HeteroduplexHeteroduplex mobility assay

Biotechnologia III rokSylwia BorkowskaMałgorzata Gawlik

Piotr Gawroński

Definicja

Heteroduplex jest dwuniciową molekułą kwasu nukleinowego powstającą podczas rekombinacji homologicznej z pojedynczych komplementarnych nici, pochodzących z różnych źródeł, np. z dwóch homologicznych chromosomów, czy nawet z dwóch różnych organizmów.

Jednym takim przykładem jest heteroduplexowe DNA tworzone w czasie hybrydyzacji materiałów genetycznych organizmów w celu ustalenia ich pokrewieństwa czy pochodzenia ( badania filogenetyczne).

Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji:(w kompleksie synaptonemalnym podczas

koniugacji poprzedzającej mejotyczny crossing-over )

Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji:

● Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji umożliwiają wymianę genów, a przez to także naprawę uszkodzonych jednostek .

Zastosowania

●badania filogenetyczne●analizy epidemiologiczne, np odnośnie Cryptosporidium wyizolowanych od ludzi i zwierząt●badania screeningowe dotyczące wielu groźnych wirusów: HIV-1, WZW typu C, enterowirusów, w celu identyfikacji ich podtypów●wykrywanie mutacji głównie punktowych i chorób genetycznych z nimi związanych (można analizować tylko krótkie odcinki kwasów nukleinowych, bo przeważnie na wstępie stosuje się PCR, nie wykryjemy tą metodą mutacji chromosomowych i genomowych).

Podstawowe założenie:

● Nici DNA tworzące Heteroduplexy różnią się od siebie pewnymi sekwencjami i nie tworzą tak stabilnych układów jak homoduplexy, czyli molekuły dwuniciowego DNA komplementarne do siebie.

Chcąc wykryć w mieszaninie, po reakcji PCR, Heteroduplexy (odróżnić je od homoduplexów)

możemy posłużyć się się metodami:

● DGGE- (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)- elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym, która jest najdokładniejsza- ma 95 % skuteczność, ale i najdroższa ●mismatch cleavage (rozłupywanie się niedopasowań)●DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)- Szybka chromatografia w roztworze denaturującym

Opis DHPLC przy wykrywaniu mutacji

Szybka chromatografia w roztworze denaturującym

DHPLC● mieszanina po reakcji PCR zawierająca DNA wzorca-

niezmutowane i DNA organizmu badanego- potencjalnie obarczone mutacją)

● Denaturacja (podgrzanie)

● Renaturacja (ochłodzenie)

● tworzą się homo- i heteroduplexy

DHPLC● Rozdział Hetero- od Homoduplexów jest osiągany poprzez

działanie częściowo denaturujących czynników (temp. 57 °C)● Rejestrowane są mikronapięcia towarzyszące przechodzeniu przez

urządzenie cząsteczek DNA

DHPLC

● DNA jednoniciowe będzie pochodziło z heteroduplexów i jeżeli zostanie wykryte przez detektor w odpowiednio wysokim stężeniu, będzie to świadczyło o mutacji w obrębie DNA badanego

● Jeśli DNA organizmu badanego będzie homozygotą pod wzlędem mutacji, to otrzymamy największy udział Heteroduplexów w mieszaninie po PCR, a stężenie nici pojedynczych wykrytych podczas DHPLC będzie wysokie,

● W przypadku heterozygotyczności pod względem mutacji DNA badanego otrzymamy mniejsze stężenie pojedynczych nici i dlatego dobrze jest wtedy powtórzyć DHPLC bez obecności wzorca-nie jest ona wymagana, bo DNA badane jest Heteroduplexem

● brak mutacji-brak heteroduplexów.

Wynik DHPLC

● DHPLC detection of mutation in the Fanconi anemia gene, exon-4 in Ashkenazi population.

Źródła informacji:

● NCBI● Wikipedia