I.-'Acción-'-.de iones metálicos sobre modelos

de fosfatasapor

Artgel Martín Municio

(PRESENTADO POR EL ACADÉMICO D. MANUEL LORA TAMAYO)

PARTE TEÓRICA -

En la obtención de modelos de esterasa de los que las fosfatasasson un caso particular, había de considerarse junto al grupo alco-hólico-el grupo amino, que intervendrían como catalizadores en lahidrólisis de un éster según el esquema siguiente :

R _ CO • O — CH2 —R -H-HÜ N — X -» R — CO — NHX + R — CH8OHR - — C O ' — N H X + HOH -> R —COOH-fNHgXR — CO • O — CH2 — R -f HOX -> R — CO • OX + R — CH2OHR —CO • OX +HOH -»• R — COOH + XOH

Y tratándose de ésteres fosfóricos en el caso de catalizadores confunción alcohólica y amínica :

OH OH/ - /

R__CH2 — O — P=0-(-H2NXH•->• R — CH,OH-f X • NH — P = O

OH OHOH OH/ /•

X - NH — P = O + HOH -> X • NH2 -(- HO — P = O\ \OH 'OH

OH OH/

R_CH, — O — P = 0 + HOX -* R — CHjOH + X - O — P = O

OH OHOH OH/ . /

X — O — P =¿ O 4- HOH -> XOH + HO — P = O\ \'OH OH

— 1.92 —

La elección de los grupos — OH y — NH2 como agrupamientos•inicialmente activos se justifica plenamente en los trabajos de Loray Segovia (1) y Lora y Tallada (2).

Coinciden estas predicciones teóricas con resultados obtenidosen experiencias de inhibición en fosfatasas de diversos orígenes (in-testino, hueso, riñon, etc.).

Delorz y King (3) asignan a la enzima un carácter de base débil,amina aromática o aminoácido, y Gould (4) encuentra inactivacionespor cetenas, C6HSNCO, NO2H y HCHO, lo que indica la necesidadde un grupo amino, •posiblemente de lisina, y aun la existencia de

,— OH fenólico libre. Posteriormente, Baccari y Auricchio (5, 6), es-tudian también la importancia de los grupos — NH2 libres en la ac-ción de la fosfatasa acida ; tratando la enzima con NO2H, CH2Oy C6H5NCO y dializando posteriormente, comprueban que aun enla escala alcalina la fosfatasa se inhibe por la ausencia de — N H 2

libres.Roche, N. van Thoai y Roger (7) describen la.inactividad de fos-

fatasa alcalina de intestinos a pH 8,8 con fluoruros, fosfatos y piro-fosfatos, sin que subsiguientemente sea reactivada cori alaniña e hi-dróxido de magnesio, pero si la enzima es primeramente incubadacon alaniña no es inactivada con el tratamiento por cualquiera deïstas sales, siendo de presumir que la alaniña se combina con la en-zima de tal manera que bloquea los .grupos sobre los que actúan es-tas sales.

Los grupos — SH parecen tener gran influencia en muchas fos-fatasas, en especial hexosafosfatasas y pirofosfatasas (8), -ya que seinhiben por reactivos del grupo sulfhidrilo y por ácido ascòrbico.

Sin embargo, es de hacer constar que frecuentemente un mismoefector se comporta de'manera diferente, según la variedad de fos-fatasa (9) ; así, el formaldehido ejerce su máxima influencia inhibi-

(1) Anal, de Fis. y Quim. 39, 882, 1943.(2) Anal, de Fis. y Quim. 41, 818, 1945(S)' Bioch. J. 37, 547, 1934. .(4) /. Biol. Chem. 156, 365, 1944.(5) Bol. Soc', ital. Biol. sper. 22, 559, 1946.(6) Bol. Soc; ital. Biol. sper. 22, 49, 1946.(7) Biochim. Biophys. Acta 1, 61, 1947.(8) E. WALSH y G. WALSH, Nature, 161, 976, 1948.(9) V. M. EMMEL, Ant. Rec. 96, 423, 1946.

— 193 —

dora eri la fosfatasa eritrocitica (10), que, por el contrario, no se al-tera en presencia de tartrato (11). Es de destacar, asimismo que unasustancia" actuando sobre idéntica fosfatasa puede ejercer acción ac-tivadora o inhibidora, dependiendo de las condiciones experimenta-les de concentración, naturaleza del substrato, tiempo de hidrólisis,etcétera.

Ya Langenbek (12)-utilizó cuerpos distintos con grupos —OHen la caracterización de modelos de esterasas sobre butirato de me-tilo. Empleando los mismos modelos y operando sobre glicerofos-fato sódico se encuentran, lo s valores más altos en el naftoil-carbinol,con un 6,6 por 100 de fósforo hidrolisado (13).

Respecto de los grupos — NH2, Lora y Tallada son los primerosen estudiar su función como grupo activo de modelos de fosfatasa,ensayando el comportamiento de aminas grasas y aromáticas, y rdes-pués activaciones por los grupos CQ y CÖOH, es decir, aminoce-tonas y aminoácidos, encontrando una acción catalítica débil sobre'lahidrólisis de los estere^ fosfóricos en la w-aniinoacetofenona y losácidos.o- y p-aminobenzoicos.

Con el mismo.' criterio comprobamos aquí, además, débiles efec-tos en la acción del ácido, nie o tínico y de la adermjna, 'compuesto esteúltimo -en el que se dan juntamente en un núcleo de piridina (aminaterciaria) grupos oximetílicos y feriólicos.

Un más amplio desarrollo del trabajo ha de'llevarnos al ensayode nuevos compuestos, en los que estos grupos, considerados comoactivos, figuren en estructuras moleculares más complejas que pue-dan reforzar su acción. Hemos de estudiar el incremento de la acti-vidad de los grupos inicialmente activos por adecuados grupas acti-vantes,; que. han de ser objeto en cada caso de una investigación sis-temática; pero en este caso de las fosfatasas hay~que hacer interve-nir como coadyuvantes especiales de los modelos orgánicos, deter-minados elementos metálicos que han demostrado desempeñar enaquéllas un-importante papel.

La activación por magnesio de la fosfomonoesterasa alcalina de

(10) .ABUL-FADL y KING, /. Clin. Path. 1, 80, 1948(11) ABUL-FADL y KING, Biochem. 1. 42, 28, 1948.(12) B. 67, 387/1,204, 1934; 69, 39C, 1945.(13) LORA Y'PANEQUE, Anal. Fis: y Qwm. 41, ?,9fl, 1945.

REV. DE LA REAI, ACADEMIA DE CIENCIAS. —1950. la

— 194 —

diversos órganos fue establecida por Erdtmann (14) y Jenner yKay (15), y comprobado después por numerosos experimentadores,incluso nosotros mismos en los preparados de fosfatasa renal obte-nidos según la técnica de Albers (16).

Otros varios iones metálicos, Mn, Zn, Ca, Fe, etc., y en algunoscasos también el magnesio, han demostrado ejercer acciones varia-bles sobre la actividad de la fosfatasa en resultados' francamente con-tradictorios, según la naturaleza del preparado y el grado de purezaen él'alcanzado.

Rossi (17) encuentra activaciones de fosfatasa ósea por ionesmagnesio, aun a pequeñas concentraciones (0,002 por 100), sobre elglicerofosfato sódico ; el calcio a igual concentración ejerce una pe-queña pero definida acción inhibidora ; observándose también por Car-tier y Simonaft (18) la activación in vivo por el magnesio de la fo.s-fataga alcalina del hueso.

Holmberg (19) demuestra, operando con fosfatasa intestinal, quela velocidad de hidrólisis sobre el glicerofosfato no es afectada porel magnesio.

Cedrangolo y Regno (20) hacen experiencias de activación pormagnesio de fosfatasas alcalina en los órganos y en los preparadosde enzima^ definiendo la zona de concentración del magnesio en lacual ejerce su acción.

K. V. Giri (21)' en ensayos con fosfatasa de riñon, hígado y ce-rebro, concluye que el tiempo de extracción y edad de .los extractosafecta a la activación por el magnesio, atribuyendo estos efectos ala variación en inhibidores e impurezas en el extracto más que a cam-bios en la. fosfatasa misma.

Roche y Van Thoai (22), utilizando extractos de mucosa intesti-nal, encuentran una fuerte activación por magnesio, manganeso ycalcio, y una inhibición parcial por los iones Fe y Zn, solos ,o en

(14) Z. phisioi: Ch. 172/182, 1927.(15) /. Biol. Ckem. 93, 733, 1931.(16) HQPPE. Seyl. Z. 232, 165, 1935.(17) Bull. Soc., ¿to/. Biol. 8, 1.714, 1938.(18) Compi Remi. Soc. Biol. 140, 303, 1946.(19) Biochem. Z. 279, 154, 1935.(20) Árch. Sci. Biol. 23, 504, 1937.(21) Z. Physiol. Chem. 254, 117, 1938.(22) Compi. Rend. Soc. Biol. '138, 49, 1944.

— 195 —

presencia de dichos Mg, Mn o Ca; los mismos autores (23). definenel Zn como activador de la fosfatasa alcalina del suero humanonormal.

Aun más que la fosfatasa alcalina, es activada por el magnesiola" fosfatasa'ácida de las bacterias del grupo tifo-paratífico, segúnM. Paget y Vittu (24).

Según Lundquist (25), la fosfatasa ácida prostática es. inhibida porel cinc.

Naganna y Narayana (26) afirman que la pirofosfatasa de eritro-citos es activada de 150 a 100 veces por el magnesio a concentracic-nes 0,02-0,05 M, siendo a su vez inhibida por las sales de cobre, pla-ta, mercurio y cinc, a^ concentración 0,0002 M, necesitando ésta seraumentada en el caso de hierro,'cobalto, manganeso, calcio y bario.Asimismo lo es también l'a pirofosfatasa del hígado, según Greens-tein, Cárter y Leuthardt (27).

Aparte de los resultados de este Laboratorio,'trabajando con lafosfatasa ósea, nosotros en la ocasión presente, trabajando con fos-fatasa renal sobre un substrato de glicerofosfato sódico, ensayamoseste efecto, encontrando una activación por el magnesio que puedeanularse e incluso quedar transformada en inhibición al aumentar laconcentración de éste. Además de esta acción del magnesio, hemosestudiado la influencia sobre la fosfatasa renal de los iones metáli-cos Zn, Ni, -Ca, Al, Na, Fe y Mn M/200 a pH neutro, y ademásmagnesio, ciric y níquel a pH ácido y óptimo alcalino, poniéndose'demanifiesto una desactivación marcada ocasionada por la presenciade los iones Zn, Ni y Al; el resto de los metales apenas ejerce va-riación notable ; la desactivación anotada, ocurre en toda la esca-la de pH.

Simón, Potts y Gerard estudian el efecto del cadmio (28) sobre lafosfatasa, que es inhibida a concentraciones de Cd de 10~3 M.

El mercurio, según Montalenti y Nicola (29), inhibe enérgicamen-te la fosfatasa alcalina del citoplasma y del núcleo.

(23) Compt Rend. Soc. Biol. 140, 632, 1946.(24) Campt. Rend. Acad. Sci. 224, 864, 1946.(25) Acta.Physiol. Scand;lS, 322, 1947.(26) /. Biol. Chem. 174, 501. 1948.(27) /. Nati. Cáncer Inst. 7, 47, 1946.(28) Arch. Biochem. 12, 383, 1947.(29) Experientía. 4, 814, 1948.

— 11)6 —

Roche (30) resume experiencias propias y de otros investigado-res, en las que se ensaya la acción de sales metálicas en presencia dealanina con o sia incubación. La fosfatasa alcalina inactivada es reac-tivada por incubación con alanina 0,01 M durante cuatro, horas a 37"a pH 8,8 y con varios cationes bivalentes Ca 1,1. IO-2 M ;' Fe 1,1; IO'7

M-; Mn 1,1. IO3 M; Zn 1,1. IO"7. M, y Mg 1,1. 1(P M. Han "hechoestudios sobre una supuesta fosfoesterasa de riñon cristalizada (31),que más tarde algunos de los propios autores han identificado comofosfato magnésico (32).

Cloetz (33) define la fosfatasa alcalina, como formada por dosgrupos, G! y G2, capaces de combinación con dos iones metálicos,M j ' y M2, en unión G^M! fácilmente disociable, y G2nM2 de ma-yor estabilidad. Así, con Zn como M2, se obtienen fosfatasas activas,interviniendo calcio, magnesio, manganeso, cobalto y níquel comoMj ; así eomo con calcio, magnesio o cobalto como M1; ycobalto omercurio como M2.

Por encima de discrepancias, dependientes de condiciones diver-sas, convergen todos los resultados experimentales de esta direcciónde trabajo en la adscripción a los metales de un papel especial enla constitución de las fosfatasas, y ello permite, en principio, consi-derarla como una enzima- de metal disociable en la que éste puedeformar parte del complejo orgánico que es portador del grufo ac-Jivo.

De todo ello se infiere el interés de ensayar los compuestos ca-racterizados como modelos orgánicos de fosfatasa en presencia deiones metálicos, a fin de obtener consecuencias sobre el grado de ac-.tivación que éstos pueden ejercer en su actividad catalítica.

Sin duda, un buen criterio en la elección de los iones metálicos quehayan de ensayarse como coactivadores de los modelos, habrá de sersuministrado por el conocimiento de los que el análisis identifique enlos distintos preparados de fosfatasa.

Por ello, hemos realizado el análisis espectroscópico de las ce-

(30) Helv. Chim. Ac. 29, 1.253, 1946.(31) N/ VAN THOAI, ROCHE y SARTORI, C. r. S. Biol. 138, 478, 1944.(32), ABUL-FADL, KING, ROCHE y VAN THOAI, Biochem. J . 14, 428, 1949.(33) Bioch. Z. 810, 42, 1941.

— 197 —

nizas de .fosfatasa ósea preparada según Lora y Rodríguez Blan-co (34),. y de las de fosfatasa renal, según Albers (35).

Del estudio comparado de los espectrogramas obtenidos se de-duce la existencia en la fosfatasa ósea de calcio como elemento másabundante, y después de él, en orden decreciente, cinc, magnesio,níquel y hierro ; en mucha menor proporción sodio y rayas muy dé-biles de silicio, boro y estroncio. Por lo" que se refiere a la fosfatasarenal, se derrjuestra también la existencia de calcio, magnesio., cinc,níquel, hierro, como asimismo potasio!

Se ha ensayado la actividad de algunos de estos iones y otros noreseñados en el espectro sobre los distintos modelos .de acción yacomprobada. El calcio rio ejerce un efecto sensible, pero ios demáselementos más destacados del espectrograma, Mg, Zn, Ni y el. Al,que no figura en aquél, activan muy especialmente el benzoil-carbinoly la w-aminoacetofenona. Los resultados son más notables cuandose procede a 40° durante ocho horas. Cinc y níquel triplican la ac-ción de la w-aminoacetofenona, y el magnesio la duplica. Igual efec-to produce éste sobre el benzoil-carbinol, y Zn, Ni y Al refuerzan suactividad en un 60 por 100. Parece ser sensible la acción del ion mag-nesio sobre el ácido -nicotínico y la adermina ; a 40°, ambos modelosno liberan fósforo del substrato, pero en presencia de aquél la cifrapromedia para uno y otro es de 4 mgrs. de P por 100.

Durante las experiencias realizadas, el curso de ellas y la deter-minación del fósforo liberados, se han visto interferidas por los mo-delos.mismos-o por reacciones secundarias debidas a la presencia delos iones metálicos.

El benzoil-carbinol reduce por sí mismo el complejo 'fosfomolíb-dico, lo que obliga a modificar la técnica colorimétrica de determi-nación del fósforo liberado.

La w-aminoacetofeñona, por su parte, en las condiciones de losensayos/ origina unos productos coloreados, que pueden separarsepor éter, de cuya disolución se cristaliza una difenil-piracina de pun-to de fusión 196°.

El ácido orto-'áminobenzoico precipita sales metálicas que hansido caracterizadas, y algunas de ellas preparadas por primera vez.Así ocurre con las'de cinc, níquel y cobalto.

(34) Ami. Fis. y Quim. 34, 376, 19S6.(35) KOPPE, Seyl. Z. 232, 165, 1935.

— I98 — '

Los modelos piridínicos (sobre todo el ácido nicotínico y Ia vi-tamina B6) dan por arrastre unos precipitados voluminosos, en losque intervienen el fósforo liberado y el reactivo molíbdico, que pue-den redisolverse sin daño para la valoración.

Teniendo presente, además, el papel que en la estructura y el me-canismo de los fermentos ejerce el constituyente proteico, ensaya-mos la variación que en la actividad de los modelos ocasiona la pre-sencia de una proteína no específica, .completando las experienciasanteriores con la "utilización de la separada de la fosfatasa por diá-lisis. En el primer caso, se obtienen globulinas de suero de vaca, ysobre el substrato de glicerofosfato-sódico y en condiciones experi-mentales que no ocasionen la desnaturalización de la proteína se dejaactuar en el .conjunto mo délo-globulina y modelo-globulina-ión me-tálico. La adición de globulinas a los modelos, con o sin iones aña-didos, no conduce a ninguna consecuencia de interés. Tampoco laadición del producto proteico de la diálisis de la propia fosfatasa hacellegar a resultados de especial activación.

P A R T E E X P E R I M E N T A D

OBTENCIÓN DE FOSFATASA OSEA

En la obtención de la fosfatasa ósea se utilizan los huesos largosde conejos jóvenes, de dos a tres meses, previamente privados deltejido conjuntivo. Estos huesos previamente lavados repetidas vecescon agua destilada y reducidos a trozos pequeños se extraen conuna mezcla de acetato de etilo, tolueno y alcohol al 30 por 100, todos

,los cuales han sido purificados y rectificados cuisadosamente (1). Porcada N. gramos de huesos se utilizan N c. c. de alcohol y N/10 deuna mezcla en partes iguales de acetato de etilo y tolueno ; el con-junto se agita mecánicamente, durando la extracción de cinco aseis horas. Una separación grosera de la parte sólida y posteriorcentrifugación nos suministra un líquido amarillento del que se pre-cipita el fermento, llevando la concentración alcohólica del 30 al 65por 100 ; el conjunto se agita enérgicamente unos minutos y la fos-fatasa precipitada se separa por centrifugación lavándose varias ve-

(1) LORA y R. BLANCO, Anal. Fis. y Quim. 34, 876, 1936.

— 199' —

ces, primero con alcohol absoluto y luego con éter anhidro, conser-vándose en desecador de vacío. La fosfatasa osea es un sólido blan-co fácilmente dispersable- en agua.

INCINERACIÓN Y ANÁLISIS ESPECTRAL DE LA FOSFATASA OSEA

A) Incineración.—La fosfatasa ósea se incinera en un crisol deplatino, obteniéndose un polvo de aspecto algo rojizo. De 0,1315 gra-mos de fermento se obtienen 0,0098 grs. de cenizas.

Se preparan cuatro muestras distintas de cenizas obtenidas de fos-fatasa ósea procedente de diferentes extracciones.

B) Análisis espectral.

P L A C A N Ú M . I

Elee.base

FeCuCu

Taladro

'Vi

C o n t e n i d o

Cenizas núm. i

—

Amp.

3,75

V.

32,5

Exp.

25 s.3 m.—

Obse rvac iones

Orientación, Análisis

Orientación

P L A C A N Ú M . 2

Elee ,base

FeCuCuCuCuCuCuCuCuCuCu

T a l a d r o

' V i - '' 'Vs>vî -

2

2

22 '

2

^^

C o n t e n i d o

Cenizas núm. 2Cenizas núm. 3Cenizas núm. 4

SO4Ni (e. p.),S04Co'(e. p.)OZn (e. p.)Cl2Hg (e. p.)S04Mn (e. p.)

•

Amp.

3,75

, —

—————"•

V.

32,5

— .

——————~

Exp.

25 s.3 m-

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—2 m.2 m.2 m.2 m.2 m.3 ni.

O b s e r v a c i o n e s

OrientaciónAnálisis

»»

Orientación»

* »•»»j>»

Se han fotografiado en la misma placa los espectros de algunosmetales para facilitar el, estudio, del que se deduce una completaidentidad en las cuatro muestras de cenizas de fosfatasa.

Queda claramente demostrada en ellas la existencia de los meta-les calcio', magnesio, cinc, hierro y níquel, y en menor proporciónsodio, estroncio, silicio y boro.

— 2OO —

OBTENCIÓN DE LA FOSFATABA RENAL (2)

La papilla de ríñones, previamente privados de todo er tejido con-juntivo, se extrae con una mezcla de alcohol al 50 por 100, acetatode etilo y tolueno, todos los cuales han sido cuidadosamente purifi-cados y rectificados. Por cada N gramos de papilla de ríñones seutilizan N c. c. de alcohol y N/10 c. c. de una mezcla en partes igua-les de acetato de etilo y tolueno ; este conjunto se agita mecánica-mente durante cuatro a cinco días, al cabo de Jos cuales se hace pri-meramente. una separación,grosera de la parte sólida mediante unBuchner adecuado, filtrándose a continuación la suspensión obteni-da. Cuando se emplean cantidades relativamente grandes en la ex-tracción, la filtración ha de ayudarse accidentalmente con un peque-ño~ vacío y separando la torta sólida que progresivamente se forma,

El líquido obtenido, con un color amarillento, más o menos os-curo según la eficacia de la extracción,"contiene la fosfatasa, del quese separa por precipitación con alcohol, bien absoluto o del 96 por100, llevando la concentración alcohólica del 50 al 65 por 100. .Enel cálculo de la cantidad de alcohol a añadir hay que tener en cuentala presencia de los .otros disolventes, la concentración del alcoholque se utiliza y las pérdidas que del conjunto tienen lugar, ya seapor evaporación inevitable o por su retención por er sólido.

Una vez llevado el líquido-filtrado a dicha concentración del 65por 100, se agita durante vinos minutos enérgicamente, y se colocael conjunto en probetas altas para favorecer el depósito de la fosfa-tasa y su posterior separación por decantación ; el decantado se cen-trifuga y la fosfatasa obtenida se lava repetidas veces con alcohol yéter anhidros. Se conserva en desecador vacío.

El aspecto de la fosfatasa renal es exactamente igual al de la fos-fatasa ósea, y el rendimiento aproximadamente de un gramo porcada kilogramo de papilla de ríñones.

La fosfatasa así obtenida se dispersa bien en agua, y puedenprepararse con ella suspensiones homogéneas para los ensayos ulte-riores.

(2) HOPPE, .Sói/. Z. 232, 165, 1935.

— 201 —

INCINERACIÓN Y ANÁLISIS ESPECTRAL DE LA FOSFATABA RENAL

a) t Incineración.—La fosfatasa.se .incinera en crisol de platino,obteniéndose un polvo de aspecto débilmente grisáceo. De 0,2440gramos de enzima se obtienen 0,0109 grs. de cenizas.

'Se preparan dos. muestras distintas de cenizas obtenidas de^fos-fatasa renal procedente de extracciones diferentes. .

b) Análisis espectral.—El análisis -espectral se realizaren la pe-,lícula obtenida con arreglo al dispositivo :

E l e e ,base

FeCu

—Cu

————~- •

T a l a d r o

""Vi— .

2• - —

—

—

—

C o n t e n i d o

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—• OZn fe. p.) (Zn)SO4Ni (e. p.) Ni)SO,Mg (e. p.) (Mg)C03Ca(e. p.) (Ca)A1203 (e. p.) (Al) •

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O b s e r v a c i o n e s

Orientación "Análisis

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En la misma película se han fotografiado los espectros de algu-nos metales para favorecer el estudio, del que se deduce una com-pleta identidad en las dos muestras .de cenizas de fosfatasa.

Queda demostrada la existencia en ellas de los metales magnesio,cinc, níquel, calcio, hierro, siendo de destacar una notable riquezaen magnesio, así como débiles líneas de sodio y potasio.

ACCIÓN DE LOS IONES METÁLICOS SOBRE LOS MODELOS DE FOSFATASA

A) Preparación de algunos modelos.

a) w-aminoacetof enona.—A partir de la acetofenona por broma-ción (3) y calefacción con ftalimida potásica ,de la bromoacetofeno-na (4), resultando la <o-aminoacetofenona del tratamiento con ácidoclorhídrico de la fenacilftalimida.

(3) BJ. VII, 283.(4) .GABRIEL, B. 41, 1.132, 1908

— 202 —

b) Éensoil-carbïnol.—Se prepara a partir de la w-bromoacetofeno-na (5), según la nota operatoria de G. Ramón (6).

c) Acido p-aminob'ensoico.—Se ha preparado por hidrólisis de laanestesina.

B), Preparación de la solución tampon.

Para mantener el pH conveniente a cada uno de los ensayos seutiliza solución tampon de acetato-veronal, preparada mezclando5 c. c. de solución de veronal sòdico, 2 c. c. de cloruro sòdico al 8,5por 100 y 20 c. c. de una mezcla de ácido clorhídrico 0,1 N y aguadestilada, variable según el pH de que se trate ;" la solución de vero-nal se prepara con 9,714 grs. de acetato sódico, 14,714 grs. de ve-ronal sódico y agua destilada libre de CO2 hasta 500 c. c.

C) Ensayos de hidrólisis.

a) Modelo.s empleados.—Benzoil-carbinol, w-aminoacetofenona,ácido p-aminobenzoico, ácido o-aminobenzoico, ácido nicotínico, ni-cotamida, vitamina B6.

b)1 Iones metálicos ensayados.—Cinc, níquel, magnesio, calcio,sodio y aluminio en solución M/20.

c) Técnica operatoria.—Se emplea como substrato una disolu-ción M/20 de glicerofosfato sódico tamponada con acetato-veronal ;sobre este substrato hacemos actuar los modelos anteriores, a la vezque consideramos la influencia metálica sobre ellos.

D) Medida de la actividad-fosfatásika de los modelos.

En el estudio cuantitativo de là actividad fosfatásica de los mode-los,, utilizamos para la determinación de la cantidad de fosforo in-orgánico liberado la técnica colorimétrica de Brigg (7), fundada enla reducción del fosfomolibdato amónico a azul de molibdeno por laacción de la mezcla hidroquinona-sulfito sódico.

Una vez transcurrido el tiempo durante el cual ha actuado el modélo sobre el substrato y suspendida la acción por un descenso rápi-

(5) B. 24, 2.680, 1891 ; 39, 2.294.(6) G. RAMÓN, Anal. Fis. y Qutm. 5, 587, 1948.(7) 7. Biol. Chem. 59, 255, 1924.

— 203 —

do de temperatura, las operaciones que siguen a la hidrólisis van en-caminadas fundamentalmente a obtener una disolución de fosfato de.concentración adecuada para la mayor. exactitud del procedimientoutilizado en la valoración.

La línea e'xtinción-concentración (gráfico 1) obtenida con solucio-nes «standard» de fosfato, valoradas gravimetricamente en forma depirofosfato amónico-magnésico, únicamente es recta entre las extin-ciones aproximadas de 0,2 y 0,6, y, por tanto, las transparencias me-didas por el colorímetro correspondientes a estas extinciones han decaer'asimismo dentro-de una determinada zona, lo cual se consiguelógicamente mediante una dilución adecuada del líquido que contieneel fosfato a valorar. Por tanto, no podemos exponer de una manerageneral las manipulaciones para todas las investigaciones ' de estetipo, sino que en cada caso particular habremos de atenernos a lasespeciales, condiciones requeridas por el ensayo.

La recta extinción-concentración se obtiene a* partir de solucio-nes de PO4H2K que contienen :

I. 1 c. c. .= 0,1 mgrs. de PII. 1 c. c. = 0,025. » de P

III. l c. c. = 0,020 » de PIV. l c. c. = 0,010 » de P

con arreglo a la siguiente dilución :

Punto A 1 c.c. soolución IIIO 002 mgrs./cc. 6 c. c. agua destilada

3 c. c. reactivos

Punto B .,..: 1,5 c. c. solución III0,003 mgrs./cc. 5,5 c. c. agua destilada

3 c. c. reactivos

Punto C 2 c. c. solución III0,004 mgrs./cc. 5 c. c. aguas destilada

3 c. c. reactivos

Los reactivos utilizados en la colorimetria del fòsforo son: l.°) Solución demolibdato amónico al 5 por 100 en ácido sulfúrico 5 N. 2.°) Solución al 1 por 100As hidroquinona, y 3.°) Solución recientemente preparada de sulfito sódico aí20 por 100.

— 204 —

La transparència leída en el colorímetro, previamente transfor-mada (8) en extinciones, nos da por medio de la recta extinción^

o.eooS _ U,DO/ utoo4o,ot}3Recta Pa trón

Gráfico i.

concentración los mgrs. de P existentes en 1 c. c. de disolución va-lorada.

(8) A. D. MARENZÍ, Fotometria y ÍM aplicación al análisis biológico, págs. 4S40.

— 205 —

E) Dispositivo general de hidrólisis.

El dispositivo general de hidrólisis es el siguiente :

Glicerofosfato -tamponde acetato-veronal..

ModeloAgua destilada. . . . . . .Solution mefálita M/20-

i

4 c. c.O-2 mmol

2 C. C.

11

4 c. c.o 2 mmol

I C. C.

i c. c.' Zn

m

4 c. c.0,2 mmo]

I C C .

t c. c. Ni

IV

4 c. c.o 2 mmol

I C. C.

i c. c. Mg

V

4*c. c.o 2 mmol

I C. C.

i c. c. Ca

VI

4 c. c.

I C C .

i c. c. Na

VII.

4 c. c.

I C. C.

i e. c. Al

Simultaneamente.se disponen los siguientes testigos sin modelo ysin substrato, respectivamente :

Testigos con substrato de glicerofosfato-tampón sin modelo.

Glicerofosfato- tamponde acetato-veronal..

Agua. . . .... ...Solución metálica M/20 . . . .

i

4 c. e.2 C. C.

II

4 c. c.I C. C.

i c. c. Zn

III

4 c. c.I C. C.

i c. c. Ni

IV

4 C. C.

1 C. C. -

i c c. Mg

V

'4 c. c.1 C. C.

i c. c. Ga

• VI

4 C. c.1 C C.

i c. c. Ha

' V I I

4 c. c.1 C . C.

i c.c. Al

Testigos sin substrato con modelos.

Agua destilada . . . . . .ModeloAgua destilada . . . .Solución metálica. . . .

I

4 c. c.0,2 mmol

2 C. C.

I.,

4 c. c.o, 2 mmol

I C. C.

i c. c. Zn

III .

4 c. c.0,2 mmol

I C, C.

i c. c. Ni

IV

4 c. c.o,2'mmol

I C. C.

i c. c. Mg

V

4 c. c.0,2 mmol

I C. C.

i c. c. Ca

VI

4 c. c.0,2 mmol

i "c. c.i c. c."Na

Vil

4 c. c.o, 2 mmol

I C. C.

i c.c. Al

No obstante, cada modelo representa un caso particular y un pro-blema a resolver, siempre acentuado en su acción conjunta con losiones metálicos.

F) Condiciones experimentales

El conjunto de experiencias que tienen lugar con los modelos enunión de iones metálicos se realizan en solución perfectamente tam-ponada, cuya constancia se ha observado por lecturas electrométri-

— zoo —

cas. Se procede calentando en termostato durante ocho.horas a 40°,o bien a 80° durante cuatro horas. En las tablas I y II se expresanlos resultados obtenidos en estas condiciones y a pH 6,7.

O B S E R V A C I O N E S

1:" Después de la hidrólisis con el benzoil-carbinol se encuentraque. aun los testigos sin substrato dan colpración azul con los reac-

T A B L A I

Benzoilcarbinol

<u-aminoacetofenona. . .Acido nicotínico

H20

°/.P

tt,oo0,080,000,000,520,00

0,000,00

Zn

%P

<0,OO

0,13(72)0,000,00•1,5(188)0,000,00

0,00

Ni

P/oP

0,000,13 (62)0,000,001,7(226)0,00

0,000,00

Mg

»/o P

0,00o, 1 6 ( i oo)0,000,001,2(130)3,80,004,2

.Ca

%P

O,OO0,080,00O,OO0,48O,oo.ovoo

- 0,00

Na

°/oP

O,OO0,07O,ooO,OO0,400,000,00O,OO

: A1

°/oP

0,000,13(6- ')o,'oo0,000,540,00

0,000,00

T A B L A I I

Benzoilcarbinol . . . . . . .

w-atninoacetofenona . . .

H20

% P .

o ^o^ ,7C•2,874-44O,2o,Oo1.7

Zn

%P

o 18O 77 ÍQ7Í

T. Oí

1,98

5,3(19)i,6 qO OO

i •?

Ni

%p

o 18o 58•2,14

2 I

.5,5(23)2,2

O,OO

I 6?

Mg

. %P

O 2 I

O 7O Í4.8Í

•3.4.0

2,2 I

5,08(14)2,^=;o oo2,2 (2Q\

Ca

%P

o 08

3 C T

l 64,352.2

O OO

I 1

Na

•AP

O OO

•3, '7

•ï 77

4,38

2,1 "í

OO O

I 7

Al

°/oP

' O ^O

o 83

I 87

1,670,001,68

Los números entre paréntesis representan el por ibo de incremento de la actividad.

tivos,.lo que obliga a separarles de la disolución por repetidas ex-tracciones con éter antes de llevar el conjunto a la dilución apro-piada.

2.a La w-aminoacetofenona experimenta. durante la calefacciónuna descomposición pronunciada, incrementada por la presencia demetales, «obre todo del níquel que ocasiona la formación de abun-dante precipitado y coloración roja intensa ; el cinc da también lugar

— 2O7- —

a la formación de precipitado abundante, .aunque no tan .intensa co-loración ; el precipitado del magnesio es menor, si bien la coloraciónes como en el caso del níquel.

Para valorar se elimina el color por extracción con éter. De losextractos-etéreos se consigue cristalizar una sustancia de punto defusión 196a:

A N Á L I S I SN % ... ..." , 11,98N % calculado para CgH9OH. ... ...... 12,00(2,5-difeniIpirazina p. f. Í96°)

3.a El ácido orto-aminobenzoico actuando sobre la disolucióntamponada de glicerofosfato sódico y en presencia de iones cinc, ní-quel y cobalto, forman precipitados, respectivamente, blanco-amari-llentos, ligeramente verdoso y ligeramente rosado, que hay que se-parar por filtración para proseguir la valoración del fósforo. La pre-cipitación es cuantitativa con relación al componente.. metálico y losprecipitados se caracterizan como- las sales correspondientes del áci-do orto-aminobenzoico. El grupo — N H 2 del ácido no participa enla formación del compuesto metálico, ya que los precipitados son fá-cilmente diazotables.

Precipitado con Zn.

Sólido de color blanco-amarillento, insoluble en agua fría y aebullición; soluble en ácidos diluidos, incluso en acético, y fácilmen-te dfazotable.

A N Á L I S I SN % experimental ... 8,29N % (HaN-C6H4-COO)2Zn 8,24Zn % experimental ... ... .'.. • •- •-.. 19,5Zn % (H2N—G6H4—COO)2Zn ... 19,48

Precipitado con Ni.

Sólido, con ligero color verdoso, insoluble en agua, difícilmentesoluble en ácido acético diluido ; fácilmente diazotable.

A N Á L I S I SN % experimental 8,48N ' % (H,N^-C6H4—COO)2Ni 8,51Ni % experimental ..- 1T.75Ni % (H2N-C6H4-COO}2Ni 17,8

— 2o8 —

Precipitado con Co.

Sòlido, con Ifgero color rosado, insoluble en agua, difícilmentesoluble en ácido acético diluído, y fácilmente diazotable.

A N Á L Í S I S

N '% experimental ... ... , ... 8,53N % (H2N—C6H4—COO)2CO ... 8,50Co.% experimental ... 1781Co % (H N-C H -CÔO) Co ... 17,9*

4.a En la valoración con molibdato-hidroquinona-sulfito de laación debida a los modelos ácido nicotínico, nicotamida y vitaminaB6 aparece un precipitado voluminoso amarillento en el preciso mo-mento de la adición del molibdato.

Este precipitado se forma :a) Cuando se mezclan en frío : disolución de fosfato potásico,

disolución de ácido" nicotínico, la amida o vitamina B6 y disoluciónde molibdato amónico.

¿>) Cuando el substrato de glicerofosfato se calienta previamen-te á 80° durante cuatro horas con dichos tres .modelos y luego seañade a la disolución el molibdato amónico.

c) Cuando mezclando previamente fosfato potásico y molibdatoamónico, sin que entre ellos ocurra reacción alguna, se añade poste-riormente la disolución del modelo ensayado.

d) Con solución de ácido molíbdico, fosfato potásico y ácido ni-cotínico, nicotamida o vitamina B6.

En cambio, no se forma dicho precipitado tomando pares-aisla-dos de las soluciones fosfato-modelo-molibdato amónico ; así comotampoco al mezclar soluciones de ácido molíbdico, ácido fosfórico ysolución de modelo.

De todo ello parece deducirse- la acción conjunta del modelo y elfosfato, añadido "o producido en la hidrólisis del glicerofosfato, conel -molibdato amónico en la formación del precipitado.

Valoración cuantitativa del fósforo por el precipitado producido.

Como el fósforo forma parte del precipitado producido, preten-demos valorar el fósforo liberado en la hidrólisis .por disolución delprecipitado en NaOH 0,1 N, como si se tratase de fosfomolibdatoamónico, y luego el exceso de álcali valorarle con C1H 0,01 N. Ha-

— 2og —

cemos varias pruebas con los precipitados formados, valorándoles sim-plemente previa centrifugación y también por centrifugación y ante-rior lavado con agua y alcohol.

La disposición de los ensayos es :

4 c. c. agua , 4 c. c. agua1 ce. agua-1 ce. fosfato 1 ce. agua-1 ce. fosfato

(0,1, mgr. P/cc.) (0,1 mgr.- P/cc.)

Ill III' III" IV IV' IV"

4 c. cs agua 4 c. c. agua: -l cc. agua-1 cc. fosfato l ce. agua-1 ce. fosfato' (0,1 mgr. P/cc.) (0;l mgr. P/cc.)

0,2 mmol ácido nicotínico 0,2 mmol nicotamida

A todos estos conjuntos añadimos un centímetro cúbico de solu-ción al 5 por 100 de molibdato amónico en ácido sulfúrico 5 N. Alos conjuntos I y II no les ocurre nada y en el resto se forman abun-dantes precipitados ; III' y IV lavamos con agua ; III" y IV" lava-mos con alcohol, y los III y IV les centrifugamos solamente. Al lavarel precipitado con alcohol se disuelve en gran parte el correspon-diente al ácido nicotínico ; el precipitado formado en presencia dela amida no se disuelve tan fácilmente. Este hecho induce a pensarla desigualdad de ambos precipitados y, por tanto, la participaciónen ellos del ácido o de la amida, respectivamente.

c. c. gastados

NaOHo. iO ClHo.oiN: (f •= o,8aa) (í = 1,069

( III 4 1,8Sinlavar j iv ......... 3 11,4

I III' -..' 3,6 12,7^.Larado con agua j Iy, _ 2 ^

IH"..... 1 »Lavado con alcohol v// 2 94

RÏV. DE LA REAL ACADEMIA DE CIENCIAS.—1950. u

Cálculo del fósforo contenido en el precipitado disuelto en s'osa0,íN (/ = 0,822) como si se tratase de fo_sfQm,Qlibdato_ amónico.

IH. 4 ce. 0822 = 3,288 ce. NaOH 0,1 N1,8 ', . 1,069 = 0,190 ce. C1H 0,1 N.3,29 —-0,19 = 3,10 ce. ;NaOH 0,1 N gastados3,10 , 0,1348 (mgrs. de P. correspondientes a

.1 ce, de NaOH 0,1 N) = 0,41 .mgrs..

Como en total pusimos en el ensayo III 0,1 mgrs. de fósforo yse da el caso de que el resultado es como si existiera cuatro vecesmás, el precipitado total no debe ser de la constitución de un fosfo-molibdato ; pudiera entrar en su formación el ácido nicotínico queconsumiera en su disolución más álcali del debido, con el aumentoconsiguiente en el imaginario porcentaje de fósforo.

IV. 8 0,822 = 2,466 ce. NaOH 0,1 N11,4 . 1,069 = 1,21 ce. C1H 0.1 N2,46,- -1,21 - = 1,25 ce. NaOH gastados1,25 .0,1348 = 0,168 mgrs. de P.

Esta cantidad es también algo superior, pero más aproximada ala cantidad de P. puesta (0,1 mgrs.); la nicotamidaj aunque forma-ra parte del precipitado, no consumiría álcali.

III'". 3,6 . 0,822 = 2,96 ce. NaOH 0,1 N12,7 . 1,069 = 1,36 ce. C1H 0,1 N2 96 —1,36 = 1,60 ce. NaOH 0,1 N gastados,1,60 . 0,1348 = 0,21 mgrs. de P.

Vemos que, aun después de lavado con agua el precipitado con-teniendo ácido nicotínico, sigue dando un valor de fósforo doble delpuesto en el ensayo correspondiente, aunque descendiendo notable-mente de cuando no se lavó.

IV'.. , 2 .0,822 = 1,644 ce. NaOH 0,1 N4,5 . 1,069 = 0,48 ce. C1H 0,1 N *1,64 — 0,48 = 1,16 ce. NaOH 0,1 N gastados1,16 .0,1048 = 0,15 mgrs. de P.

Es, aproximadamente, igual que el valor obtenido cuando el sis-

— 2 1 1 —

tema en presencia de nicotamida no se lavó con agua y algo superioraún al valor- de fósforo puesto en la disolución.

HI". 1 • 0822 = 0,822 ce. NaOH 0,1 N8 . 1,069 = 0,85 ce. C1H 0,1 N0,83 — 0,85 =0

Vemos que al lavar el precipitado, obtenido en presencia de áci-do nicotínico, con alcohol, se ha disuelto en él todo lo que habríaposteriormente de disolverse en sosa.

IV". 2 (. 0,822 = 1,644 ce. NaOH 0,1 N9,4 '.1,069 =1,00 ce. C1H 0,1 N1,64 — 1,00 = 0,64 ce. NaOH gastados0,64 . 0,1348 = 0,08 íngrs. de P.

Valor también aproximado, en presencia de nicotamida^ aunqueen este caso por defecto, a la cantidad de P puesto en la disolución.

Influencia en la composición del precipitado de la cantidad de mo-_libdato añadida.

Al conjunto :

1 e. c. H2O — 1 c. e! sol. fosfato (0,1 mgr. P)4 . ce. agua destilada0,2 mmol ácido nicotínico

repetido dos veces añadimos 1 ó 2 c. c., respectivamente, de solu-ción de molibdato amónico, al 5 por 100. En ambos casos centrifu-gamos, el precipitado formado, disolvemos en sosa, y valoramos elexceso de álcali -con ácido clorhídrico 0,01N. Los resultados hansido :

Molibdato amónico

Ì c. c.2 c. c.

Cálculos :

3 .. 0,822 = 2,466 ce. NaOH 3 0,822 = 2,466 ce. NaOH.5,8 .1,069 = 0,620 ce. C1H 5,6 1,009 = 0,598 ce. C1H .2,466—0,620 = 1,846 ce. NaOH 2,466 — 0,598 = 1,868 ce. NaOH1,84 . . 0,1348 = 0,248 mgrs. P. 1,86 . 0,1348 = 0,250 mgrs. P.

c. c. gai

nico NaON o,iN

3• . ..: 3

itados

ClHo.iN

5,85,6

— 2 ia —

Como puede observarse, no hay influencia,alguna motivada porla cantidad de molibdato añadida.

Influencia sobre la composición del precipitado de la calefacción a80° durante cuatro horas del sistema :

4 c. c. de glicerofosfato sódico. M/200,2 mmol dé ácido nicotínico o la amida1 c. c. agua1 . c. c. solución de fosfato (0,1 mgrs. de P).

En frío, el modelo no tiene acción sobre el substrato, y el valorobtenido por el anterior método volumétrico .para este sistema enfrío, será únicamente debido al fosfato, si bien ambos valores defósforo, teórico añadido y experimental del precipitado calculado enforma de forfomolibdato amónico, no coinciden bien por no corres-ponder dicho precipitado exactamente a la fórmula PO4I(NH4)3, í2MoO3, bien por intervenir en su composición cantidades variables demodelo. Si al calentar el conjunto-anterior hubiese alguna variaciónen la composición del precipitado tendría que verificarse :

(Valor en caliente) 80°, 4h.—(Acción del modelo sobre el substrato)Valor en frío del sistema

1.° Con ácido nicotínico :

c. c. gastados

NaOHo.iN C1N o,orN

Valor en frío del sistema 3 3,2Valor en caliente ... ... 4 0,2Acción independiente 3 5,7

Resultados :

mgrs. de P

Valor en frío 0,285Valor en caliente .... 0,440Acción del modelo ... 0,249

De donde se deduce que el valor en caliente viene a ser aproxi-madamente igual al valor en frío más el valor de la acción que a 80°

— 213 —

durante cuatro horas ejerce independientemente el ácido nicotínicosobre el glicerófosfato sódico;

2.a Con la amida nicotínica:c. c. gasiados

NaOHo.iN ClHo.oiN

Valor en frío del sistema '. 3 8,5Valor en caliente ., ... 3 -3,6Acción del modelo 2 7,0

Resultados :mgrs. P

Valor en frío 0,195Valor en caliente , ,. 0,280Acción del modelo -¡ 0,119

-También - en este caso se verifica con bastante aproximación laigualdad: Valor en caliente = Valor en frío + Acción del modelo.De ello podemos concluir que,el precipitado producido al investigarla acción de los modelos ácido nicotínico y nicotamida sobre el gli-cerófosfato sódico es el mismo que el obtenido en frío en los ensa-yos anteriores.

Contenido en nitrógeno del-precipitado..—Hacemos análisis deN amoniacal del precipitado amarillo obtenido en las experiencias an-teriores :

% N amoniacal del precitado ... ... , 0,42•% N (P04(NH4)3, 12 Mo03...)-

:. ... ... -2,2

La inconstancia de la composición de este precipitado, deducidade los resultados analíticos, no permite asignarle una estructura de-finida, pareciendo posiblemente un caso de arrastre del modelo porel tamaño de la molécula fosfomolíbdica. No puede valorarse, poi-tanto, su contenido en fósforo por el método volumétrico ensayado,y para obviar la dificultad que crea su aparición .se ha procurado quetodo el precipitado se redisuelva, mediante- ensayos preliminares desu solubilidad, eri la solución sulfúrica del reactivo, dando •previa-mente al líquido que contiene el fosforo una dilución-adecuada, demodo que todo él pueda formar rápidamente el azul de molibdenopara su valoración colorimétrica.

— 214 —

Para ver la posible interferencia en la valoración motivada porla aparición de este precipitado se hacen determinaciones colorimé-tricas con soluciones standard de fosfato, según la siguiente dispo-sición :.

4 .-e. c.'de.agua destilada0,2 mmol de ácido nicotínicoI c. c. H2O--1 c. c. sol. fosfato (0,1 mgr..P)

Un centímetro cúbico de esta disolución contiene 0,0160 mgrs. defósforo, y en la valoración colorimétrica se obtienen 0,0169 miligra-mos P/c. c. Luego esta valoración es prácticamente correcta en pre-sencia de los modelos, aun cuando se llegue a formar el precipitado,pero con tal .que se redisúelva en seguida y pueda tomar parte enla reacción coloreada.

5.° En el caso de acción combinada del ácido nicotínico " y lavitamina B6 con el ion Mg se reproducen en la tabla I unos valoresobtenidos repetidas veces según el dispositivo principal :

4 c. c. glicerofosfatp-tampón M/200,2 mmol de modelo1 c. c. H O — 1 ce. sol Mg

2

pero al lado de estos valores elevados se- han obtenido en estas con-diciones algunas veces resultados negativos de hidrólisis, obtenién-dose los primeros cuando el correspondiente testigo sin modelo nimetal da un contenido inicial en fosfato liberado. Desde luego, lasexperiencias han sido realizadas simultáneamente con el ácido nico-tínico, la nicotamida y la vitamina B6, y con el mismo substrato y lamisma solución de sal de magnesio, en idénticas condiciones expe-rimentales y empleando en. su valoración la misma dilución :

T R A N S P A R E N C I A SDilución =======

Acido Amida Vit. B6

1:15 31 88 27

INFLUENCIA DE GLOBULINAS SOBRE MODELOS DE FOSFATABA

A) Obtención de globulinas.

Las globulinas se obtienen a partir de suero de sangre de vaca.El suero es previamente centrifugado y luego se trata con un volu-

2 1 5 —

men igual-de una solución saturada de sulfato amónico, dejándoloestar en reposo a baja temperatura durante doce horas. El sólidoprecipitado se filtra a la trompa y lava con solución de sulfato amó-nico a media saturación.

La torta de proteínas así obtenida se disuelve en la menor can-tidad posible.de disolución semisaturada de sulfato amónico, y se pu-rifica finalmente por diálisis.

B) Acción independiente,de globulinas y cambinadaA. con metales..

o) Disposición de las experiencias.

Se emplea substrato de glicerofosfato M/20-tampón, de acetato-veronal, sobre el que se hace actuar la proteína, bien sola o unida al-metal correspondiente : -

Agua . . . .1 c. c. sol. M/2O.. . . .Globulinas. . . . . . . .

I

1 C. C.

II

Zn1 C. C.

.

III

Nil C. C.

IV

4 c. c.

MgI C. C.

, V

A C. C.

CaI C. C.

VI

AlI C. C.

disponiéndose además la correspondiente serie de testigos sin subs-trato y sin globulina y globulina-metal.

¿>) Las condiciones experimentales son siempre que se empleenglobulinas 40° durante un período de ocho horas.

c) Técnica operatoria.Para evitar la precipitación de las proteínas añadidas con los reac-

tivos de valoración del fósforo, se separan previamente con'soluciónal 20 por 100 de ácido tricíoroacético, se filtra y se lleva la disolu-ción a la dilución conveniente.

En los casos del benzoií-carbinol y la a-aminoacetofenona son vá-lidas las observaciones hechas anteriormente a este respecto.

T A B L A III

Globulinas

H2O

0,84

zn

0,69

N¡

0,71

Mg

O,79

ca

0,73

AI

O. Ç I

— ilo —

C)' A'ccción conjunta de globulinas y modelos- de fo.sfatasa.

a) Disposición de los ensayos.

Se emplea substrato de glicerofosfato sòdico M/20 tamponada enla misma disolución con acetato-veronal y sobre este conjunto subs-_trato-tampón se hacen actuar conjuntamente los diversos modelosensayados con globulinas cqn arreglo al siguiente esquema :

0,2 nimol de modelo..

Agua ........Globulinas ....

I ,

4 c. c. 'benzoilcar-

binolI C. C.

. I C. C.

Substrato0,2 mmol de modeloAguaGlobulinas ... . . , . . - . . .

II

4 c. c.o-aminoben-

zoicoI C. C.

I C. C.

V

4 c. c.ácido nicotínico

1C. C.

I C. C.

III

4 c. c.p-aminobcn-

zoicoI C. C.

1 C. C.

VI

4 c. c.amida nicotínica

I C. C.

I .C. C.

IV

4 c. c.w-aminoace-

tofenonaI C. C.

1 c. c.

Vil

4 o.e.vitamina B6

I C. C.I C. C.

è) Las condiciones experimentales y la técnica operatoria, exac-'tamente igual que en el caso anterior.

T A B L A I VGlobulinas

ídem con benzpil-carbinol .

Idem con p-aminobenzoico

Idem con o-aminobenzoico

ídem con «-aminoacetofenona .

Idem con ácido njcotínico , ... ..

'ídem con nicotamida ... '-. . . .

ídem con vitamina B

0,84 %

0,85 %

0,76 %

0,04 %

0,88 %

0,GO %

0,85 %

0,78 %

0,5G %

0,01 %

0,84 %

0,58. %0,83 »/o

0,70 %

La segunda columna de valores se refiere a resultados obtenidosen experiencias de incubación previa de los modelos con la proteína.

— 217 —

D) Acción de globulinas y metales juntamente c<m mo_delo_s de ÍQ.S-fatasa.

a) Disposición de los ensayos.

^Se utiliza como substrato una disolución M/20 de glicerofosfatosódico en tampón de acetato-veronal, sobre la'que se hace actuarconjuntamente el -modelo respectivo con las globulinas y cada unode los metales ensayados.

El dispositivo de esta serie de experiencias es el siguiente :

ni IV

Substrato

Modelo

Agua

Globulinas ....

i c. c. solución metal.

4 c. c.

0.2 ramol

, i c. e.

i c. c.

4 c. c,

0,2 mmol

i c. c.

Zn

4 c. c.

0,2 mmol

i c. c.

N Í '

4 c. c. •

0,2 mmol

i c, c.

Mg:VI- VII

Substrato.

Modelo.

Globulinas.

Agua

i c. c. solución metálica.

4 c. c.

0,2 mmol

i c, c.

Ca

4 c. c.

0,2 mmol

i c. c.

Al

4 c. c.

0,2 mmol

2 c. c.

Todo este conjunto se repite para cada uno de los modelos ben-zoil-carbinol, w-aminoacetofenona, o-aminobenzoico, p-aminqbenzoi-co, ácido nicotínico, nicotarnida y vitamina B6, con sus correspon-dientes series de testigos.

b) Las condiciones experimentales como en los casos anterioresen que seNensayan globulinas, calefacción a 40° durante ocho horasen termostato. La técnica operatoria después de la calefacción, coniola ya descrita en el caso anterior.

— 2l8 —

c) Los resultados obtenidos se exponen en la tabla V:

T A ' B L A V

Id, con o-aihinobenzoico.. . .Id. con p-aminobenzoico. . .

Id. con vitamina B ........

Zn . -

0,6o "/„õ 78 °/„0,52-0,200,20-0,00O.Ç Ç-O.I0,50-0,080,64

Ni .

0,71 °/00,76 °L0,52-0,360,20-0,00o, ci0,40o, 6 1

Mg-

0,70 °/n

o 87 °/rt

0,77-0,510,64-0,50o,q8O.4.7

i,3

ca

0,7S °/n0 80 u/n

O,2I

0,48-0,28

0,54

AI«

0,54 °/n

O Ó l °/n

0,200,19-0,120,60

Lãs segundas columnas de valores se refieren a resultados de ex-periencias con incubación de modelos con globulinas.

Copelación de modelos de fosfatasa con «.proteína» de fosfatasarenal.

La proteína de la fosfatasa renal obtenida en la electrodiálisisclorhídrica se centrifuga, se lava con agua destilada y se prepara conella una suspensión" acuosa lo más homogénea posible, la cual se Uti-liza en los 'ensayos de hidrólisis incubada previamente durante veinti-cuatro horas a la temperatura ordinaria con.0,2 m. mole.s de losmodelos: ácido o-aminobenzoico, ácido p-aminqbenzoico, benzoil-carbinol, w-aminoacetofenona, ácido nicotínico y nicotamida. Lãsexperiencias se realizan utilizando; substrato de. glicerofosfato sódicoM/20-tampón'de acetato-veronal pH 9,16 calentando a 40° duranteocho horas.

El dispositivo de hidrólisis es el siguiente :-

Glicerofosfato M/20-tampón pH 9,16 4 c. c. 4 c. c.Proteína de fosfatasa , l c. c 1 c. c.Modelo ... .... 0,2 mmol. 0,2 nunol.

• 1 c. c. H„O 1 c. c. (Mg, Zh; Ni, Ca)

Este conjunto se repite para todos y cada uno de los modelos "defosfatasa mencionados con anterioridad, .

— 2 I9

Asimismo se disponen lös testigos que pondrán de manifiesto laactividad que sobre el mismo substrato ejerza la proteína aislada y'la proteína influida por los metales aislados y en conjunto, como sedisponen en combinación con los modelos :

i u ni I V

4 c. c. subst. 4 c. c. subst. 4 c. c. subst. 4 c. c. subst.

l c. c. proteína l c. c. proteína l c. c. proteína I.e. c. proteína

1 c. ç. agua 1 c. c. (Mg.• Zn, Ni, Ca) . 1 c. c. Mg 1 c. c. Zn

V l V II

4 c. c. subst.

1 c. c.' proteína

1 c. c. Ni

4 c. c. agua

1 c. c. proteína

1 c. c. ,agua

4 c. c. subst.

2 "c. c. agua

Terminada la calefacción se enfría el conjunto y se añade en todoslos casos 0,5 c. c. de ácido tricloroacético y 0,5 c. c. de agua, se fil-tra, y al filtrado con un total de T c. c. se añaden los tres corres-pondientes de la colorimetria del fòsforo.

En el caso del benzoil-carbinol se extrae con éter después de lafiltración.

Los resultados son los siguientes:l.° Acción de la proteína de fosfatasa renal sola y en presencia

de metales:

Proteina de fosfatasa . .

H20

0,76 °/o

. Ms

o,880/0

Zn .

0,21 °/0

Ni

o,55°/o

Mg-Zn-Ni-Ca

0-53 °/o

Se ve que la proteína ejerce una débil acción que se disminuyepor el conjunto metálico Mg-Zn-Ni-Oa, así como por los metales cinc,níquel y calcio independientemente ; el magnesio produce un ligeroincremento.

220 —

2."

la misma :Acción conjunta de la proteína de fosfatasa y de modelos deia :

Proteina 0,76

Idem con o-aminobenzoico... *. ... ... 0,44' '

Idem p-aminobenzoico 0,(iO

Idem benzoilcarbinol ' 0,70

Idem w-aminoacetofenona • '. 0,80

Idem ácido nicotínico. 0,59

ídem nicotamida • ' . ... 0,73

Se observa que la acción que independientemente ejerce la pro-teína sobre el substrato de glicerofosfato -sódico se encuentra dis-minuida principalmente por la presencia de los modelos o-aminoben-zoico, p-aminobenzoico y ácido nicotínico.

3.° Acción de «proteína» de fosfatasa y modelos'conjuntamentecon el sistema de metales :

%

Proteína + (Mg-Zn-Ni-Ca) + o-aminobenzoico : 0,33

Id. Id. p-aminobenzoico !. 0,41

Id. Id. benzoilcarbinol .... ... 061

Id. Id. co-aminoacetofenona 0,93

Id. Id. ácido nicotínico... 0,49

Id. Id. nicotamida ... ... 0,55

La presencia del conjunto metálico sobre el sistema modelo-pro-teína ejerce una nueva disminución de la actividad sobre el subs-trato de glicerofosfato. Únicamente en el caso de la aminoacetofeno-na la presencia de los metales logra una pequeña elevación del por-centaje en fósforo Hidrolisado.

C O N C L U S I O N E S

1.a El análisis espectral de las cenizas de fosfatasa ósea, prepa-rada según Lora y Rodríguez Blanco, da Ca como elemento más

— 221 —

abundante, y después de él, en orden decreciente, Zn, Mg, Ni, Fe, ytrazas de Na, Si, Sr y B.

2.a En las cenizas de fosfatasa renal/ obtenidas, según la técni-ca v-de Albers, se identifica mediante análisis espectral la existenciade Mg, Zn, Ni, Ca y Fe, junto con débiles líneas de Na y K.

3." El Mg, Zn, Ni, y también el Al, activan especialmente albenzoil-carbinol y la w-aminoacetofenona, obteniéndose los porcen-tajes más elevados a 40° y ocho horas de duración del ensayo.

4.a Durante las experiencias se han caracterizado y preparadolas sales de Zn, Ni y Co del ácido o-aminobenzoico, así como la2,5-difenilpiracina, tomo producto de descomposición de la w-amino-.aceto f enona.

5.a La adición de globulinas, obtenidas a partir de suero de san-gre, a los modelos de fosfatasa no ofrece ningún efecto sensible, niaun en el caso de empleo simultáneo de iones metálicos.

6.a Con «proteína» de fosfatasa, obtenida por electrodiálisis clor-hídrica de la enzima, se realizan experiencias,análogas de copulacióncon .modelos, tanto aislados como en presencia de metales,'sin queen ningún caso se obtengan activaciones ; pero ninguna interpreta-ción definitiva puede darse a ésta, porque posiblemente lá proteínase desnaturaliza en su obtención.

Agradezco a la Real Academia de Ciencias la Beca de la Fun-dación ,«Conde de Cartagena» que le fue concedida para estas inves-tigaciones y al Prof. Lora Tamayo su dirección y consejos.

Madrid, octubre 1950.

Instituto «Alonso Barba» del C. S. <ãe I. C. y Facultad•ae Ciencias de Madrid.

Departamento de Química Orgánica.