ANALISYC II

ANTECEDENTES

R.D. 2001/1995

Directiva 94/36/CE Colorantes alimentarios

Naturales Sintéticos

Azoicos No azoicos

Sólo están autorizados aquellos

colorantes azoicos que tienen

TODOS sus grupos

aromáticos sulfonados

La legislación europea impide

desde 2004 la comercialización

de productos que contengan Sudán I-IV

Sudán I-IV

ANTECEDENTES LOS SUDANES I-IV

Sudán III

Sudán IV

Sudán I

Sudán II

Intensos colores por

resonancias electrónicas

Grupo azo conjugado con anillos aromáticos por ambos extremos

(−N=N−)

ANTECEDENTES LOS SUDANES I-IV

400,0 420 440 460 480 500 520 550,0

0,003

0,02

0,04

0,06

0,08

0,092

nm

A

sudan IV

sudan III

sudan II

sudan I

Absorciones máximas en la región visible del espectro comprendidas entre 450-540 nm

Disolvente: acetonitrilo, concentración: 1 mg/mL

ANTECEDENTES LOS SUDANES I-IV

Sudán III

Sudán IV

Sudán I

Sudán II

Muy solubles en disolventes orgánicos apolares

Poco polares y básicos (pKa = 11-12)

Baratos (5-6 euros/kg)

Toxicología: clasificados como “carcinogénico clase 3” por la IARC

Intensos colores por

resonancias electrónicas

Grupo azo conjugado con anillos aromáticos por ambos extremos

(−N=N−)

Muy utilizados en el sector industrial

LA CRISIS ALIMENTARIA DE LOS SUDANES

Importación de especias

Europa : 2003-2006

“Crisis alimentaria de los sudanes”

Francia, 2003, alertó por vez la presencia

de Sudan I en partidas de chile en polvo

procedentes de India

2003 -…. , episodios semejantes en toda Europa

Reino Unido, Italia, Austria, Alemania, España,

Países Bajos, Hungría

- Necesidad de colorear artificialmente especias (chile y otras especias en

polvo), que aparecen a menudo con colores poco intensos

¿Origen de la aparición de los sudanes y de otros colorantes ilegales en alimentación?

-El consumidor o el productor exigen un efecto picante muy alto y un color

rojizo intenso

Adulteraciones en salsas y condimentos

SALSAS Y CONDIMENTOS: PROBLEMÁTICA ANALÍTICA

Procedimientos largos y laboriosos

Recuperaciones de analitos bajas

Interferencias

Espectrofotometría DAD

Espectrometría MS

Interferencias de

carotenoides

Matrices variadas

y complejas

HPLC-DAD: LOD

Insuficientes en

ocasiones

HPLC- DAD:

Interferencias de

carotenoides

HPLC-MS:

Interferencia de la

capsaicina

Licopeno y -caroteno en tomate

Capsantina y capsorrubina en pimiento

Fitoeno, caroteno acíclico presente en el tomate

MSPD

HPLC-DAD

Separación cromatográfica por

HPLC

Preparación de la muestra Detección

OPTIMIZACIÓN DE LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

Condiciones finales

• Columna:

Phenomenex Synergy Polar RP

• Elución isocrática a 1.0 mL/min

• Temperatura: 30ºC

• Longitud de onda DAD

- sudán I y sudán II a 484 nm

- sudán III y sudán IV a 510 nm

Separación cromatográfica de los colorantes

azoicos (Sudán I-IV y Para Red)

2.

• Fase móvil ternaria:

MetOH 65% / ACN 20% / agua 15%

ttotal= 10 minutos

- disolvente de extracción

- t. de preparación de la muestra

- Presencia de interferencias

Muestra +

Sorbente

Extractos

PROCEDIMIENTO B

PROCEDIMIENTO A

Sorbente para la purificación

Lana de vidrio

Extractos

Muestra +

Sorbente

Lana de

vidrio

Lana de

vidrio

Sorbente

para la

purificación

OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD, DISPERSIÓN DE LA MATRIZ EN FASE SÓLIDA

- Dispersión de la muestra en un soporte sólido

MSPD

- Generación de una mezcla sólida

- Completa disgregación de la muestra

Carácter cromatográfico suficiente

para la extracción selectiva

de los componentes y analitos

- Empaquetamiento en columna SPE

- Elución secuencial mediante el empleo de

disolventes de polaridad creciente o decreciente

Ventajas

OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD

Carotenoides (apolares)

ESTRATEGIA DE ELUCIÓN DE LOS ANALITOS

Carga de

la muestra Lavado

Elución

Frita

Materia

grasa

Hexano 1+3 mL

Sudan I-IV

Carotenoides

apolares

Acetonitrilo 1+3 mL

Azúcares

Sales

….

H2O

Carotenoides

polares y

apolares

Metanol 2 mL

Analitos: Sudan I-IV

OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD

C18

Sílic

e

Sílic

e a

cti

vad

a

Alú

min

a N

Alú

min

a N

act.

Flo

risil

Celite

sudán I

sudán III

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

rec

up

era

ció

n,

%

Recuperaciones en función del tipo de sorbente

sudán I

sudán II

sudán III

sudán IV

Realizada con salsa de

chile nº 1

- Sílice

- Alúmina

- Florisil

- Celite (tierra de diatomeas)

- C18

1. Optimización del sorbente

Sólo con Florisil se consiguen

recuperaciones aceptables

OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD

2. Optimización cantidad de sorbente

Recuperaciones en función de la cantidad de sorbente

50

60

70

80

90

100

0,25 0,50 0,75 1,00

Florisil, g

re

cu

pe

ra

ció

n,

%

sudan I

sudan II

sudan III

sudan IV

Recuperaciones en función del volumen de eluyente

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6

volumen de acetonitrilo, mL

re

cu

pe

ra

ció

n %

sudan I

sudan II

sudan III

sudan IV

4. Optimización del Vol. eluyente

3. Optimización del eluyente

Tetrahidrofurano, acetona, acetato de etilo,

acetonitrilo, mezcla acetonitrilo/agua, metanol

0,50 g

3 mL

acetonitrilo

OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD

Sudán I

Extracto

Sudán IV Carotenoides Patrón

Sudán II Sudán III

Extracto de una muestra de salsa de chile dopada con Sudán I-IV (0,5μg/g)

Patrón Sudán I-IV (1 ppm)

CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS

Rectas de calibrado en salsa de chile

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 0,5 1 1,5 2 2,5

dosis, mg/g

área m

ed

ia, m

Au

.s

Lineal (sudan I)

Lineal (sudan II)

Lineal (sudan IV)

Lineal (sudan III)

Analito

Intervalo

de

linealidad

mg/g

R2 LOD*,

mg/g

LOQ,

mg/g

sudán I 0-2 0.9964 0.09 0.15

sudán II 0-2 0.9957 0.07 0.17

sudán III 0-2 0.9959 0.08 0.12

sudán IV 0-2 0.9989 0.05 0.10

Analito Repetibilidad

% RSD

Reproducibilidad

% RSD

sudán I 3-5 3

sudán II 3-4 5

sudán III 1-8 4

sudán IV 2-8 3

* El LOD establecido en la

UE es de 0.5 mg/g

Calibrado

Precisión

APLICACIÓN DEL MÉTODO MSPD A DIVERSAS SALSAS Y CONDIMENTOS PICANTES

Nº

No

mb

re

Marc

a

Orig

en

Base

Ch

ile

Azú

care

s

Pim

en

tón

Sal

Alm

ido

ne

s,

esp

esan

tes

Aceite

s

Vin

ag

re

Esp

ecia

s,

hie

rbas

Ajo

, ceb

olla

Co

nserv

an

t.

su

dán

I

su

dán

II

su

dán

III

su

dán

IV

1 Chili picante

molto Heinz España

Tomate

48%

0.5

% 81 75 75 69

2 Sweet chili

sauce Vitasia Alemania Tomate

0.7%

68 86 57 93

3 Salsa

Picante

Louisiana

Chovi España Pimiento 66 67 61 48

4

Salsa Brava Orlando España Tomate 72 71 61 49

5

Curry Sauce Vitasia Alemania Tomate 68 99 70 85

6 Picante para

Botana

La

Costeña México Zanahoria 89 98 81 59

7 Salsa de Ají

picante Oriental Ecuador Pimiento - - 62 66

8

Chimichurri JR España - 89 73 52 58

9 Chiles

adobados

San

Marcos México Pimiento - - 71 69

Muestras adicionadas con Sudán I-IV (0,25μg/g)

Síntesis, caracterización y evaluación analítica de MIPs

selectivos para la determinación de colorantes

4.

MIP para Sudán I MIP para amaranto

DIFUSIÓN DE RESULTADOS

PUBLICACIONES

- “Two rapid and sensitive automated methods for the determination of nitrite and nitrate in soil samples”. C.

E. López Pasquali, A. Gallego-Picó, P. Fernández-Hernando, M. Velasco, J.S.Durand Alegría.

Microchemical Journal, 2010, 94, 79-82

-“Rapid and interference-free determination of illegal dyes in sauces and condiments by matrix solid phase

dispersion (MSPD) and liquid chromatography (HPLC-DAD)”, L. Enríquez, A. Gallego-Picó, R.M. Garcinuño,

P.Fernández-Hernando, J.S. Durand-Alegría (Enviado febrero 2011)

- “An HPLC-DAD method for the simultaneous determination of nine β-lactam antibiotics in ewe milk". M.

Cámara, A. Gallego-Picó, R.M. Garcinuño, P. Fernández-Hernando, J.S. Durand-Alegría, P.J. Sánchez .

Food Chemistry (Enviado marzo 2011)

- “Methacrylyc acid-ethyleneglycol dimethacrylate polymeric sorbent for the removal of estrogens from

water samples”, J.C. Bravo, A. Gallego-Picó, R. M. Garcinuño, P. Fernández, J.S. Durand (enviado).

DIFUSIÓN DE RESULTADOS

CONGRESOS

- “4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA 2009)” (INTERNACIONAL),

“HPLC-DAD method for simultaneous determination of nine β-lactam antibiotics in Manchega sheep milk”,

M. Cámara, A. Gallego, R.M. Garcinuño, P.Fernández-Hernando, J.S. Durand-Alegría, P.J. Sánchez, Praga,

República Checa, noviembre 2009

- “4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA 2009)” (INTERNACIONAL)

“Optimization of a matrix solid-phase dispersion method for the determination of sudans I-IV in tomato an

chilli sauce samples”, Enríquez L., R.M. Garcinuño, P.Fernández-Hernando, J.S. Durand-Alegría, Praga,

República Checa, noviembre 2009

- 28th International Symposium on Chromatography (ISC 2010)” (INTERNACIONAL) “Application of

methacrylyc acid-ethyleneglycol dimethacrylate polymeric sorbent for the removal of estrogens from water

samples”, A. Gallego, J.C. Bravo, R.M. Garcinuño, P. Fernández and J.S. Durand, Valencia, España,

septiembre 2010

COLABORACIÓN ENTRE GRUPOS

Con UAH: preparación de MIPs para antibióticos y validación por EC-MS

Con CISC-AA: preparación de MIPs para acrilamida

Con Laboratorio URJ: preparación de MIPs para nuevos estrógenos

FORMACIÓN Y MOVILIDAD

Dra. Gema Paniagua González – Universidad de Alcalá de Henares Dra. Alejandrina Gallego Picó – CSIC-IQOG Lda. Judith Gañán Aceituno (Universidad Rey Juan Carlos) – UNED María Cámara Díaz (CERSYRA)-UNED

GRACIAS POR SU ATENCIÓN