MucoviscidoseMucoviscidose

Historique : Maladie hHistorique : Maladie héérrééditaire ditaire –– Modifications ioniques : ElModifications ioniques : Eléévation du Cl et du Na sudoralvation du Cl et du Na sudoral(di (di SantSant’’AgneseAgnese, , AmAm J J MedMed, 1953), 1953)

Maladie hMaladie héérrééditaire frditaire frééquente quente –– Transmission mode ARTransmission mode AR–– GraveGrave–– FrFrééquentequente–– Grande variabilitGrande variabilitéé dd’’expressionexpression–– Due Due àà une atteinte du gune atteinte du gèène CF codant la protne CF codant la protééine CFTRine CFTR–– Diagnostic et dDiagnostic et déépistage de la maladiepistage de la maladie

Delphine FeldmannLaboratoire de Biochimie,Biologie MoléculaireHôpital A Trousseau

fréquence à la naissance fréquence hétérozygotes

Caucasiens 1/2 500 (1/1 800 à 1/3 500) 1/251/4 300 1/33

Moyen-Orient 1/4 400 1/33Hispaniques 1/8 500 1/46Noirs Américains / Africains 1/20 000 1/70Asiatiques 1/32 400 1/90

d’après Monaghan et Feldman, Prenat Diagn 1999; 19:604-609

Fréquences en fonction des populationsFréquences en fonction des populations

insuffisance pancréatiquefonction pancréatique conservée

formes “monosymptomatiques”de l’adulte

- Absence bilatérale des canaux déférents- Bronchectasies diffuses- Pancréatite chronique- Atteinte rhino-sinusienne chronique atypique

atteinte respiratoire variable

test de la sueur : test de la sueur : + + intermédiaire négatifintermédiaire négatif

Variabilité phénotypiqueVariabilité phénotypiquepathologie du gène pathologie du gène CFTRCFTR

iléus méconial

Identification du gèneIdentification du gène--Clonage positionnelClonage positionnel--1989, Science, 1989, Science, TsuiTsui et Collinset Collins

localisationchromosomique

localisationchromosomique

fine

cartographie physique

recherche de gènes(clonage)

contig gène

identification de mutation→ implication du gène

mutation

AAATATCATTGGTGTTTCC

TCT

F508delexon 10

Etude de marqueurs ADN dans les familles :

étude de liaison génétique

cartographie génétique

Du gène à la protéine CFTRDu gène à la protéine CFTR

Gène : 7q31 – 200 kb

Protéine : 1480 aamb apicale des cellules des épithéliums sécrétoires

ARNm : 6,5 kb

Régulation de l’expression mal connue

Métabolisme de la protéine CFTR

D’après JR Riordan, Am J Hum Genet 1999

ORCC

Cl-

sécrétion

biosynthèse

Inflammationglutathion, HCO3-

autres molécules ?

récepteur de bactéries ?ENaC

Na+

CFTR

CFTR CFTR -- fonctionsfonctions

noyau

Cl-

REGolgi

PKa, PKcAMPc

ATP

exocytose

CFTRCFTR

FonctionsFonctions–– Canal Cl limitantCanal Cl limitant–– RRéégulateur dgulateur d’’autres canaux ioniquesautres canaux ioniques–– Favorise lFavorise l’’exocytoseexocytose–– RRéégulation du pH intracellulairegulation du pH intracellulaire–– RRôôle dans lle dans l’’inflammationinflammation

protprotééine ine «« rrééseau seau »»

CFTRCFTR

Expression Expression –– PPôôle apical des cellules le apical des cellules éépithpithèèlialesliales

Canaux pancrCanaux pancrééatiques et biliairesatiques et biliairesCyptes Cyptes intestinalesintestinalesArbre Arbre trachtrachééoo--bronchiquebronchiqueTubules rTubules réénaux, appareil gnaux, appareil géénital, glandes nital, glandes sudoriparessudoriparesPas de corrPas de corréélation entre le taux dlation entre le taux d’’expression et la expression et la pathologiepathologie

CFTRExons 3

E60XG85E

394delTT

4

R117HY122X

621+1G>T

5 6a 7 9 10 11Intron 11

12 13 14a14b 16 17b 18 19

Intron 1920 21

G178R711+1G>T

L206WL227R

1078delTR334WR347HR347P

1342-6(5T/6T/7T)D443YA445E

Q493X1609delCAI507delF508del1677delTA

1717-1G>AG542XS549RG551DQ552XR553X

G576XG576AE585X

1898+1G>A1898+1G>T1898+5G>T

R668C2143delTG673X

2183AA>G2184insAK710XR792X

W846X2789+5G>A

3120+1G>A

3272-26A>GY1092XL1065PR1066C

D1152H

R1158XR1162X3659delC

G1144ES1251N3905insTW1282X

4005+1G>A 4016insTN1303KQ1313X

1811-1,6kbA>G 3849+10kbC>T

Mutations du gène Mutations du gène CFTRCFTR

1 2 6b 8 15 17a 22 23 24

1500 mutations tout le long du gène

E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil

16%

faux-sens47,5%

13%

20%

épissage

frameshift

non-sens

grands réarrangements

2% autres (en phase ins/del, promoteur)

2%

sévères

Types de mutations du gène Types de mutations du gène CFTRCFTR

sévères/modérées/neutres ?E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil

Répartition des mutations en EUROPERRéépartition des mutations en EUROPEpartition des mutations en EUROPE

UK DF508 UK DF508 DF508 : 80% DF508 : 80% BELGIQUE DF 508BELGIQUE DF 508 G551D G551D G542X G542X ALLEMAGNEALLEMAGNE G542X G542X N1303K N1303K DF508DF508 ESPAGNE 621+1G>T ESPAGNE 621+1G>T 17171717--1 G>A R553X1 G>A R553X DF 508 1717DF 508 1717--1 G>A 1 G>A 2184 2184 deldel A G542X A G542X G542X (R117H) G542X (R117H) W1282X W1282X G551DG551D N1303K (R553X) N1303K (R553X) R347PR347P R1162X (1898+1 G>A) R1162X (1898+1 G>A) N1303KN1303K 711+1 G>T (N1303K) 711+1 G>T (N1303K) R334W R334W ITALIE DF 508ITALIE DF 508 G85E G85E N1303K N1303K

FRANCE DF 508 FRANCE DF 508 G542XG542X G542X G542X 17171717--1 G> A1 G> A N 1303 K N 1303 K R 1162XR 1162X W 1282 X W 1282 X W1282X W1282X 1717 1717 --1 G> A 1 G> A R553XR553X G551 D G551 D 45% 45% (621+1 G> T) (621+1 G> T)

Phénotype cliniqueGénotype CFTR

Mutations de classes

Corrélations génotypeCorrélations génotype--phénotypephénotype

Mucoviscidose-Insuffisance pancréatiquesévère / sévère

Mucoviscidose-Fonction pancréatique conservéesévère / modérée

Formes mono-symptomatiquesde l’adultesévère / très modérée

modérée / modérée

W1282X

F508del, N1303K

G551D

R117H

Q1411X

CorrCorréélations glations géénotypenotype--phphéénotypenotype

((++) avec la fonction pancr) avec la fonction pancrééatiqueatique((--) avec l) avec l’’atteinte respiratoireatteinte respiratoire

Facteurs intervenant dans la variabilité clinique ?

Facteurs génétiques Facteurs génétiques modificateurs modificateurs

de la mucoviscidosede la mucoviscidose

Variabilité aussi au sein de fratries

gènes modificateurs

Variabilité phénotypique pour un même génotypeautres mutations du gène CFTRfacteurs environnementaux

Expression phénotypique de la mucoviscidose variable(âge de début, gravité de l’atteinte pulmonaire, positivité du test de la sueur…)

nature des mutations

mutations CFTR / gènes modificateurs

voies respiratoirescomplications hépato-biliaires

intestinpancréas endocrinepancréas exocrine

glandes sudoriparestractus génital

… La description d’allèles complexes est de plus en plus fréquente (www.genet.sickkids.on.ca/cftr/), avec même l’association de plusieurs polymorphismes qui aurait un effet synergique ou cumulatif délétère, et qui pourrait rendre compte de formes monosymptomatiques de l’adulte.

AllAllèèles complexes du gles complexes du gèène ne CFTRCFTR

SSéévvééritritéé

F508del + F508del + R553QR553Q identique mais identique mais test de la sueur test de la sueur

normalnormalR334WR334W + R1158X+ R1158X

--102T>A102T>A + S549R+ S549R

R74WR74W + D1270N+ D1270N

G576A + R668C + G576A + R668C + D443YD443Y

R347H + R347H + D979AD979A

R117H +R117H + IVS8IVS8--5T5T

5’ 3’8 9 10F508del

TTTTTGA(TG)mTnTnAAACAG GGATTTGGG

8 9 10 ARNm CFTR normal7T ou 9T

ARNm CFTR délété de l’exon 98 105T5T

Modulation du phénotype par le variant d’Modulation du phénotype par le variant d’épissageépissage de de l’intron 8l’intron 8

1 génotype : F508del / R117H → 2 phénotypes (Kiesewetter et al., Nature Genet 93)

F508del / R117H + IVS8-5T5T → mucoviscidose Test de la sueur NlF508del / R117H + IVS8-7T → infertilité masculine par absence bilatérale

des canaux déférentsou mucoviscidose très modéréeou asymptomatique

?

(TG)mT5

Diagnostic de la mucoviscidoseDiagnostic de la mucoviscidose

CritCritèères pour res pour éétablir le diagnostic de la tablir le diagnostic de la mucoviscidose mucoviscidose ((RosensteinRosenstein andand CuttingsCuttings JPediatr.1998)JPediatr.1998)

–– Un ou plusieurs signes cliniquesUn ou plusieurs signes cliniques–– Ou un frOu un frèère ou une sre ou une sœœur atteintur atteint–– Ou un Ou un ddéépistage npistage nééonatal positifonatal positif

Et un Et un test de la sueur positif test de la sueur positif àà au moins 2 au moins 2 reprisesreprisesOu Ou 2 mutations du g2 mutations du gèène CFTRne CFTROu une Ou une diffdifféérence de potentiel nasale anormalerence de potentiel nasale anormale

Test de la sueur (1)Test de la sueur (1)ElEléément indispensable du diagnosticment indispensable du diagnosticGibson et Cooke, Gibson et Cooke, PediatricsPediatrics, 1959., 1959.–– Stimulation de la sudation : Stimulation de la sudation : iontophoriontophorèèsese àà la la

pilocarpinepilocarpine

+ --

K2SO4Pilocarpine

Test de la sueur (2)Test de la sueur (2)

Stimulation de la sudationStimulation de la sudationRecueil de la sueurRecueil de la sueur–– Papier filtre, Papier filtre, ExsupatchExsupatch, , MacroductMacroduct, , NanoductNanoduct–– DurDuréée : 20 e : 20 --30 30 mnmn, , NanoductNanoduct : 3: 3--5 5 mnmn

DDéébit de sueur 1g/m2/bit de sueur 1g/m2/mnmn (70mg)(70mg)

Dosage des ionsDosage des ions–– Cl spCl spéécifique : titrimcifique : titriméétrie, trie, coulomcouloméétrietrie, ,

potentiompotentioméétrietrie ((ExsudoseExsudose))–– Ions : Ions : conductimconductiméétrietrie ((WescorWescor, , NanoductNanoduct))

Test de la sueur (3)Test de la sueur (3)Cl spCl spéécifiquecifique

Normal < 40 Normal < 40 mmolmmol/l /l nvnv nnéé < 30 < 30 mmolmmol/l/l

IntermInterméédiaire 30, 40 diaire 30, 40 –– 60 60 mmolmmol/L/L

PathologiquePathologique > 60 > 60 mmolmmol/L/L

ConductimConductiméétrietrieNormal < 50 Normal < 50 -- 60 60 mmolmmol/l /l

IntermInterméédiaire 50 diaire 50 –– 90 90 mmolmmol/L/L

PathologiquePathologique > 80 > 80 -- 90 90 mmolmmol/L/L

InterprInterpréétationtationAge de lAge de l’’enfantenfantDDéébit de sueur bit de sueur MMééthode de dosagethode de dosageAbsence de Absence de

contaminationscontaminations

très rares

Faux négatifs

Faux positifsDénutrition,desydratation,fiévre,eczema

Tr corticostéroides

Outils dOutils d’é’étude du gtude du gèène ne CFTRCFTR

Méthodes de détection cibléetrousses (20-30 mutations)

Méthodes de balayage d’exons

Gène CFTR190 kb 27 exons> 1000 mutations ponctuellesdistribution et fréquence variables selon l’origine géographique

Recherche de remaniements(délétions, duplications,

insertions)

Analyse de microsatellites- étude indirecte pour cas urgents- exclusion du gène - détection de délétions, disomies uniparentales- diagnostic prénatal

CF (12) m PCR kit - La technologie ARMS

CF (12) m PCR kit CF (12) m PCR kit -- La technologie La technologie ARMSARMS

La PCR n'a lieu que lorsque la sLa PCR n'a lieu que lorsque la sééquence cible est prquence cible est préésente dans l'sente dans l'ééchantillon chantillon Primer ARMS spPrimer ARMS spéécifique de la scifique de la sééquence cible P Primer communquence cible P Primer commun Extension par la Extension par la TaqTaq PolymPolyméérase Pas d'extensionrase Pas d'extension

SSééquence ADN cible Squence ADN cible Sééquence d'ADN non quence d'ADN non -- ciblecible

P 3' 5' P 3' 5' 3' 3' 5'5'

5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3'

PRODUITS de PCR PRODUITS de PCR PAS PAS dede PRODUITS de PCRPRODUITS de PCR

CF (12) m PCR kit - La technologie ARMS

CF (12) m PCR kit CF (12) m PCR kit -- La technologie La technologie ARMSARMS

TUBE A TUBE A DNADNA TUBE BTUBE B RRééaction ARMS 1 action ARMS 1 -- Primer normal RPrimer normal Rééaction ARMS 2 action ARMS 2 -- Primer mutantPrimer mutant commun commun commucommunn

n n mm Si sSi sééquence normale dans le DNA Si squence normale dans le DNA Si sééquence mutquence mutéée dans le DNAe dans le DNA

Produit de PCR aProduit de PCR analysnalyséé sur gelsur gel

Normal Homozygote HNormal Homozygote Hééttéérozygote Homozygote mutantrozygote Homozygote mutant Tube 1 Tube 2 Tube 1 Tube Tube 1 Tube 2 Tube 1 Tube 2 Tube 1 Tube 22 Tube 1 Tube 2 nn m m nn m m n n mm

CFTRExons 3

E60XG85E

394delTT

4

R117HY122X

621+1G>T

5 6a 7 9 10 11Intron 11

12 13 14a14b 16 17b 18 19

Intron 1920 21

G178R711+1G>T

L206WL227R

1078delTR334WR347HR347P

1342-6(5T/6T/7T)D443YA445E

Q493X1609delCAI507delF508del1677delTA

1717-1G>AG542XS549RG551DQ552XR553X

G576XG576AE585X

1898+1G>A1898+1G>T1898+5G>T

R668C2143delTG673X

2183AA>G2184insAK710XR792X

W846X2789+5G>A

3120+1G>A

3272-26A>GY1092XL1065PR1066C

D1152H

R1158XR1162X3659delC

G1144ES1251N3905insTW1282X4005+1G>A 4016insT

N1303KQ1313X

1811-1,6kbA>G 3849+10kbC>T

Mutations du gène Mutations du gène CFTRCFTR

1 2 6b 8 15 17a 22 23 24

KIT Elucigene CF 30 mutations FranceDétection de 81 à 85 % des allèles mutésDe la population française caucasienne

0 50 100 150 200 250 (kb)

5 '- 3 '

1 2 3 4 5 6a 6b 7 8910 13 14a14b 15

1617a17b 1819 20 2111 12 22 2324

dele2* dele19dele14a

dele14b-18 (20kb)

dele17a-18 (8.6kb)

dele2,3 (21kb)

dele4-10 (40kb)

dele4-7 (10kb) + 11-18 (40kb)

dele16-17b

dele17b-18

dele2-10 (95,7kb)

dele21dele17b

dele22-23*

dele11-16

dele4-6a

dele4dele1*

dele17b

dele14b-17b (10kb)dele17a-17b (2.5kb)

dele3-10,14b-16

deleCFTR (>3Mb)

dup4-8

dele2-6b

dup11-13

Remaniements du gène Remaniements du gène CFTRCFTR

2% des anomalies mais 20% des mutations non identifiéesE. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil

F508del

F508del

G542X

G542X

F508delR553Q

F508delR533Q

Génotype : Etudes familiales

?

?

Différence de Potentiel Transépithèliale Nasale

D’après I.Sermet-Gaudelus, BMC, 2006

La phénylcétonurie (PCU) avec le test de Guthrie depuis 1972

L'hypothyroïdie congénitale (1978)

La drépanocytose depuis 1989 dans les Dom-Tom et 1995 en métropole

L'hyperplasie congénitale des surrénales depuis 1995.

La Mucoviscidose mis en place courant 2002

DEPISTAGE NEONATALDEPISTAGE NEONATAL5 maladies rares5 maladies rares–– ddéébut asymptomatique but asymptomatique –– traitables, traitables,

systsystéématique matique Il est effectuIl est effectuéé sur chaque bsur chaque béébbéé entre son 3entre son 3èème me et 4et 4èème jour de vie.me jour de vie.Objectif : bObjectif : béénnééfice direct et immfice direct et imméédiat diat àà un enfant un enfant qui se rqui se réévvéélera malade.lera malade.CritCritèères stricts : res stricts : critcritèères de Wilsonres de Wilson ddééfinis en finis en 1965 puis confirm1965 puis confirméés en 1989 lors de la dernis en 1989 lors de la dernièère re confconféérence de consensus organisrence de consensus organiséée au Canada.e au Canada.

IRT > 65 μg/L

Recherche 30 mutations

M/M M/X X/X

Test de la sueur

Positif négatiflimite

IRT > seuil 3

Laboratoirede dépistage

Laboratoire degénétique moléculaire 1

Laboratoire degénétique moléculaire 2

Laboratoirede biochimie

Balayage du gène CFTR

CRCM Prise en charge + conseil génétique

DEPSTAGE NEONATAL DE LA MUCOVISCIDOSE

Prise en charge + conseil génétiquePrise en charge + conseil génétiquePrise en charge + conseil génétique

DDéépistagepistage

AvantagesAvantages–– Organisation en CRCMOrganisation en CRCM–– Suivi des patients standardisSuivi des patients standardisééssLimitesLimites–– Faux nFaux néégatifsgatifs–– DDéépistage des hpistage des hééttéérozygotesrozygotes–– DDéépistage des formes frustres pistage des formes frustres

STRATEGIE D’ETUDE PATIENT Né AVT 2003

Symptomes cliniquesTest de la sueur

Positf X2 Négatif X2Intermédiaire X2

BM 30 mutations

-/- -/-ConsanguinsPopulation particulière

+/-

Screening du gène

CRCM

-/-

arret

+/- +/+

+/+

CRCM

arrêtSymptômesCliniques +++

?D.Feldmann, Trousseau, Paris

Indications d’étude du gène Indications d’étude du gène CFTRCFTR

Approche directe uniquement2 - Aide au diagnostic

Mucoviscidose- formes atypiques- iléus méconial- suspicion chez le fœtus sur signe

d’appel échographique

Formes mono-symptom.de l’adulte- stérilité masculine par ABCD- dilatation des bronches- pancréatites chroniques

1 - Conseil génétique

3 - Dépistage néonatal

Encadrement particulier

cas index + parents

Diagnostic prénatalrisque de mucoviscidose = 1/4

Couples à risque

Recherche du statut de porteur sain chez

les apparentés

Recherche du statut de porteur sain chez

les conjoints

E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil

Étroite collaboration

- documentation clinique

- suivi des patients

- réseau : projets de recherche

clinicien

Biologiste moléculaire, généticien

Clinicien CRCM

Unités de recherche