Ref.: S2009/AGR-1464

III REUNIÓN CIENTÍFICA

ANALISYC-II

Instituto de Química Orgánica General, (CSIC). Madrid, 12 de Junio de 2012

GRUPO UNED-QA

Separación cromatográfica de los colorantes azoicos (Sudán I-IV y Para Red)

Desarrollo de un sistema de extracción basado en la metodología MSPD para la extracción de Sudán I-IV y Para Red en salsas de tomate, ketchup, curry, etc..

2.

3.

Nuevas síntesis, caracterización y evaluación analítica de MIPs selectivos para la determinación de colorantes

4.

1.

Síntesis de los polímeros de impronta molecular para los estrógenos objeto de estudio

GRUPO UNED-QA

Separación cromatográfica de los colorantes azoicos (Sudán I-IV y Para Red)

Desarrollo de un sistema de extracción basado en la metodología MSPD para la extracción de Sudán I-IV y Para Red en salsas de tomate, ketchup, curry, etc..

2.

3.

Nuevas síntesis, caracterización y evaluación analítica de MIPs selectivos para la determinación de colorantes

4.

1.

Síntesis de los polímeros de impronta molecular para los estrógenos objeto de estudio

GRUPO UNED-QA

Nuevas metodologías selectivas de tratamiento de muestra en continuo aplicadas a la determinación de alteradores endocrinos

en muestras de agua

MIP- DES MIP- E2

MIP- EE2

Analitos

ethynylestradiol (E2), beta-estradiol (EE2), diethylstilbestrol (DES), estriol (E3) y estrona (E1)

Micro-Columna MISPE- Análisis por Inyección en Flujo

MISPE-Multiple-online

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

GRUPO UNED-QA

PROCEDIMIENTO

MIP-Multiple

Disolventes

de lavado y elución

Carga

Eluato

HPLC-DAD Bomba peristáltica

Flujo: 1.7 mL min-1

Micro-Columna

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

GRUPO UNED-QA

Flujo

Microcolumnas de teflón:

Columna A (D 1.5 mm, L 10 mm)

Columna B (D 3 mm, L 4 mm)

Columna C (D 1.5 mm, L 24 mm)

Carga (agua Milli-Q)

Lavado (agua Milli-Q)

Elución (agua/etanol 50:50)

CONDICIONES FIA-MISPE CROMATOGRAFICAS

Flujo: 1 mL/min

Gradiente Fase Móvil:

A (acetonitrilo), B (agua Milli-Q)

35 % A : 65 % B 5 min.

50 % A : 50 % B 5 - 20 min.

35 % A : 65 % B 20 min.

Tª de la columna (fase reversa): 25º C

Longitud de onda: 226, 280 nm

Inyección: 20 microlitros

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

GRUPO UNED-QA

OPTIMIZACION DE VARIABLES

Microcolumnas

Columna A (D 1.5 mm, L 10 mm) Columna B (D 3 mm, L 4 mm) Columna C (D 1.5 mm, L 24 mm)

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Columna A Columna B Columna C

Re

cu

pe

rac

ion

es

(%

)

Metanol/acetonitrilo (50:50)

E2

EE2

DES

GRUPO UNED-QA

Elución MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

0

50

100

150

200

�E3 �E2 �EE2 �E1 �DES

Re

cu

pe

rac

ion

es

(%

)

Columna C

agua/acetonitrilo(80:20)

etanol

hexano

agua

0

20

40

60

80

100

120

�E3 �E2 �EE2 �E1 �DES

Re

cu

pe

rac

ion

es

(%

)

Columna A

agua/etanol(50:50)

agua/acetonitrilo(50:50)

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

GRUPO UNED-QA

0

20

40

60

80

100

120

6,2 12,5 25 50 100

Re

cu

pe

rac

ion

es

(%

)

Concentraciones (ng/mL)

E3 E2 EE2 E1 DES

0

20

40

60

80

100

120

E3 E2 EE2 E1 DESR

ec

up

era

cio

ne

s (

%)

agua/etanol (50:50)

agua/acetonitrilo (50:50)

GRUPO UNED-QA

y = 427,83x + 2,8957

y = 183,03x + 5,4957

y = 228,05x + 5,8253

y = 146,57x + 6,55

y = 626,71x + 4,2478

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 100 120

Are

as

Concentraciones (ng/mL)

E3

E2

EE2

E1

DES

Compuesto Rango lineal R2 Limite de detección RSD

E3 12.5 – 100 0,9914 9,1 0,1

E2 12.5 – 100 0,9805 9,3 0,1

EE2 6.2 – 100 0,9902 4 0,15

E1 25 – 100 0,9974 25 0,11

DES 12.5 – 100 0,989 7,8 0,06

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS CARACTERISTICAS ANALITICAS

GRUPO UNED-QA

APLICACIONES Recuperaciones (%)

E3 E2 EE2 E1 DES

AGUA DE GRIFO

25 ng/mL 118 98 105 95 89

50 ng/mL 109 106 93 96 80

AGUA DE RIO (Manzanares)

25 ng/mL 97 101 88 98 101

50 ng/mL 91 82 96 98 84

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

GRUPO UNED-QA

Desarrollo de un MIP como material sorbente para la extracción y limpieza selectiva de antibióticos macrólidos en muestras de leche de

oveja.

Control del nivel de residuos

Riesgo para salud pública

Veterinaria

Acumulación en tejido adiposo y órganos diana

Presencia de antibióticos en productos de consumo humano

Terapéutico

Antibióticos Profiláctico Engorde del

animal

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

GRUPO UNED-QA

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

Legislación

• Reglamento CEE 2377/1990:

Define los LÍMITES MÁXIMOS DE RESIDUOS (MRLs) como la concentración

máxima de medicamentos veterinarios permitida en alimentos de origen animal.

• Reglamento CE 1181/2002:

Fija los MRLs de antibióticos macrólidos en muestras de leche.

Tilosina: 50 g kg-1 Eritromicina: 40 g kg-1

Roxitromicina: 200 g kg-1 Espiramicina: - Ivermectina: -

Josamicina: -

GRUPO UNED-QA

Objetivos

- Establecer un método sencillo y selectivo de tratamiento de muestra para la determinación

simultánea de antibióticos macrólidos en leche de oveja desarrollando un proceso MISPE.

- Establecer la estrategia de síntesis más adecuada para el MIP de forma que presente un

adecuado reconocimiento y capacidad de unión específica para la eritromicina.

- Optimización de las etapas del proceso MISPE.

- Optimización del método cromatográfico aplicado a la determinación de los antibióticos.

- Determinación selectiva de antibióticos macrólidos en leche de oveja mediante este método.

Grasa: 6 - 7%

LIMPIEZA - PRECONCENTRACIÓN

MATRIZ COMPLEJA Proteínas: 5 - 6%

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

GRUPO UNED-QA

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

Resultados

1. Carga del analito en acetonitrilo

Metanol (2x2 mL) % Eritromicina recuperada

Polimerización por

calor Polimerización por

radiación UV

MIP 56 73

NIP 10 21

Metanol /Ác. acético (0.5%) (2x2 mL) Metanol /Ác. acético (0.5%)

(3x2 mL)

3. Optimización volumen de elución

2. Optimización elución

% Eritromicina recuperada

Polimerización por

calor

Polimerización por

radiación UV

MIP 99 97

% Eritromicina recuperada

Polimerización por calor

Polimerización por radiación UV

MIP 95 65

NIP 50 43

% Eritromicina retenida

Polimerización por

calor

Polimerización por

radiación UV

MIP 99 74

NIP 55 54

GRUPO UNED-QA

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

CONDICIONES ÓPTIMAS ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO

- 200 mg MIP (polimerización mediante calor) (50-200 µm)

- Etapa acondicionamiento: 3×2 mL MeOH // 3×2 mL ACN

- Etapa de carga: 1 mL 100 ppm ERY

- Etapa lavado: 2×2 mL ACN

- Etapa elución: 3×2 mL MeOH/ HAc (0.5%)

- Evaporación y redisolución de la muestra en 1 mL fase móvil.

CONDICIONES ÓPTIMAS PROCESO MISPE PARA ERITROMICINA

- Columna Hypersil ODS. Dim. (mm): 100×4.6. Particle size (µm): 5

- Temperatura: 60ºC

- Elución gradiente a 1.2 mL/min (ERY)

- Fase móvil: NaH2PO4/ ACN (70:30) pH 7

- Tiempo análisis: 9 min (ERY)

- Detección UV-DAD: ERY (210 nm)

GRUPO UNED-QA

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

Aplicación del método MISPE al análisis de eritromicina en leche de oveja

Leche de oveja 40 ºC, 3 min

Tª amb Estabilización 20 min

1mL

Eritromicina 200 ppm

Leche

Preparación de la muestra

Tampón fosfato 25 mM/ACN (3:1) pH 3.5 (4 mL)

FILTRADO

Proteínas Sobrenadante

CENTRIFUGACIÓN (10 min, 3500 rpm)

Precipitación de proteínas

E T A P A S P R E V I A S

10 min Tª amb

GRUPO UNED-QA

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

Método MISPE optimizado aplicado al análisis de eritromicina en leche de oveja

1. Etapa acondicionamiento: 3x2 mL Metanol // 3x2 mL ACN

2. Etapa de carga: 2 mL muestra de leche desproteinizada

3. Eliminación de grasa: 5x1 mL NaOH 0.5 M

4. Etapa de lavado: 2x2 mL ACN

5. Etapa de elución: 3x2 mL Metanol/Ac. Acético (0.5%)

6. Análisis eluatos mediante método cromatográfico optimizado.

GRUPO UNED-QA

3. Optimización concentración NaOH

2. % Recuperación proceso MISPE tras la eliminación de grasa en continuo

Tipo de polimerización % ERY no retenida % ERY recuperada

Calor 18 39

Radiación UV 8 45

0

20

40

60

80

0 0,5 1 1,5 2 2,5

[NaOH] / M

R %

73%

1. % Recuperación proceso MISPE tras la desproteinización

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

% ERITROMICINA RECUPERADA

NaOH 1 M Hexano

42 30

GRUPO UNED-QA

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

Características analíticas del método desarrollado

• RSD= 1.7% (n= 5, 50 ppb ERY)

• Linealidad: 25-200 ppb

• Límite de cuantificación: 24.7 g kg-1 (MRL- ERY= 40 g kg-1)

• Tiempo vida media MIP: Mínimo 200 ensayos

• Frecuencia de muestreo: 10 ensayos/hora

* Análisis posteriores: Aplicación del método MISPE desarrollado a la

determinación de antibióticos macrólidos en leche de oveja mediante HPLC de

forma directa, sin necesidad de la etapa de desproteinización.

GRUPO UNED-QA

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

CONDICIONES ÓPTIMAS PROCESO MISPE ANTIBIÓTICOS

CONDICIONES ÓPTIMAS ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO

- 200 mg MIP (polimerización mediante calor) (50-200 µm)

- Etapa acondicionamiento: 3×2 mL MeOH // 3×2 mL ACN

- Etapa de carga: 1 mL 100 ppm (ERY, ROX), 10 ppm (SPI, JOS, TYL, IVER) en ACN

- Etapa lavado: 2×2 mL ACN

- Etapa elución: 3×2 mL MeOH/ HAc (0.5%)

- Columna Hypersil ODS

- Temperatura: 60ºC

- Elución gradiente 1-1.5 mL/min

- Fase móvil: NaH2PO4:ACN (50:50) pH 7

- Tiempo análisis: 35 min (6 antibióticos macrólidos)

- Detección UV-DAD: ERY/ROX (210 nm), TYL (287 nm), SPI/JOS (231 nm), IVER (254 nm)

GRUPO UNED-QA

TYL IVER

JOS SPI

ROX ERY

Cromatogramas de una muestra de leche de oveja dopada con 100 ppm ERY y ROX; 10 ppm SPI, JOS, IVER, TYL y muestra blanco de leche (----). (A) 210 nm, (B) 231 nm, (C) 254

nm, y (D) 287 nm.

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

GRUPO UNED-QA

% Recuperación proceso MISPE antibióticos

Antibiótico % Recuperación

ERY 99

ROX 76

SPI 100

JOS 15

IVER 0

TYL 15

MANIFESTACIONES CIENTIFICAS

*Análisis actuales: Aplicación a las muestras de leche de oveja del método desarrollado para la determinación de los 6 antibióticos macrólidos.

GRUPO UNED-QA

MANIFESTACIONES CIENTÍFICAS

DESARROLLO NUEVOS MATERIALES SELECTIVOS ADSORBENTES PARA TRATAMIENTO DE MUESTRA

1. Síntesis y caracterización de polímeros de impresión molecular para la

determinación de los colorantes azóicos Sudan I y Amaranto

GRUPO UNED-QA

2. Nuevas estrategias de síntesis de polímeros no impresos para mejorar la morfología y textura de los polímeros

MANIFESTACIONES CIENTÍFICAS

EN BLOQUE

NIP ACN(L) MAA(L) EGMA((L) AIBN(mg)

1 960 36 540 12,30

PRECIPITACIÓN

SIN AGITACIÓN

CON AGITACIÓN

NIP %porógeno V ACN(mL) MAA(L) EGMA((L) AIBN(mg)

1 98% 28,2 mL

36 540 12,30 2 97% 18,6 mL

3 96% 13,8 mL

4 95% 10,9 mL

NIP ACN:Tolueno Vporógeno(mL) MAA(L) DVB-80(L) AIBN(mg)

1 3:1 26,8 mL 36 500 10,04

GRUPO UNED-QA

3. Síntesis de membranas poliméricas modificadas con agentes adsorbentes y con distintos grados de selectividad (C8, C18, sílica-gel, alúmina y MIPs) para la determinación de colorantes en alimentos

Desarrollo de nuevos dispositivos para soporte de membranas adsorbentes de microextracción

GRUPO UNED-QA

RELACIONES CON OTROS GRUPOS ANALISYC

Colaboración con el laboratorio de la Universidad Rey Juan Carlos Isabel Sierra

Trabajo de investigación: Desarrollo de un método de extracción MIP-MSPD, para la detección de 17 β-Estradiol en muestras de leche de cabra

Resultados: - Trabajo de fin de Máster de JUDITH GAÑAN Publicación: “Development of a moleculary imprinted polymer-matrix solid phase disprsion methos for selective determination of β-Estradiol as anabolic growth promoter in goat milk” Anal Bioanal Chem: DOI 10.1007/s00216-012-5794-0 Marzo-2012 - Congresos

- RAFA. Praga nov-2011 - ACOFESAL. Madrid Junio-2012

GRUPO UNED-QA

ACTIVIDADES DE DIFUSION Programas de radio

- RNE: “ La congelación de los alimentos”. Junio 2011. Pilar Fernández - RNE: “Utilización de aditivos en alimentos”. Diciembre 2011. Rosa Mª Garcinuño

Congresos

RAFA Praga Noviembre 2012 1. “Development of a moleculary imprinted polymer-matrix solid phase disprsion

methos for selective determination of β-Estradiol as anabolic growth promoter in goat milk”

2. “Characterization of Spanish honeys with protected designation o origen “miel de Granada” according to their mineral content”

- ALCOFESAL. Madrid Junio 2012 3. “Optimización de un método de extracción en fase sólida utilizando un polímero de

impresión molecular para la determinación de antibióticos macrólidos en muestras lácteas mediante HPLC”

4. “Nuevas metodologías selectivas de tratamiento de muestra en continuo aplicadas a la determinación de alteradores endocrinos en muestras de agua”

5. - “Preparation and evaluation of selective moleculary imprinted polymers for the azoic dye amaranto”

GRUPO UNED-QA

Publicaciones Científicas

1. “Rapid and interference-free determination of illegal dyes in sauces and condiments by matrix solid phase dispersion (MSPD) and liquid chromatography (HPLC-DAD)” Food Chemistry . Aceptado _ 2012 DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.04.065

2. “Matrix Solid-Phase Dispersion Method for the Determination of Macrolide Antibiotics in Sheep′s Milk” Food Chemistry: Aceptado febrero 2012. DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.02.120

1. “Characterization of Spanish honeys with protected designation o origen “Miel de

Granada” according to their mineral content” Food Chemistry. Aceptadp Marzo 2012

2. “Molecularly imprinted solid phase extraction and micellar electrokinetic chromatography with online sample preconcentration for the determination of digoxin in human fluids” Eletrophoresis. Aceptado Marzo 2012. DOI: 10.1002/elps.201100588

3. “Development of a moleculary imprinted polymer-matrix solid phase disprsion methos for selective determination of β-Estradiol as anabolic growth promoter in goat milk”. Anal. Bioanal. Chem. Aceptado Enero 2012. DOI 10.1007/s00216-012-5794-0

GRUPO UNED-QA

Formación

- 9 Trabajos de fin de master - 2 DEAs - 1 Tesis Doctoral

Cursos de verano: CP de Cáceres “Alteraciones de los alimentos”

Cursos de Master - Toxicología Analítica - Química y Análisis de los alimentos

Programa de Doctorado

GRUPO UNED-QA

Problemas encontrados para alcanzar los objetivos

- Falta de personal/becarios para llevara a cabo el trabajo de laboratorio - Contaminación de la bomba del inyector del HPLC-MS. Causa de interferencia en

la detección de algunos colorantes por ejemplo el amaranto.

Propuestas para mejorar el programa ANALISYC

- Mayor numero de colaboraciones con otros grupos - Programas de radio o TV (recursos UNED)

Internacionalización

Estancia de 2 meses de OLIVA LUCIA ATIAGA FRANCO (Quito- Ecuador) Trabajo de Fin de Master: “Síntesis de nuevos materiales selectivos para microextacción utilizando membranas poliméricas”

GRUPO UNED-QA

Gracias

Senén Durand Alejandrina Gallego Rosa Mª Garcinuño Lola Picón Juan Carlos Bravo Gema Paniagua Pilar Fernández Leonardo Enriquez Asunción Garcia Ana Mª Montero Aitor Barrilero Oliva Aitaga Judith Gañan