ma in ogni caso non oltre 12 mesi dalla data di spedizione. Per quanto riguarda i materiali di consumo personalizzati(vale a dire, confezionati in base a specifiche o indicazioni dell'acquirente o forniti a Illumina da o per contodell'acquirente), Illumina garantisce esclusivamente che i materiali di consumo personalizzati saranno prodotti etestati in conformità con i processi standard di controllo qualità e produzione di Illumina. Illumina non garantisceche i materiali consumabili personalizzati funzioneranno come previsto dall'acquirente o per gli usi da lui previsti.

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b Garanzia sull'hardware. Illumina garantisce che l'hardware, diverso dai componenti aggiornati, sarà conforme allerelative specifiche, per un periodo di 12 mesi dalla data di spedizione da parte di Illumina, a meno che non includal'installazione a opera di Illumina: in tal caso, il periodo di garanzia decorrerà dalla data di installazione o dal 30°giorno successivo alla data di consegna, se precedente (di seguito la "Garanzia hardware base"). Per "componentiaggiornati" si intendono componenti, modifiche o miglioramenti apportati da Illumina all'hardware precedentementeacquisito dall'acquirente. Illumina garantisce che i componenti aggiornati saranno conformi alle relative specifiche perun periodo di 90 giorni dalla data di installazione I componenti aggiornati non estendono la garanzia dell'hardware, ameno che l'aggiornamento non sia stato eseguito da illumina presso i propri stabilimenti, nel qual caso all'hardwareaggiornato spedito all'acquirente si applicherà la garanzia hardware di base.

c Esclusioni dalla garanzia. Le garanzie di cui sopra non si applicano qualora la mancata conformità sia dovuta a: (i)abuso, uso improprio, negligenza, colpa, incidente, conservazione inadeguata o uso contrario alla documentazione oalle specifiche, (ii) movimentazione, installazione, manutenzione o riparazione impropria (a meno che eseguita dapersonale Illumina), (iii) modifiche non autorizzate, (iv) eventi di forza maggiore o (v) utilizzo con un articolo di terzinon fornito da Illumina (a meno che la documentazione o le specifiche del prodotto indichino espressamente talearticolo come adatto per l'utilizzo con il prodotto).

d Procedure per l'applicazione della garanzia. A scopo di idoneità in relazione alla riparazione o alla sostituzione ingaranzia, l'acquirente deve (i) rivolgersi prontamente al Servizio assistenza Illumina per segnalare la non conformità,(ii) fornire la propria collaborazione a Illumina allo scopo di confermare o diagnosticare la non conformità e (iii)restituire questo prodotto a Illumina, anticipando le spese di trasporto, in base alle istruzioni di Illumina o, seconcordato tra le parti, consentire al riparatore autorizzato di Illumina di accedere al prodotto, al fine di confermare lanon conformità e procedere alla riparazione.

e Esclusività della tutela in garanzia. Illumina provvederà, a sua discrezione, a riparare o a sostituire il prodottonon conforme del quale abbia confermato la copertura in garanzia. Ai materiali di consumo riparati o sostituiti siapplica una garanzia di 30 giorni. L'hardware può essere riparato o sostituito con hardware o componentifunzionalmente equivalenti, ricondizionati o nuovi (anche se solo un solo componente dell'hardware sia nonconforme). Qualora l'hardware venga sostituito interamente, il periodo di garanzia per la sostituzione è il periodo piùbreve tra i 90 giorni successivi alla data di spedizione e la durata restante della garanzia hardware originale. Qualoravenga sostituito o riparato unicamente un componente, il periodo di garanzia per il suddetto componente è il periodoche termini più tardi tra i 90 giorni successivi alla data di spedizione e la durata restante della garanzia hardwareoriginale. Quanto sopra esaurisce i mezzi di tutela a disposizione dell'acquirente e gli obblighi di Illumina ai sensidella garanzia qui prevista.

f Articoli di terzi e garanzia. Illumina non ha alcun obbligo di garanzia in relazione a qualsiasi articolo provenienteda terzi e fornito all'acquirente ai sensi della presente. Sono articoli di terzi quelli riportanti marchio o etichetta con ilnome di un terzo. L'eventuale garanzia per gli articoli di terzi è fornita dal produttore originale. Previa richiestascritta, Illumina tenterà di passare eventuali garanzie di tale tipo all'acquirente.

9 Indennizzo.a Indennizzo per violazione di diritti di terzi da parte di Illumina. In conformità ai presenti termini e condizioni

comprese, a titolo esemplificato ma non esaustivo, le esclusioni agli obblighi di indennizzo di Illumina (sezione 9(b)di seguito) e le condizioni degli obblighi di indennizzo (sezione 9(d) di seguito), Illumina sarà tenuto (i) a difendere,manlevare e tenere l'acquirente indenne da ogni pretesa o azione di terzi basata sulla presunta violazione di diritti diproprietà intellettuale validi e applicabili di terzi da parte di questo prodotto, quando utilizzato a scopi di ricerca, inconformità con i presenti termini e condizioni, e in conformità con la documentazione e le specifiche relative e (ii) asostenere i costi di qualsivoglia transazione, sentenza definitiva e spesa (comprese le ragionevoli spese legali) chel'acquirente debba sostenere in relazione a tale pretesa violazione. Qualora questo prodotto o parte di esso divenga opossa diventare secondo l'opinione di Illumina, oggetto di azione per violazione di diritti di terzi, sarà facoltà diIllumina, a sua discrezione: (A) di procurare all'acquirente il diritto di continuare a utilizzare questo prodotto, (B) dimodificare o sostituire questo prodotto con un sostituto sostanzialmente equivalente che non configuri violazione o(C) di richiedere la restituzione di questo prodotto e porre fine ai diritti, alla licenza e a ogni altra autorizzazionefornita all'acquirente in relazione a esso, nonché a rimborsare all'acquirente il valore (come indicato nei documentiufficiali dell'acquirente) del prodotto restituito, tenendo conto dell'ammortamento maturato al momento dellarestituzione; considerando che nessun rimborso verrà effettuato per i materiali di consumo usati o scaduti. Lapresente sezione esaurisce la responsabilità di Illumina per qualsiasi violazione di diritti di proprietà intellettuale diterzi.

b Esclusioni agli obblighi di indennizzo di Illumina. Illumina ha l'obbligo di difendere, indennizzare e tenereindenne l'acquirente da qualsiasi pretesa violazione di diritti di terzi da parte di Illumina, nella misura in cui essaderivi da: (i) l'utilizzo di questo prodotto in qualsiasi modo o per qualsiasi scopo non compreso nell'ambitodell'utilizzo per scopi di ricerca, (ii) l'utilizzo di questo prodotto in modo non conforme alle sue caratteristichetecniche, alla documentazione, ai diritti espressamente concessi all'acquirente nell'ambito della presente o inviolazione, da parte dell'acquirente, dei presenti termini e condizioni, (iii) l'utilizzo di questo prodotto incombinazione con altri prodotti, materiali o servizi non forniti da Illumina, (iv) l'utilizzo di questo prodotto pereseguire saggi o altri processi non forniti da Illumina o (v) la conformità di Illumina con specifiche o istruzioni perquesto prodotto fornite da o per conto dell'acquirente (ciascuno dei punti da (i) a (v) viene di seguito definito comeuna "Pretesa oggetto di esclusione").

c Indennizzo da parte dell'acquirente. L'acquirente dovrà difendere, manlevare e tenere indenne Illumina, i suoiaffiliati, i loro collaboratori non affiliati e partner di sviluppo che abbiano contribuito allo sviluppo di questoprodotto, nonché i rispettivi funzionari, dirigenti, rappresentanti e dipendenti, da qualsiasi pretesa, responsabilità,

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danno, multa, penale, azione legale e perdita di ogni e qualsivoglia tipo comprese, a titolo esemplificativo ma nonesaustivo, azioni per danni a persone o decesso, e violazioni di diritti di proprietà intellettuale di terzi, derivanti,relativi o che siano originati da (i) violazione da parte dell'acquirente di uno dei presenti termini e condizioni, (ii)utilizzo di questo prodotto da parte dell'acquirente al di fuori dell'ambito di utilizzo per scopi di ricerca, (iii) qualsiasiutilizzo di questo prodotto non conforme alle specifiche o alla documentazione relativa o (iv) qualsiasi pretesaoggetto di esclusione.

d Condizioni degli obblighi di indennizzo. Gli obblighi di indennizzo delle parti sono condizionali al fatto che laparte che richiede l'indennizzo (i) informi tempestivamente la controparte, in forma scritta, della pretesa o dell'azionerelativa, (ii) conferisca alla controparte controllo e autorità esclusivi in relazione alla difesa e alla transazione di talepretesa o azione, (iii) non ammetta la violazione di qualsivoglia diritto di proprietà intellettuale altrui senza ilpreventivo consenso scritto della controparte, (iv) non concluda alcuna transazione o compromesso relativo aqualsivoglia pretesa o azione senza il preventivo consenso scritto della controparte e infine (v) fornisca ragionevoleassistenza alla controparte nella difesa della pretesa o azione; a condizione che la parte indennizzata venga rimborsatadalla controparte per le ragionevoli spese effettivamente sostenute per fornire tale assistenza.

e Articoli di terzi e indennizzo. Illumina non ha alcun obbligo di indennizzo in relazione a qualsiasi articoloproveniente da terzi e fornito all'acquirente. Sono articoli di terzi quelli riportanti marchio o etichetta con il nome diun terzo. Gli eventuali diritti di indennizzo dell'acquirente in relazione ad articoli di terzi saranno quelli previsti aisensi degli obblighi di indennizzo del produttore o del licenziante originale. Previa richiesta scritta, Illumina tenteràdi passare eventuali garanzie di tale tipo all'acquirente.

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Crono

logiarevisio

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Cronologia revisioni

N. codice Revisione Data Descrizione della modifica

15050524_ITA C Febbraio2015

Corretti errori di formattazione.

15050524 B Gennaio2015

Disponibile solo in inglese.Aggiornato il nome del kit di reagenti da MiSeqForenSeq Sequencing Kit a MiSeq FGx Reagent Kit.

15050524 A Ottobre2014

Disponibile solo in inglese.Versione iniziale.

viii N. codice 15050524 Rev. C ITA

Sommario

Cronologia revisioni viiSommario ix

Capitolo 1 Informazioni preliminari 1Uso previsto 2Componenti 3Avvio di MiSeq FGx 6Materiali di consumo necessari 7

Capitolo 2 MiSeq FGx Software 9Introduzione 10MiSeq FGx Control Software 11Opzioni di software di analisi per le corse RUO 36

Capitolo 3 Esecuzione di una corsa 39Introduzione 40Flusso di lavoro di MiSeq FGx 41Preparazione della cartuccia di reagenti 43Accesso e selezione del tipo di corsa 46Pulizia della cella a flusso 47Caricamento della cella a flusso 49Caricamento dei reagenti 51Avvio della corsa 53Monitoraggio della corsa 54

Capitolo 4 Procedure di manutenzione 55Introduzione 56Esecuzione di un lavaggio post-corsa 57Esecuzione di un lavaggio di manutenzione 60Esecuzione di un lavaggio di standby 63Spegnimento dello strumento 66

Capitolo 5 Risoluzione dei problemi 67Introduzione 68Risoluzione degli errori d'impostazione della corsa 69Risoluzione degli errori di lettura dell'etichetta RFID 70Evitare il riavvio durante una corsa 72Risoluzione dei problemi per l'errore della portata 73Esecuzione di un test volume 74Misura dei volumi di lavaggio previsti 76

Indice 77

Assistenza tecnica 79

Guida di consultazione dello strumentoMiSeqFGx ix

x N. codice 15050524 Rev. C ITA

Capitolo1

Guida di consultazione dello strumentoMiSeqFGx 1

Capitolo 1 Informazioni preliminari

Informazionipreliminari

Uso previsto 2Componenti 3Avvio di MiSeq FGx 6Materiali di consumo necessari 7

Inform

azioniprelim

inari

2 N. codice 15050524 Rev. C ITA

Usoprevisto

MiSeq FGx è uno strumento di sequenziamento che misura i segnali fluorescenti dinucleotidi marcati mediante l'uso di reagenti e celle a flusso specifici per lo strumento,hardware di imaging e software per l'analisi dei dati. MiSeq FGx, come parte del sistemaMiSeq Forensic Genomics, è previsto per il sequenziamento mirato di DNA per casi forensi,creazione di database e altre applicazioni di identificazione umana. MiSeq FGx fornisceinoltre una modalità solo a uso di ricerca (RUO). La modalità RUO funziona con tutti i kitdi preparazione delle librerie RUO Illumina compatibili con MiSeq.

Componenti


Componenti

MiSeq FGx è costituito dai seguenti componenti visibili dall'esterno:

A Scomparto della cella a flusso: contiene il piano portacelle che ospita la cella a flussodurante l'esecuzione della corsa. I motori del piano portacelle fanno fuoriuscire il pianodal modulo ottica incorporato per permettere il caricamento della cella a flusso e ilsuccessivo riposizionamento in sede all'avvio della corsa.

B Modulo ottica incorporato: contiene i componenti ottici che consentono l'imaging dellacella a flusso.

C Barra di stato: utilizza tre colori per indicare lo stato dello strumento. Il blu indica che lostrumento è in funzione, l'arancione indica la necessità di un intervento da partedell'utente e il verde indica che lo strumento è pronto a iniziare la corsa successiva.

D Monitor touch screen: permette la configurazione integrata sullo strumento el'impostazione della corsa utilizzando l'interfaccia software.

E Porta USB esterna: facilita il trasferimento dei file e dei dati al computer dello strumentoattraverso il monitor touch screen.

F Scomparto reagenti: contiene i reagenti mantenendoli alle temperature adatte, lesoluzioni di lavaggio e il flacone degli scarti. Il dispositivo magnetico chiude lo sportellodello scomparto reagenti.

L'interfaccia di MiSeq FGx guida gli utenti lungo la procedura di impostazione della corsa,eseguita mediante il touch screen.

Inform

azioniprelim

inari


Scomparto della cella a flusso

A Piano portacelleB Sportello dello scomparto della cella a flussoC Coperchio a scatto della cella a flussoD Cella a flussoE Pulsante di sblocco del coperchio a scatto della cella a flusso

Lo scomparto della cella a flusso contiene il piano portacelle, la stazione termica e leconnessioni della fluidica alla cella a flusso. Il piano portacelle ospita la cella a flusso e ilcoperchio a scatto fissa e tiene in posizione la cella a flusso. Quando il coperchio a scattodella cella a flusso è chiuso, due perni accanto alla cerniera del coperchio a scattoposizionano automaticamente la cella a flusso.La stazione termica, situata sotto il piano portacelle, controlla le variazioni di temperaturadella cella a flusso, necessarie per la generazione di cluster e il sequenziamento.

Cella a flusso

A Porta di uscitaB Area di imagingC Porta di ingresso

La cella a flusso MiSeq FGx è un substrato su vetro monouso su cui vengono generati icluster e viene eseguita la reazione di sequenziamento.I reagenti entrano nella cella a flusso tramite la porta di ingresso, attraversano l'area diimaging a singola corsia ed escono dalla porta di uscita. Gli scarti provenienti dalla cella aflusso vengono raccolti nel flacone degli scarti.Durante la corsa di sequenziamento, la singola corsia è sottoposta a imaging in base apiccole aree di imaging denominate tile.

Componenti


Scomparto reagenti

A Vano refrigerato per i reagentiB Maniglia del pettine di aspirazione (sollevata nella figura)C Flacone della soluzione SBS (PR2)D Flacone degli scartiE Cartuccia di reagenti MiSeq FGx

Lo scomparto reagenti comprende un vano refrigerato per i reagenti e un vano per ilflacone della soluzione SBS (PR2) e il flacone degli scarti.Durante la corsa, il vano refrigerato può contenere una cartuccia di reagenti monouso.Durante il lavaggio dello strumento, il vano refrigerato può contenere il vassoio dilavaggio. Il software abbassa automaticamente i pescanti in ciascun serbatoio dellacartuccia di reagenti al momento opportuno durante la corsa, in base alla procedura inesecuzione.A destra del vano refrigerato sono presenti due alloggiamenti appositamente conformatiper accogliere rispettivamente il flacone della soluzione SBS (PR2) e il flacone degli scarti.La maniglia del pettine di aspirazione blocca in posizione i flaconi e abbassa in ciascunflacone il pescante appropriato.I reagenti vengono aspirati dai pescanti, scorrono nei tubi della fluidica e infine giungonoalla cella a flusso. Il reagente di scarto viene convogliato nel flacone degli scarti durantel'intero processo.

Inform

azioniprelim

inari


AvviodiMiSeqFGx

NOTAIllumina raccomanda di lasciare lo strumento sempre acceso. Tuttavia, se lo strumento deveessere spento, attenersi alla procedura descritta in Spegnimento dello strumento a pagina 66.Attendere almeno 60 secondi prima di riaccenderlo portando l'interruttore di alimentazionesu ON.

1 Se MiSeq FGx non è già acceso, portarsi sul lato destro dello strumento per individuarel'interruttore di alimentazione sul pannello posteriore. L'interruttore è situatonell'angolo in basso al di sopra del cavo di alimentazione.

Figura 1 Posizione dell'interruttore di alimentazione

2 Portare l'interruttore di alimentazione in posizione ON (Acceso). Il computer integratoallo strumento si avvia.

3 Accedere al sistema operativo.Attendere che il sistema operativo completi il caricamento. MiSeq FGx Control Softwareviene avviato e inizializza lo strumento automaticamente.

4 Al termine della fase di inizializzazione, eseguire il login usando il nome utente epassword per ForenSeq Universal Analysis Software.Figura 2 Schermata di login

5 Fare clic su Next. Si apre la schermata Welcome (Benvenuto). Vedere Schermata Welcome(Benvenuto) a pagina 11.

Materialid

iconsum

onecessari


Materiali di consumonecessari

Materiali di consumo per il sequenziamentoI materiali di consumo per il sequenziamento necessari per il funzionamento di MiSeq FGxsono forniti separatamente.

Materiali di consumo forniti dall'utentePrima di avviare una corsa di sequenziamento, accertarsi di avere a disposizione iseguenti materiali di consumo forniti dall'utente.

Materiale di consumo Fornitore ScopoSalviettine imbevute di alcolisopropilico al 70%oppureEtanolo al 70%

VWR, n. di catalogo95041-714*

Fornitore generico

Pulizia del vano portacella

Guanti monouso, privi dipolvere

Fornitore generico Uso generico

Panno da laboratorio abassissimo rilascio diparticelle


Pulizia del piano portacelle edella capsula in alluminio checopre il serbatoio dicaricamento dei campioni

Carta pulente per lenti,10 x 15 cm ca.


Pulizia della cella a flusso

Provette permicrocentrifuga

Fornitore generico Denaturazione e diluizionedelle librerie di campioni edel DNA del campione dicontrollo PhiX

Ipoclorito di sodio Fornitore generico Lavaggio dello strumentoTween 20 Sigma-Aldrich, n. di

catalogo P7949Lavaggio dello strumento

Pinzette di plastica conpunta quadrata (opzionale)

McMaster-Carr, n. dicatalogo 7003A22*

Estrazione della cella a flussodal relativo contenitore

Acqua, priva di nucleasi Fornitore generico Lavaggio dello strumento

* o equivalente

Linee guida per l'acqua priva di nucleasiPer eseguire le procedure dello strumento usare sempre acqua priva di nucleasi. Non usaremai acqua di rubinetto o acqua deionizzata. A titolo di esempio, è accettabile quanto segue:} Illumina PW1} Acqua pari a 18 MΩ (Megaohm)} Acqua Milli-Q} Acqua Super-Q} Acqua sterile per biologia molecolare


Capitolo2


Capitolo 2 MiSeq FGx Software

MiSeqFGxSoftware

Introduzione 10MiSeq FGx Control Software 11Opzioni di software di analisi per le corse RUO 36

MiSeq

FGxSoftware


Introduzione

Il software descritto nel presente capitolo è utilizzato per configurare, utilizzare eanalizzare i dati ottenuti da MiSeq FGx.} MiSeq FGx Control Software: controlla il funzionamento dello strumento, compresevarie impostazioni di configurazione. Il software è installato e opera sullo strumento.VedereMiSeq FGx Control Software a pagina 11.

} Real-Time Analysis (RTA): esegue l'analisi delle immagini e l'identificazione delle basie assegna un punteggio qualitativo a ciascuna base per ciascun ciclo. Le immaginivengono temporaneamente memorizzate nella cartella della corsa per essere analizzateda RTA e sono automaticamente cancellate al termine dell'analisi RTA. Il software èinstallato e opera sullo strumento.

} ForenSeq Universal Analysis Software: esegue l'autenticazione utente e l'analisi comedemultiplex, allineamento, identificazione delle varianti e generazione di report. Lefunzioni specifiche supportate variano in base all'applicazione. Questo software è nonè installato sullo strumento ma su un server indipendente. L'output viene visualizzatomediante un browser Web. Per informazioni sull'analisi dei dati, vedere la Guida perForenSeq Universal Analysis Software (n. codice 15053876).

} Per le corse RUO, BaseSpace e MiSeq Reporter sono disponibili per eseguire ulteriorianalisi. Vedere Opzioni di software di analisi per le corse RUO a pagina 36.

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MiSeqFGxControl Software

Durante la corsa, MiSeq FGx Control Software aziona il piano portacelle, eroga i reagenti,controlla le temperature della cella a flusso e acquisisce le immagini dei cluster sulla cellaa flusso. Il software di controllo esegue la corsa in base ai parametri specificati in ForenSeqUniversal Analysis Software.

SchermataWelcome (Benvenuto)All'avvio del software, l'interfaccia di MiSeq FGx Control Software si apre sulla schermataWelcome (Benvenuto).

Figura 3 Schermata Welcome (Benvenuto)

} Sequence (Sequenziamento): questa opzione apre una serie di schermate che guidanol'utente nell'impostazione della corsa. Vedere Schermate per l'impostazione della corsaa pagina 21.

} Perform Wash (Esecuzione lavaggio): fornisce opzioni per avviare i lavaggi dellostrumento seguenti: lavaggio di manutenzione, lavaggio di standby o lavaggio post-corsa. Vedere Schermata Perform Wash (Esecuzione lavaggio) a pagina 13.

} Manage Files (Gestione file): questa opzione consente di accedere ai comandi perspostare, caricare o eliminare i file sul computer dello strumento. Vedere SchermataManage Files (Gestione file) a pagina 14.

} Run Options (Opzioni corsa): consente di accedere alle opzioni per il lavaggio post-corsa, per cambiare i percorsi predefiniti per le cartelle dei dati e per specificare leprocedure per la notifica email. Vedere Schermata Run Options (Opzioni corsa)a pagina 16.

} Manage Instrument (Gestione strumento): consente di accedere a opzioni per andarealle impostazioni del sistema, eseguire una verifica del sistema, aggiornaremanualmente il software e riavviare o spegnere lo strumento. Vedere Schermata ManageInstrument (Gestione strumento) a pagina 19.

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Indicatori di attivitàNell'angolo inferiore destro di ciascuna schermata dell'interfaccia è presente una serie diicone. Ciascuna icona è un indicatore che segnala all'utente quale attività sta eseguendo lostrumento.

Figura 4 Indicatori di attività

Da sinistra a destra, gli indicatori segnalano le seguenti attività:} Spostamento del piano Y} Spostamento del piano Z} Attivazione della funzionalità dell'elettronica} Uso della videocamera} Pompaggio nel sistema di fluidica

Indicatori di rilevamentoAlla base di ciascuna schermata dell'interfaccia si trovano quattro indicatori di rilevamentoche rappresentano lo stato di un componente del sistema.

Figura 5 Indicatori di rilevamento

Da sinistra a destra, gli indicatori di rilevamento segnalano lo stato dei seguenticomponenti:} Sportello dello scomparto della cella a flusso in posizione chiusa o aperta} Temperatura del vano refrigerato per i reagenti in °C} Temperatura della cella a flusso in °C} Stato della connessione del server

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Icone di statoNell'angolo superiore destro della schermata Welcome (Benvenuto) è visualizzata un'iconadi stato che segnala eventuali cambiamenti delle condizioni operative durantel'impostazione o l'esecuzione della corsa.

Icona distato

Nome dello stato Descrizione

Stato OK Nessun cambiamento. Le condizioni del sistema sononormali.

Attenzione Informazioni importanti. Si raccomanda un intervento.

Avvertenza Le avvertenze non interrompono una corsa. Tuttavia, alcuneavvertenze richiedono un intervento prima di poterprocedere.

Errore In genere gli errori provocano l'arresto di una corsa, chepotrà continuare solo dopo un intervento dell'utente.

Quando si verifica un cambiamento nelle condizioni operative, l'icona cambia per mostrarel'immagine associata e lampeggia per avvertire l'utente. In tal caso, selezionare l'icona peraprire la finestra di stato contenente una descrizione generale della condizione segnalata.} Selezionare le voci elencate nella finestra per visualizzare una descrizione dettagliatadella condizione verificatasi ed eventualmente le istruzioni per risolvere il problema.

} Selezionare Acknowledge (Accetta) per confermare di aver letto il messaggio e Close(Chiudi) per chiudere la finestra di dialogo.

I messaggi nella finestra di stato possono essere filtrati selezionando le icone lungo ilmargine superiore della finestra. Selezionare un'icona per mostrare/nascondere lacondizione associata.

Schermata PerformWash (Esecuzione lavaggio)La schermata Perform Wash (Esecuzione lavaggio) permette all'utente di eseguire i seguentitipi di lavaggio e di vedere la data del lavaggio più recente:} Maintenance Wash (Lavaggio di manutenzione): consiste in tre cicli consecutivi dilavaggio che puliscono a fondo il sistema. Eseguire un lavaggio di manutenzione comeminimo ogni 30 giorni. Vedere Procedura a pagina 60.

} Standby Wash (Lavaggio di standby): prepara adeguatamente i tubi della fluidica peril passaggio a un stato di inattività e consiste di due cicli consecutivi di lavaggio.Eseguire un lavaggio di standby se lo strumento sarà inattivo per un periodo fino asette giorni. Vedere Esecuzione di un lavaggio di standby a pagina 63.Quando lo strumento è stato posto nello stato inattivo, deve essere eseguito unlavaggio di manutenzione prima di poter avviare una corsa di sequenziamento.

} Post-Run Wash (Lavaggio post-corsa): rappresenta il lavaggio standard dellostrumento eseguito tra le corse di sequenziamento e consiste di un solo ciclo dilavaggio. Per eseguire un lavaggio post-corsa in un momento che non sia subito dopouna corsa, utilizzare il comando sulla schermata Perform Wash (Esecuzione lavaggio)per avviare il lavaggio.MiSeq FGx può essere configurato per eseguire un lavaggio di manutenzione, piuttostoche un lavaggio post-corsa, tra le corse. Per maggiori informazioni, vedere SchermataRun Options (Opzioni corsa) a pagina 16.

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Figura 6 Schermata Perform Wash (Esecuzione lavaggio)

La schermata Perform Wash (Esecuzione lavaggio) include anche un comando che sollevai pescanti, in questo modo la cartuccia di reagenti può essere rimossa dallo strumento incaso di un errore o di un'interruzione imprevista della corsa.

ATTENZIONEChiudere sempre lo sportello del vano refrigerato per i reagenti dopo aver caricato il vassoiodi lavaggio e prima di avviare un lavaggio. Questo impedisce eventuali lesioni se le manisono nel percorso dei pescanti durante la fase di abbassamento.

Schermata Manage Files (Gestione file)Utilizzare le funzioni della schermata Manage Files (Gestione file) per spostare, caricare oeliminare i file sul computer dello strumento. La schermata presenta sei schede: Runs,Sample Sheets, Manifests, Genomes, Recipes e Bundle Logs (Corse, Fogli campioni, Filemanifest, Genomi, Ricette e Raggruppa registri).

Figura 7 Schermata Manage Files (Gestione file)

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Opzioni Manage Files (Gestione file)Da qualsiasi scheda della schermata Manage Files (Gestione file), selezionare Browse(Sfoglia) per visualizzare qualsiasi file accessibile allo strumento.

Scheda Caratteristiche Utilizzo

Runs (Corse) Delete (Elimina) o Move(Sposta)

Per uso forense o modalità RUO.

Sample Sheets (Foglicampioni)

Delete (Elimina), Upload(Carica) o Rename(Rinomina)

Per la modalità RUO.

Manifests (Filemanifest)

Delete (Elimina) o Upload(Carica)


Genomes (Genomi) Delete (Elimina) o Upload(Carica)


Recipes (Ricette) Delete (Elimina) o Upload(Carica)


Bundle logs(Raggruppa registri)

Bundle Logs (Raggrupparegistri)

Solo per la risoluzione dei problemi daparte dell'Assistenza tecnica Illumina.

* I file manifest, genoma e ricetta ForenSeq sono pre-caricati per i kit forensi e non dovrebbero esseremodificati.

} Delete (Elimina): selezionare la casella di controllo accanto al file o alla cartellaelencata e poi selezionare Delete (Elimina). La funzione di eliminazione è disponibilesu tutte le schede. Per eliminare i file della corsa è necessario avere il livello di accessoutente Admin (Amministratore).

} Move (Sposta): disponibile solo per le cartelle delle corse. Selezionare la casella dicontrollo accanto alla cartella e poi scegliereMove (Sposta) e scegliere una posizioneappropriata. La funzioneMove (Sposta) copia la cartella della corsa nella nuovaposizione indicata e poi la elimina dalla posizione precedente.

} Select All Files (Seleziona tutti i file): selezionare la casella di controllo a sinistra delpulsante Delete (Elimina), quindi scegliere l'azione da eseguire, Delete (Elimina) oMove (Sposta). Delete (Elimina) o Move (Sposta). L'azione scelta viene quindi applicataa tutti i file o le cartelle.

} Upload Files (Carica file): se MiSeq FGx non è connesso a una rete, utilizzare questafunzione per caricare i file dei fogli campione nel computer dello strumento da undispositivo USB. Selezionare Upload (Carica) e cercare nel dispositivo USB i filedesiderati dove si trova il foglio campioni. Il file viene quindi caricato nella cartellaindicata nel campo Directory.

} Rename (Rinomina): selezionare la casella di controllo accanto al file del fogliocampioni e poi scegliere Rename (Rinomina). Utilizzare la tastiera sullo schermo perassegnare un altro nome al foglio campioni.

} Bundle Logs (Raggruppa registri): questo comando raggruppa e comprime in formatozip gruppi di file che verranno utilizzati dall'Assistenza tecnica Illumina per larisoluzione dei problemi.

.

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Schermata RunOptions (Opzioni corsa)La schermata Run Options (Opzioni corsa) presenta tre schede che permettono dispecificare le impostazioni predefinite per una corsa: Run Settings, Folder Settings e EmailNotifications (Impostazioni corsa, Impostazioni cartelle e Notifiche email).

Figura 8 Scheda Run Settings (Impostazioni corsa) sulla schermata Run Options (Opzioni corsa)

Scheda Run Settings (Impostazioni corsa)} Post-Run Wash Option (Opzione lavaggio post-corsa): dopo ciascuna corsa èobbligatorio un lavaggio dello strumento. Il software non procederà alle fasid'impostazione della corsa per una corsa successiva fino a quando non viene eseguitoun lavaggio. Tramite questa opzione è possibile impostare, come impostazionepredefinita, il tipo di lavaggio da eseguire dopo una corsa. Un lavaggio post-corsa duracirca 30 minuti e un lavaggio di manutenzione circa un'ora.

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Scheda Folder Settings (Impostazioni cartelle)MiSeq FGx richiede l'accesso a diversi tipi di file archiviati nelle cartelle sulla rete locale osul computer dello strumento. Le opzioni della scheda Folder Settings (Impostazionicartelle) indicano a MiSeq FGx la posizione delle cartelle.

Figura 9 Scheda Folder Settings (Impostazioni cartelle)

} Recipes (Ricette): le ricette personalizzate non sono supportate per i kit ForenSeq.} Sample Sheets (Fogli campioni): imposta il percorso predefinito per le informazioni suicampioni a ForenSeq Universal Analysis Software. Le informazioni sui campioni sonocreate prima della preparazione della libreria e contengono i parametri per la corsa.

} Manifests (File manifest): la maggior parte dei kit ForenSeq utilizza i file manifestprecaricati.

} MiSeqFGxOutput (Output di MiSeq): imposta il percorso predefinito per i file di outputdell'analisi. Illumina consiglia di cambiare il percorso predefinito della cartella dioutput modificandolo in un percorso di rete per la condivisione, l'archiviazione dilungo termine.

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Scheda Email Notifications (Notifiche email)MiSeq FGx può essere configurato per ricevere una notifica email al termine dell'analisiRTA, al termine dell'analisi di ForenSeq Universal Analysis Software o quando si verificaun errore critico nel software del sistema MiSeq FGx. Le notifiche email sono disponibilisolo se lo strumento è collegato a una rete con accesso a Internet.

Figura 10 Scheda Email Notifications (Notifiche email)

} Local SMTP email server address (Indirizzo locale server email SMTP): utilizzare latastiera sullo schermo per inserire l'indirizzo del server locale email SMTP. Senecessario, per queste informazioni rivolgersi all'amministratore della propriastruttura.

} Sender email address (Indirizzo email del mittente): utilizzare la tastiera sulloschermo per inserire l'indirizzo email del mittente. Può essere l'indirizzo emaildell'utente Admin (Amministratore) o un altro indirizzo specificato per l'invio dellenotifiche email. L'indirizzo email del mittente deve obbligatoriamente avere lo stessonome di dominio del server email.

} Recipient addresses (Indirizzi destinatari): utilizzare la tastiera sullo schermo perinserire gli indirizzi email di ciascun destinatario che deve ricevere le notifiche.Separare ciascun indirizzo email mediante una virgola. Selezionare Test (Test): perinviare un messaggio email di test ai destinatari delle notifiche.

} Notify via email when (Notificare via email quando): selezionare la corrispondentecasella di controllo per ciascuno degli eventi della corsa che innesca una notifica.

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Schermata Manage Instrument (Gestione strumento)La schermata Manage Instrument (Gestione strumento) contiene i comandi per leimpostazioni di sistema, la risoluzione dei problemi, l'aggiornamento manuale delsoftware, il riavvio o l'arresto del software dello strumento.

Figura 11 Schermata Manage Instrument (Gestione strumento)

} System Settings (Impostazioni di sistema): consente di accedere alle opzioni permodificare l'indirizzo IP, il nome del computer o il dominio. Vedere Schermata SystemSettings (Impostazioni di sistema) a pagina 20.

} System Check (Verifica sistema): fornisce opzioni di risoluzione dei problemi per laverifica dello stato di funzionamento dei componenti del sistema. Vedere SchermataSystem Check (Verifica sistema) a pagina 20.

} Manual Update (Aggiornamento manuale): fornisce l'opzione per aggiornaremanualmente il software sul computer dello strumento. Vedere Schermata ManualUpdate (Aggiornamento manuale) a pagina 21.

} Reboot (Riavvia): consente di riavviare in modo sicuro il software di sistema, senecessario per la risoluzione dei problemi. Non è necessario riavviare periodicamenteil software come parte della manutenzione regolare.

} Shut Down (Spegnimento): consente di spegnere il software di controllo e Windows sulcomputer dello strumento. Vedere Spegnimento dello strumento a pagina 66.

} Minimize to Windows (Ridurre a Windows): fornisce un accesso rapido al sistemaoperativo dello strumento e alle cartelle sul computer dello strumento quando si staeseguendo MiSeq FGx in modalità "kiosk" piuttosto che in modalità Windows.Per utilizzare questa funzione è necessario disporre del livello di accesso utente Admin(Amministratore) o SuperUser (Utente con privilegi avanzati).

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Schermata System Settings (Impostazioni di sistema)Le impostazioni di sistema vengono normalmente configurate all'installazione inizialequando lo strumento è avviato per la prima volta. Se è necessario modificare leimpostazioni a causa di una modifica alla rete o al laboratorio, usare la funzione SystemSettings (Impostazioni di sistema).

Figura 12 System Settings (Impostazioni di sistema)

Rivolgersi all'amministratore della struttura per informazioni relative alle impostazioni direte da inserire.

Schermata System Check (Verifica sistema)La funzione System Check (Verifica sistema) di norma è utilizzata per collegarsi ad unaddetto dell'Assistenza tecnica Illumina durante una sessione Live Help (Assistenza indiretta). L'uso di questa funzione non è necessario durante il normale funzionamento o perla manutenzione dello strumento.Alcuni controlli di sistema possono essere eseguiti prima di rivolgersi all'Assistenzatecnica Illumina, ad esempio Volume Test (Test volume). Il test volume verifica il correttostato del sistema di fluidica stimando il volume del flusso al passaggio delle bolle tra isensori. Per maggiori informazioni, vedere Esecuzione di un test volume a pagina 74.Al termine di un System Check (Verifica sistema), i risultati del test appaiono sulloschermo:} Selezionare Show Details (Mostra dettagli) per visualizzare un riepilogo dei risultatisull'interfaccia di MiSeq.

} Selezionare Export Results (Esporta risultati) per esportare i risultati in formato *.csvsu un dispositivo USB.

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Figura 13 Opzioni System Check (Verifica sistema)

Schermata Manual Update (Aggiornamento manuale)La funzione Manual Update (Aggiornamento manuale) è usata per aggiornare il softwaredi controllo dello strumento e il software di analisi. Questa funzione non è disponibile perMiSeq FGx. Tutti gli aggiornamenti software sono eseguiti dal personale Illumina permantenere la configurazione corretta del sistema.

Schermata Review (Revisione)La schermata Review (Revisione) conferma che MiSeq FGx Control Software ha ricevuto leinformazioni della corsa da ForenSeq Universal Analysis Software.

Figura 14 Schermata Review (Revisione)

Schermate per l'impostazione della corsaDopo aver selezionato Sequence sulla schermata Welcome (Benvenuto), selezionare untipo di corsa. Quando si seleziona Forensic Genomics (Genomica forense) sulla schermataWelcome (Benvenuto), viene visualizzata una serie di schermate per l'impostazione dellacorsa nell'ordine seguente: Select Run, Load Flow Cell, Load Reagents, Review e Pre-Run

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Check (Tipo di corsa, Caricamento cella a flusso, Caricamento reagenti, Revisione e Verificapre-corsa). Quando si seleziona Research Use Only Run (Corsa solo a uso di ricerca), vienevisualizzata una serie di schermate per l'impostazione della corsa. Vedere Schermate perl'impostazione della corsa per una corsa RUO a pagina 25.

Schermata di selezione di una corsaSelezionare una corsa per il sequenziamento usando il menu a discesa. Le corse sonoimpostate in ForenSeq Universal Analysis Software.

Figura 15 Schermata di selezione di una corsa

Schermata Load Flow Cell (Caricamento cella a flusso)La schermata Load Flow Cell (Caricamento cella a flusso) viene visualizzata quando è ilmomento di caricare la cella a flusso. Dopo aver caricato la cella a flusso, chiudere ilcoperchio a scatto della cella a flusso e lo sportello dello scomparto della cella a flusso. Ilcoperchio a scatto e lo sportello dello scomparto della cella a flusso devono essere chiusiprima di avviare la corsa.

Figura 16 Schermata Load Flow Cell (Caricamento cella a flusso)

Una volta caricata la cella a flusso, il software legge l'etichetta RFID e ne registra ilcontenuto. Se l'etichetta RFID viene letta correttamente, nell'angolo inferiore destro dellaschermata appare un messaggio di conferma.Se l'etichetta RFID non può essere letta, le informazioni identificative possono essereinserite manualmente. Tuttavia, il software permette un solo errore sui tre componenti con

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etichetta RFID (cella a flusso, cartuccia di reagenti, soluzione SBS (PR2)) su una corsa. Permaggiori informazioni, vedere Risoluzione degli errori di lettura dell'etichetta RFIDa pagina 70.Selezionare l'icona della guida nell'angolo superiore destro dello schermo. Il file della guidacontiene un video che mostra le fasi del caricamento della cella a flusso.

Schermata Load Reagents (Caricamento reagenti)La schermata Load Reagents (Caricamento reagenti) prevede due fasi: dapprima si carica ilflacone della soluzione SBS (PR2) e si svuota il flacone degli scarti; poi si carica la cartucciadi reagenti. Quando il flacone della soluzione SBS (PR2) e la cartuccia di reagenti sonocaricati, il software legge e registra le etichette RFID. Se l'etichetta RFID viene lettacorrettamente, nell'angolo inferiore destro della schermata appare un messaggio diconferma.

NOTAUtilizzare i componenti corretti del kit di reagenti (sequenziamento) per il tipo di corsa che sidesidera eseguire. Le corse di genomica forense possono essere eseguite solo con i kit disequenziamento ForenSeq e le corse RUO possono essere eseguite solo con i kit direagenti RUO.

Figura 17 Caricamento del flacone della soluzione SBS (PR2) e del flacone degli scarti

Figura 18 Caricamento della cartuccia di reagenti

Se l'etichetta RFID non può essere letta, le informazioni identificative possono essereinserite manualmente. Tuttavia, il software permette un solo errore sui tre componenti conetichetta RFID (cella a flusso, cartuccia di reagenti, soluzione SBS (PR2)) su una corsaforense. Per maggiori informazioni, vedere Risoluzione degli errori di lettura dell'etichetta RFIDa pagina 70.

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Selezionare l'icona della guida nell'angolo superiore destro dello schermo. Il file della guidacontiene un video che mostra le fasi di caricamento della cartuccia di reagenti e delcaricamento del flacone della soluzione SBS (PR2).

Schermata Pre-Run Check (Verifica pre-corsa)Il software esegue automaticamente una verifica pre-corsa dei componenti e dellecondizioni necessarie prima di permettere l'avvio della corsa. In caso di errori durante laverifica pre-corsa, viene visualizzato un messaggio che descrive l'errore e l'interventonecessario per correggerlo.Per maggiori informazioni, vedere Risoluzione degli errori d'impostazione della corsaa pagina 69.

Figura 19 Schermata Pre-Run Check (Verifica pre-corsa)

Se la verifica pre-corsa viene eseguita correttamente, il pulsante Start Run (Avvia corsa)diventa attivo.

Schermata Sequencing (Sequenziamento)La schermata Sequencing (Sequenziamento) si apre all'inizio della corsa. La schermatafornisce una rappresentazione visiva dell'avanzamento della corsa, che comprende leintensità e i punteggi qualitativi (Q-scores).} Run Progress (Avanzamento della corsa): mostra a che punto è giunta la corsa in unabarra di stato ed elenca il numero di cicli completati.

} Intensity (Intensità): mostra il valore delle intensità dei cluster per il 90° percentile perciascuna tile.Il grafico dell'area Intensity (Intensità) rappresenta il numero di tile e il numero disuperfici sottoposti a imaging.• Solo la superficie superiore della cella a flusso viene sottoposta a imaging. Vienevisualizzato un grafico a colonna singola.

} Flow Cell (Cella a flusso): mostra la temperatura corrente della cella a flusso,identificandola con un colore. Il blu indica le temperature più basse, mentre arancionee rosso indicano temperature più alte. Durante l'imaging, le tile appaiono di coloregrigio scuro. Durante la fase della chimica, linee ondeggianti indicano l'erogazione incorso dei reagenti alla cella a flusso.

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} Cluster Density (K/mm²) (Densità dei cluster - K/mm²): mostra il numero di cluster permillimetro quadrato, per la corsa. L'intervallo delle densità dei cluster prevista ottimaleè di 400-1650 K/mm².

} Clusters Passing Filter (%) (Cluster che attraversano il filtro - %): mostra la percentualedi cluster che attraversano il filtro basata sul filtro Chastity Illumina, che misura laqualità. Questi dati appaiono solo dopo il ciclo 25.

NOTAIl valore Chastity di una identificazione delle basi è dato dal rapporto di intensità tra ilsegnale maggiore diviso per la somma dei due segnali maggiori. Le letture nonattraversano il filtro qualità se sono presenti una o più operazioni di identificazionedelle basi con valore Chastity inferiore a 0,6 durante i primi 25 cicli.

} Phasing (%) (Determinazione delle fasi - %): vedere Numero di cicli in una letturaa pagina 32 e la sezione Scheda Run Metrics (Metriche della corsa) nella Guida perForenSeq Universal Analysis Software (n. codice 15053876).

} Prephasing (%) (Predeterminazione delle fasi - %): vedere Numero di cicli in una letturaa pagina 32 e la sezione Scheda Run Metrics (Metriche della corsa) nella Guida perForenSeq Universal Analysis Software (n. codice 15053876).

} Read 1 (Lettura 1): per informazioni, vedere la sezione Scheda Run Metrics (Metrichedella corsa) nella Guida per ForenSeq Universal Analysis Software (n. codice 15053876).

} Index 1 (Indice 1): per informazioni, vedere la sezione Scheda Run Metrics (Metrichedella corsa) nella Guida per ForenSeq Universal Analysis Software (n. codice 15053876).

} Read 2 (Lettura 2): per informazioni, vedere la sezione Scheda Run Metrics (Metrichedella corsa) nella Guida per ForenSeq Universal Analysis Software (n. codice 15053876).

} Index 2 (Indice 2): per informazioni, vedere la sezione Scheda Run Metrics (Metrichedella corsa) nella Guida per ForenSeq Universal Analysis Software (n. codice 15053876).

Schermate per l'impostazione della corsa per una corsa RUODopo aver selezionato Sequence (Sequenziamento) sulla schermata Welcome (Benvenuto),selezionare un tipo di corsa. Quando si seleziona Research Use Only Run (Corsa solo a usodi ricerca) sulla schermata Welcome (Benvenuto), viene visualizzata una serie di schermateper l'impostazione della corsa nell'ordine seguente: BaseSpace Option, Load Flow Cell,Load Reagents, Review e Pre-Run Check (Opzione BaseSpace, Caricamento cella a flusso,Caricamento reagenti, Revisione e Verifica pre-corsa). Quando si seleziona ForensicGenomics (Genomica forense), viene visualizzata una serie di schermate perl'impostazione della corsa. Vedere Schermate per l'impostazione della corsa a pagina 21.

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Schermata BaseSpace Option (Opzione BaseSpace)Se si sta eseguendo l'analisi per una corsa RUO su BaseSpace, selezionare Use BaseSpacefor storage analysis (Usa BaseSpace per l'archiviazione e l'analisi). Quando si selezionaBaseSpace (Opzione BaseSpace), le informazioni sulla corsa vengono trasferite a BaseSpace.Immettere le informazioni dell'account MyIllumina.

Figura 20 Schermata BaseSpace Option (Opzione BaseSpace)

Schermata Load Flow Cell (Caricamento cella a flusso)La schermata Load Flow Cell (Caricamento cella a flusso) viene visualizzata quando è ilmomento di caricare la cella a flusso. Dopo aver caricato la cella a flusso, chiudere ilcoperchio a scatto della cella a flusso e lo sportello dello scomparto della cella a flusso. Ilcoperchio a scatto e lo sportello dello scomparto della cella a flusso devono essere chiusiprima di avviare la corsa.

Figura 21 Schermata Load Flow Cell (Caricamento cella a flusso)

Una volta caricata la cella a flusso, il software legge l'etichetta RFID e ne registra ilcontenuto. Se l'etichetta RFID viene letta correttamente, nell'angolo inferiore destro dellaschermata appare un messaggio di conferma.Se l'etichetta RFID non può essere letta, le informazioni identificative possono essereinserite manualmente. Tuttavia, il software permette un solo errore sui tre componenti conetichetta RFID (cella a flusso, cartuccia di reagenti, soluzione SBS (PR2)) su una corsa. Permaggiori informazioni, vedere Risoluzione degli errori di lettura dell'etichetta RFIDa pagina 70.

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Selezionare l'icona della guida nell'angolo superiore destro dello schermo. Il file della guidacontiene un video che mostra le fasi del caricamento della cella a flusso.

Schermata Load Reagents (Caricamento reagenti)La schermata Load Reagents (Caricamento reagenti) prevede due fasi: dapprima si carica ilflacone della soluzione SBS (PR2) e si svuota il flacone degli scarti; poi si carica la cartucciadi reagenti. Quando il flacone della soluzione SBS (PR2) e la cartuccia di reagenti sonocaricati, il software legge e registra le etichette RFID. Se l'etichetta RFID viene lettacorrettamente, nell'angolo inferiore destro della schermata appare un messaggio diconferma.

NOTAUtilizzare i componenti corretti del kit di reagenti (sequenziamento) per il tipo di corsa che sidesidera eseguire. Le corse di genomica forense possono essere eseguite solo con i kit disequenziamento ForenSeq e le corse RUO possono essere eseguite solo con i kit direagenti RUO.

Figura 22 Caricamento del flacone della soluzione SBS (PR2) e del flacone degli scarti


Se l'etichetta RFID non può essere letta, le informazioni identificative possono essereinserite manualmente. Tuttavia, il software permette un solo errore sui tre componenti conetichetta RFID (cella a flusso, cartuccia di reagenti, soluzione SBS (PR2)) su una corsaforense. Per maggiori informazioni, vedere Risoluzione degli errori di lettura dell'etichetta RFIDa pagina 70.Selezionare l'icona della guida nell'angolo superiore destro dello schermo. Il file della guidacontiene un video che mostra le fasi di caricamento della cartuccia di reagenti e delcaricamento del flacone della soluzione SBS (PR2).

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Opzione Change Sample Sheet (Cambia foglio campioni)Per una corsa RUO è richiesto un foglio campioni. Per impostazione predefinita, il softwarecerca un file del foglio campioni con un nome che corrisponde al numero del codice a barredella cartuccia di reagenti caricata sullo strumento. Se non viene trovato un fogliocampioni, si apre una finestra che permette di cercare il foglio campioni.Selezionare il pulsante Change Sample Sheet (Cambia foglio campioni) nella schermataLoad Reagents (Caricamento reagenti) e cercare il foglio campioni appropriato.

Schermata Review (Revisione)La schermata Review (Revisione) verifica che il software abbia individuato il fogliocampioni per la corsa e visualizza il nome del foglio campioni insieme ai parametri inesso specificati.

Figura 24 Schermata Review (Revisione)

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Schermata Pre-Run Check (Verifica pre-corsa)Il software esegue automaticamente una verifica pre-corsa dei componenti e dellecondizioni necessarie prima di permettere l'avvio della corsa. In caso di errori durante laverifica pre-corsa, viene visualizzato un messaggio che descrive l'errore e l'interventonecessario per correggerlo.Per maggiori informazioni, vedere Risoluzione degli errori d'impostazione della corsaa pagina 69.

Figura 25 Schermata Pre-Run Check (Verifica pre-corsa)

Se la verifica pre-corsa viene eseguita correttamente, il pulsante Start Run (Avvia corsa)diventa attivo.

Schermata Sequencing (Sequenziamento) per RUO1 Durante la corsa RUO, monitorarne l'avanzamento, le intensità e i punteggi qualitativi

sulla schermata Sequencing (Sequenziamento). La schermata Sequencing(Sequenziamento) è di sola visualizzazione.Per monitorare con maggiore dettaglio la corsa, utilizzare Sequencing Analysis Viewer(SAV) installato su un altro computer indipendente da quello dello strumento. Occorreuna connessione alla rete. Vedere la Guida per l'utente di Sequencing Analysis Viewer(SAV), n. codice 15020619.In alternativa, se si dispone di una connessione a BaseSpace, è possibile monitorare lacorsa usando SAV in BaseSpace.

} Run Progress (Avanzamento della corsa): mostra a che punto è giunta la corsa in unabarra di stato ed elenca il numero di cicli completati.

} Intensity (Intensità): mostra il valore delle intensità dei cluster per il 90° percentile perciascuna tile.Il grafico dell'area Intensity (Intensità) rappresenta il numero di tile e il numero disuperfici sottoposti a imaging.• Se la cella a flusso è sottoposta a imaging solo sulla superficie superiore, vienevisualizzato un grafico a colonna singola.

• Se la cella a flusso è sottoposta a imaging sulla superficie superiore e inferiore,viene visualizzato un grafico a colonna doppia.

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A Indica due tile, solo superficie superioreB Indica quattro tile, superficie superiore e inferiore

} Q-Score All Cycles (Punteggi qualitativi per tutti i cicli): mostra la percentuale mediadi basi con punteggio qualitativo superiore a Q30. Un punteggio qualitativo è unapredizione della probabilità di un'errata identificazione delle basi. I punteggi qualitativi(Q-score) sono calcolati dopo il ciclo 25.Punteggioqualitativo

Probabilità di errata identificazionedelle basi

Q40 1 su 10.000Q30 1 su 1.000Q20 1 su 100Q10 1 su 10

} Cluster Density (K/mm²) (Densità dei cluster - K/mm²): mostra il numero di cluster permillimetro quadrato, per la corsa.

} Clusters Passing Filter (%) (Cluster che attraversano il filtro - %): mostra la percentualedi cluster che attraversano il filtro basata sul filtro Chastity Illumina, che misura laqualità. Questi dati appaiono solo dopo il ciclo 25.

NOTAIl valore Chastity di una identificazione delle basi è dato dal rapporto di intensità tra ilsegnale maggiore diviso per la somma dei due segnali maggiori. Le letture nonattraversano il filtro qualità se sono presenti una o più operazioni di identificazione dellebasi con valore Chastity inferiore a 0,6 durante i primi 25 cicli.

} Estimated Yield (Mb) (Resa prevista - Mb): mostra il numero previsto di basiidentificate per la corsa, misurato in megabasi. Questi dati appaiono solo dopo ilciclo 25.

2 Al termine della corsa, compare il pulsante Next (Avanti). Prima di procedere,esaminare i risultati sulla schermata Sequencing (Sequenziamento).

NOTAIl valore Chastity di una identificazione delle basi è dato dal rapporto di intensità tra ilsegnale maggiore diviso per la somma dei due segnali maggiori. Le letture nonattraversano il filtro qualità se sono presenti una o più operazioni di identificazione dellebasi con valore Chastity inferiore a 0,6 durante i primi 25 cicli.

3 Selezionare Next (Avanti) per uscire dalla schermata Sequencing (Sequenziamento) eprocedere con un lavaggio post-corsa.

MiSeq

FGxContro

lSoftw

are


Figura 26 Schermata Sequencing (Sequenziamento) per una corsa RUO

Generazione della griglia per l'identificazione dei clusterLa generazione della griglia per l'identificazione dei cluster è il processo mediante il qualele posizioni dei cluster sull'intera superficie della cella a flusso sono definite secondo lecoordinate X e Y. Real-Time Analysis (RTA) usa i primi sette cicli della corsa disequenziamento per generare la griglia per l'identificazione dei cluster per i kit MiSeq FGxe RUO v3 e i primi quattro cicli per i kit RUO v1 e v2.Dopo che la griglia delle posizioni dei cluster è stata generata, le immagini prodotte a ognisuccessivo ciclo di imaging vengono allineate rispetto alla griglia. Le intensità dei singolicluster in tutti e quattro i canali cromatici dei nucleotidi possono essere estratte e leidentificazioni delle basi possono essere ricavate dalle intensità dei cluster normalizzate.

MiSeq

FGxSoftware


Cartelle delle corseCiascuna corsa su MiSeq FGx genera tre cartelle della corsa, ciascuna con uno scopospecifico:} D:\Illumina\MiSeqFGxTemp: all'inizio della corsa, viene scritta sul disco locale delcomputer dello strumento una cartella temporanea, che è utilizzata come area di lavoroper MiSeq FGx Control Software e RTA. Non è necessario accedere alla cartella Temp(Temporanea). Dopo sette giorni il contenuto di questa cartella è eliminato.

} D:\Illumina\MiSeqFGxOutput: RTA copia i file dalla cartella Temp (Temporanea) allacartella Output (Output). Mentre vengono generati i file delle identificazioni delle basi edei punteggi qualitativi delle identificazioni delle basi, RTA copia i file nella cartellaTemp (Temporanea) e riempie la cartella Analysis (Analisi). Le immagini difocalizzazione e le immagini in miniatura non sono copiate nella cartella Analysis(Analisi).È possibile modificare il percorso della cartella di output nel campo Output Folder(Cartella di output) della schermata Run Options (Opzioni corsa). Per maggioriinformazioni, vedere Schermata Run Options (Opzioni corsa) a pagina 16.

} D:\Illumina\MiSeqFGxAnalysis: al termine dell'analisi RTA, ForenSeq UniversalAnalysis Software accede alla cartella Analysis (Analisi) sul disco locale dellostrumento per iniziare ulteriori analisi. Tutti i file scritti nella cartella Analysis (Analisi)vengono copiati nella cartella Output (Output). Per maggiori informazioni, vedere laGuida per ForenSeq Universal Analysis Software (n. codice 15053876).

Denominazione della cartella della corsaIl nome della cartella della corsa individua la data delle corsa, il numero dello strumento ela cella a flusso utilizzata per la corsa. Per ciascuna corsa, ciascuna cartella della corsa halo stesso nome della cartella a livello base.Per impostazione predefinita, il nome della cartella utilizza il formato seguente:

AAMMGG_<NumeroStrumento>_<Numero Corsa>_A<CodiceBarreCellaFlusso>Il numero della corsa viene incrementato di uno ogni volta che si esegue una corsa su undato strumento.

Durata della corsaLa durata della corsa dipende dal numero di cicli eseguiti. MiSeq FGx è in grado dieseguire una corsa di sequenziamento indicizzata 8 + 8 di 351 x 31 cicli per i kit ForenSeq.

Numero di cicli in una letturaIl numero di cicli eseguiti in una lettura è pari a un ciclo in più rispetto al numero di ciclianalizzati. Il ciclo extra è necessario per i calcoli di determinazione delle fasi (phasing) e dipredeterminazione delle fasi (prephasing).Ad esempio, una corsa paired-end da 350 + 30 cicli esegue una lettura da 351 cicli e unalettura da 31 cicli per un totale di 382 cicli. Al termine della corsa, sono analizzati 380 cicli.Per informazioni sul numero dei cicli che possono essere eseguiti con un kit, vedere laGuida di consultazione di MiSeq FGx Reagent Kit (n. codice 15055483). Se si sta eseguendo unacorsa RUO, vedere la guida di preparazione dei reagenti per il kit di reagenti MiSeq perRUO.

MiSeq

FGxContro

lSoftw

are


Spazio su disco necessarioIl computer integrato allo strumento dispone di una capacità di memoria di circa 550 GB.Prima di avviare una corsa, il software verifica lo spazio disponibile su disco. Se non èdisponibile spazio su disco sufficiente per la corsa, viene visualizzato un messaggio delsoftware. Il messaggio indica quanto spazio su disco è richiesto per la corsa e quantospazio su disco deve essere liberato prima di procedere con la corsa.Se viene richiesto di liberare spazio su disco, andare alla schermata Welcome (Benvenuto)e selezionareManage Files (Gestione file). Nella schermata Manage Files (Gestione file),selezionare la scheda Runs (Corse). Spostare o eliminare, a seconda dei casi, le cartelledelle corse meno recenti. Per maggiori informazioni, vedere Schermata Manage Files (Gestionefile) a pagina 14. Dopo avere liberato spazio su disco sufficiente, selezionare Restart Check(Riavvia verifica).

Sospensione o arresto di una corsaMiSeq FGx è progettato per eseguire una corsa dall'inizio alla fine senza interventodell'utente. È tuttavia possibile sospendere o arrestare una corsa dalla schermataSequencing (Sequenziamento).

Sospensione di una corsaSe necessario, una corsa può essere sospesa durante il sequenziamento (ad esempio, persvuotare il flacone degli scarti o per controllare il volume rimanente nel flacone dellasoluzione SBS (PR2)) e quindi ripresa per continuare il sequenziamento.

ATTENZIONENon sospendere la corsa durante la generazione di cluster o nei primi otto cicli disequenziamento. Non è possibile riprendere una corsa che è stata sospesa in questefasi. Se si usa MiSeq FGx in modalità RUO, vedereMetriche della corsa a pagina 54 per leinformazioni relative ai cicli per i kit delle cartucce di reagenti.

Per sospendere la corsa dalla schermata Sequencing (Sequenziamento), selezionare Pause(Pausa). L'esecuzione del comando corrente viene portata a termine, poi la corsa vienesospesa, la cella a flusso viene posta in uno stato sicuro e il pulsante passa a Resume(Riprendi). A questo punto è possibile, ad esempio, vuotare il flacone degli scarti.Selezionare Resume (Riprendi) per proseguire con la corsa.

Arresto di una corsaSe necessario, è possibile arrestare una corsa durante il sequenziamento (ad esempio, se lacorsa non è stata impostata correttamente, se la qualità dei dati è insoddisfacente o se siverifica un errore hardware).Per arrestare una corsa dalla schermata Sequencing (Sequenziamento), selezionare Stop(Arresta). Quando si arresta una corsa, l'esecuzione del comando corrente non vieneportata a termine e il piano portacelle si sposta in posizione anteriore. L'analisi RTAcontinua per l'ultimo ciclo completato.

MiSeq

FGxSoftware


Figura 27 Arresto di una corsa

L'arresto di una corsa è definitivo. Una corsa arrestata non può essere ripresa. Si può solopassare a un lavaggio dello strumento.Se si arresta una corsa, non usare i reagenti residui nella cartuccia di reagenti per unacorsa successiva. Una nuova corsa richiede una nuova cartuccia di reagenti.

Live Help (Assistenza in diretta)Per abilitare Live Help (Assistenza in diretta), MiSeq FGx deve essere collegato a una retecon accesso a Internet. La funzione Live Help (Assistenza in diretta) è uno strumento diassistenza online che consente a un addetto dell'Assistenza tecnica Illumina divisualizzare la schermata di MiSeq FGx, con il consenso dell'utente, e di condividere ilcontrollo dello strumento. L'utente mantiene il controllo prioritario sullo strumento e puòmettere fine alla sessione di condivisione della schermata in qualsiasi momento.La funzione Live Help (Assistenza in diretta) è accessibile selezionando l'icona della guidasulla schermata Welcome (Benvenuto).

Figura 28 Menu Help (Guida)

Per rendere possibile una connessione, prima si deve obbligatoriamente ottenere un codicedi accesso univoco dall'Assistenza tecnica Illumina; poi inserire quel codice nellaschermata Live Help (Assistenza in diretta) e infine selezionare Next (Avanti).

MiSeq

FGxContro

lSoftw

are


Figura 29 Schermata Live Help (Assistenza in diretta)

MiSeq

FGxSoftware


Opzioni di software di analisi per le corse RUO

Una volta completata l'analisi RTA, MiSeq FGx sottopone a sequenziamento i dati per lecorse ForenSeq richieste per l'analisi su ForenSeq Universal Analysis Software. Quando siesegue una corsa RUO su MiSeq FGx, i dati di sequenziamento possono essere analizzatisul cloud usando BaseSpace o sul computer dello strumento usando MiSeq Reporter.BaseSpace e MiSeq Reporter generano informazioni su allineamento, varianti e gruppi dicontig per ciascun genoma richiesto e per ciascun campione di una corsa multi-campione.

Panoramica su BaseSpaceBaseSpace è l'ambiente sul cloud computing Illumina. L'utilizzo di BaseSpace permemorizzare e analizzare i dati delle corse assicura i seguenti benefici:} Elimina la necessità di avere in sede spazio di archiviazione e capacità di calcolo} Rende possibile la gestione e l'analisi dei dati su base web} Permette di avviare una nuova corsa di sequenziamento mentre i dati sono analizzati} Fornisce strumenti per la collaborazione e la condivisione globaleQuando viene avviata la corsa di sequenziamento, i file vengono cifrati durante iltrasferimento, decifrati durante l'analisi e infine nuovamente cifrati all'attodell'archiviazione.È possibile accedere a BaseSpace quando si imposta una corsa di sequenziamento. Permaggiori informazioni, vedere Schermata BaseSpace Option (Opzione BaseSpace) a pagina 26.BaseSpace si disconnette automaticamente da MiSeq FGx al termine della corsa o nonappena i file dell'analisi RTA sono stati caricati. In caso di interruzione della connessioneInternet, una volta ristabilita la connessione il caricamento dei file dell'analisi riprende dalpunto in cui era stato interrotto.Non appena viene caricato su BaseSpace l'ultimo file dell'identificazione delle basi, vieneavviata un'ulteriore analisi dei dati. Su BaseSpace sono supportati gli stessi flussi di lavorodi analisi eseguibili con l'analisi integrata sullo strumento utilizzando MiSeq Reporter.BaseSpace supporta solo gli stessi genomi forniti con MiSeq Reporter.Per connettersi a BaseSpace andare all'indirizzo https://basespace.illumina.com. Accedereusando il proprio account di login MyIllumina. Per maggiori informazioni sull'utilizzo diBaseSpace, vedere la guida online di BaseSpace sul sito Web Illumina:www.illumina.com/help/BaseSpaceHelp/BaseSpaceHelp.htm.

Panoramica suMiSeq ReporterMiSeq Reporter è un'applicazione basata su Windows che elabora le identificazioni dellebasi generate dall'analisi iniziale. MiSeq Reporter inizia l'analisi secondariaimmediatamente dopo la conclusione dell'analisi RTA della corsa di sequenziamento.MiSeq Reporter viene eseguito sul computer dello strumento MiSeq FGx. Tuttavia,l'interfaccia software è visibile solo tramite un browser Web da un altro computer che siacollegato alla stessa rete a cui è connesso MiSeq Reporter.Al termine dell'analisi secondaria, nella cartella della corsa viene creato un file denominatoCompletedJobInfo.xml. Per maggiori informazioni, vedere la Guida per l'utente di MiSeqReporter (n. codice 15042295).

http://basespace.com/

http://www.illumina.com/help/BaseSpaceHelp/BaseSpaceHelp.htm

Opzio

nidiso

ftware

dianalisip

erleco

rse RUO


Sequenziamento durante l'analisiSe MiSeq Reporter viene scelto per l'analisi ulteriore di una corsa RUO, le risorse di calcolodello strumento MiSeq FGx sono dedicate al sequenziamento o all'analisi. Se si avvia unnuova corsa di sequenziamento su MiSeq FGx prima che l'analisi secondaria di una corsaprecedente sia stata completata, viene visualizzata una finestra di dialogo di conferma.Dopo aver confermato la corsa di sequenziamento, l'analisi secondaria si arresta.Per riavviare l'analisi, utilizzare la funzione Requeue (Rimetti in coda) sull'interfaccia diMiSeq Reporter una volta completata la nuova corsa di sequenziamento. A questo punto,l'analisi riprende dall'inizio.


Capitolo3


Capitolo 3 Esecuzione di una corsa

Esecuzionediunacorsa

Introduzione 40Flusso di lavoro di MiSeq FGx 41Preparazione della cartuccia di reagenti 43Accesso e selezione del tipo di corsa 46Pulizia della cella a flusso 47Caricamento della cella a flusso 49Caricamento dei reagenti 51Avvio della corsa 53Monitoraggio della corsa 54

Esecuzione

diuna

corsa


Introduzione

Per eseguire una corsa su MiSeq FGx, attenersi alla procedura d'impostazione descritta inquesto capitolo. Dopo l'avvio di una corsa, non è richiesto nessun altro intervento da partedell'utente.Al termine della corsa di sequenziamento, eseguire un lavaggio dello strumento.

Flusso

dilavo

rodiM

iSeq

FGx


Flussodi lavorodiMiSeqFGx

Assicurarsi che le librerie di campioni siano state caricate sulla cartuccia dei reagentiprima di impostare la corsa. Questa procedura si applica a qualsiasi protocollo del saggio.

Preparare la cartuccia dei reagenti, quindi caricare il pool dilibrerie nell'apposito serbatoio.

Dall'interfaccia software, selezionare Sequence(Sequenziamento) per avviare la procedura diimpostazione della corsa.[Opzionale] Se si sta eseguendo una corsa RUO, collegarsia BaseSpace.

Lavare e asciugare accuratamente la cella a flusso.Attenersi alle istruzioni del software per caricare la cella aflusso.

Attenersi alle istruzioni del software per caricare il flaconedella soluzione SBS (PR2), assicurarsi che il flacone degliscarti sia vuoto e caricare la cartuccia di reagenti. Per unacorsa RUO, selezionare un foglio campioni.

Riesaminare i parametri della corsa e i risultati dellaverifica pre-corsa.Selezionare Start Run (Avvia corsa).

È possibile monitorare la corsa dalla schermata Sequencing(Sequenziamento).

Eseguire un lavaggio post-corsa utilizzando acqua priva dinucleasi miscelata con ipoclorito di sodio.

Generazione di clusterDurante la generazione di cluster, singole molecole di DNA si legano alla superficie dellacella a flusso e in seguito vengono sottoposte ad amplificazione "a ponte" per formare icluster.

SequenziamentoDopo essere stati generati, i cluster vengono sottoposti a imaging utilizzando LED ecombinazioni di filtri specifici per ciascuno dei quattro dideossinucleotidi con marcaturafluorescente. Ultimato l'imaging di una delle tile, la cella a flusso viene riposizionata perl'esposizione della tile successiva. Il processo viene ripetuto fino al completamentodell'imaging di tutte le tile. Dopo l'analisi delle immagini, il software eseguel'identificazione delle basi, il filtraggio e il calcolo dei punteggi qualitativi.

Esecuzione

diuna

corsa


AnalisiAl termine della corsa, ForenSeq Universal Analysis Software esegue automaticamenteun'ulteriore analisi. L'analisi viene monitorata da un altro computer via Internet. Vedere laGuida per ForenSeq Universal Analysis Software (n. codice 15053876).

Prep

arazione

della

cartucciadireag

enti


Preparazionedella cartuccia di reagenti

Le istruzioni che seguono descrivono come scongelare la cartuccia di reagenti utilizzandoun bagnomaria a temperatura ambiente. Il metodo richiede circa un'ora.

NOTAUna cartuccia di reagenti MiSeq FGx può essere usata con le corse di sequenziamentoForenSeq e non può essere usata con le corse RUO. Quando si esegue una corsa disequenziamento RUO, utilizzare una cartuccia di reagenti MiSeq standard.

1 Rimuovere la cartuccia di reagenti dal luogo di conservazione con temperatura tra-25 °C e -15 °C.

2 Collocare la cartuccia di reagenti in un bagnomaria contenente abbastanza acquadeionizzata a temperatura ambiente da immergere la base della cartuccia di reagentifino alla linea di livello acqua stampata sulla cartuccia stessa. Evitare che l'acquasuperi la linea di massimo livello acqua.

Figura 30 Linea di massimo livello acqua

3 Lasciare la cartuccia di reagenti a scongelare nel bagnomaria a temperatura ambienteper circa 60-90 minuti o fino a completo scongelamento.

4 Rimuovere la cartuccia dal bagnomaria e picchiettarla delicatamente sul banco per farfuoriuscire l'acqua in eccesso dalla base della cartuccia. Asciugare la base dellacartuccia. Verificare che sulla parte superiore della cartuccia di reagenti non sia cadutadell'acqua.

Ispezione della cartuccia di reagenti1 Capovolgere la cartuccia dieci volte per miscelare i reagenti scongelati e poi

ispezionare visivamente tutte le posizioni per accertarsi che siano scongelati.

NOTAÈ fondamentale che i reagenti nella cartuccia siano scongelati completamente e miscelatiper assicurare il sequenziamento corretto.

2 Ispezionare visivamente i reagenti nelle posizioni 1, 2 e 4 per accertarsi che siano benmiscelati e privi di precipitati.

3 Picchiettare delicatamente la cartuccia sul banco per ridurre le bolle d'aria nei reagenti.

NOTAI tubi dei pescanti di MiSeq FGx raggiungono il fondo di ciascun serbatoio per aspirare ireagenti, per questa ragione è importante che i serbatoi non contengano bolle.

4 Riporre la cartuccia di reagenti in ghiaccio o conservarla a una temperatura compresatra 2 °C e 8 °C (fino a 6 ore) finché non si è pronti a impostare la corsa. Per risultatiottimali, procedere direttamente caricando il campione e impostando la corsa.

Esecuzione

diuna

corsa


Caricamento delle librerie di campioni nella cartucciaNOTASe si sta eseguendo una corsa RUO, attenersi alle istruzioni di caricamento dei campioniillustrate in Caricamento delle librerie di campioni nella cartuccia per RUO a pagina 45.

Una volta preparata la cartuccia di reagenti MiSeq FGx per l'uso, si è pronti per ilcaricamento dei campioni.

1 Usare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per pulire il sigillo inalluminio che copre il serbatoio contrassegnato con Load Samples (Caricamentocampioni).

2 Utilizzare la punta di una pipetta pulita 1 ml per forare la capsula in alluminio checopre il serbatoio contrassegnato con Load Samples (Caricamento campioni).

NOTANon perforare nessun'altra posizione di reagenti. Le altre posizioni di reagenti sonoperforate automaticamente durante la corsa.

3 Pipettare 600 µl di librerie di campioni DNL nel serbatoio contrassegnato con LoadSamples (Caricamento campioni). Non toccare la capsula in alluminio mentre si erogail campione.Una volta caricato il campione, verificare la presenza di bolle d'aria nel serbatoio. Incaso di presenza di bolle d'aria, picchiettare delicatamente la cartuccia sul banco inmodo da farle fuoriuscire.

Figura 31 Caricamento delle librerie

4 Passare direttamente alla procedura d'impostazione della corsa usando l'interfaccia diMiSeq FGx Control Software.

Prep

arazione

della

cartucciadireag

enti


Caricamento delle librerie di campioni nella cartuccia per RUONOTASe richiesto dal tipo di libreria, denaturare e diluire le librerie e aggiungere un campione dicontrollo PhiX facoltativo. Vedere Preparazione delle librerie di DNA per il sequenziamento suMiSeq (n. codice 15039740).Questa fase non si applica a tutti i tipi di librerie. Alcuni metodi di preparazione deicampioni Illumina consentono di ottenere una concentrazione normalizzata pronta per l'usodi un pool di librerie. Fare riferimento alla guida di preparazione dei campioni relativa al kitutilizzato per preparare le librerie dei campioni.

NOTASe si utilizzano i primer personalizzati, preparare i primer e impostare il foglio campionicome descritto in Utilizzo di primer personalizzati su MiSeq (n. codice 15041638).

Una volta preparata la cartuccia di reagenti MiSeq FGx per l'uso, si è pronti per ilcaricamento dei campioni.

1 Usare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per pulire il sigillo inalluminio che copre il serbatoio contrassegnato con Load Samples (Caricamentocampioni).

2 Utilizzare la punta di una pipetta pulita 1 ml per forare la capsula in alluminio checopre il serbatoio contrassegnato con Load Samples (Caricamento campioni).

NOTANon perforare nessun'altra posizione di reagenti. Le altre posizioni di reagenti sonoperforate automaticamente durante la corsa.

3 Pipettare 600 µl delle librerie preparate nel serbatoio contrassegnato con Load Samples(Caricamento campioni). Non toccare la capsula in alluminio mentre si eroga ilcampione.Una volta caricato il campione, verificare la presenza di bolle d'aria nel serbatoio. Incaso di presenza di bolle d'aria, picchiettare delicatamente la cartuccia sul banco inmodo da farle fuoriuscire.

Figura 32 Caricamento delle librerie

4 Passare direttamente alla procedura d'impostazione della corsa usando l'interfaccia diMiSeq FGx Control Software.

Esecuzione

diuna

corsa


Accessoe selezionedel tipodi corsa

1 Dalla schermata di accesso, immettere il nome utente e password di ForenSeqUniversal Analysis Software, quindi selezionare Next (Avanti).

2 Nella schermata Welcome (Benvenuto), selezionare Sequence (Sequenziamento).

3 Quando viene visualizzata la schermata Select Run Type (Seleziona tipo corsa),selezionare Forensic Genomics (Genomica forense) oppure Research Use Only Run(Corsa solo a uso di ricerca).

Figura 33 Selezione del tipo di corsa

4 Attenersi alle istruzioni per caricare la cella a flusso e i reagenti e impostare la corsa(vedere le sezioni seguenti).

Pulizia

della

cellaaflusso


Pulizia della cella a flusso

La cella a flusso viene fornita in un apposito contenitore, immersa in un tampone diconservazione.

1 Indossare un nuovo paio di guanti privi di polvere.

2 Con una pinza di plastica, afferrare la cella a flusso dalla base della relativa cartucciain plastica ed estrarla dal contenitore.

Figura 34 Rimozione della cella a flusso

3 Sciacquare delicatamente la cella a flusso con acqua priva di nucleasi, verificando benedi aver eliminato i sali in eccesso dal vetro e dalla cartuccia di plastica. I sali ineccesso possono impedire il corretto posizionamento della cella a flusso sullostrumento. Se i sali si asciugano nell'area di imaging, questo incide anche sull'imaging.

Figura 35 Risciacquo della cella a flusso

4 Prestando particolare attenzione intorno alla guarnizione nera della porta della cella aflusso (come evidenziato in arancione nella seguente immagine), asciugare con cura lacella a flusso e la cartuccia con un panno pulente per lenti che non lascia residui.Asciugare tamponando delicatamente l'area della guarnizione e il vetro adiacente.

Figura 36 Porte e guarnizione della cella a flusso

Esecuzione

diuna

corsa


5 Con una salvietta imbevuta di alcol, pulire il vetro della cella a flusso. Assicurarsi dinon lasciare striature e impronte sul vetro e che siano completamente assenti particelleestranee o fibre di tessuto. Evitare di passare la salvietta imbevuta di alcol sullaguarnizione della porta della cella a flusso.

Figura 37 Asciugatura della cella a flusso

6 Asciugare l'eventuale alcol in eccesso con un panno pulente per lenti che non lasciaresidui. Ispezionare visivamente la cella a flusso per accertarsi che la guarnizioneaderisca bene intorno alle porte e che quest'ultime non siano ostruite.Se la guarnizione sembra leggermente scostata, riposizionarla esercitando una leggerapressione fino a farla aderire saldamente alle porte della cella a flusso.

Caricam

entodella

cellaaflusso


Caricamentodella cella a flusso

La schermata Load Flow Cell (Caricamento cella a flusso) invita l'utente a caricare la cellaa flusso.

1 Sollevare lo sportello dello scomparto della cella a flusso, poi premere il pulsante disblocco a destra del coperchio a scatto della cella a flusso. Il coperchio a scatto dellacella a flusso si apre.

Figura 38 Apertura del coperchio a scatto della cella a flusso

2 Ispezionare visivamente il piano portacelle per verificare che siano assenti particelleestranee. Se si riscontra la presenza di fibre o altre particelle estranee, pulire il pianoportacelle con una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residuiimbevuto di etanolo o isopropanolo. Strofinare delicatamente la superficie del pianoportacelle finché non è perfettamente pulita e asciutta.

3 Tenendo la cella a flusso per i bordi della cartuccia della cella a flusso, posizionare lacella a flusso sul piano portacelle.

Figura 39 Posizionamento della cella a flusso sul piano portacelle

4 Premere delicatamente il coperchio a scatto per abbassarlo sulla cella a flusso.NOTAQuando il coperchio a scatto della cella a flusso viene chiuso, due perni diallineamento accanto alla cerniera posizionano e allineano correttamente la cella aflusso. Quando si sente un 'clic' vuol dire che il coperchio a scatto è chiusocorrettamente.

Esecuzione

diuna

corsa


Figura 40 Chiusura del coperchio a scatto della cella a flusso

5 Verificare i dati visualizzati nell'angolo inferiore sinistro della schermata per accertarsiche l'etichetta RFID della cella a flusso è stata letta correttamente.

NOTASe quell'etichetta RFID non può essere letta, le informazioni identificative possono essereinserite manualmente. Tuttavia, il software permette un solo errore sui tre componenti conetichetta RFID (cella a flusso, cartuccia di reagenti, soluzione SBS (PR2)). Per maggioriinformazioni, vedere Risoluzione degli errori di lettura dell'etichetta RFID a pagina 70.

6 Chiudere lo sportello dello scomparto della cella a flusso.

7 Selezionare Next (Avanti) nella schermata Load Flow Cell (Caricamento cella a flusso).Si apre la schermata Load Reagents (Caricamento reagenti).

Caricam

entodeireag

enti


Caricamentodei reagenti

Il caricamento dei reagenti prevede due fasi. Dapprima, si carica il flacone della soluzioneSBS (PR2) e si verifica che il flacone degli scarti sia vuoto. In seguito, si carica la cartucciadi reagenti.

Caricamento della soluzione SBS (PR2) e verifica del flacone degli scarti1 Rimuovere il flacone della soluzione SBS (PR2) dal luogo di conservazione tra 2 °C e

8 °C. Capovolgere delicatamente il flacone per miscelare il contenuto del flacone dellasoluzione SBS (PR2) e poi rimuovere il coperchio.

2 Aprire lo sportello dello scomparto reagenti.

3 Sollevare la maniglia del pettine di aspirazione finché non si blocca in sede.

4 Collocare il flacone della soluzione SBS (PR2) nell'incavo a destra del vano refrigeratoper i reagenti.

Figura 41 Caricamento del flacone della soluzione SBS (PR2)

5 Verificare che il flacone degli scarti sia vuoto. Nel caso non sia vuoto, vuotarne ilcontenuto nell'appropriato contenitore per gli scarti.

6 Abbassare lentamente la maniglia del pettine di aspirazione. Accertarsi che i pescantivengano abbassati nei flaconi della soluzione SBS (PR2) e degli scarti.

Figura 42 Abbassamento della maniglia del pettine di aspirazione

Esecuzione

diuna

corsa


7 Verificare i dati visualizzati nell'angolo inferiore sinistro della schermata per accertarsiche l'etichetta RFID del flacone della soluzione SBS (PR2) sia stata letta correttamente.

NOTASe l'etichetta RFID non può essere letta, le informazioni identificative possono essere inseritemanualmente. Tuttavia, il software permette un solo errore sui tre componenti con etichettaRFID (cella a flusso, cartuccia di reagenti, soluzione SBS (PR2)) su una corsa di genomicaforense. Per maggiori informazioni, vedere Risoluzione degli errori di lettura dell'etichetta RFIDa pagina 70.

8 Selezionare Next (Avanti) nella schermata Load Reagents (Caricamento reagenti).

Caricamento della cartuccia di reagentiNOTANon lasciare lo sportello del vano refrigerato aperto per periodi prolungati.

1 Aprire lo sportello del vano refrigerato per i reagenti.

2 Afferrare la cartuccia di reagenti dall'estremità con l'etichetta Illumina e farla scorrereall'interno del vano refrigerato finché non si arresta.


3 Chiudere lo sportello del vano refrigerato.

4 Verificare i dati visualizzati nell'angolo inferiore sinistro della schermata per accertarsiche l'etichetta RFID della cartuccia di reagenti sia stata letta correttamente.

NOTASe quell'etichetta RFID non può essere letta, le informazioni identificative possono essereinserite manualmente. Tuttavia, il software permette un solo errore sui tre componenti conetichetta RFID (cella a flusso, cartuccia di reagenti, soluzione SBS (PR2)). Per maggioriinformazioni, vedere Risoluzione degli errori di lettura dell'etichetta RFID a pagina 70.

5 Chiudere lo sportello dello scomparto reagenti.

6 Selezionare Next (Avanti) nella schermata Load Reagents (Caricamento reagenti). Siapre la schermata Review (Revisione).

Avvio

della

corsa


Avviodella corsa

Dopo aver caricato la cella a flusso e i reagenti riesaminare i parametri della corsa edeseguire una verifica pre-corsa prima di avviare la corsa.

Revisione dei parametri della corsa1 Rivedere i campi Worklist Name (Nome lista di lavoro), Analysis Workflow (Flusso di

lavoro dell'analisi) e Read Length (Lunghezza lettura). In modalità RUO, questiparametri sono specificati nel foglio campioni.

2 Quando in modalità RUO, rivedere i percorsi delle cartelle nell'angolo inferiore sinistro.Per eventuali modifiche, selezionare Change Folders (Cambia cartelle). Al termine dellemodifiche, selezionare Save (Salva) e successivamente Next (Avanti).

3 Selezionare Next (Avanti). Si apre la schermata Pre-Run Check (Verifica pre-corsa).

Revisione della verifica pre-corsaIl sistema verifica tutti i componenti della corsa, lo spazio su disco e le connessioni di reteprima di avviare la corsa.Se uno o più degli elementi controllati non superano la verifica pre-corsa, appare unmessaggio con le istruzioni per correggere l'errore. Per maggiori informazioni, vedereRisoluzione degli errori d'impostazione della corsa a pagina 69.Dopo che tutte le voci hanno superato con successo la verifica pre-corsa, selezionare StartRun (Avvia corsa).

Nota importante prima di avviare la corsaAVVERTENZAIl sistema MiSeq FGx è sensibile alle vibrazioni. Toccare lo strumento dopo l'avviodella corsa può incidere negativamente sui risultati del sequenziamento.Dopo aver selezionato Start Run (Avvia corsa), non aprire lo sportello dello scomparto dellacella a flusso o lo sportello dello scomparto reagenti, né toccare il monitor dello strumento ameno che non si desideri sospendere la corsa. Per maggiori informazioni, vedere Sospensionedi una corsa a pagina 33.

Esecuzione

diuna

corsa


Monitoraggiodella corsa

1 Durante la corsa, monitorarne l'avanzamento, le intensità e i punteggi qualitativi sullaschermata Sequencing (Sequenziamento). La schermata Sequencing (Sequenziamento) èdi sola visualizzazione. Per maggiori informazioni, vedere Schermata Sequencing(Sequenziamento) a pagina 24. Per una corsa RUO, vedere Schermata Sequencing(Sequenziamento) per RUO a pagina 29.

2 Al termine della corsa, compare il pulsante Next (Avanti). Prima di procedere,esaminare i risultati sulla schermata Sequencing (Sequenziamento).

NOTALa schermata Sequencing (Sequenziamento) è visualizzabile fino a quando si selezionaNext (Avanti). Dopo aver selezionato Next (Avanti), non è possibile ritornare allaschermata Sequencing (Sequenziamento).

3 Selezionare Next (Avanti) per uscire dalla schermata Sequencing (Sequenziamento) eprocedere con un lavaggio post-corsa.

Metriche della corsaLe metriche della corsa appaiono sulla schermata Sequencing (Sequenziamento) in fasidifferenti di una corsa. Durante le fasi di generazione di cluster non appare alcuna metrica.Dopo l'inizio del sequenziamento, in corrispondenza dei cicli indicati appaiono le metricheseguenti:

Metrica Kit CicloIntensità MiSeq FGx Reagent Kit

MiSeq RUO Reagent Kit, v3MiSeq RUO Reagent Kit, v2MiSeq RUO Reagent Kit, v1

Ciclo 1-7Ciclo 1-7Ciclo 1-4Ciclo 1-4

Intensità e densità cluster MiSeq FGx Reagent KitMiSeq RUO Reagent Kit, v3MiSeq RUO Reagent Kit, v2MiSeq RUO Reagent Kit, v1

Ciclo 8-25Ciclo 8-25Ciclo 5-25Ciclo 5-25

Intensità, densità cluster, % PF, resa epunteggi qualitativi

MiSeq FGx Reagent KitMiSeq RUO Reagent Kit, v3MiSeq RUO Reagent Kit, v2MiSeq RUO Reagent Kit, v1

Dal ciclo 26 altermine della corsa

Capitolo4


Capitolo 4 Procedure di manutenzione

Proceduredimanutenzione

Introduzione 56Esecuzione di un lavaggio post-corsa 57Esecuzione di un lavaggio di manutenzione 60Esecuzione di un lavaggio di standby 63Spegnimento dello strumento 66

Proceduredim

anutenzione


Introduzione

Al termine di una corsa di sequenziamento, eseguire sempre un lavaggio dello strumento.I lavaggi dello strumento eseguiti regolarmente assicurano la continuità della prestazionidello strumento per i motivi seguenti:} Eliminano gli eventuali residui di reagenti dai tubi della fluidica e dai pescanti} Impediscono l'accumulo e la cristallizzazione dei sali nei tubi della fluidica e neipescanti

} Impediscono la contaminazione incrociata con la corsa precedente

Frequenza di manutenzioneEseguire le attività di manutenzione descritte nel presente capitolo con la frequenzariportata nelle tabelle seguenti.

Attività Ogni giorno Mensilmente Secondonecessità

Lavaggio post-corsa

Dopo ogni corsa

Lavaggio dimanutenzione

X

Lavaggio distandby

Preparazione alperiodo diinattività

(≥7 giorni di nonutilizzo)

Spegnimentodello strumento

X

Tabella 1 Manutenzione durante il funzionamento normale

Attività Ogni giorno Mensilmente Secondo necessità

Lavaggio distandby

X

Spegnimento dellostrumento

X

Tabella 2 Manutenzione durante il periodo di inattività (≥7 giorni di non utilizzo)

Manutenzione preventivaIllumina raccomanda di eseguire una manutenzione preventiva ogni anno solare. Se non sidispone di un contratto di assistenza, contattare il responsabile dell'account sul territorio ol'Assistenza tecnica Illumina per organizzare un servizio di manutenzione preventiva apagamento.

Esecuzio

nediun

lavaggiopost-co

rsa


Esecuzionedi un lavaggiopost-corsa

Al termine di una corsa di sequenziamento, eseguire sempre un lavaggio dello strumento.Attenersi alle istruzioni del software per caricare i componenti di lavaggio ed eseguire illavaggio. Il lavaggio post-corsa dura circa 30 minuti.

NOTAIl lavaggio post-corsa contiene ipoclorito di sodio. Non usare ipoclorito di sodio per unlavaggio di manutenzione o un lavaggio di standby.

Il software non procederà alle fasi d'impostazione della corsa per una corsa successiva finoa quando non viene eseguito un lavaggio.

NOTALasciare la cella a flusso usata sullo strumento. Per eseguire un lavaggio dellostrumento, è necessario che una cella a flusso sia caricata sullo strumento.

Materiali di consumo forniti dall'utente} Tween 20 (Sigma-Aldrich, n. di catalogo P7949)} Ipoclorito di sodio} Acqua priva di nucleasi

Procedura1 Preparare una soluzione di lavaggio fresca con Tween 20 e acqua priva di nucleasi nel

modo seguente:a Aggiungere 5 ml di Tween 20 100% a 45 ml di acqua priva di nucleasi. Con questi

volumi si otterrà Tween 20 10%.b Aggiungere 25 ml di Tween 20 10% a 475 ml di acqua priva di nucleasi. Con

questi volumi si otterrà una soluzione di lavaggio Tween 20 0,5%.c Capovolgere diverse volte per miscelare.

2 Preparare una soluzione di lavaggio fresca di ipoclorito di sodio con acqua priva dinucleasi nel modo seguente:a Aggiungere 30 µl di ipoclorito di sodio 6% a 870 µl di acqua priva di nucleasi.

Questi volumi forniscono una diluizione di ipoclorito di sodio 1:30.b Aggiungere 50 µl di diluizione di ipoclorito di sodio 1:30 a 950 µl di acqua priva

di nucleasi in una provetta MiSeq fornita da Illumina (n. codice MS-102-9999).

NOTAAssicurarsi di verificare la percentuale di ipoclorito di sodio sull'etichetta delprodotto. È importante utilizzare una concentrazione corretta di ipoclorito di sodio.Se la concentrazione è troppo elevata, potrebbe causare la mancata generazione dicluster nelle corse successive. Se non è disponibile ipoclorito di sodio 6%, creare 1 mldi soluzione di ipoclorito di sodio 0,01% in acqua priva di nucleasi.

c Miscelare bene la diluizione di ipoclorito di sodio e la miscela di acqua, pipettandosu e giù con una micropipetta P1000.

3 Preparare i componenti di lavaggio con soluzione di lavaggio fresca Tween 20 0,5% nelmodo seguente:a Aggiungere 6 ml di soluzione di lavaggio a ciascun serbatoio del vassoio di

lavaggio.b Aggiungere 350 ml di soluzione di lavaggio al flacone di lavaggio da 500 ml.

Proceduredim

anutenzione


4 Inserire la provetta MiSeq contenente la soluzione di lavaggio di ipoclorito disodio 0,01% nella posizione 17 del vassoio di lavaggio fino a quando il collo dellaprovetta viene lavato con il vassoio. La provetta sposta la soluzione di lavaggiocomposta di Tween 20 e di acqua priva di nuclease dalla posizione 17.

Figura 44 Provetta MiSeq nella posizione 17 del vassoio di lavaggio

NOTAAssicurarsi di inserire la provetta MiSeq con ipoclorito di sodio solo nella posizione 17 delvassoio. Se la provetta viene inserita in un'altra posizione potrebbe causare la mancatagenerazione di cluster nelle corse successive e danneggiare il sistema di fluidica dellostrumento MiSeq FGx.

5 Dalla schermata del lavaggio post-corsa, selezionare Start Wash (Avvia lavaggio). Ilsoftware alza automaticamente i pescanti nel vano refrigerato per i reagenti. Prima diproseguire, attendere diversi secondi per permettere ai pescanti di sollevarsicompletamente.

6 Aprire lo sportello dello scomparto reagenti e lo sportello del vano refrigerato per ireagenti e far scorrere la cartuccia di reagenti usata dal vano refrigerato.

7 Far scorrere il vassoio di lavaggio all'interno del vano refrigerato per i reagenti finchénon si arresta poi chiudere lo sportello del vano refrigerato.

8 Sollevare la maniglia del pettine di aspirazione di fronte ai flaconi della soluzione SBS(PR2) e degli scarti finché non si blocca in sede.

9 Rimuovere il flacone della soluzione SBS (PR2) e sostituirlo con un flacone di lavaggio.NOTADopo ciascuna corsa smaltire il flacone della soluzione SBS (PR2). Non riutilizzarealcuna soluzione SBS (PR2) residua.

10 Rimuovere il flacone degli scarti ed eliminarne il contenuto seguendo le opportuneprocedure di smaltimento. Riposizionare il flacone degli scarti nello scompartoreagenti.

AVVERTENZAQuesto set di reagenti contiene formammide, una ammide alifatica che è una probabiletossina riproduttiva. L'inalazione, l'ingestione, il contatto con la pelle o con gli occhipossono causare lesioni personali. Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati inconformità alle norme locali di sicurezza vigenti. Per maggiori informazioni, vedere leSDS per questo kit, all'indirizzo support.illumina.com/sds.html.

11 Abbassare lentamente la maniglia del pettine di aspirazione, accertandosi che ipescanti vengano abbassati nei flaconi di lavaggio e degli scarti.


http://support.illumina.com/sds.html

Esecuzio

nediun

lavaggiopost-co

rsa


13 Selezionare Next (Avanti). Il lavaggio post-corsa ha inizio.Una volta completato il lavaggio, lasciare sullo strumento la cella a flusso usata, il vassoiodi lavaggio e il flacone di lavaggio contenente la soluzione di lavaggio residua. Unapiccola quantità di soluzione di lavaggio rimane nella provetta MiSeq nella posizione 17.

NOTAI pescanti rimangono nella posizione abbassata, il che è normale. Lasciare la soluzionedi lavaggio non utilizzata nel vassoio di lavaggio e nel flacone di lavaggio per evitareche i pescanti asciughino e che entri aria nel sistema.

Proceduredim

anutenzione


Esecuzionedi un lavaggiodimanutenzione

Eseguire un lavaggio di manutenzione ogni 7 giorni per garantire prestazioni ottimali.Questa manutenzione comprende una serie di tre fasi di lavaggio utilizzando unasoluzione di lavaggio di acqua priva di nucleasi miscelata con Tween 20. Il lavaggio dimanutenzione richiede circa 90 minuti.

Materiali di consumo forniti dall'utente} Tween 20 (Sigma-Aldrich, n. di catalogo P7949)} Acqua priva di nucleasi

Procedura1 Accertarsi che una cella a flusso usata sia caricata sullo strumento.

2 Dalla schermata Welcome (Benvenuto), selezionare Perform Wash (Esecuzionelavaggio).

3 Nella schermata Perform Wash (Esecuzione lavaggio), selezionareMaintenance Wash(Lavaggio di manutenzione). Il software alza automaticamente i pescanti nel vanorefrigerato per i reagenti.

Esecuzione del primo lavaggio1 Preparare una soluzione di lavaggio fresca con Tween 20 e acqua priva di nucleasi nel






Esecuzio

nediun

lavaggiodim

anutenzione


3 Caricare sullo strumento il vassoio di lavaggio e il flacone di lavaggio:a Aprire lo sportello dello scomparto reagenti e lo sportello del vano refrigerato per i

reagenti e far scorrere la cartuccia di reagenti usata o il vassoio di lavaggio dalvano refrigerato.

b Far scorrere il vassoio di lavaggio all'interno del vano refrigerato finché non siarresta. Chiudere lo sportello del vano refrigerato.

c Sollevare la maniglia del pettine di aspirazione di fronte al flacone della soluzioneSBS (PR2) e al flacone degli scarti finché non si blocca in sede e sostituire il flaconedella soluzione SBS (PR2) con il flacone di lavaggio.

NOTADopo ciascuna corsa smaltire il flacone della soluzione SBS (PR2). Non riutilizzarealcuna soluzione SBS (PR2) residua.

d Rimuovere il flacone degli scarti ed eliminarne il contenuto seguendo le opportuneprocedure di smaltimento. Riposizionare il flacone degli scarti nello scompartoreagenti.

e Abbassare lentamente la maniglia del pettine di aspirazione, accertandosi che ipescanti vengano abbassati nei flaconi di lavaggio e degli scarti.

f Chiudere lo sportello dello scomparto reagenti.

4 Selezionare Next (Avanti). Il primo lavaggio ha inizio.

Esecuzione del secondo lavaggioNOTAPer ciascuna fase di lavaggio usare sempre una soluzione di lavaggio fresca. Il riutilizzo diuna soluzione di lavaggio usata per un lavaggio precedente può riportare scarti nelle lineedella fluidica.

1 Preparare una soluzione di lavaggio fresca con Tween 20 e acqua priva di nucleasi nelmodo seguente:a Aggiungere 5 ml di Tween 20 100% a 45 ml di acqua priva di nucleasi. Con questi



2 Al termine del primo lavaggio, rimuovere il vassoio di lavaggio e il flacone di lavaggioe smaltire la soluzione di lavaggio rimanente.

3 Riempire di nuovo i componenti di lavaggio con soluzione di lavaggio frescaTween 20 0,5% come segue:a Aggiungere 6 ml di soluzione di lavaggio a ciascun serbatoio del vassoio di


4 Caricare il vassoio di lavaggio e il flacone di lavaggio nel modo seguente:a Far scorrere il vassoio di lavaggio all'interno del vano refrigerato finché non si

arresta. Chiudere lo sportello del vano refrigerato.b Caricare il flacone di lavaggio e abbassare lentamente la maniglia del pettine di

aspirazione, accertandosi che i pescanti vengano abbassati nei flaconi di lavaggio edegli scarti.

c Chiudere lo sportello dello scomparto reagenti.

5 Selezionare Next (Avanti). Il secondo lavaggio ha inizio.

Proceduredim

anutenzione


Esecuzione del lavaggio finale1 Preparare una soluzione di lavaggio fresca con Tween 20 e acqua priva di nucleasi nel




2 Al termine del secondo lavaggio, rimuovere il vassoio di lavaggio e il flacone dilavaggio e smaltire la soluzione di lavaggio rimanente.







5 Selezionare Next (Avanti). Il lavaggio finale ha inizio.

Dopo il lavaggioUna volta completato il lavaggio, lasciare sullo strumento la cella a flusso usata, il vassoiodi lavaggio e il flacone di lavaggio contenente la soluzione di lavaggio residua.

NOTAI pescanti rimangono nella posizione abbassata, il che è normale. Lasciare la soluzione dilavaggio non utilizzata nel vassoio di lavaggio e nel flacone di lavaggio per evitare che ipescanti asciughino e che entri aria nel sistema.

Esecuzio

nediun

lavaggiodistand

by


Esecuzionedi un lavaggiodi standby

Nel caso si preveda di non usare lo strumento nei sette giorni successivi, prepararlo per lostato di inattività (idle) eseguendo un lavaggio di standby. Un lavaggio di standby eseguedue lavaggi consecutivi, che puliscono ciascuna posizione liberandola da ogni reagenteresiduo o accumulo dei sali. Ciascun lavaggio dura circa 60 minuti. Per l'esecuzione dellavaggio di standby prevedere circa due ore.Al termine del lavaggio di standby, lo strumento è in modalità standby e appare unmessaggio sulla schermata Welcome (Benvenuto) che indica lo stato dello strumento.Quando lo strumento è in modalità standby, deve essere eseguito un lavaggio dimanutenzione prima di poter avviare una corsa di sequenziamento. Per informazioni suquando eseguire i lavaggi, vedere Frequenza di manutenzione a pagina 56.

NOTAIllumina consiglia di ripetere il lavaggio di standby ogni 30 giorni di permanenza nello statoinattivo.

Materiali di consumo forniti dall'utente} Tween 20 (Sigma-Aldrich, n. di catalogo P7949)} Acqua priva di nucleasi

Procedura1 Assicurarsi che sullo strumento sia caricata una cella a flusso usata.

2 Dalla schermata Welcome (Benvenuto), selezionare Perform Wash (Esecuzionelavaggio).

3 Nella schermata Wash Options (Opzioni lavaggio), selezionare Standby Wash(Lavaggio di standby). Il software alza automaticamente i pescanti nel vano refrigeratoper i reagenti.

Esecuzione del primo lavaggio1 Preparare una soluzione di lavaggio fresca con Tween 20 e acqua priva di nucleasi nel






Proceduredim

anutenzione


3 Caricare sullo strumento il vassoio di lavaggio e il flacone di lavaggio:a Aprire lo sportello dello scomparto reagenti e lo sportello del vano refrigerato per i

reagenti e far scorrere la cartuccia di reagenti usata o il vassoio di lavaggio dalvano refrigerato.

b Far scorrere il vassoio di lavaggio all'interno del vano refrigerato finché non siarresta. Chiudere lo sportello del vano refrigerato.

c Sollevare la maniglia del pettine di aspirazione di fronte al flacone della soluzioneSBS (PR2) e al flacone degli scarti finché non si blocca in sede e sostituire il flaconedella soluzione SBS (PR2) con il flacone di lavaggio.

NOTADopo ciascuna corsa smaltire il flacone della soluzione SBS (PR2). Non riutilizzarealcuna soluzione SBS (PR2) residua.

d Rimuovere il flacone degli scarti ed eliminarne il contenuto seguendo le opportuneprocedure di smaltimento. Riposizionare il flacone degli scarti nello scompartoreagenti.

e Abbassare lentamente la maniglia del pettine di aspirazione, accertandosi che ipescanti vengano abbassati nei flaconi di lavaggio e degli scarti.

f Chiudere lo sportello dello scomparto reagenti.

4 Selezionare Next (Avanti). Il primo lavaggio ha inizio.

Esecuzione del secondo lavaggioNOTAPer ciascuna fase di lavaggio usare sempre una soluzione di lavaggio fresca. Il riutilizzo diuna soluzione di lavaggio usata per un lavaggio precedente può riportare scarti nelle lineedella fluidica.

1 Preparare una soluzione di lavaggio fresca con Tween 20 e acqua priva di nucleasi nelmodo seguente:a Aggiungere 5 ml di Tween 20 100% a 45 ml di acqua priva di nucleasi. Con questi



2 Al termine del primo lavaggio, rimuovere il vassoio di lavaggio e il flacone di lavaggioe smaltire la soluzione di lavaggio rimanente.







5 Selezionare Next (Avanti). Il secondo lavaggio ha inizio.

Esecuzio

nediun

lavaggiodistand

by


Dopo il lavaggioUna volta completato il lavaggio, lasciare sullo strumento la cella a flusso usata, il vassoiodi lavaggio e il flacone di lavaggio contenente la soluzione di lavaggio residua.

NOTAI pescanti rimangono nella posizione abbassata, il che è normale. Lasciare la soluzione dilavaggio non utilizzata nel vassoio di lavaggio e nel flacone di lavaggio per evitare che ipescanti asciughino e che entri aria nel sistema.

Proceduredim

anutenzione


Spegnimentodello strumento

Di norma, si consiglia di lasciare lo strumento sempre acceso. Tuttavia, nel caso sianecessario spegnere lo strumento, attenersi alla procedura seguente per spegnere Windowse preparare i tubi della fluidica.

1 Eseguire un lavaggio di manutenzione. Per maggiori informazioni, vedere Proceduraa pagina 60.

2 Rimuovere il flacone degli scarti ed eliminarne il contenuto seguendo le opportuneprocedure di smaltimento. Riposizionare il flacone degli scarti nello scompartoreagenti.


4 Dalla schermata Manage Instrument (Gestione strumento), selezionare Shut Down(Spegnimento). Questo comando spegne il software.

Figura 45 Schermata Manage Instrument (Gestione strumento)

5 Portare l'interruttore di alimentazione nella posizione OFF.

NOTAOgni volta che si spegne lo strumento, attendere almeno 60 secondi prima di riaccenderloportando l'interruttore di alimentazione su ON.

Capitolo5


Capitolo 5 Risoluzione dei problemi

Risoluzionedeiproblemi

Introduzione 68Risoluzione degli errori d'impostazione della corsa 69Risoluzione degli errori di lettura dell'etichetta RFID 70Evitare il riavvio durante una corsa 72Risoluzione dei problemi per l'errore della portata 73Esecuzione di un test volume 74Misura dei volumi di lavaggio previsti 76

Risoluzione

deiproblemi


Introduzione

Questa sezione descrive comuni passi per la risoluzione dei problemi da seguire prima dirivolgersi all'Assistenza tecnica Illumina. Per la maggior parte dei problemi, appare unmessaggio sullo schermo con istruzioni per la risoluzione.Per eventuali domande tecniche, visitare le pagine di supporto relative a MiSeq FGx sulsito Web Illumina per accedere alle domande frequenti, oppure eseguire il log in sulproprio account MyIllumina per prendere visione dei bollettini di assistenza.Per problemi relativi alla qualità della corsa o alle prestazioni, rivolgersi all'Assistenzatecnica Illumina. Per maggiori informazioni, vedere Assistenza tecnica a pagina 79.L'addetto dell'Assistenza tecnica Illumina potrebbe chiedervi di fornire copie dei filespecifici della corsa, con lo scopo di risolvere il problema. I seguenti file sono collocati alivello base della cartella di output della corsa:} SampleSheet.csv se si usa lo strumento in modalità RUO} RunParameters.xml} RunInfo.xml} Cartella InterOp

Riso

luzione

deg

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'impostazio

nedella

corsa


Risoluzionedegli errori d'impostazionedella corsa

Se durante la verifica pre-corsa uno qualsiasi dei controlli non è superato, appare un'iconarossa vicino all'elemento interessato. Sullo schermo viene visualizzato un messaggio chedescrive l'errore e il modo per correggerlo.

Errore InterventoFlow Rate Measured

(Portata misurata)Si apre la schermata per la verifica della portata. Utilizzare l'elenco a discesa o latastiera sullo schermo per inserire quanto segue:• Solution (Soluzione): PR2• Volume (Volume): 250• Aspirate Rate (Velocità di aspirazione): 2500• Dispense Rate (Velocità di erogazione): 2500Selezionare Pump (Pompa). Se l'errore permane, impostare il volume perpompare 500 µl di soluzione SBS (PR2) e ripetere il processo. Dopo l'erogazionedei fluidi, selezionare Restart Check (Riavvia verifica).Se la verifica pre-corsa viene eseguita correttamente, il pulsante Start Run(Avvia corsa) diventa attivo.Se la verifica del flusso non viene superata nuovamente, ricollocare nella suasede la cella a flusso per assicurare che il flusso non si interrompa a causa di unaallineamento errato. Ispezionare la guarnizione della cella a flusso per verificareche non siano presenti particelle estranee o irregolarità.

Free Disk Space (Spaziolibero su disco)

Se lo spazio su disco è insufficiente, viene visualizzato un messaggio indicante lospazio necessario. Usare la funzioneManage Files (Gestione file) per liberare lospazio necessario sul computer dello strumento.

Network ConnectionActive (Connessione reteattiva)

Verificare che il cavo di rete sia ben collegato allo strumento.Se la connessione alla rete non è ripristinata, selezionare Reboot (Riavvia) sullaschermata Manage Instrument (Gestione strumento) per riavviare il software.Se la connessione continua a non essere ripristinata, selezionare Shut Down(Spegnimento) sulla schermata Manage Instrument (Gestione strumento), poispegnere lo strumento utilizzando l'interruttore di alimentazione. Attenderealmeno 60 secondi e poi accendere lo strumento e avviare il software.

Primary Analysis Ready(Analisi primaria pronta)

L'analisi RTA della corsa precedente non è terminata. Il tempo preimpostatoconcesso per la conclusione dell'analisi RTA è un'ora e sullo schermo compare unconteggio alla rovescia. Le opzioni sono di attendere un'ora o di selezionareTerminate Analysis (Termina analisi). L'analisi con ForenSeq Universal AnalysisSoftware si arresta per i cicli incompleti.

Sample Sheet Present(Foglio campioni presente)

Se il foglio campioni non è stato denominato con l'ID della cartuccia di reagenti,lo strumento non può individuare automaticamente il foglio campioniappropriato. Navigare fino a raggiungere il foglio campioni della corsa.Se il foglio campioni è stato denominato con l'ID della cartuccia di reagenti per lacorsa, accertarsi che il foglio campioni sia collocato nella cartella predefinita delfoglio campioni. Controllare il percorso predefinito in Run Options (Opzionicorsa) sulla schermata Welcome (Benvenuto).Accertarsi che l'estensione file del foglio campioni sia *.csv.Se il foglio campioni risulta irreperibile, crearne uno nuovo e copiarlo nellacartella del foglio campioni specificata in Run Options (Opzioni corsa).Dopo aver individuato un foglio campioni, selezionare Restart Check (Riavviaverifica).

Risoluzione

deiproblemi


Risoluzionedegli errori di lettura dell'etichettaRFID

Gli errori di lettura dell'etichetta RFID sono attivati se:} Il componente caricato non fa parte di un kit forense.} Per una corsa RUO, il componente caricato non fa parte del kit identificato dal fogliocampioni.

} Errore tecnico con l'etichetta RFID nel componente.Le fasi seguenti possono essere utilizzate per risolvere gli errori di lettura dell'etichettaRFID risultanti da un guasto tecnico.

NOTAPer una corsa è permesso che si verifichi un solo errore di lettura dell'etichetta RFID.Nel caso l'etichetta RFID non possa essere letta su due materiali di consumo, ilsoftware non può procedere con la fase d'impostazione della corsa successiva. Inquesto caso, contattare l'Assistenza tecnica Illumina.

Cella a flusso1 Riprovare sempre una seconda volta l'operazione di lettura dell'etichetta RFID prima

di continuare. A tale scopo, aprire e poi chiudere lo sportello dello scomparto dellacella a flusso.

2 Se la lettura RFID non riesce una seconda volta, aprire lo sportello dello scompartodella cella a flusso e rimuovere delicatamente la cella a flusso.

3 Verificare che la cella a flusso e il piano portacelle non presentino particelle estranee osali che potrebbero arrestare la lettura RFID.

4 Ricollocare la cella a flusso. Assicurarsi che il coperchio a scatto ponga la cella a flussonell'allineamento corretto.

5 Chiudere lo sportello dello scomparto della cella a flusso.

6 Se la lettura RFID continua a non riuscire, selezionare l'icona della tastiera per aprire latastiera sullo schermo.

7 Inserire il numero del codice a barre della cella a flusso, che si trova sull'etichetta delcontenitore della cella a flusso direttamente sotto il codice a barre. Selezionare Done(Fine).

8 Sezionare Next (Avanti) per procedere con la fase d'impostazione della corsasuccessiva.

Flacone della soluzione SBS (PR2)1 Riprovare sempre una seconda volta l'operazione di lettura dell'etichetta RFID prima

di continuare. A tale scopo, alzare e poi abbassare la maniglia del pettine diaspirazione.

2 Se la lettura RFID non riesce una seconda volta, aprire lo sportello dello scompartoreagenti. Sollevare la maniglia del pettine di aspirazione e rimuovere il flacone dellasoluzione SBS (PR2).

3 Verificare che il flacone della soluzione SBS (PR2) e dello scomparto reagenti nonpresentino particelle estranee o sali che potrebbero arrestare la lettura RFID.

4 Sostituire il flacone della soluzione SBS (PR2) e abbassare lentamente la maniglia delpettine di aspirazione finché non si blocca in sede. Accertarsi che i pescanti venganoabbassati nei flaconi della soluzione SBS (PR2) e degli scarti.

Riso

luzione

deg

lierrorid

iletturadell'etichetta

RFID


5 Se la lettura RFID continua a non riuscire, selezionare l'icona della tastiera per aprire latastiera sullo schermo.

6 Inserire il numero del codice a barre del flacone della soluzione SBS (PR2), che si trovasull'etichetta del flacone della soluzione SBS (PR2) direttamente sotto il codice a barre.Selezionare Done (Fine).


Cartuccia di reagenti1 Riprovare sempre una seconda volta l'operazione di lettura dell'etichetta RFID prima

di continuare. A tale scopo, aprire e poi chiudere lo sportello del vano refrigerato per ireagenti.

2 Se la lettura RFID non riesce una seconda volta, aprire lo sportello del vano refrigeratoper i reagenti e rimuovere la cartuccia.

3 Verificare che la cartuccia di reagenti e il vano refrigerato per i reagenti non presentinoparticelle estranee o sali che potrebbero arrestare la lettura RFID.

4 Sostituire la cartuccia di reagenti e chiudere lo sportello del vano refrigerato per ireagenti.

5 Se la lettura RFID continua a non riuscire, selezionare Enter Reagent Kit Barcode(Inserire codice a barre kit di reagenti).

6 Inserire il numero del codice a barre del kit di reagenti, che si trova sull'etichetta del kitimmediatamente sotto il codice a barre.

7 Inserire il numero di codice del kit di reagenti, che si trova alla destra del REFsull'etichetta del kit di reagenti.

Figura 46 Inserimento delle informazioni dei reagenti

8 Selezionare Next (Avanti) per ritornare alla schermata Load Reagents (Caricamentoreagenti).


Risoluzione

deiproblemi


Evitare il riavviodurante unacorsa

Se il sistema MiSeq FGx si riavvia durante una corsa, è possibile che il software WindowsUpdate della rete è configurato per installare automaticamente gli aggiornamenti delsoftware. Questa impostazione avrebbe dovuto essere disattivata durante l'installazione.Rivolgersi al dipartimento IT locale per assistenza sulla disattivazione degli aggiornamentiautomatici del sistema operativo Windows eseguiti in background su MiSeq FGx.

NOTAUn riavvio termina la corsa e questa non può essere recuperata. La corsa deve essere avviatanuovamente dall'inizio.

Riso

luzione

deip

roblem

iper

l'errore

della

portata


Risoluzionedei problemiper l'errore della portata

La portata è la velocità alla quale i fluidi transitano nel sistema di fluidica (µl/min). Laportata viene misurata prima di ciascuna corsa durante la verifica pre-corsa. Se il sistemanon è in grado di misurare la portata, pompare un volume di reagente (soluzione SBS(PR2)) attraverso il sistema prima di una nuova verifica della portata.

1 Utilizzare l'elenco a discesa o la tastiera sullo schermo per inserire le seguentiinformazioni:• Solution (Soluzione): PR2• Volume (Volume): 250 µl• Aspirate Rate (Velocità di aspirazione): 2500 µl/min• Dispense Rate (Velocità di erogazione): 2500 µl/min

2 Selezionare Pump (Pompa).

Figura 47 Misura della portata

3 Una volta terminata la fase di pompaggio, selezionare Restart Check (Riavviaverifica).

4 Se l'errore persiste, impostare il volume per pompare 500 µl di soluzione SBS (PR2) eripetere il processo ancora una volta. Se il secondo tentativo non risolve l'errore,contattare l'Assistenza tecnica Illumina.

Risoluzione

deiproblemi


Esecuzionedi un test volume

Un'ostruzione nelle linee della fluidica può provocare scarsa erogazione dei reagenti eincidere sui risultati del sequenziamento. Nel caso si sospetti un'ostruzione nelle linee dellafluidica, eseguire un test volume.Il test volume verifica lo stato del sistema di fluidica stimando il volume tra due bolle alloro passaggio tra i sensori. Per eseguire un test volume, caricare una cella a flusso usatasul dispositivo quindi caricare il vassoio di lavaggio e il flacone di lavaggio con acquapriva di nucleasi. Per eseguire il test, attenersi alle istruzioni sullo schermo.1 Accertarsi che una cella a flusso usata sia caricata sullo strumento.2 Dalla schermata Manage Instrument (Gestione strumento), selezionare System Check

(Verifica sistema).3 Selezionare Conduct Volume Test (Esegui test volume) e quindi selezionare Next

(Avanti).Figura 48 Schermata System Check (Verifica sistema)

4 Riempire ciascun serbatoio del vassoio di lavaggio con 6 ml di acqua priva dinucleasi.

5 Riempire con 350 ml di acqua priva di nucleasi il flacone di lavaggio da 500 ml.6 Caricare sullo strumento il vassoio di lavaggio e il flacone di lavaggio.

a Aprire lo sportello dello scomparto reagenti e lo sportello del vano refrigerato per ireagenti e fare scorrere il vassoio di lavaggio verso il vano refrigerato fino al puntodi arresto. Chiudere lo sportello del vano refrigerato.

b Sollevare la maniglia del pettine di aspirazione finché non si blocca in sede ecaricare il flacone di lavaggio.

c Rimuovere il flacone degli scarti ed eliminarne il contenuto seguendo le opportuneprocedure di smaltimento. Riposizionare il flacone degli scarti nello scompartoreagenti.

d Abbassare lentamente la maniglia del pettine di aspirazione, accertandosi che ipescanti vengano abbassati nei flaconi di lavaggio e degli scarti.

7 Seguendo le istruzioni sullo schermo, rimuovere le eventuali goccioline dal pescantedel flacone di lavaggio, come segue:

Esecuzio

nediun

testvolum

e


a Quando compare la corrispondente istruzione, sollevare lentamente la maniglia delpettine di aspirazione e verificare se sul pescante del flacone di lavaggio è presenteuna grossa gocciolina d'acqua.

b Quando compare la corrispondente istruzione, abbassare lentamente la manigliadel pettine di aspirazione a sufficienza nell'acqua per consentire che la tensionesuperficiale rimuova la gocciolina.

c Quando compare la corrispondente istruzione, sollevare lentamente la maniglia delpettine di aspirazione e verificare se sul pescante del flacone di lavaggio è presenteuna grossa gocciolina d'acqua.

d Quando compare la corrispondente istruzione, abbassare lentamente in modocompleto la maniglia del pettine di aspirazione, accertandosi che i pescantivengano abbassati nei flaconi di lavaggio e degli scarti.

Figura 49 Rimozione di una gocciolina dal pescante

8 Selezionare Next (Avanti). Ha inizio il test volume.Una volta terminato il test volume, sullo schermo appaiono i risultati.Figura 50 Risultati del test volume

Se il test non viene superato, eseguire un lavaggio di manutenzione. Vedere Proceduraa pagina 60.

9 Al termine del lavaggio di manutenzione, ripetere il test volume.

Risoluzione

deiproblemi


Misura dei volumidi lavaggioprevisti

La misurazione dei volumi di lavaggio previsti conferma che la fluidica di lavaggio stafunzionando in modo efficiente.

1 Prima d'iniziare un lavaggio, svuotare il flacone degli scarti.

2 Al termine del lavaggio, misurare il volume di lavaggio nel flacone degli scarti.

Tipo di lavaggio Volume di lavaggio previstoLavaggio post-corsa 25,5 mlLavaggio di standby 46 mlLavaggio di manutenzione 17,25 ml

Indice


Indice

Aaccensione dello strumento 6analisidurante il sequenziamento 37opzioni 36

arresto di una corsa 33assistenza tecnica 79avvisi email 16avviso di stato, icona 13

BBaseSpace 26connessione 12

Ccaricamento cella a flusso 22, 26caricamento dei reagenticartuccia 52soluzione SBS 51

caricamento reagenti 23, 27cartelle corsadenominazione 32

cartelle della corsatemp, output, analisi 32

cartelle delle corsegestione 14

cella a flussocaricamento 22, 26, 49panoramica 4pulizia 47

cicli in una lettura 32componenticella a flusso 4modulo ottica 3scomparto della cella a flusso 3-4scomparto reagenti 3, 5

connessione rete 69copia di file e cartelle 14

Ddensità cluster 24documentazione 79durata corsa 32

Eeliminazione di file e cartelle 14

Ffile manifestcopiare sullo (verso lo) strumento 14

filtro Chastity 24flacone degli scarti 5fluidicalavaggio 60, 63risoluzione dei problemi 73-74

flusso di lavorodurata corsa 32

foglio campionicopiare sullo (verso lo) strumento 14non trovato 69

Ggenerazione della griglia 31guida, Live Help (Assistenza in diretta)

34guida, tecnica 79

Iiconeavviso di stato 13errori e avvertenze 13indicatori di attività 12sensore 12

identificazioni delle basi 24impostazione dello strumento 19impostazioni della rete 20impostazioni di sistema 20indicatori di attività 12indicatori di rilevamento 12indirizzo IP 20inizializzazione 69intensità 24interruttore di alimentazione 6

Llavaggibenefici di 56impostazioni lavaggio post-corsa 16manutenzione 13, 60post-corsa 57preparazione allo spegnimento 66preparazione allo stato inattivo (idle)

63standby 13, 63volumi previsti 76

lavaggio di manutenzione 60lavaggio di standby 63lavaggio manutenzione 13lavaggio post-corsa 57lavaggio standby 13Live Help (Assistenza in diretta) 34lunghezza lettura 32

Mmaniglia del pettine di aspirazione 5materiali di consumoforniti da Illumina 7forniti dall'utente 7

materiali di consumo fornitidall'utente 7

Indice


MiSeq Reporterpanoramica 36

modulo ottica 3monitoraggio della corsa 24, 29, 54morsetto della cella a flusso 4

Nnome dominio 20nome utente 6

Oopzioni corsa 16

Ppassword 6porre lo strumento in stato inattivo

(idle) 63portata, risoluzione dei problemi 73posizione cartelleimpostazioni predefinite 16

QQ-scores (punteggi qualitativi) 24

Rraggruppamento registri 15reagenticaricamento 23, 27, 51nel kit 7

Real Time Analysis (RTA)cartella della corsa 32generazione della griglia 31

RFIDcartuccia dei reagenti 52cella a flusso 49risoluzione dei problemi 70soluzione SBS 51

riavvio del software (reboot) 19ricette, gestione 14riferimenti genomici 14risoluzione dei problemierrori impostazione corsa 69file specifici per la corsa per 68fluidica 74portata 73raggruppamento registri 15RFID 70

Sschermata Sequencing

(Sequenziamento) 24, 29, 54schermata Welcome (Benvenuto) 11schermate impostazione corsa 25casi forensi 22database 22

scomparto della cella a flusso 3-4scomparto reagenti 3, 5selezione di una corsa 22sensore sportello cella a flusso 12Sequencing Analysis Viewer (SAV) 29,

54softwaredurata corsa 32impostazione dello strumento 19

inizializzazione 6verifica spazio su disco 33

soluzione SBS, caricamento 51sospensione di una corsa 33spazio su discospazio su disco insufficiente 69verifica 33

spegnimento dello strumento 19, 66spostamento di file e cartelle 14

Ttest volume 74

Vvano refrigerato per i reagenti,

temperatura 12volumi di lavaggio 76

WWindows, ridurre a 19

Assistenza

tecnica


Assistenza tecnicaPer assistenza tecnica, contattare l'Assistenza tecnica Illumina.

Sito Web www.illumina.com

E-mail [email protected]

Tabella 3 Dati di contatto generali Illumina

Area geografica Numero di contatto Area geografica Numero di contattoNord America 1.800.809.4566 Italia 800.874909Australia 1.800.775.688 Norvegia 800.16836Austria 0800.296575 Nuova Zelanda 0800.451.650Belgio 0800.81102 Paesi Bassi 0800.0223859Danimarca 80882346 Regno Unito 0800.917.0041Finlandia 0800.918363 Spagna 900.812168Francia 0800.911850 Svezia 020790181Germania 0800.180.8994 Svizzera 0800.563118Irlanda 1.800.812949 Altri paesi +44.1799.534000

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Guida di consultazione dello strumento MiSeq FGx · 2016-11-26 · SOLO A USO DI RICERCA, FORENSE O PER PATERNITÀ DI PROPRIETÀ DI ILLUMINA N. codice 15050524 Rev. C ITA Febbraio