Ievads proteīnu kristalogrāfijā(proteīnu rentgenstruktūranalīzē)

Kristalogrāfija vai rentgenstruktūranalīze - metode vielas molekulu trīsdimensionālās struktūras noteikšanai, izmantojot rentgenstaru difrakciju vielas kristālos

Kāpēc nepieciešams noteikt proteīnu struktūras?

• Vizuāls attēls – kā proteīns izskatās

• Priekšstats par to, kā proteīns veic savas funkcijas

• Nobela prēmijas...

Nobela prēmijas proteīnu kristalogrāfijā

• M. F. Perutz, Sir J. C. Kendrew (Chemistry, 1962) for structure of globines• Sir A. Klug (Chemistry, 1982) for his development of crystallographic electron

microscopy and his structural elucidation of biologically important nuclei acid-protein complexes

• J. Deisenhofer, R. Huber, H. Michel (Chemistry, 1988) for the determination of the three-dimensional structure of a photosynthetic reaction centre

• P. D. Boyer, J. E. Walker, J. C. Skou (Chemistry, 1997) for their elucidation of the enzymatic mechanism underlying the synthesis of adenosine triphosphate (ATP) and for the first discovery of an ion-transporting enzyme, Na+, K+ -ATPase

• R. D. Kornberg (Chemistry, 2006) for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription

• V. Ramakrishnan, T. A. Steitz, Ada E. Yonath (Chemistry, 2009) for studies of the structure and function of the ribosome

• Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka (Chemistry, 2012) for studies of G-protein-coupled receptors"

Pielietojuma piemērs: Uz struktūras bāzēts zāļu dizains HIV proteāzei

Active site

Kādas manipulācijas jāveic, lai noteiktu proteīnu struktūru

• 1. – proteīna gēna klonēšana (parasti baktērijās)• 2. – proteīna producēšana• 3. – proteīna attīrīšana• 4. – proteīna kristalizēšana• 5. – datu vākšana no kristāliem• 6. – struktūras noteikšana• 7. – struktūras validēšana un deponēšana PDB

datu bankā• 8. – struktūras publicēšana

Kas ir kristāls ?

• Trīsdimensionāls identisku vienības šūnu režģis, kuras ir izvietotas vienā noteiktā orientācijā

• Katra vienības šūna var saturēt vienu vai vairākas molekulas

Kristāls

Šajā gadījumā katrā vienības šūnā ir viena molekula un visas vienības šūnas ir taisnstūru paralēlskaldņi

MolekulaVienības šūna

Kristāls

Molekula

Vienības šūna

Divas molekulas vienības šūnā, kuras malu leņķi nav 90o

Kristāls

Kā iegūt kristālu?

• Vienkārši no neorganiskajām un mazām organiskajām molekulām

• Grūti no proteīniem• Kāpēc?

-nav termostabili

-var izmantot tikai uz ūdeni bāzētus šķīdumus

-lielas un fleksiblas molekulas

-parasti pieejami ļoti nelielos daudzumos

Kā iegūt proteīnu kristālu ?• Princips: lēni paaugstināt precipitantu koncentrāciju šķīdumā• Precipitanti: dažādi sāļi, polietilēnglikoli (PEG), alkoholi• pH buferējošās vielas uztur noteiktu pH – piemēram, acetāta vai tris

buferšķīdumi• Aditīvi: vielas, kas nav precipitanti, bet mijiedarbojas ar proteīnu un

palīdz tos sakristalizēt (piemēram metālu joni)• Variējamie parametri:-precipitantu un aditīvu sastāvs-precipitantu un aditīvu koncentrācija-proteīna koncentrācija (parasti ap 1%)-pH-temperatūra (parasti RT, dažreiz +4, +15 vai +37)Parasti nav iespējams teorētiski noteikt, kādi precipitanti un kādās

koncentrācijās varētu būt nepieciešami, lai veidotos kristāli Parasti nepieciešams testēt vairākus simtus dažādu apstākļu

Fāzes diagramma

[proteīns]

[precipitants]

tīrs šķīdums

nogulsnes

kristāli?

Sēdošā piliena iztvaikošanas tehnika

Precipitants

Precipitants + proteīns (1:1)

Iztvaikošana

Iztvaikošanas rezultātā lēnām samazinās piliena tilpums un paaugstinās precipitanta un proteīna koncentrācija

Kristalizācijas robots

• Var viegli pārbaudīt simtiem apstākļu

• Var operēt ar ļoti maziem tilpumiem –līdz 0.1 l

Piekārtā piliena iztvaikošanas tehnika

Precipitants

Precipitants + proteīns (1:1)

Princips līdzīgs, kā sēdošajam pilienam, tikai piliens ir «piekārts» pie trauciņa vāka

Iztvaikošana

Olu baltuma lizocīma kristalizēšana ar piekārtā piliena tehnoloģiju

• Lizocīms ir ļoti viegli kristalizējams proteīns• Kristālus var iegūt dažu minūšu laikā• Mēs izmantosim piekārtā piliena tehnoloģijas atvieglotu

variantu – bez precipitanta trauciņa apakšā• Lizocīmu sajauksim ar precipitantu un pilienam ļausim

lekcijas turpinājumā lēnām iztvaikot• Pēc lekcijas beigām aplūkosim kristālus mikroskopā un

pārbaudīsim to difrakcijas kvalitāti

Mini lab. darba protokols• Uz Petri plates vāciņa iekšpuses sajaucam pilienu no 3 l

lizocīma šķiduma (40 mg/ml) un 3l precipitanta (30% w/v metilpolietilēnglikols 5,000, 1.0 M NaCl, 50 mM Na acetāts pH 4.5, 5% glicerīns)

• Plates vāciņu uzmanīgi uzliek uz plates

• Pēc lekcijas beigām pilienus aplūko mikroskopā

• Vienu no iegūtajiem kristāliem ar cilpas palīdzību izņem no šķīduma un ievieto krioplūsmā rentgenstaru difrakcijas aparātā

• Darba vadītājs demonstrē difrakcijas attēlu iegūšanu no kristāla

Kāpēc nepieciešami tieši rentgensari?

• Viļņa garumam ir aptuveni tāds pats izmērs, kā attālums starp atomiem molekulās

Kā iegūt rentgenstarus?

X-rays

Copper anode

Rotējošais anods Sinhrotrons

Elektronu kūlis no katoda atsitas pret metāla (parasti Cu) anodu un producē rentgenstarus

Daļiņu paātrinātājs

Lielā ātrumā mainot kustības virzienu, elementārdaļiņas (elektroni vai pozitroni) emitē rentgenstarus

Rotējošais anods Sinhrotrons

• Labi:

-Relatīvi lēti (1/2 milj. $)

-Relatīvi mazi• Slikti:

-Radiācija ir vāja

-Viļņa garums ir fiksēts

• Labi:

-Radiācija ir spēcīga

-Viļņa garums ir maināms

• Slikti:

-Ļoti dārgi (miljardi $)

-Ļoti lieli

ESRF sinhrotrons Grenoblē, Francijā

• Visspēcīgākais rentgenstaru avots Eiropā

• Akadēmiskiem pētījumiem bezmaksas

Elektromagnētiskie viļņi

• E- elektromagnētiskā lauka stiprums• A- amplitūda• - leņķiskais ātrums• - frekvence• – viļņa garums

A

E

z

A

E

Z

z

E = A cos t

= 2 E = A cos (+t)

• - fāze

Vilnis kā vektors

F=Acos+iAsinvai

F=exp(i)

A

Reālā ass

Imag

inār

ā as

s

A- viļņa amplitūda

- viļņa fāze

Viļņu interference

+

+

=

= .

Kas notiek ar elektronu, kad pa to trāpa rentgenstari?

• Elektrons sāk vibrēt ar tādu pašu frekvenci, ka krītošie rentgenstari• Rezultātā, elektrons izstaro sekundāros rentgenstarus visos virzienos

Primārais stars

Sekundārie stari

Izkliede no molekulas• Molekula sastāv no vairākiem atomiem• Atomu sastāvā ir elektroni• Ja molekulu apstaro ar rentgenstariem, katrs elektrons izstaro (izkliedē) sekundāros rentgenstarus• Izstarotie rentgenstari mijiedarbojas viens ar otru un veido interferenci• Kopējā rentgenstaru izkliede no molekulas ir atkarīga no elektronu skaita un to savstarpējā novietojuma• Citiem vārdiem sakot, izkliede ir atkarīga no molekulas struktūras• Ja mēs zinātu izkliedēto staru amplitūdas un fāzes, vai varētu aprēķināt molekulas struktūru?

Primārais stars

Furjē transformācija

• F(k)= f(x)e-2ikx dx

• Elektronu blīvuma sadalījums molekulā un molekulas veidotais rentgenstaru izkliedes attēls ir savstarpējas Furjē transformācijas• Tātad – ja varētu izmērīt vienas molekulas izkliedēto rentgenstaru amplitūdas un fāzes, struktūras aprēķins būtu trivāls• Bet ir divas problēmas...

Praksē...

• Izkliede no vienas molekulas ir pārāk vāja, lai to varētu detektēt

• Izkliede no daudzām molekulām atšķirīgās orientācijās (piem. šķīdumā) novedīs pie izkliedēto staru savstarpējas dzēšanās

• Ja molekulas ir orientētas visas vienā virzienā (kā kristālā), rentgenstaru izkliede pastiprināsies noteiktos virzienos

Brega likums

http://www.eserc.stonybrook.edu/ProjectJava/Bragg/

Izkliedētie stari ir vienā fāzē, tie summējas

Izkliedētie stari ir pretējās fāzēs, tie savstarpēji dzēšas

n = 2d sin

Tipisks difrakcijas attēls no proteīna kristāla

Uz viena attēla ir tikai neliela daļa no visiem teorētiski iespējamajiem difrakcijas punktiem

Kristālu pagriež pa 0.2-2 grādiem un iegūst nākošo attēlu un tā tālāk

Atkarībā no vienības šūnas izmēra un izšķirtspējas ir jāsavāc 100 -1000 attēlu ar 104-106 difrakcijas punktiem

Izšķirtspēja• Mazākais attālums, ko

var izšķirt elektronu blīvuma kartē

• Atbilst mazākajam attālumam starp atstarojošām plaknēm, kurām var saskatīt difrakcijas punktus

• Augstas izšķirtspējas difrakcijas punkti ir tālāk no attēla centra

• Izšķirtspēja ir atkarīga no tā, cik perfekti ir izkārtotas vienības šūnas

10Å

5Å

3Å

2Å

Augstas izšķirtspējas kristāls

Zemas izšķirtspējas kristāls

• No kā atkarīga kristāla kvalitāte?

-No molekulu kontaktiem kristālā – no to skaita (vairāk=labāk) un rakstura

-No molekulu fleksibilitātes (jo fleksiblāka, jo sliktāk)

Vai kristālu ārējam izskatam ir korelācija ar izšķirtspēju?

• Īpašas korelācijas nav

• Vienīgais veids kā pārbaudīt kristālu kvalitāti ir ievietot tos rentgenstaros

Kamolzāles raibuma vīrusa kristāli, izšķirtspēja 3.7Å

Tā paša vīrusa kristāli (audzēti citos apstākļos). Izšķirtspēja 2.6Å

Fāzes problēma

• Ar detektoru var izmērīt tikai difrakcijas punktu intensitāti

• Informācija par fāzēm netiek fiksēta – nav tādas ierīces, kā “fāzesmetrs”

• Tas nozīmē, ka informācija par fāzēm ir jāiegūst netieši• Mazām molekulām (<100 atomu) eksistē tiešās metodes.

Tas nozīmē, ka fāzes var izskaitļot no amplitūdām bez jebkādas papildus informācijas.

• Proteīni ir daudzkārt par lielu lai izmantotu tiešās metodes, tāpēc ir izstrādātas citas metodes

Difrakcija

Struktūras aprēķins tikai no punktu intensitātēm

Mazās molekulas (<100 atomu)

Difrakcija

Struktūras aprēķins tikai no punktu intensitātēm

Proteīni (>>100 atomu)

NaCl NaCl

NaCl NaCl

Izomorfā aizvietošana

• Ieviešot proteīnu kristālos smagos atomus, difrakcijas punktu intensitāte izmainās

• No izmaiņām var noteikt smago atomu atrašanās vietas un no tām - fāzes

• Jāizmanto vismaz divi dažādi smagie elementi

Pb2+

A BA-B

Smago metālu struktūras aprēķins kā mazajām molekulām

Fāzes aprēķins

Izomorfās aizvietošnas problēmas:

• 1) Vienības šūnas izmēri var izmainīties. Tas izmainīs difrakcijas režģi un metodi vairs nevar izmantot

• 2) Proteīna struktūra vai tā orientācija vienības šūnā var izmainīties

• 3) Kristālu var sabojāt, to mērcējot smago elementu šķīdumā

• 4) Smagie atomi var nepiesaistīties noteiktās vietās• -Problēmas daļēji iespējams risināt, proteīna sastāvā

ieviešot selenometionīnu (Selēns ir smags elements)

Molekulārā aizvietošana

• Šobrīd visizplatītākā metode• Var pielietot tikai tad, ja ir zināma līdzīga proteīna struktūra

(vismaz 25% sekvences identitāte)• Zināmās struktūras fāzes tiek kombinētas ar nezināmās

struktūras amplitūdām• Kombinēšana ir iespējama tikai tad, ja abu struktūru kristālu

vienības šūnu parametri ir identiski un molekulas tajā ir identiskās orientācijās

Novērotās amplitūdas Nezināmā struktūra

Zināma struktūra Izskaitļotās amplitūdas un fāzes

Fāzes nav zināmas!

Furjē kaķis Kaķis

Bezastes kaķis Furjē bezastes kaķis

FFT

FFT

Novērotās amplitūdas, izskaitļotās fāzes

Aste ir redzama!

FFT

Pīles amplitūdas + kaķa fāzes

Pīle Furjē pīle

Kaķis !!!???

Ja struktūras nav pietiekoši līdzīgas...

Kā praksē kombinēt fāzes un amplitūdas

• Fāzes un amplitūdas ir iespējams kombinēt tikai no kristāliem ar identiskiem vienības šūnu izmēriem

• Ja kristālu simetrija vai vienības šūnas izmēri atšķiras, iegūst dažādus difrakcijas režģus

• Praksē zināmās un nezināmās struktūras proteīnu kristāliem reti kad ir vienādi vienības šūnu parametri

• Tādēļ nepieciešams zināmo struktūru ievietot teorētiskā kristālā, lai sakristu vienības šūnu parametri un molekulu orientācija

• Kā noteikt molekulu orientāciju nezināmajā struktūrā???

Teorētiskā difrakcijas režģa aprēķins zināmai molekulai virtuālā kristālā

Furjē

transformācija

Furjē

transformācija

Rotācijas un translācijas funkcijas

• Uzdevumu matemātiski iespējams sadalīt divās daļās – rotācijas meklējumā un translācijas meklējumā (funkcijās)

• Zināmo molekulu daudzās dažādās orientācijās ievieto virtuālajā kristālā, kura vienības šūnu izmērs ir tāds pats kā nezināmās struktūras eksperimentāli iegūtajam kristālam

• Katrai orientācijai izskaitļo Furjē transformāciju un iegūst teorētiskās intensitātes

• Pareizajā orientācijā ir visaugstākā eksperimentālo un teorētisko intensitāšu korelācija

rotācija translācija

Zināma struktūra A Nezināma struktūra B

Furjē transformācija

Difrakcijas punktu

intensitātes ir ļoti atšķirīgas

A un B orientācijas ir atšķirīgas

Zināma struktūra A Nezināma struktūra B

Furjē transformācija

Difrakcijas punktu

intensitātes ir līdzīgas

A un B orientācijas ir līdzīgas

Modeļa veidošana

• Proteīnu sekvences savietošana ar novēroto elektronu blīvumu

• Vienkārša molekulārajā aizvietošanā• Sarežģītāka, ja nav līdzīgas zināmas struktūras• Viennozīmīga pie pietiekoši augstas izšķirtspējas

(labākas par 3.0 Å)• Var tikt automatizēta, ja izšķirtspēja ir 2.5Å vai

labāka

2.0 Å

Rifainments (Refinement)

• Automatizēta modeļa uzlabošana, lai labāk izskaidrotu eksperimentālās amplitūdas

• Arī fāzes tiek uzlabotas, tādejādi uzlabojas elektronu blīvuma kartes kvalitāte

Validēšana

• Finālā (?) modeļa kvalitātes pārbaude• Kā izskatās aminoskābju ģeometrija?

(Ramačandrāna plots, u.c.)• Vai nekovalenti saistītie atomi ir pietiekoši tālu

viens no otra? • Vai aminoskābes iederas apkārtējā vidē?

(Hidrofobās proteīna iekšienē, polārās uz virsmas)• Vai ūdeņraža saišu donori/akceptori ir

kompensēti?

Deponēšana• Struktūras deponēšana PDB datu bankā ir

priekšnosacījums publicēšanai žurnālos

• Vajadzētu deponēt arī eksperimentālos datus, lai būtu iespējams ģenerēt elektronu blīvuma karti un pārleicināties, ka modelis tai atbilst

Neuzmanības rezultātā...

• Zinātnieks no Scripps institūta publicēja divas pilnīgi nepareizas struktūras

• Struktūras izraisīja milzīgu interesi, jo bija ļoti atšķirīgas no gaidītā

• 3 raksti Science, viens JMB un viens PNAS• Pēc kļūdas noskaidrošanas, visi raksti tika

atsaukti• Viss finansējums un prezidenta dotās medaļas

atņemtas...• Veicot vienkāršu validēšanu, no tā visa varētu

izvairīties