Upload
noreen
View
58
Download
2
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Immunohistokemi. Cecilia Ottosson Laboratoriemetodik, grundläggande, vt14 Biomedicinska analytikerprogrammet, inr laboratoriemedicin. Litteratur. Cellular pathology - kap 10, 13. Immunohistochemical Staining Methods (finns i pingpong) - kap 1 , 2 , 3 , 8, 9 och 17. Immunohistokemi. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Immunohistokemi
Cecilia OttossonLaboratoriemetodik, grundläggande, vt14
Biomedicinska analytikerprogrammet, inr laboratoriemedicin
Litteratur
• Cellular pathology
- kap 10, 13
• Immunohistochemical Staining Methods
(finns i pingpong)
- kap 1, 2, 3, 8, 9 och 17
Immunohistokemi
• Identifiering av vävnadskomponenter med hjälp av antikroppar
• Immunohistokemi – vävnadsproverImmunocytokemi – cellutstryk
• Antigener, ag - epitop
• Antikroppar, ak – Immunoglobuliner (Ig)-plasmaceller (B-lymfocyt)-IgG, IgM
Immunohistokemi
• Polyklonala antikroppar- immunisering av värddjur- ak mot ett flertal olika epitoper
• Monoklonala antikroppar-hybridomteknik-högt specifika, riktade mot endast en epitop
Immunohistokemi
• Bindning ag-ak- samverkan mellan jonbindningar, vätebindningar, Van der Waals krafter och hydrofoba bindningar
• Visualisering av ak- markörer- kovalent bindning- konjugering, biotinylering
Markörer
• Enzymer- horseradish peroxidas (HRP)- alkaliskt fosfatas (AP)
• Horseradish peroxidas- substrat: väteperoxid- PRP: syre- kromogen: DAB (diaminobenzidin)
AEC (aminoetylkarbazol)
• Alkaliskt fosfatas- substrat: α-naftolfosfat- PRP: : α-naftol- kromogen: diazosalter (Fast Red)
Substrat primär reaktionsprodukt (PRP)
PRP + kemiskt ämne slutlig reaktionsprodukt (SRP)
SRP – olöslig (precipitat)
Markörer
• Fluorescerande molekyler- FITC, Texas Red
- fluorescensemikroskop- nackdel: speciellt mikroskopmörkt rumsvårt att orientera sigbleknar med tiden
• Metaller- guld, silver- vid elektronmikroskopi
• Biotin- avidin- ej visualisering!
Ospecifik bakgrund
• Ospecifik inbindning av ak- inkubering med proteinlösning innan ak- normalserum
• Endogent enzymaktivitet- peroxidas – väteperoxid- alkaliskt fosfats - levamisol
• Endogent biotin- avidin
Korsreaktioner
• Ak reagerar med en snarlik epitop på annat ag
• Ak korsbinder till varandra
Spädning av ak
• Optimal spädning – högsta spädningen på ak som ger stark färgningsreaktion med låg bakgrundsfärgning
• Högre affinitet – lägre koncentration (hög spädning)
• Affinitet – dragningskraften/bindning mellan ak-ag
• ”Smarta” spädningar
Inkubering
• Tid
• Temperatur
• Fuktig kammare
Avmaskering
• Formaldehydfixerat, paraffininbäddat material
• Fixering – maskering av antigen
• Enzymatisk behandling- proteolytiska enzymer (trypsin, proteinase K)- kritisk steg: tid för kort tid – ej tillräcklig avmaskering för lång tid – tar bort antigen
• Värmebehandling- mikrovågsugn, tryckkokare- citratbuffert, EDTA-buffert
Metoder i ett och två steg
• Direkt metod- endast en ak- ak märkt med markör- fördel: snabb metod- nackdel: låg sensitivitet
• Indirekt metod- omärkt primär ak- märkt sekundär ak riktad mot primär ak- fördel: känsligare metod, mer ekonomisk- nackdel: långsammare
Metoder i tre steg
• PAP – peroxidas-anti-peroxidas
• APAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas
• ABC – avidin biotin komplex
• LSAB – labelled streptavidin biotin
Enzym-anti-enzymkomplex
• PAP – peroxidas-anti-peroxidasAPAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas
• Naturlig affinitet hos en antikropp mot ett antigen (här: enzym)
- omärkt primär ak- sekundär ak – ”bro”- enzym-anti-enzymkomplex- substrat och kromogen
Avidin-biotin
• ABC (avidin-biotin-komplex)LSAB (labelled streptavidin biotin)
• Avidins höga affinitet mot biotin
- omärkt primär ak- sekundär biotinylerad ak- avidin-biotin/avidin konjugerat med enzym- substrat och kromogen
Immunogold
• Ej naturligt i kroppen
- primär omärkt ak- sekundär ak märkt med guldpartikel- om ljusmikroskopi: intensifiering med silver- om elektronmikroskopi: olika storlekar på guldpartiklarna → dubbelinfärgning
Polymerkonjugerade system
• Dextranmolekyl
• Direkt metod- ex EPOS (Enhanced Polymer One-Step Method)
• Indirekt metod- ex Envision
Kontroller
• Vävnadskontroller- positiv- negativ
• Blank
In situ hybridisering• Lokalisering på vävnad
• Märkta DNA strängar – fluorescense (FISH)kromogen (CISH)silver (SISH)
In situ hybridisering
• Små mängder prober
• DEPC, EDTA, formamid, NaCl
• Förbehandling:- avmaskering av DNA- blockering av ospecifik inbindning