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Hideyuki OkanoDean and Professor, Keio University School of Medicine

「iPS細胞を用いたALS の病態と創薬の研究」

IBC報告会2016November 6, 2016

iPS細胞10周年記念シンポジウム

• 再生医療• 病態解析と創薬• がん免疫療法

• Invitroorganogensisとヒトの発生生物学研究

• 異種間キメラ• ヒト生殖生物学• Epigenomicsとreprogramming

幹細胞を用いた脊髄再生への挑戦Challenge toward Regeneration of

injured Spinal Cord

脊髄損傷の再生医療を目指して

Traumatic spinal cord injury affects many people, including young people, and can result in severe damage, leading to paraplegia, tetraplegia, or worse.

ラット胎仔中枢神経系幹細胞のラット脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofRatfetalNSCsintoRatSpinalCordInjury(SCI) Model (Ogawaetal.,JNR2002)

ヒト胎児中枢神経系幹細胞のサル脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofhumanNSCsintonon-humanprimateSpinalSCIModel(Iwanami,etal.,JNR2005)

Clinical Trial

Control iPS-SNS transplanted animal

対照Control

Control

Human NSC

Common marmoset

（損傷後日数)

spon

tane

ous

mot

or a

ctiv

ity

(%) 0

20

40

60

80

100

120

0 10

20

30

40

50

60

70

移植群対照群

＊ ＊ ＊ ＊＊

NSCTP

Spontaneous motor activityNSC TPControl

（Days after SCI)

NSCTransplantation site

(Washington Post, Jan 2004 )

These results are a big step towards the clinical trial of neural stem cell transplantation for patients with SCI.

ラット胎仔中枢神経系幹細胞のラット脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofRatfetalNSCsintoRatSpinalCordInjury(SCI) Model (Ogawaetal.,JNR2002)

ヒト胎児中枢神経系幹細胞のサル脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofhumanNSCsintonon-humanprimateSpinalSCIModel(Iwanami,etal.,JNR2005)

倫理問題の壁：Barriers of Ethical IssuesiPS細胞技術による克服の開始: Challenge by iPS cells (2006)

Clinical Trial

Control iPS-SNS transplanted animal

対照Control

ラット胎仔中枢神経系幹細胞のラット脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofRatfetalNSCsintoRatSpinalCordInjury(SCI) Model (Ogawaetal.,JNR2002)

ヒト胎児中枢神経系幹細胞のサル脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofhumanNSCsintonon-humanprimateSpinalSCIModel(Iwanami,etal.,JNR2005)

倫理問題の壁：Barriers of Ethical IssuesiPS細胞技術による克服の開始: Challenge by iPS cells (2006)

Clinical Trial

マウスiPS細胞由来神経幹細胞のマウス脊髄損傷モデルへの移植Transplantationofmouse

iPS-derivedlNSCsintomouse SCIModel (Tsuji,etal.,PNAS2010)

iPS細胞の神経分化誘導の開発: Neural Induction of iPS cells(Miura,etal.,NatBiotech2009)

Control iPS-SNS transplanted animal

ヒトiPS細胞由来神経幹細胞のマウス脊髄損傷モデルへの移植

Human cellsintomouseModel(Nori,etal.,PNAS2011)

ヒトiPS細胞由来神経幹細胞のサル脊髄損傷モデルへの移植HumancellsintoprimateModel (Kobayashii,etal.,PLoS ONE2012)

対照Control

ラット胎仔中枢神経系幹細胞のラット脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofRatfetalNSCsintoRatSpinalCordInjury(SCI) Model (Ogawaetal.,JNR2002)

ヒト胎児中枢神経系幹細胞のサル脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofhumanNSCsintonon-humanprimateSpinalSCIModel(Iwanami,etal.,JNR2005)

倫理問題の壁：Barriers of Ethical IssuesiPS細胞技術による克服の開始: Challenge by iPS cells (2006)

Clinical Trial

マウスiPS細胞由来神経幹細胞のマウス脊髄損傷モデルへの移植Transplantationofmouse

iPS-derivedlNSCsintomouse SCIModel (Tsuji,etal.,PNAS2010)

iPS細胞の神経分化誘導の開発: Neural Induction of iPS cells(Miura,etal.,NatBiotech2009)

Control iPS-SNS transplanted animal

ヒトiPS細胞由来神経幹細胞のマウス脊髄損傷モデルへの移植

Human cellsintomouseModel(Nori,etal.,PNAS2011)

ヒトiPS細胞由来神経幹細胞のサル脊髄損傷モデルへの移植HumancellsintoprimateModel (Kobayashii,etal.,PLoS ONE2012)

対照Control

Control 移植動物

ラット胎仔中枢神経系幹細胞のラット脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofRatfetalNSCsintoRatSpinalCordInjury(SCI) Model (Ogawaetal.,JNR2002)

ヒト胎児中枢神経系幹細胞のサル脊髄損傷モデルへの移植TransplantationofhumanNSCsintonon-humanprimateSpinalSCIModel(Iwanami,etal.,JNR2005)

倫理問題の壁：Barriers of Ethical IssuesiPS細胞技術による克服の開始: Challenge by iPS cells (2006)

Clinical Trial

マウスiPS細胞由来神経幹細胞のマウス脊髄損傷モデルへの移植Transplantationofmouse

iPS-derivedlNSCsintomouse SCIModel (Tsuji,etal.,PNAS2010)

iPS細胞の神経分化誘導の開発: Neural Induction of iPS cells(Miura,etal.,NatBiotech2009)

Control iPS-SNS transplanted animal

ヒトiPS細胞由来神経幹細胞のマウス脊髄損傷モデルへの移植

Human cellsintomouseModel(Nori,etal.,PNAS2011)

ヒトiPS細胞由来神経幹細胞のサル脊髄損傷モデルへの移植HumancellsintoprimateModel (Kobayashii,etal.,PLoS ONE2012)

対照Control

非移植動物 移植動物

iPS細胞由来神経前駆細胞を用いた脊髄損傷治療

-動物実験を用いた試み -

iPS細胞しん

神経系への誘導

サルおよびマウス脊髄損傷モデルへの移植

神経幹細胞

Okano et al. Circulation Res, 2013

体細胞

iPS細胞

脊髄損傷患者 iPS細胞バンク(CiRA)• 臨床に使用するより安全なiPS細胞ストックの樹立

iPS細胞を用いた脊髄再生医療の実現に向けて

OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, DNp53

ボランティア

iPS-NSC

• iPS細胞の樹立に3ヶ月、さらに神経分化に3ヶ月、約半年の時間を要する

• 十分な安全性の検証と品質管理が困難

• 費用がかかる

iPS細胞由来神経幹細胞

① 安全性評価法の確立• 安全性スクリーニング法の確立• 分化誘導法の最適化

② 脊髄再生医療に用いる細胞の製造

• 臨床研究開始までの必須事項

OkanoandYamanaka,MolecularBrain,2014

安全性試験造腫瘍性試験

効能試験

ProductionProcessforiPSC-NSC Therapeutics

凍結安定性試験輸送試験

HLAホモiPS細胞由来神経幹細胞の培養工程

再生医療用iP

S

細胞ストック

胚様体

中間細胞株

RO

CK

阻害剤+

低分子化合物

を含む無血清培地へ

神経分化誘導工程

初代

神経前駆細胞

神経前駆細胞

最終製品

継続培養を繰り返す

神経前駆細胞増幅工程

細胞凍結

液体窒素で凍結保

管

凍結保管工程

中核拠点CiRA

解凍

移植用培地に細胞懸濁

神経前駆細胞

治療用

治療用細胞準備工程

臨床研究

12

【iPS細胞細胞を用いた再生医療の展望】亜急性期脊髄損傷に対する臨床研究を開始する

さらなる適応拡大• 慢性圧迫性脊髄障害（後縦靱帯骨化症など）• 脊髄疾患（脊髄空洞症、脊髄変性疾患など）• 髄鞘関連疾患（多発性硬化症・白質形成不全症など）• 一部の神経変性疾患（ハンチントン病など）

•慢性期不完全脊髄損傷に対する臨床研究•亜急性期脳梗塞に対する臨床研究

•慢性期完全脊髄損傷に対する臨床研究•慢性期脳梗塞に対する臨床研究

治験への移行製薬 企業と連携して薬機法に基づく承認の取得、実用化を目指す

後縦靱帯骨化症 脊髄空洞症

難治性疾患

iPS細胞技術を用いた難病の病態解析Imaizumi andOkano,J.Neurochem 2013

OurGroupestablishediPS celllinesfromabout40neurologicalDisorders.

ヒト神経疾患研究の難しい点

• 疾患モデルマウスが必ずしもヒトの病態を反映しない• ゲノムでの遺伝子変異と表現型の因果関係を証明することが難しいことがある

• 剖検脳の解析だけでは、疾患のonsetにおいてin vivoで何が起きているか？を知ることが困難

• 疾患感受性細胞（脳の細胞）へのaccessibilityの低さ

iPS細胞技術と遺伝子改変霊長類を用いた解決の試み

• CHARGE症候群• Rett症候群• Pradaer-Willi症候群• Angelman症候群• 神経管閉鎖不全症

• 滑脳症 (Lissencephaly) • Pelizaues-Merbacher病 (PMD)• 小児難治性てんかん（Dravet症候群）：• Sjögren-Larsson症候群• ギャロウェイモアット症候群

• 網膜色素変性症

• Pendred症候群

• 統合失調症 (Schizophrenia)• 双極性障害

• 家族性パーキンソン病（PARK2）• 家族性パーキンソン病（PARK4）• 家族性パーキンソン病（PARK6）• 家族性パーキンソン病（PARK8）• 家族性パーキンソン病（PARK9）• 弧発性パーキンソン病

• 家族性ALS(FUS)• 弧発性ALS• 球脊髄性筋萎縮症 (SBMA)• 多系統萎縮症

• Kii ALS/PDC• 脊髄小脳変性症

• 家族性アルツハイマー病

• FTDP-17• フェリチン症候群• その他

Alzheimerdisease(Yagietal.HumanMol Genet2011;Imaiuzmi etal.,StemCellReports2015),PARK2(Imaizumi etal.Mol Brain2012;Matsumotoetal.StemCellReports2016),SBMA (Niheietal.JBiol Chem2013),Dravet (Higurashi etal.Mol Brain2013),RetinitisPigmentosa (Yoshidaetal.Mol Brain2014),Schizophrenia(Bundo etal.Neuron2014),PARK8 (Ohta etal.HumanMol Genet2015),Rett syndrome(Noda-Andoh etal.Mol Brain2015),ALS(FUS)(Ichiyanagi etal.StemCellReports2016),Lissencephaly(Bamaba etal.Mol Brain2016)

慶應義塾大学で進行中の精神・神経疾患特異的iPS細胞研究

AmyotrophicLateralSclerosis(ALS)

Death of neurons controlling voluntary muscles

Stiff musclesMuscle twitchingMuscle wasting

5% cognitive changes, FTD c9orf72

Onset around age 60Men>women

Average survival 3-4 years

2 people per 100,000 per year5-10% inherited

http://www.als-cure.com

sporadic,

90.0%

SOD, 2.0%

FUS, 0.5%other

genes,

7.5%

家族性ALS原因遺伝⼦Onset hereditary locus gene Protein

ALS1 Adult AD 21q22.1 SOD1 Cu/Zn superoxidedismutase

ALS2 Juvenile AR 2q33-35 ALS2 Alsin

ALS3 Adult AD 18q21 unknown

ALS4 Juvenile AD 9q34 SETX Senataxin

ALS5 Juvenile AR 15q15-21 SPG11 Spatacsin

ALS6 Adult AD/AR 16p11.2 FUS Fusedinsarcoma

ALS7 Adult AD/AR 20p13 unknown

ALS8 Adult AD 20q13.33 VAPB VAMP-associatedprotein B

ALS9 Adult AD 14q11 ANG Angiogenin

ALS10 Adult AD 1q36 TARDBP TARDNA-bindingprotein

ALS11 Adult AD 6q21 FIG4 Pl(3.5)P(2)5-phosphatase

ALS12 Adult AR/AD 10p15-p14 OPTN Optineurin

ALS14 Adult AD 9p13.3 VCP Valosin containingprotein

ALS15/X Adu/Juv XD Xp11 UBQLN2 Ubiquilin 2

ALS16 Juvenile AR 9p13.2-21.3 SIGMAR1 SIGMAR1

ALS-FTD1 Adult AD 9q21-22 unknown unknown

ALS-FTD2 Adult AD 9p21 C9orf72 Chromatin9ORF72

Fused in sarcoma: FUS

l 2009年に発⾒されたALSの原因遺伝⼦l 15のエクソンを有する、DNA/RNA結合タンパク質l 転写制御、スプライシング、核-細胞質のシャトリングなど種々の細胞

機能に関わるl 30以上のALS関連変異が確認されており、その多くがC末端の核局在

シグナル (NLS)に位置する

QGSYrichregion Grichregion RRM R/Grich ZNF R/G

rich

KMDSRGE HRQDRRERPY510 526

1 165 267 285 371 422 453

Nuclearlocalizationsignal

FUS構造模式図

Ichiyanagi et al., Stem Cell Reports, 2016

FUS 患者

年齢 患者① 39歳患者② 42歳

性別 男性臨床診断 家族性筋萎縮性側索硬化症

Familial amyotrophic lateral sclerosis⽣検部位 上肢・⽪膚変異遺伝⼦ FUS/TLS His517Asp (H517D):

c.1549C>G in exon 15 heterozygous

①②

家系図

1

QGSY Grich RRM R/G R/G

KMDSRGEH RQDRRERPY510 526

H517D

165 267 285 371 422 453

NLS

FUSの構造と変異ポイントIchiyanagi et al., Stem Cell Reports, 2016

iPS細胞樹⽴Sox2, Klf4, Oct3/4, L-Myc, Lin28, sh-p53の6因⼦をEpisomal vectorによってFibroblastへ導⼊

Oct4

bar=100μm

SSEA4 TRA-1-60

未分化マーカー

Tuj1 αSMA Sox17

Bar=200μm

三胚葉分化能

CAC/ GAC

FUS変異保持の確認

iPS細胞からの運動ニューロン誘導

iPS cell Motorneuron

神経幹細胞誘導 運動ニューロン誘導

Neurosphere

Hoechst: 核

Islet1: 運動ニューロン

HB9: 運動ニューロン

Tuj1: ニューロン

merge:Motorneuron

ALSは運動ニューロンが侵される疾患 → iPS細胞を運動ニューロンへ分化

迅速かつ高効率な運動ニューロン分化誘導法の開発

iPS Motor Neuron

Primary Secondary

Motor Neuron Precursor(MNP) Induction

Expansion of MNP

Reduction of MNP stemness

bFGF (-)CHIR99021

(-)

Induction of Motor Neuron

EB-like cellSB431542 (+)

Dorsomorphin (+) CHIR99021 (+)

Induction of EB-like cell

300 Days

0

20

40

60

80

100

従来法 本法

% o

fHB9

(+) /

bIII

-tubu

lin(+

)

**

** : p<0.01 vs Control group. N=3 Student’s t-test

Shimojo et al., Mol Brain, 2016

Ichiyanagi)et)al.)Stem%Cell%Reports,)2016)

FUS FALS &iPS

FUS変異による運動ニューロン異常が生ずる分子メカニズムの研究

FUS Mutation

?

?

Motor Neuron Degeneration(Neurite Outgrowth, FUS mislocatization

Stress Granule, Cell Death)

FALS

WT

0

5

10

15

0 5 10 15

FALS > WT124 genes

WT > FALS35 genes

エクソン・アレイ法による遺伝子発現 (18738 遺伝子の解析)

Affymetrix Exon Array with tertiary MPC

WT FALS

18738 genes (using core probes)↓

159 genes p<0.001

Exon array enables unbiased measurement across the length of the gene allowing you to detect transcripts that would be missed with 3' arrays. Detectexon- and gene-level expression and alternative splicing events from single experiment.

FUS変異を伴う運動ニューロンにおける遺伝子の発現異常

2012年: 一論文あたり平均約2.5症例

・iPS細胞樹立・分化誘導・病態解析

ハイスループットな疾患iPS病態解析系

(~100症例)

多大な労力長期間

対象疾患例家族性疾患稀少疾患

孤発性疾患一般的な疾患

解析に必要な患者数

1-10症例 50-10000症例

疾患発症とその要因

単一の遺伝要因複数の遺伝的素因を含む

複数要因

現在の疾患iPS病態解析系

疾患iPS病態解析系のハイスループット化による孤発性疾患・一般的な疾患のiPS細胞病態解析の実現

治療薬候補

患者

iPS細胞

多数の検体（〜100症例以上）

遺伝的背景が未解析の大量の検体をどうiPS細胞化し、解析するか？

多検体処理を実現化し、非遺伝性疾患・孤発性疾患の解析のプロトタイプ作成

樹立・分化誘導・解析の効率化・ハイスループット化

侵襲性の高い皮膚生検から末梢血など協力が得やすい細胞からの樹立方法の移行

多検体を用いたより確かな薬効評価

不死化リンパ芽球ライブラリの利用

例：名古屋大学医学部 神経内科 祖父江 元 教授

JaCALS 多施設共同大規模ALSコホートとの共同研究

不死化リンパ芽球由来iPSから誘導したニューロン

Fujimori et al., Mol Brain, 2016

表現型解析から、創薬スクリーニングへ

Thankyouverymuchforyourattention!

Keio University

Reona KobayashiTakashiro KondoNoriyuki Kishi

CIEAErika Sasaki Junko OkaharaKenya Sato

Max Plank InstituteWieland Huttner

Harvard UniversityByoung-il BaeChristopher Walsh

INSTITUT JACQUES-MONODAlessandra PIERANIYoko Arai

RIKENAtsushi IrikiTomomi ShimogoriChihiro YokoyamaTadafumi KatoTateo Yoshikawa

Fukuoka UnversityShinichi HiroseNorimichi Higurashi