INA_440_Lecture10_2015

7/21/2019 INA_440_Lecture10_2015

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Método de separación de los componentes de una mezcla basánd

diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analiza

columna cromatográfica

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La velocidad de la fase móvil que pasa a través de la column

se puede expresar como:

Velocidad de flujo volumétrico o velocidad de flujo lineal:

• Velocidad de flujo volumétrico: 0.30 mL/min

• Indica los mL de solvente que viajan a través de l

columna

• Velocidad de flujo lineal: 5.3 cm/min

• Indica cuantos cm del largo de la columna so

recorridos por el solvente en 1 min.

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Es un gráfico que representa la respuesta del detector e

función del tiempo de elución

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Tiempo de retención (tr) = el tiempo requerido después de

inyección para que el compuesto alcance el detector

Volumen de retención (Vr) = volumen de la fase móvil que se requ

para que un compuesto abandone la columna

Tiempo de retención ajustado ( ´ ) = el tiempo adicional que

requiere para que el soluto viaje a lo largo de la columna

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@7 !)*+,-*.),+,

´ = −

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Retención relativa (α) = La relación entre los tiempos de retenció

de dos compuestos

Donde t´r2 > t´r1, entonces α ! "# $%&'()*+ ,-+ *.(* &+ .* )&(&'/%0' )&.*(%1

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=

´

´

Retención relativa sin ajustar (γ) = La razón de las velocidades cuales los compuestos viajan.

.

=

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@7 !)*+,-*.),+,

Factor de capacidad () = se define para cada pico

Mientras mayor tiempo el compuesto se retenga en la column

factor de capacidad será más alto. Este parámetro junto co

número de platos de la columna, y la asimetría del pico se emp

para determinar la degradación de la columna

= −

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Ex. Una mezcla de benceno, tolueno y metano fue inyectada e

cromatografo de gases. El metano dio un pico definido en 42 s, mientrasel beceno 251 s y el tolueno eluyó en 333 s.

Encuentre el tiempo de retencion ajustado y el factor de capacidad

cada soluto y el tiempo de retencion relativo

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@7 !)*+,-*.),+,

: ´ = − = 251 − 42 =

: ́ = − = 333 − 42 =

: = −

=

251 − 4242

= 5.0

: = −

= 333 − 42

42

= 6.9

ó

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Ex. Una mezcla de benceno, tolueno y metano fue inyectada e

cromatografo de gases. El metano dio un pico definido en 42 s, mientrasel beceno 251 s y el tolueno eluyó en 333 s.

Encuentre el tiempo de retencion ajustado y el factor de capacidad

cada soluto y el tiempo de retencion relativo

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=

()´

()´ =

333 − 42

251 − 42 = 1.39

?

= ()

´

()

´ = 333251

= 1.33

sin ?

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Factor de capacidad (k´) = se define para cada pico

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@7 !)*+,-*.),+,

=

ó

=

ó

=

=

=

La relación entre R)/Cm representa la relación entre soluto en la fase móvil y en

estacionaria. Una vez que se alcanza el equilibrio en la columna esta relación es

coeficiente de partición

∝=

=

=

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Ex. En el ejemplo anterior. Si la columna cromatográfica tiene un diám

interno de 250 µm y es revestida en el interior con una capa de estacionaria de 1 µm de espesor. Estime el coeficiente de partición

benceno entre la fase estacionaria y la fase móvil e indique que fracció

tiempo el benceno pasa en la fase móvil

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−

− = 2

248μm

1μm- thick layer of stationary

phase

Column wall

ℎ : = 124

ℎ: = 124.5

=

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@>6963:96, <3 7, 23/,),964:





= −

=

251 − 42

42 = 5.0

=

⇒ 5.0 = 0.0161 ⇒K = 310

=

7.8 × 10

4.83 × 10 = 0.01611

)

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@>6963:96, <3 7, 23/,),964:





= ℎ

ℎ

= −

=

⇒ =

ℎ ℎ =

− =

+ =

1

+ 1 =

1

5.0 + 1 = 0.17

()

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Resolución = conforme el soluto se mueve a través de la columna

pico tiende a «spread» en un pico Gaussiano con una desviació

estándar ɤ. Mientras mayor tiempo pasa el soluto en la columna, ma

ancho es el pico o la banda

Medidas: el ancho (w1/2) medida a una altura igual a la mitad del alt

de pico y el ancho (w) en la línea base entre las tangentes dibujada

en las partes más pronunciadas de los picos.

Donde:

∆ o ∆ = separación entre picos en tiempo o volumen

= ancho promedio entre dos picos

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@>6963:96, <3 7, 23/,),964:

= ∆

=

∆

=

0.5989∆

/

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Ex. Un pico con un tiempo de retencion de 407 s tiene un ancho en la

de 13 s. Un pico vecnio eluye a 424 s con un ancho de 16 s. Encuen

resolución entre estos dos picos

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Una banda de soluto se hace más ancha conforme se mueve a l

largo de la columna y las bandas se hacen asimétricas

Difusión es una de las razones para que las bandas se hagan ancha

El coeficiente de difusión mide la tasa a la que una sustancia s

mueve aleatoriamente desde un región de mayor concentración hac

una de menor concentración.

= = −

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Cuando un soluto empieza a viajar, el perfil gaussiano de la banda s

describe como

= √4

/()

Donde

C = concentración (mol/m3)

t = tiempo

x = distancia a lo largo de la columna desde el centro de la banda

H = altura del plato

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A6>B264:

= 2

= 2 = 2

= 2

=

=

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Altura del plato viene del proceso de destilación donde la separació

ocurre en platos. La altura del plato es aproximadamente la longitu

de la columna necesaria para un equilibrio entre la fase móvil y lestacionaria. Por lo tanto, mientras mas pequeña la altura del plato

más angosta la banda, mejor separación

El numero de platos en la columna (N) es igual a:

=

=

16

=

=

= 55.5

/

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A6>B264:

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La ecuación de Van Deemeter indica como la columna y el fluj

afectan la altura del plato

= +

+

ℎℎ = ℎ + +

Donde:

A,B, y C = constantes

= flujo lineal

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Espectrometría de masas:

• Medición de iones derivados de moléculas.

• La composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos es

analizada separando los núcleos atómicos en función de su relación masa-

carga (m/z).

• En la técnica clásica de impacto electrónico (electron ionization EI),algunas de las moléculas ionizadas del analito “explotan” en una variedad

de fragmentos ionizados

• El patrón de fragmentación resultante así como los iones residuales

constituyen el espectro de masas.

• El espectro de masas de cada compuesto es único y puede ser usado

como su “huella química” para caracterizar el analito

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Espectrometría de masas:

La muestra gaseosa (situada a la izquierda de la figura) se ioniz

mediante un haz de electrones. Los iones positivos son acelerado

por un campo eléctrico que existe entre las placas aceleradoras.

continuación el haz de iones pasa por una zona del espacio dondexiste un campo magnético B, que ejerce una fuerza sobre un

carga, como la fuerza (representada en verde en la figura) e

perpendicular a la trayectoria de los iones, éstos tendrán aceleració

normal, y se desviarán describiendo una trayectoria curva.

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HPLC-suppressed conductivity detection chromatograph of an aqueous scontaining 12.5 mg L-1 PFOS

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3.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0 {Va le ri a} [m od ifi ed by xi um in j] 1 2. 5 m g/L P FOSµS

min

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0 7

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P F O S

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0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 20 40 60 80 100 120 140 160

PFOS concentration (mg L-1)

A r

e a ( u S * m i n )

Figura 9. Calibration curve of aqueous PFOS by HPLC suppressed conductivity detection (r2 > 0.99).

Calibration curve of aqueous PFOS based on the peak of the linear comby HPLC-suppressed conductivity detection chromatography

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C1"O

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F

O

O

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22 0

HPLC-suppressed conductivity detection chromatograph of an aqueosolution containing PFBS, PFOA, and PFOS (21 mg L-1 each).

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1,9-*) <3 )32/B

iN]Q Z U'9U

iNBY Z U'U=

iNBQ Z U'U`

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0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.0 µS

min

C o n d u c t i v i t y [ µ S ]

Retention Time [min]

P F B S

P F O A

B r a n c h e d 1

B r a n c h e d 2

L i n e a r P F O S

F

F

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F

F

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!K !K

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MagicMS C18 reversed

phase chromatography

Mobile phase

– 10mM NH4OAc

– Methanol

– Linear gradient program

0 min: 95:5 v/v

35 min: 10:90 v/v

Selected Ion Monitoring (SIM) to improve detection limits

– Standard solutions - peak intensity ratios

– m/z window + 3 around selected m/z ion

– LOD: 50 µg/L

Tandem MS/MS to get structural information

Finnigan LCQ-HPLC/MS

http://www.chem.a

^C#!N%ON%O

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O"W^1

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1

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1 1

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1 1

1 1

1 1

C1^d2

C1"O

C1AO

1

1

1 1 1 1

1 1 1 1 1

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1

1

1

1

1 1 1 1

1 1 1 1 1

1 1

1 1

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1

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C1"'

C1A'

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100

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'77 C1!2

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1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

50

100

1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

50

100

1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

50

100

1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

50

100

1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

50

100

10 15 20 25 30

Time min

PFHXs (399)

PFOA (413)

PFOS (499)

PFDA (513)

PFDS (599)

R e l a t i v e A b u n d a n c e

!H

!K

!KFO"WF

!GI

!GIFO"WF

<!=>8?>8

Negative ESI/MS spectrum of a mixed solution (5 mg/l of each PF

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INA_440_Lecture10_2015