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Hepatitis C
Diagnóstico en un solo paso
Dra. Aitziber Aguinaga Pérez
Servicio de Microbiología Clínica
Complejo Hospitalario Navarra
Hepatitis C. Diagnóstico en un solo paso
• Epidemiología VHC
• Marcadores de la infección
• Ag core VHC
• Experiencia con el Ag core VHC en CHN
• Diagnóstico:
-Algoritmo convencional
-Diagnóstico en un solo paso
• Conclusiones
En 2016, La OMS se propuso como estrategia mundial eliminar la hepatitis viral como
un problema de Salud Pública en 2030.
La eliminación se definió como un 90% de reducción en nuevas infecciones crónicas y
un 65% de reducción en la mortalidad comparado con los datos de 2015.
2030
Diagnosticar 90% de los infectados
Tratar 80% de los diagnosticados
2015, VHC
20% pacientes infc estaban diagnosticados
7% habían iniciado tratamiento
Tratamiento AAD
Seguros
Altamente efectivos
Pangenotípicos
Reducción de precios
Diagnóstico
Sencillo
Búsqueda activa
Prevención
Transmisión Sangre
Virus de la Hepatitis C (1989)
• Familia: Flaviviridae
• Género: Hepacivirus
• Características: ssRNA (+)
Restrepo JC. Medicina
&Laboratorio 2011;17:411-28.
RNA (9400
nucleótidos)
Core
Glicoproteínas
Envoltura
ɸ: 55-65 nm
• Gran variabilidad genética
• Cuasiespecies
•7 GT, >65 SubT,
Lancet Gastroenterol Hepatol. 2017 Mar;2(3):161-176.
Historia natural VHC
Guidelines for the screening, care and treatment of persons with chronic hepatitis C infection.
World Health Organization, April 2016.
Edad avanzada, obesidad, esteatosis, alcohol, ADVP, coinfección VIH, VHB
Trasplante hepático
70% 4% per year
Extrahepatic
manifestactions
Datos WHO (2018)
referidos 2015:
* 1.75 millones de
nuevas infecciones
* 71 millones de
personas viven con
VHC crónica
* 2.3 millones de
personas VIH-VHC
* 399000 Fallecidos
por VHC estadío final
* 843000 Curados
Prevalencia mundial:
1%
7
Plan Estratégico Nacional de la Hepatitis C,
2015
Bruguera 2006. En España entre 1994-2004 prevalencia: 1.6-2.6%.
García Comas 2015. Estudio en Madrid 2008-2009 prevalencia 1.8%.
Enero 2015 (Situación previa al plan estratégico):* 4269 persona con diagnóstico de Ac VHC positivo: 7/1000
habitantes de haber tenido infección VHC (virémicos: 2,4/1000 hab)* 10% de los pacientes VHC +, Co-VIH* 47% de los pacientes VIH+, Co-VHC (transmisión en UDP)
Navarra
“Evaluación de intervenciones preventivas y terapéuticas frente a la infección por el virus de la hepatitis C (EIPT-VHC)” financiado por el Plan estratégico Nacional de la hepatitis C a través del Instituto de Salud Carlos III (2015-2019). (CM17/00095 and INT17/00066). Liderado por Dr. Jesús Castilla (Salud Pública)
Conclusiones:
Prevalencia de ac-VHC y de
infecciones no diagnosticadas
inferior a la propuesta en España
(1.7, 60%, respectivamente).
PER:1/1/2014-30/09/2016
Protocolo preqgico MF;
CP, Otorrino, Oftalm, CC
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Diagnóstico- Marcadores de infección VHC
Ac VHC
1ª G Ab test (NS4) 3ª G Ab test (Core, NS3, NS4 y NS5)
2ª G Ab test (Core, NS3 y NS4)
P. Ventana
Días
Ac anti-VHC (Architect/Alinity, Abbott)
• Ensayo cualitativo (3G)
• Quimioluminiscencia de 2 pasos
• Dirigido a determinar ac vs proteínas estructurales y no estructurales.
• Proteína HCr43 compuesta por 2 regiones codificantes no contiguas; aa 1192-1457 del NS3
• Proteína c100-3NS3 y NS4
• S: 99.1% (IC 95%: 96.77-99.89%)
• E: 99.2% (IC 95%: 99.45-99.71%)
Testing for HCV Infection: An Update of Guidance for Clinicians and Laboratories. MMWR May 10, 2013 / 62(18);362-365.
Screening S/CO Valuen % n % n %
<2.5 8 21.62 3 8.11 26 70.002.5-4.9 7 41.18 4 23.53 6 35.29
TOTAL <5 15 27.78 7 12.96 32 59.265-9.99 9 75.00 2 16.67 1 8.00>10 35 97.22 1 2.78 0 0
TOTAL >5 44 91.67 3 6.25 1 2.08
Confirmatory assay INNOLIAPOSITIVE INDETERMINATE NEGATIVE
Conclusions:
1. The result of the S/CO value is useful to determine the true positives: 27.78% ≤ 5 are true
positives; however when S/CO is >5, 91.67% are true positives. With S/CO values >10,
97.22% are true positives.
2. Performing on the same serum sample the confirmatory test has the advantage of avoiding
possible false positive reports and reporting the true positives without delay. 9.80% of the
samples have indeterminate results in the confirmatory test and require monitoring over
time.
Correlation between a confirmatory test and S/CO values in the initial HCV antibody assay. Navascués A., Aguinaga A, Polo I. et al.
PEP: 1/01/2015-30/09/2015
• Inmunoensayo de 3 G
• Incorpora Ag derivados región del core, región hipervariable E2, NS3 helicasa, región NS4A, región NS4B y región NS5A (adheridos a la tiranylon).
Confirmatorio Ac anti-VHC (INNO-LIA HCV Score, FUJIREBIO)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
RNA VHC
Ac VHC
HCV RNA
P. Ventana
Diagnóstico- Marcadores de infección VHC
Días
3ª G Ab test 2ª G Ab test 1ª G Ab test
Sample preparation
Sampletransfer
Result calculation
Result delivery to LIS
Amplification & detection
Cobas ® 6800 System, Roche
preparationResult
calculationResult
delivery to LISAmplification & detection
Desnaturalización
Hibridación de los primers-extensión
Pol
Extracción/purificación
Rango detección:
VHC: 15-1x108 UI/mL
Diagnóstico infección aguda,
crónica activa,
monitorización AAD,
Inmunosuprimidos
Genotipado VHC- Line probe assay (LiPA) VERSANT HCV Genotype 2.0 (Siemens)
BCIP/NBT
Secuenciación
RNA VHC
Ag VHC
Ac VHC
P. Ventana
- 1ª gen (1996): ELISA Detectan la fracción libre� periodo ventana. Cualitativo. (Ortho)
- 2ª gen (1999): ELISA Detecta fracción libre y ligada a Ig, pretratamiento manual. Cuantitativo. (Ortho)
- 3ª gen (2006): MEIA Detecta fracción libre y ligada a Ig, pretratamiento automatizado (Abbott)
Diagnóstico- Marcadores de infección VHC
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
3ª G Ab testHCV Antígeno coreHCV RNA
Días
Antígeno core VHC
(Architect/Alinity, Abbott)
Ensayo Quimioluminiscencia (2 pasos)
Ac monoclonales vs Ag core
Paso previo: Pretratamiento- Ruptura de inmunocomplejos
Rango: 3 fmol/L-20000 fm/L
Solución
Pretratamiento +
Suero (Agc VHC)
Ac VHC Ag core
paramagnetic
microparticle.
WASH
Anti-TC:acridinium
conjugate (mouse, moncl.)
is added.
Conjugate binds to TC
bound to solid phase.
Unbound conjugate
is removed. Rate of chemiluminescence is
directly proportional to Agc VHC
in sample.
basic pH + peroxide
light
acridinium
WASH
Suero (VHC Ag core)
Características marcadores de replicación
ARN VHC (Carga viral) Antígeno core VHC
– marcador de viremia
– infección aguda
– diagnóstico de infección vertical
– confirma hepatitis crónica C
– confirma VHC en pacientes con una alteración de la inmunidad humoral
– monitorización de la respuesta al tratamiento antiviral.
3fm/L
GT RNA (UI/mL)
1a 507
1b 405
2 600
3 771
4 RNA (+)/Ag (-): RNA: 73- 814 IU/ml
6 RNA(+)/AgVHC(-): 5 RNA: 75-249 UI/ml , 1 RNA 6572 UI/ml
No Falsos Positivos de Ag
Conclusions
HCVcAg assays with signal amplification havehigh sensitivity, high specificity, and goodcorrelation with HCV RNA greater than 3000 IU/mL. HCVcAg assays have the potential toreplace NAT in high HCV prevalence settings.
Freiman JM et al. Annals of Internal Medicine, 2016
IV Congreso Nacional de Hepatitis
(Gehep/SEIMC) Cordoba 2018
17189 CV - 595 (3.46%) CV < 5000 UI/mL
64 (0.37%) pacientes naïve
2735 Ag - 83 (3%) <3fmol/l
34 (0.18%) pacientes naïve
Eficacia del Ag core monitorización/RVS con AAD
(99.83%)
Discusión-conclusiones: Ag core fue capaz de determinar 98.7% de pacientes virémicos al inicio de tratamiento.
Fue capaz de diferenciar entre SVR y NO-SVR 12w en un 100%. (95.9%).
Objetivo: evaluar la utilidad del Ag
core para la monitorización y
fracaso del tratamiento AAD.
MyM: Estudio prospectivo
monitorización: 262 pacientes en
2015 (Baseline, +1w, +4w, End T,
+12w)
Estudio retrospectivo de
muestras 132 pacientes con fracaso
AAD
VRS 12 S: 3 FP Ag c (Ag c P, RNA N) Seguimiento 24 S: 3 Ag c N y RNA N
VRS 12 S: 1 FN Ag c (Ag c N, RNA 1288 UI/mL), No hubo muestra seguimiento 24 S
Coste/efectivo
↑Screening
Dudoso RVS
Octubre 2016-Enero 2017 Noviembre 2016-febrero 2017 Febrero-Agosto 2017 Junio-Diciembre 2017
Control al inicio de tratamiento Control S4 tratamiento Control FIN tratamiento
(S12/24)Control +12S
post-tratamiento(S 8/12/16/24)
Determinación Ag core VHC CHN
HCV core antigen: useful in the diagnosis and management of patients treatment with AAD. J hepatol 2018 (In press)
Cribado (40 muestras/40 pacientes (44%), 91 nuevos diagnósticos)
Fracaso tratamiento (14 muestras/14 pacientes (36%) 39 fracasos AAD)
Inicio de tratamiento (249 muestras/70 pacientes (13.8%), 507 pacientes):
P. estudio: octubre 2016- diciembre 2017
VariableTotal
(N=124)Treatment
(N=70)Screening
(N=40)Failure Ttm
(N=14)n(% ) n(% ) n(% ) n(% )
Age Medium (sd) 52,4(10,5) 51,2(8,4) 51,9(14,5) 51,1(5,9)
Gender Men 87(70,2) 50(71,4) 24(60) 13(92,8) Female 37(29,8) 20(28,6) 16(40) 1(7,2)Group patients Treatment 70(56,5) 70(100) - - Screening 40(32,3) - 40(100) - Failure 14(11,3) - - 14(100)
No 99(79,8) 49(70) 39(97,5) 14(100) Sí 22(18,2) 21(30) 1(2,5) 0Genotype 1a 45(37,2) 26(37,1) 12(32,5) 7(50) 1b 27(22,3) 14(20) 11(29,7) 2(14,3)_2 7(5,8) 6(8,6) 1(2,7) 0_3 30(24,8) 13(18,6) 13(35,1) 4(28,6)_4 12(9,9) 11(15.7) 0 1(7,1)
HIV Co-infection
Determinación Ag core VHC CHN
Determinación Ag core VHC CHN
Negative Positive Negative Positive Negative Positive
HCV-cAg Negative 166 4 2 1 0 0
Indeterminate 5 2 0 1 0 0
Positive 3 123 0 36 0 14
VL VL VL
Total (n=303) Screening (n=40) Failure (n=14)
HCV-cAg Negative
Indeterminate
Positive
Negative Positive Negative Positive Negative Positive Negative Positive
0 0 0 39 3 62 0 63 0
0 0 0 2 1 2 0 1 0
14 0 69 1 2 2 0 0 2
VL VL VL
Treatment (n=70)
VLBaseline 4 weeks End treatment 12 weeks Post-ttm
Se (%) Sp(%) Se(%) Sp(%) Se(%) Sp(%)
3 97(92,99) 95(91,98) 97(92,99) 94(88,97) 98(91,100) 95(77,100)10 95(89,98) 98(95,100) 94(88,98) 97(93,99) 95(77,100) 100(91,100)
2 98(93,100) 95(91,98) 98(93,100) 94(88,97) 95(77,100) 98(91,100)5 96(91,99) 98(94,99) 96(90,99) 96(91,99) 95(77,100) 100(91,100)6 95(90,98) 98(94,99) 95(89,98) 96(91,99) 95(77,100) 100(91,100)12 95(89,98) 99(96,100) 94(88,98) 98(94,100) 95(77,100) 100(91,100)
Puntos de corte clásicos
Otros puntos de corte alternativos
Total CO-VIH no CO-VIH sí
Se (%) Sp(%) Se (%) Sp(%) Se (%) Sp(%)
3 97(92,99) 95(91,98) 98(89,100) 93(83,98) 100(82,100) 91(82,100)
10 95(89,98) 98(95,100) 96(86,100) 98(91,100) 100(82,100) 94(80,99)
Se (%) Sp(%) Se (%) Sp(%) Se (%) Sp(%)
3 100(47,100) 100(66,100) 100(83,100) 97(86,100) 86(57,98) 100(83,100)10 86(42,100) 100(66,100) 97(82,100) 100(86,100) 86(57,98)100(83,100)
Puntos de corte clásicos
Puntos de corte clásicos
Genotipo 2 Genotipo 3 Genotipo 4
Total Genotipo 1a Genotipo 1b
Subgrupos de pacientes Nδ ROC(95% IC)
NºMuestra total 303(91%) 0.987(0.972, 1.000) 174Según situación
Recta de regresión CV vs Ag IC95% (b) R2
Total Log10 CV = 1.77* Log10 Ag + 0.22 (1.71,1.82) 0.932
Co-VIH
SI Log10 CV = 1.84* Log10 Ag + 0.16 (1.75,1.92) 0.958
NO Log10 CV = 1.75* Log10 Ag + 0.23 (1.68,1.81) 0.926
Genotipo
1a Log10 CV = 1.72* Log10 Ag + 0.17 (1.65,1.80) 0.957
1b Log10 CV = 1.69* Log10 Ag + 0.04 (1.55,1.82) 0.913
2 Log10 CV = 2.00* Log10 Ag + 0.29 (1.64,2.36) 0.877
3 Log10 CV = 2.00* Log10 Ag + 0.24 (1.88,2.12) 0.948
4 Log10 CV = 1.75* Log10 Ag + 0.25 (1.64,1.87) 0.958
Determinación Ag core VHC CHN
Conclusión
Antígeno-core VHC es técnica con una alta correlación con respecto a la técnica gold
standard, útil para el seguimiento de pacientes en tto con AAD frente VHC, detección
de nuevos casos y fracasos de tratamiento.
ARN VHC (Carga viral) Antígeno core VHC
Marcador de viremia
Infección aguda
Diagnóstico de infección vertical
Confirma hepatitis crónica C
Confirma VHC en pacientes con una alteración de la inmunidad humoral
Monitorización de la respuesta al tratamiento antiviral
– sensibilidad analítica 12/20 UI/ml – sensibilidad analítica 3 fmol/l≈500-3000 UI/ml
– EASL guidelines (AI) 2016, equivalencia ARN (diagnóstico, monitorización)
Características marcadores de replicación
EALS 2016 EALS 2018
ARN VHC (Carga viral) Antígeno core VHC
Marcador de viremia
Infección aguda
Diagnóstico de infección vertical
Confirma hepatitis crónica C
Confirma VHC en pacientes con una alteración de la inmunidad humoral
Monitorización de la respuesta al tratamiento antiviral
– sensibilidad analítica 12/20 UI/ml – sensibilidad analítica 3 fmol/l≈500-3000 UI/ml
– EASL guidelines (AI) 2016, equivalencia ARN (diagnóstico, monitorización)
Características marcadores de replicación
– rapidez/flexibilidad
– coste reducido
– estabilidad de diana (proteína)
– misma plataforma que Ac: utilidad como reactivo combo, útil en donantes, diálisis, peq. laboratorios, bajos recursos….
– Simplifica los algoritmos diagnósticos
Testing for HCV Infection: An Update of Guidance for Clinicians and Laboratorians. MMWR May 10, 2013 / 62(18);362-365
Algoritmo diagnóstico en un solo paso
Todo en una misma muestra
Negativo
Cribado
Ac-VHCPositivo
Stop
Replicación
Negativo
Alerta/comunicación APInfección
activa
Stop
Retraso entre diagnóstico e inicio de tratamiento.
Harris M. J Viral Hepat 2016;23:479-86.
Levi M. Eur J Public Health 2016;26:561-9.
Casas P, Enferm Infecc Microbiol Clin 2019;37 (5):347-48.
Positivo
Implementación del diagnóstico en un solo paso
Algoritmo diagnóstico en un solo paso
Cribado
Ac-VHCPositivo
Negativo
Stop
Replicación Positivo
Negativo
Alerta/comunicación
AP
Infección
activa
Stop
Algoritmo diagnóstico VHC CHN
Ac VHC
N
P (>1 S/CO)
B. Test 3 G
P
N
GT
• Encuesta a nivel nacional (hospitales públicos/privados, acreditados, >200 camas): 90 Hospitales.
• Alta variabilidad en el diagnóstico de la hepatitis C (Servicio, test confirmatorio, D1P, información) .
• Menos de la mitad (43%) de los encuestados cree que el diagnóstico definitivo se debe hacer con una única muestra.
• 81% de los hospitales encuestados dispone de medios para realizar el diagnóstico de la infección por el VHC en un solo paso, pero sólo lo realiza el 31%.
• El 88% de los encuestados cree que debe existir algún tipo de alerta ante el diagnóstico de una infección activa, pero casi un tercio de los hospitales no tiene estrategia de comunicación cuando se detecta una infección activa.
García F, et al. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2019. https://doi.org/10.1016/j.eimc.2019.03.001
F1. Circuito asistencial del
D1P.
F2. Circuito asistencial del
DTRA.
Ideas para llevar…
• El diagnóstico en un solo paso es un procedimiento sencillo, asequible para los Servicios de Microbiología Clínica y necesario para mejorar el acceso de los pacientes VHC virémicos a Atención Especializada en el menor tiempo posible.
Esta estrategia evita “pérdidas” de los pacientes, y contribuye a la eliminación de la Hepatitis C.
• El Ag del core es un marcador de replicación útil (eficaz y eficiente) tanto en el diagnóstico, monitorización y RVS. Puede servir como alternativa al RNA, simplificando los algoritmos diagnósticos y economizando los procedimientos diagnósticos.
MUCHAS GRACIAS