Capitulo 5 + 6 Capitulo 8

www.whfreeman.com/lodish http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=mboc4

Dra. van Zundert

Métodos en Biol. Celular: - Separación de células en cultivo;

- Fraccionamiento celular;

- Aislamiento y caracterización de macromoléculas celulares.

“In vivo” (“en el organismo viviente”): Experimentos que se llevan a cabo en organismos

completos.

Tipos Experimentos

Figure 8-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

“In vitro” (“en vidrio”): Experimentos que se realizan sobre cultivos celulares,

Células primarias

Líneas célulares

Hibridomas

Células madres

¿Como estudiar un tipo célula?

- Neuronas

- Glia

- Fibroblastos

excitatorio

inhibitorio

glutamato

dopamina

acetilcolina

Neurotransmisión:

Disección

1. Mecánico

1. Las células deben ser “extraídas”

Manual

Láser

microdisección de captura por láser

Disección

1. Mecánico

2. Enzimático

- Tripsina

- Colagenasa

Enzimas

proteolícas

Degradan de matriz extracelular

Figure 8-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

1. Las células deben ser “extraídas” y separados

Se pueden utilizar varios métodos para separar los diferentes tipos celulares de la

suspensión celular, según sus propiedades:

1. La diferencia de tamaño de las células permite separarlas por centrifugación.

2. La capacidad que tienen algunos tipos celulares de adherirse al vidrio o al

plástico, permite separarlos de otras células que se adhieren débilmente.

3. Algunos anticuerpos se unen específicamente a sustancias presentes en

determinadas células. Luego, se emplea diferentes matrices (como colágeno, bolitas

de polisacáridos, plástico) a la cuales sólo las células reconocidas por los anticuerpos

podrán adherirse.

4. Se emplean anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para marcar

células específicas adheridas a ellos. Las células marcadas por interacción con el

anticuerpo pueden ser separadas de las no marcadas en un separador de células

activado por fluorescencia o cell sorter ( ver figura).

2. Separación de los distintos tipos de células

Figure 8-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Equipo para la separación de células activado por fluorescencia. Las células individuales viajan a través de un conducto muy delgado y son iluminadas por un láser. El equipo puede detectar qué células emiten fluorescencia (por el anticuerpo adherido). Cada célula es incorporada en una gota que es “cargada” eléctricamente como negativa o positiva en función de la presencia o ausencia del colorante fluorescente. Luego, las gotas son separadas por un campo eléctrico hacia los recipientes colectores según su carga

Citofluorímetros de flujo: “Sorter” de Células

no-fluorescente

“In vivo” (“en el organismo viviente”): Experimentos que se llevan a cabo en organismos

completos.

“In vitro” (“en vidrio”): Experimentos que se realizan sobre cultivos celulares,

Tipos Experimentos

Células primarias

Líneas célulares

Hibridomas

Células madres

Table 8-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Líneas célulares

HEK

Las células HeLa constituyen una línea de células epiteliares humanas procedentes de un carcinoma

cervical, y las primeras células humanas de las cuales se estableció una línea celular permanente. En

1951 se practicó una operación quirúrgica a la paciente Henrietta Lacks (de ahí el nombre), una mujer

afroamericana de 31 años, en la cual se extrajeron células de un carcinoma en el útero con la intención

de evaluar su malignidad. La paciente falleció 8 meses después a causa de su tumor.

Las células extraídas estaban invadidas por el virus del papiloma humano 18 (HPV18),

transformándose en células tumorales.

Líneas célulares: HeLA

Hoescht

- Replicación indefinidamente: immortal

- Hasta hoy >60.000 publicaciones con HeLa

-10-20% otras líneas célulares estan contaminados con HeLA

“In vivo” (“en el organismo viviente”): Experimentos que se llevan a cabo en organismos

completos.

“In vitro” (“en vidrio”): Experimentos que se realizan sobre cultivos celulares,

Tipos Experimentos

Células primarias

Líneas célulares

Hibridomas

Células madres

Figure 8-8 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Hibridomas

Preparación de hibridomas que

secretan anticuerpos monoclonales

contra un antígeno en particular. Aquí el

antígeno de interés es designado como

“antígeno X”. El medio de crecimiento

selectivo utilizado luego del paso de fusión

celular, contiene un inhibidor

(aminopterina) que bloquea las rutas

biosintéticas normales por las cuales se

sintetizan los nucleótidos. Como

consecuencia, las células deben utilizar

una vía alternativa para fabricar sus

ácidos nucleicos. Esta vía es defectiva en

la línea celular mutante derivada del tumor

de linfocitos B, pero está intacta en las

células obtenidas del ratón inmunizado.

Debido a que ninguna de las células

utilizadas para la fusión inicial puede

crecer por sí sola, solo las células híbridas

sobreviven.

“In vivo” (“en el organismo viviente”): Experimentos que se llevan a cabo en organismos

completos.

“In vitro” (“en vidrio”): Experimentos que se realizan sobre cultivos celulares,

Tipos Experimentos

Células primarios

Líneas célulares

Hibridomas

Células madres

Tipos de células madre

Existen cuatro tipos de células madre:

Las células madre totipotentes pueden crecer y formar un organismo completo, tanto los

componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y

los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (como la placenta). Es

decir, pueden formar todo los tipos celulares. (cigota; esporas)

Las células madre pluripotentes no pueden formar un organismo completo, pero sí cualquier

otro tipo de célula correspondiente a los tres linajes embrionarios (endodermo, ectodermo y

mesodermo), así como el germinal y el saco vitelino. Pueden, por tanto, formar linajes

celulares.

Las células madre multipotentes son aquellas que sólo pueden generar células de su misma

capa o linaje embrionario de origen (por ejemplo: una célula madre mesenquimal de médula

ósea, al tener naturaleza mesodérmica, dará origen a células de esa capa como miocitos,

adipocitos u osteocitos, entre otras).

Las células madre unipotentes pueden formar únicamente un tipo de célula particular.

Tipos de células madre

Existen cuatro tipos de células madre:

Las células madre totipotentes pueden crecer y formar un organismo completo, tanto los

componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y

los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (como la placenta). Es

decir, pueden formar todo los tipos celulares (cigota; esporas) .

Las células madre pluripotentes no pueden formar un organismo completo, pero sí cualquier

otro tipo de célula correspondiente a los tres linajes embrionarios (endodermo, ectodermo y

mesodermo), así como el germinal y el saco vitelino. Pueden, por tanto, formar linajes

celulares. (células embrionarias)

Las células madre multipotentes son aquellas que sólo pueden generar células de su misma

capa o linaje embrionario de origen (por ejemplo: una célula madre mesenquimal de médula

ósea, al tener naturaleza mesodérmica, dará origen a células de esa capa como miocitos,

adipocitos u osteocitos, entre otras).

Las células madre unipotentes pueden formar únicamente un tipo de célula particular.

Tipos de células madre

Existen cuatro tipos de células madre:

Las células madre totipotentes pueden crecer y formar un organismo completo, tanto los

componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y

los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (como la placenta). Es

decir, pueden formar todo los tipos celulares (cigota; esporas) .

Las células madre pluripotentes no pueden formar un organismo completo, pero sí cualquier

otro tipo de célula correspondiente a los tres linajes embrionarios (endodermo, ectodermo y

mesodermo), así como el germinal y el saco vitelino. Pueden, por tanto, formar linajes

celulares. (células embrionarias)

Las células madre multipotentes son aquellas que sólo pueden generar células de su misma

capa o linaje embrionario de origen (por ejemplo: una célula madre mesenquimal de médula

ósea, al tener naturaleza mesodérmica, dará origen a células de esa capa como miocitos,

adipocitos u osteocitos, entre otras).

Las células madre unipotentes pueden formar únicamente un tipo de célula particular.

Fuentes de células madre

Básicamente, en biología se trabaja sobre dos tipos de células madre:

Célula madre embrionaria (pluripotentes): En la actualidad se utilizan como modelo para

estudiar el desarrollo embrionario y para entender cuáles son los mecanismos y las señales

que permiten a una célula pluripotente llegar a formar cualquier célula plenamente

diferenciada del organismo.

Célula madre adulta (multipotentes): En un individuo adulto se conocen hasta ahora

alrededor de 20 tipos distintos de células madre, que son las encargadas de regenerar tejidos

en continuo desgaste (como la piel o la sangre) o dañados (como el hígado). Su capacidad es

más limitada para generar células especializadas. Las células madre hematopoyéticas de

médula ósea (encargadas de la formación de la sangre) son las más conocidas y empleadas

en la clínica desde hace tiempo. En la misma médula, aunque también en sangre del cordón

umbilical, en sangre periférica y en la grasa corporal se ha encontrado otro tipo de célula

madre, denominada mesenquimal que puede diferenciarse en numerosos tipos de células de

los tres derivados embrionarios (musculares, vasculares, nerviosas, hematopoyéticas, óseas,

etc). Aunque aún no se ha podido determinar su relevancia fisiológica se están realizando

abundantes ensayos clínicos para sustituir tejidos dañados (corazón) por derivados de estas

células.

area tegmental ventral

Substancia

nigra

Corteza

frontal

Ganglio

basal

!

Enfermedad de Parkinson

Transplante de paciente humano con tejido neuronal de embriones humanos

(se requiere 10-15 embriones humanos de 5-8 semanas de edad!!)

area tegmental ventral

Substancia

nigra

Corteza

frontal

Ganglio

basal

12-14 weeks abortion 22

23

Figure 8-5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Célula madre embrionaria

Tipos de células madre

Existen cuatro tipos de células madre:

Las células madre totipotentes pueden crecer y formar un organismo completo, tanto los

componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y

los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (como la placenta). Es

decir, pueden formar todo los tipos celulares. (cigota; esporas)

Las células madre pluripotentes no pueden formar un organismo completo, pero sí cualquier

otro tipo de célula correspondiente a los tres linajes embrionarios (endodermo, ectodermo y

mesodermo), así como el germinal y el saco vitelino. Pueden, por tanto, formar linajes

celulares. (células embrionarias)

Las células madre multipotentes son aquellas que sólo pueden generar células de su misma

capa o linaje embrionario de origen (por ejemplo: una célula madre mesenquimal de médula

ósea, al tener naturaleza mesodérmica, dará origen a células de esa capa como miocitos,

adipocitos u osteocitos, entre otras).

Las células madre unipotentes pueden formar únicamente un tipo de célula particular.

Dr. Yamanaka: inducible pluripotent stem cells (oct4, sox2, c-myc and klf4)

Los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y

la presencia de otros componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a

los medios derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino.

Composición de medios de cultivo para células eucariotas animales

5% CO2 -95% O2

95% Humedad

37°C

Incubadora con condiciones controladas:

Célula eucariote

Cultivar células

Ventajas de los cultivos celulares

- Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden controlar todos

los factores dle medio: Físico-químicos (pH, temperatura, presión osmótica, niveles de O2, CO2,

tensión superficial...), y fisiológicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular,...)

- Caracterización y homogeneidad de la muestra. Las células en cultivo de una línea celular, o de

una línea continua son homogéneas, con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener

con facilidad un número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave problema de

heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de experimentación.

- Economía. Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en

volúmenes reducidos, y con un acceso directo de las células a la droga las concentraciones

requeridas son mucho más bajas que en el animal completo.

- Motivaciones éticas. La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles

de animales de experimentación. El cultivo celular no puede reemplazar siempre el ensayo "in vivo"

pero es una alternativa válida en muchas situaciones.

Desventajas de los cultivos celulares

- No reproduce la situación en vivo (3-D) con múltiples interacciones entre distintos tipos de células

- Técnica sensible. El crecimiento de las células animales es mucho más lento que el de los

contaminantes más habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas...) y además dado que

proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una compleja mezcla de

nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto supone la necesidad de mantener las

condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido

como del personal cualificado para su manipulación.

- Cantidad y costo. El costo de producción de 1 gramo de tejido en cultivo es más de 10 veces superior

al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitación de producción, que es del orden de 10 g de

células en un laboratorio normal, y que para ser superior a 100 g requiere instalaciones de tipo industrial.

- Inestabilidad. Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la

dotación cromosómica aneuploide. La población celular puede variar su composición si alguna de las

subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente superior, es decir podemos

encontrar diferencias significativas en la línea celular de una generación a la siguiente. La única manera

de evitarlo es emplear líneas estables que se resiembran a partir de un stock congelado cada determinado

tiempo, o después de un determinado número de generaciones.

Fraccionamiento celular

Centrífuga

Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que

producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densida mayor que

la del medio que las rodea. En general se diferencian en función de los márgenes de

aceleración a que someten a las muestras en : centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 xg),

super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 xg a 20000 xg) y

ultracentrífugas (de 15000 xg a 600000xg). En las centrífugas se suele controlar la

temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción.

En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea neceario

hacer un intenso vacio en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y

muestra.

Figure 8-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Figure 8-10 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la

suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones

suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más

densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en

condiciones de mas tiempo y más fuerza de aceleración sedimentan de nuevo las partículas

más densas presentes,.. y así sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de

severidad en la centrifugación y obtener una colección de sedimentos que corresponden

sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad

Alternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para

sedimentar las partículas para realizar una centrifugación en un medio en el que exista un

gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Después de un

tiempo las diferentes poblaciones de partículas se sitúan en diferentes profundidades del tubo.

Haciendo un pequeño orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que

contengan a las distintas poblaciones separadas

¿Como comprobar pureza de a fracciones?

Aislamiento y caracterización de macromoléculas celulares

Escala de las células y átomos

Figure 9-1 and 9-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Cristalografía de rayos X

las proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamañó o su

capacidad de unirse a grupos químicos particulares..

Figure 8-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de proteínas. Consiste en

la aplicación de una muestra compleja de proteínas a una columna de cristal en la que se ha

situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. A continuación se bombea una

gran cantidad de solvente a través de la columna. Las diferentes proteínas se van retrasando de

manera distinta según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas

a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Según la matriz escogida, las proteínas se

pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamañó o su capacidad de

unirse a grupos químicos particulares..

Cromatografía en columna

Tipos de matrices

1.

Figure 8-13 and 8-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

2.

Tipos de matrices

Figure 8-13 and 8-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

3.

Tipos de matrices

Figure 8-13 and 8-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

¿Como comprobar pureza de a fracciones?

Figure 8-13 and 18b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida

dete

rgente

anió

nic

o d

odecil-

sulfato

de N

a

Los enlaces S-S de las proteínas se reducen,

y las proteínas se desnaturalizan totalmente

Figure 8-14d and 18 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida

fraccionamento

actina?

Una proteína específica puede ser identificada y visualizada en un 'Western blot' empleando

técnicas de inmunodetección. Estas técnicas emplean la capacidad de reconocimiento de los

anticuerpos a sus antígenos. En 'Western blot' se emplea comunmente el sistema de

inmunodetección indirecta que se representa en la figura. En este método se emplea un

anticuerpo primario para localizar la proteína de interés. Un segundo anticuerpo, marcado

con un enzima, y contra la especie en la que se ha producido el primero, se emplea para

localizar donde se formaron los complejos antígeno-anticuerpo. Este anticuerpo secundario

se puede marcar de formas muy diversas con el fin de producir una señal detectable (por

ejemplo una señal sobre una película radiográfica o una mancha de color en el filtro).