Upload
onofre
View
157
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Göğüs Hastalıklarında in vivo ve in vitro Araştırma Yöntemleri. İmmunohistokimyasal Tanı Yöntemleri. Prof. Dr. Hasan YÜKSEL. hyukselefe @ hotmail .com www. cocukalerjiklinigi .com www. cocukgogusklinigi .com. Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
İmmunohistokimyasal Tanı Yöntemleri
Prof. Dr. Hasan YÜKSEL
www.cocukalerjiklinigi.com
www.cocukgogusklinigi.com
Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi
Pediatrik Alerji Bilim Dalı ve Çocuk Göğüs Bilim
Dalı
Göğüs Hastalıklarında in vivo ve in vitro Araştırma Yöntemleri
Herhangi bir çıkar çatışmam yoktur .
2
İmmunohistokimyasal (İHK) Tanı Yöntemleri
Göğüs Hastalıklarında in vivo ve in vitro Araştırma Yöntemleri
1. Deneysel modeller
2. Malignite vb in vivo tanı
3. Fonksiyonel proteinler (SPs,
CD…)
4. Patolojik (PAP, kollojen,…..)
5. …….
Astım, alerjik rinit, pnömoni, fibrozis, Tb, toksik...
Solunum Yolunda Deneysel Modeller
Solunum yolu epiteli, submukoza, parankim...
In Vivo Tanı
6
• Astımda alveollerin ve hücrelerin IM ve EM inceleme
farklılaşması
Işık ve Elektron Mikroskopik İnceleme
Floresan, peroksidaz yöntemle görüntüleme
İmmünohistokimya nedir ?
PAP
APAAP
(Strept) Avidin-Biotin
Polimer Bazlı Teknoloji
Eşzamanlı Birden Çok Doku Belirtecinin Boyanması (Double-Stain)
8
Double Stain: SARS-CoV ve sitokeratin.
İmmünohistokimyada Boyama Yöntemleri
Hücrelerdeki reaktivite membranöz, sitoplazmik ve/veya nükleer olabilir.
Boyanmanın genişliğine, yoğunluğuna ve/veya kombinasyonuna göre
reaktivite var bir aralıkta değerlendirilir (zayıf, orta, güçlü ; +, ++, +++ gibi…)
Kompüterize alan hesabı yapılabilir (Stereoloji …. vs) 9
membranözNükleer ve sitoplazmik
İmmünohistokimyasal Boyamanın Kantitasyonu
10
Deneysel Modellerde İHK
En sık kullanım.
Hava yolu İHK
Parankim İHK
BAL İHK
……
Tanı Kullanılan panel Yeğlenen panel
Karsinoma Pansitokeratin Pansitokeratin
Lenfoma CD45 CD45 + CD43
Melanoma S-100 S-100 ve Melan A
Sarkoma Vimentin Kollajen tip IV ve Vimentin
Panel seçiminde algoritm önemlidir
KHDAK Hastaları Çeşitli subtipler
Adenokarsinom Adenokarsinom dışı
Patolog
“Düşük risk” “Orta risk” “Yüksek risk” “Düşük risk” “Orta risk” “Yüksek risk”
In Vivo Tanıda Panel Seçimi
İmmunohistokimyasının western-
blot ile kantitatif hale
getirilmesi
Kök hücrenin
FISH ile gösterilmesi
İmmünohistokimyasal Yöntemlere Destek Yöntemler
Markırlar ile hücreler ve differansiasyon evreleri İHK olarak tanımlanır
İHK Yöntemler: Farklılaşan Hücrelerin Tanımlanmasında
14
Örnekleme
• Deney hayvanlarından
alınan dokular
• Hücre kültürü
• Aspirasyon materyalleri,
• Bronkoalveoler lavaj gibi
sıvılar
• Biyopsi
Patolojik Durumlarda İHK Yöntemler
Patolojik Durumlarda İHK Yöntemler
1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)
2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…
3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,
fibroz
4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg
5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..
6. Apopitozis, Efferositozis
7. EM-Ultrastruktur-ince yapı
İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar
1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)
2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…
3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,
fibroz
4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg
5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..
6. Apopitozis, Efferositozis
7. EM-Ultrastruktur-ince yapı
İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar
18
Astım/rinitte hücrelerin tipinin ve lokalizasyonunun saptanması.
Yapısal ve patolojik proteinlerin tipinin ve lokalizasyonunun saptanması.
İHK ile yapısal değişiklikler: Deneysel Modeller
Etiopatogeneze katkı İnflamasyonda hücre çeşitliliğinin ve birikme yerlerinin
saptanması Tedavinin şekillendirilmesi
İHK ile yapısal değişiklikler
• Akciğerdeki diffüz parenkimal
akciğer hastalıklarında,
• Astımve KOAH ….
• İnflamatuvar hücre çeşitleri ve
sayılarının saptanmasında,
• Akciğerin benign ve malign
neoplazmlarında,
• Patogenez ve tedaviye yönelik
deneysel çalışmalarda
kullanılmakta .
İHK ile yapısal değişiklikler
21
1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)
2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…
3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,
fibroz
4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg
5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..
6. Apopitozis, Efferositozis
7. EM-Ultrastruktur-ince yapı
İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar
• Altın standard
Mukoza Biyopsisi
Ekspresyon oranları;
• FOXP3, T-bet, GATA-3,
• TGF-β1, IL-10 and
• TH1/ TH2 sitokin oranı (IFN-γ , IL-4, IL-5,
IL13)
N. Van Bruaene et al, JACI 2008.
Nazal polipde T-regulatör hücre düşüklüğü
İHK ile İnflamasyon
*
** *
*
Van Bruaene et al, submitted
Nazal polipde inhibitör T-hücre yanıtı
Kim Clin Exp Allergy 2005;35:591-7
Astımda BAL da ECP ve IL-8
27
28
1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)
2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…
3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,
fibroz
4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg
5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..
6. Apopitozis, Efferositozis
7. EM-Ultrastruktur-ince yapı
İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar
www.alerjiklinigi.com
Astımda İnflamasyon
Kronik inflamasyon
Yapısal değişiklikler
Akut İnflamasyoneklenmesi
Zaman
Havayoluremodelingi
RBM kalınlaşması (neoanjiogenzis + fibrinoid) kas hücresi ve goblet hiperplazi kantitasyonu
İHK ile Remodelingin Değerlendirilmesi
Hoshino M. Gene expression of vascular endothelial growth factor and its receptors and angiogenesis in bronchial asthma. J Allergy Clin Immunol 2001;107:1034-8.Neden nazal mukozada
AZ/YOK ?
Akciğerde bulunur
VEGF, endotel hücreler için çok spesifikmitojenik etkileri nedeniyle anjiogenezisisve lenfanjiyogenezisi tetikleyici etkileri olan bir moleküldür.
VEGF ailesi yeditane üye içerir:
VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PlGF.
Tüm üyeler VEGF homology parçası bulundururlar.
VEGF ve remodelling (neoanjiogenzis + fibrinoid)
İHK ile Remodelingin Değerlendirilmesi
Yuksel H et al, Increased exp. of tissue VEGF and flk-1R in seasonal allergic rhinitis and relevance to asthma component. Clin Exp Allergy 2007.
0
50
100
150
200
250
300
Kontrol AR AR+Astım0
5
10
15
20
25
Kontrol AR AR+Astım
VEGF
flk-1
Rem
od
eli
ng
Sistemik Allerjik Enflamasyonun Eş Zamanlı İki Doku Tutulumu
VEGF flk-1 (VEGF-R)
p < 0.05
p > 0.05
p < 0.05
p < 0.05
www.alerjiklinigi.com
H&E ile boyanmış akciğer kesitleri
Bronşiyolerde VEGF-pozitif hücreler
BAL sıvısındaVEGF-pozitif hücreler
Plasebo
TDI
TDI +
VEGFR inhibitörü Lee YC, et al.
J Immunol
2002;168:3595-600.
VEGF ve remodelling (neoanjiogenzis + fibrinoid) neden ÖNEMLİ ?
İHK ile Remodelingin Değerlendirilmesi
Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü
Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008
0
0,5
1
1,5
2
2,5
eNOS iNOS
AR
Kontrol
p>0.05 p<0.05
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Kontrol AR AR+Astım
Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü
p<0.05
p<0.05iNOS Birleşik Hava Yolu
Hastalığı Patogenezi
İnhale NO
iNOS Ekspirasyonu
Enflamatuvar Potansiyel
Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008
1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)
2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…
3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,
fibroz
4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg
5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..
6. Apopitozis, Efferositozis
7. EM-Ultrastruktur-ince yapı
İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar
CoordinateGene
Expression
T -Cells (CD4+)–––
Eosinophils–––
Macrophages–––
Epithelial Cells–––
Smooth MuscleCells
Corticosteroids
GeneticFactors
EnvironmentalFactors
(Smoke, allergens)
GeneProducts
Cytokines–––
Chemokines–––Cell
AdhesionMolecules
–––Enzymes
Pathology
AcuteInflammation
–––Progressive
ChronicInflammation
–––Airway
Remodeling
Astım: Kronik hava yolu inflamasyonu ve mikroçevre değişiklikleri
İHK ile Meditör/Sitokinlerin Değerlendirilmesi
Normal
Normal
Asthma
Asthma
COPD
COPD
Astım: DPP10 (dipeptidil peptidaz 10) nun astım ve koah daki mukozal lokalizasyonu.
İHK ile Meditör/Sitokinlerin Değerlendirilmesi
Yuksel H, et al. Epithelial barrier dysfunction in pathogenesis of allergic rhinitis: Zonula Occludens-1 protein. VI. W Immune Reg. Meeting. March 2011. Abstr no 112.
7. Epiteliyal Bariyer Disfonksiyonu
Epiteliyal bariyer disfonksiyonu alerjik enflamasyondan önce var olan primer neden
olabilir !!!
n=10 n=10
Ko
ntro
lA
lerjik Rin
it
1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)
2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…
3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,
fibroz
4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg
5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..
6. Apopitozis, Efferositozis
7. EM-Ultrastruktur-ince yapı
İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar
43
44
Astım: EGF-R, MUC5A, MUC5B değişiklikleri
İHK ile Meditör/Sitokinlerin Değerlendirilmesi
Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü
Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008
0
0,5
1
1,5
2
2,5
eNOS iNOS
AR
Kontrol
p>0.05 p<0.05
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Kontrol AR AR+Astım
Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü
p<0.05
p<0.05iNOS Birleşik Hava Yolu
Hastalığı Patogenezi
İnhale NO
iNOS Ekspirasyonu
Enflamatuvar Potansiyel
Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008
1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)
2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…
3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,
fibroz
4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg
5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..
6. Apopitozis, Efferositozis
7. EM-Ultrastruktur-ince yapı
İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar
İHK + EM ile Akciğerin Ultrastrüktürel Değerlendirilmesi
49
İHK + EM ile Akciğerin Ultrastrüktürel Değerlendirilmesi
Parankimal hücreler, Organeller, Parankimal yeniden şekillenme, Astım/Amfizem benzeri patholojilerde:
alveol tip II hücre hiperplazisi ve hipertrofisi hücreiçi sürfaktan değişiklikleri
değerlendirilebilir. Alveollerin sayıları ve alveolar açıklıkların
sayılarıAlveol yüzey alanı (Alveolar surface density :
ASD)Işık mikroskop altında sistematik rastgele- fiziksel disektor
kullanılarak hesaplanabilir.
Teoriden Nümerik Değere: Akciğerin Stereolojik İncelenmesi
Tarafsız Taraflı
A C
B D
Stereoloji: Tarafsız sistemik rastgele örneklem
BA
Basit Rastgele Örnekleme Sistematik Uniform Rastgele Örnekleme
Total Organ Örneklemi
Evre 1 Akciğer 1 Akciğer 2 Akciğer 3
Blok 2Blok 1 Blok 3Evre 2
Kesit 1 Kesit 2 Kesit 3
Alan 1 Alan 2 Alan 3
Evre 3
Evre 4
Evre 5 Değerlendirme –Kantitatif veya Kalitatif
Stereolojide Mikroskopi için çok taraflı örneklem
Organ Slicer Slice Selector
Field Selector
Stereolojide SUR Örneklemde Yardımcı Ekipman
Delesse Prensibi:
Relatif alandan relatif hacim ölçülebilir,
Pa
Stereoloji: Tarafsız sistemik rastgele örneklem ve nokta sayımı
Terry M Mayhew School of Biomedical Sciences University of Nottingham
P L
Stereoloji: Tarafsız sistemik rastgele interseksiyon ile nokta sayımı
Bilgisayar adapte !!!!
1 2
3
A
Stereoloji: Tarafsız sistemik rastgele transseksiyonseksiyon ile nokta sayımı
58