INDUSTRIJSKI BIOPROCESI; PROIZVODNJA …web.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/1999_00/Topila.pdf · Leta 1973 je nastopila tako imenovana naftna kriza, kar je ponovno vzbudilo

UNIVERZA V LJUBLJANIBIOTEHNI�KA FAKULTETA�TUDIJ �IVILSKA TEHNOLOGIJA

INDUSTRIJSKI BIOPROCESI; PROIZVODNJAORGANSKIH TOPIL

Natalija ČEH, Nata�a DOLANC, Nata�a ERAZEM, Sebastjan FILIP

(�tudentje tretjega letnika �tudija �ivilske tehnologije)

asist. Maja Pa�, dipl. in�. in prof. dr. Peter Raspor (mentorja)

Ljubljana, 2000

*Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Industrijski bioprocesi; proizvodnja organskih topil, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilsketehnologije, 2000.

2

POVZETEK

Fermentacija bakterij rodu Clostridium, ki proizvajajo aceton, butanol in izopropanol, jebila včasih po produkciji takoj za etanolno fermentacijo s pomočjo kvasovk. Proizvodnja jezačela padati po letu 1950 zaradi nara�čanja stro�kov substrata in mo�nosti mnogocenej�ega pridobivanja v petrokemični industriji. Leta 1973 je nastopila tako imenovananaftna kriza, kar je ponovno vzbudilo zanimanje ne samo za fermentacijo in njeneprodukte, ampak tudi za metabolizem in genetiko vključenih bakterijskih vrst. Kotposledica tega so poznani vsi vodilni encimi, ki sodelujejo v nastanku topil, prav tako sosekvencirani njihovi geni (Clostridium acetobutylicum je bil zadnje čase vključen vsekvencijski projekt mikrobnih genomov). Za konstrukcijo klostridijevih specifičnihproizvodnih produktov so razvili regulatorni mehanizem s kontrolo rekombinacije DNA ingenov. Poceni osnovani agrokulturni-odpadek, kot potencialni novi substrat, je bila kotmetoda uspe�no utemeljena in sedaj so na voljo nove on-line tehnologije, tako kot jeplinsko kondenziranje-odparevanje, ekstrakcija tekoče-tekoče in membransko osnovanemetode.

SUMMARY

Clostridial acetone, butanol, isopropanol fermentation used to rank second only to ethanolfermentation by yeast in its scale of production and thus is one of the largestbiotechnological processes known. Its decline since about 1950 has been caused byincreasing substrate costs and the availabilitiy of much cheaper feedstocks for chemicalsolvent synthesis by the petrochemical industry. The so-called oil crisis in 1973 led torenewed interests in novel fermentation and product recovery technologies as well as in themetabolism and genetics of the bacterial species involved. As a concequence, almost all ofthe enzymes leading to solvent formation are known, thier genes have been sequenced (infact, Clostridium acetobutylicum has beeen recently included in the microbial genomesequencing project), the regulatory mechanisms controlling solventogenesis have begun toemerge and recombinant DNA techniques have been developed for these clostridial toconstruct specific production strains. In parallel, cheap agricultural-waste-based feedstockshave been exploited for thier potential as novel substrates, continuous culture methodehave been successfully established and new on-line product recovery technologies are nowavaiable, such as gas stripping, liquid/liquid extraction, and membrane-based methods.


3

KAZALO

1. Povzetek 22. Zgodovina bioprocesa 43. Mikrobiolo�ke osnove bioprocesa 53.1.Rod: Bacillus 53.2. Rod Clostridium 64. Biokemijske osnove bioprocesa 8

4.1. Razgradnja polisaharidov 84.2. Sprejem monosaharidov in disaharidov v celico 84.3. Katabolizem do piruvata 94.4. Nastanek produktov 9

5. Bioin�enirske osnove bioprocesa 12 5.1. Splo�no 12

5.1.1 Substrati 125.1.2. Mikroorganizmi 125.2. Bioproces 125.2.1. Priprava inokuluma 135.2.2. Glavna fermentacija 145.2.3. Mo�nost uporabe kontinuiranih postopkov 155.2.4. Imobilizacija celic 165.2.5. Pridobivanje produktov 16

6. Ekolo�ki aspekt bioprocesa 177. Uporaba proizvodov v drugih tehnologijah 17 7.1. Splo�ne značilnosti organskih topil 17

7.2. Uporaba acetona, izopropanola, butanola 199. Zaključek 2010. Reference 21


4

2. ZGODOVINA BIOPROCESA

Leta 1861 je Pasteur prvi izoliral bakterijo, ki proizvaja butanojsko kislino in jopoimenoval Vibrion butyrique. Ker pa bakterija ni rasla ob prisotnosti kisika, so zaopisovanje tak�nega tipa metabolizma uporabili izraz «anaerobni » (Pasteur 1861, 1863).Nadalje je ugotovil, da pri mikrobni proizvodnji maslene kisline nastaja tudi butanol(Pasteur, 1862). Nekaj desetletij kasneje, leta 1905, je ta proces proučeval Scardinger inodkril nastanek acetona. V �tudijo proizvodnje butanola oziroma bakterije, ki proizvaja butanol se je poglobilFitz. Ta bakterija naj bi fermentirala glicerol v butanol, masleno kislino, CO2 in H2. Vmanj�ih količinah pa so prisotni tudi ocetna kislina, etanol, laktat ter propandiol (1876,1878, 1882). Bakterijo je leta 1878 opisal kot anaerobno, sporogeno bakterijo, paličasteoblike. Skica te bakterije je sicer kazala formo značilno za klostridije, vendar je leta 1882bakterijo izoliral, ter jo opisal kot kulturo Bacillus butylicus. Delo Pasteurja in Fitzapredstavlja začetek raziskovanj, osnove, ki so bile pobuda drugim mikrobiologom zanadaljna odkrivanja. Beijrinck je leta 1893 odkril dve vrsti bakterij Granulobacter saccharobutyricum inGranulobacter butylicum. Granulobacter saccharobutyricum proizvaja butanojskokislino, ta bakterija je verjetno identična Bacillusu butylicusu. Granulobacter butylicum paproizvaja izopropanol vzporedno z butanolom, bakterija je bila kasneje imenovanaClostridium butylicum, 1983 pa je bilo dokazano, da pripada vrsti Clostridium beiierinckii.Kulturo Clostridium pastorianum, ki proizvaja butanojsko kislino in majhne količinebutanola je 1902 odkril Winogradsky. V Angliji so za firmo Strange and Graham delali Perkin in Weizmann izMenchesterske univerze, ter Fernbach in Schoen iz Pasteurjevega in�tituta. Fernbach inWeizmann sta leta 1911 proučevala in odkrila bakterijo, ki je s fermentacijo na �krobukrompirja proizvajala butanol, etanol in aceton. Leto kasneje je Weizmann izoliralmikroorganizem, ki je proizvajal �tiri krat več acetona kot Fernbachov mikroorganizem inje lahko fermentiral �krob tudi iz drugih izvorov. Ta mikroorganizem so pozneje (leta1919) poimenovali Clostridium acetobutylicum. Od leta 1920 naprej je fermentacija acetona, butanola in propanola postalaindustrijsko pomembna, zato je pri�lo do proučevanja primernih surovin za fermentacijo.Delali so poizkuse z melaso, �iti, dodatki sojine moke in drugimi proteini. Te kombinacijeniso bile najbolj uspe�ne, zato so kasneje izbolj�ali postopek za fermentacijo melase. Leta 1935 so Tatum, Peterson in Fred ugotovili, da nekatere nepoznane substancelahko vplivajo na smer in končni produkt fermentacije. Te substance so imenovalistimulatorji, aktivatorji ali rastni faktorji. Njihova kemijska sestava takrat �e ni bilapoznana.Nahajajo pa se v različnih travah, krompirju, grahu, solati, zelju, kvasu innekaterih bakterijah. Te substance stimulirajo hidrolizo �kroba in omogočajo, da nastaneveč butanola, medtem ko na povečanje acetona nimajo vpliva. Leta 1938 je Müller patentiral proces fermentacije 4-6% raztopine monosaharida.Uporabil je mikroorganizem, ki ga je poimenoval Clostridium propylbutylicum, kiproizvaja butanol. Substrat,ki ga je uporabil je bil sestavljen iz 0,1% amonijevih soli, 0,1%soli fosforne kisline, 0,2% netopnega kalcijevega karbonata in dodatka sladkorja. Hitroizkori�čanje saharoze je dosegel s predhodno invertacijo sladkorja s kislinami ali encimi.Ugotovil je, da so pri predhodnih postopkih fermentacije manjkale določene hranilne snovi(predvsem amonijev du�ik) in vzdr�evanje optimale pH-vrednosti.


5

Po teh raziskavah in odkritjih sledijo �tevilna odkritja bakterijskih vrst iz roduClostridium: C. propylbutylicum alpha (Müller, 1938), C. saccharobutylacetonicumliquefaciens (Arzberger, 1938), C. saccharobutylacetonicum liquefaciens gamma, delta(Carnarius, McCutchan, 1938), C. madisonii (McCoy, 1946), C. saccharoperbutylicum(Beesch, 1948), C .saccharoperbutylacetonicum (Hongo, 1960) in drugi.

TABELA 1: Imena bakterij, njihovih avtorjev in leto odkritja

IME ORGANIZMA AVTOR LETO

Bacillus butylaceticum FREIBERG 1925Bacillus acetobutylicum FUNK 1925

IZSAK , FUNK 1933Clostridium saccharobutylicum gammaClostridium saccharobutylacetonicum LOUGHLIN 1935Clostridium saccharoacetobutylicum beta, gamma ARZBERGER 1936Clostridium saccharoacetobutylicum alpha WOODRUFF 1937Clostridium invertoacetobutylicum LEGG, STILES 1937Bacillus tetryl ARROYO 1938P-bacillus MUELLER 1938bClostridium propylbutylicum alpha MUELLER 1938aClostridium saccharobutylacetonicum liquefaciens ARZBERGER 1938Clostridium saccharobutylacetonicum liquefaciensgamma, delta

CARNARIUS,McCUTCHAN

1938

Clostridium madisonii McCOY 1946Clostridium saccharoperbutylicum BEESCH 1948

3.MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA

Organska topila kot so aceton, butanol in izopropanol so produkti fermentacij, pri katerihso prisotne bakterije iz rodu Bacillus in Clostridium.

Dru�ina: Bacillaceae

3.1 Rod : Bacillus (lat. Bacillus = palička)

V rodu Bacillus so bakterije v obliki ravnih paličk zaobljenih ali ravno odsekanih robov.So po Gramu pozitivne, proizvajajo spore in katalaze. Rastejo aerobno in fakultativnoanaerobno, nekatere vrste rastejo v kolonijah na trdih goji�čih in na povr�ini v tekočihgoji�čih. Skoraj vse vrste utekočinjajo �elatino in rastejo na krompirju. V rodu so �tevilnevrste, večinoma saprofiti (B .subtilis), ki jih najdemo v zemlji, kjer razkrajajo organskesnovi. Nekatere so patogene: B. anthracis, B. alvei, B. larvae�Vrste, ki proizvajajo


6

organska topila so: B.butylicus, B. butyricus, B. orthobutylicu (butanol), B. macerans(aceton), B. amylobacter (butanol, propanol), B. butylaceticum, B .acetobutylicum�

3.2. Rod Clostridium (gr.kloster = vreteno)

Tabela 2 : Pomembnej�e vrste rodu Clostridium, njihovi substrati in produkti fermentacij

VRSTA SUBSTRAT PRODUKTI FERMENTACIJE

C butyricum glukoza,�krob,dekstrini butanojska kislina, acetat, CO2, H2

C.tyrobutyricum glukoza ali laktat,glicerol + acetat

butanojska kislina, acetat, CO2, H2

C.pasteurianum glukoza, �krob, manoza butanojska kislina, acetat, CO2, H2

C.pectinovorum pektin, �krob, glikogen,dekstrini

butanojska kislina, acatat

C.butylicum glukoza butanojska kislina, acetat, butanol, 2-propanol, CO2, H2

C.acetobutylicum glukoza, glicerol,piruvat

butanojska kislina, acetat, butanol,aceton, acetoin, etanol, CO2, H2

C.propionicum alanin,treonin acetat, propionat, CO2

C.botulinum proteini, amino kisline acetat, laktat, NH3,H2

C.histolyticum proteini, amino kisline acetat, laktat, NH3,H2

C.sporogenes proteini, amino kisline acetat, laktat, NH3,H2

C.sticklandii proteini, amino kisline acetat, laktat, NH3,H2

Tabela 3 : Snovi, ki jih tvorijo C.butyricum, C.acetobutylicum, in C.butylicum iz glukoze(mol / 100 molov glukoze )

PRODUKT C.butyricum C.acetobutylicum C.butylicum

maslena kislina 76 4 17ocetna kislina 46 14 17etanol - 7 -butanol - 56 59aceton - 22 -izopropanol - - 123-hidroksi-2-butanon - 6 -CO2 188 221 204H2 235 135 78

V rod Clostridium �tejemo sporogene bacile, ki so striktni anaerobi ali aerotolerantni. Sodolge, po Gramu pozitivne paličke, pri nekaterih vrstah se postavljajo posamič ali v parih,


7

pri drugih zopet v dolgih nizih. Spore so ovalne in �ir�e od vegetativne oblike, postavljenecentralno, paracentralno ali terminalno v bakterijski celici in so rezistentne na visoketemperature.Optimalna temperatura za rast najbolj poznanih klostridijev je 30 - 40°C. Poleg tehmezofilnih klostridijev, je veliko tudi termofilnih , katerih optimalna temperatura rasti je60 - 70°C. Klostridiji ne proizvajajo katalaze. Večina mikrobov tega rodu �ivi v zemlji,kjer sodelujejo pri fermentacijskih procesih. Nekaj vrst je patogenih za ljudi in �ivali,nekatere pa povzročajo zastrupitve s hrano. Pri razmno�evanju v hrani proizvajajo namrečtoksine, ki povzročajo hude zastrupitve. Najpomembnej�a vrsta, ki zagotavlja proizvodnjo acetona in butanola je Clostridiumacetobutylicum. Je gram pozitivna, striktno anaerobna sporogena bakterija. Za maksimalnoproduktivnost bakterij so potrebni optimalni pogoji in ustrezne hranilne snovi.

• Hranilne snovi :

- vir ogljika (skoraj vsi sladkorji, melasa, sirotka, sulfitna lu�nica, hidrolizati rastlin, �krob,zlasti pa �itarice in otrobi koncentracije med 3 - 8%)

- vir du�ika (aminokisline in proteini, delno amonijeve soli)- topni fosfati (vsebnost pod 1g/L)- kalij- vitamini

Slika 1 : Clostridium acetobutylicum ( Biotechnology, 2nd completery reved. Weinheim;New York; Basel; Cambridge; Tokyo, VCH; Products of primary metabolism / ed. by M.Roehr )

• Optimalni pogoji za rast in delovanje bakterij Clostridium acetobutylicum :


8

- anaerobni pogoji- temperatura ; med 30 in 37°C- pH . Na začetku fermentacije je pH okoli 4.5, kasneje, ko se količina ocetne in maslenekisline zmanj�uje, začne nastajati aceton in butanol. Do nevtralizacije kislin pride zdekarboksilacijo in redukcijo, rezultat je povi�anje pH vrednosti.

4. BIOKEMIJSKE LASTNOSTI BIOPROCESA

Clostridium acetobutylicum lahko uporabi za svojo rast nekatere heksoze kot pentoze ternjihove �tevilne oligomere in polimere. Kot končni produkt razgradnje sladkorjev pa dajeta sporogena bakterija aceton, n-butanol, 2-propanol, etanol, ocetno in masleno kislino, terCO2 in H2. Kot vir ogljika pridejo tako v po�tev skoraj vsi sladkorji (monosaharidi indisaharidi kot so celobioza, D-manoza, D-galaktoza, D-riboza, D-ksiloza, L-arabinoza, D-glukozamin itd.), sulfitna lu�nica, hidrolizati rastlin, �krob, zlasti pa �itarice in otrobi.Sam proces pridobivanja produktov lahko razdelimo na več stopenj. Predhodno se morajopolisaharidi razgraditi v monosaharide, le-te celica sprejme s pomočjo transportnihsistemov, kjer poteka katabolizem.

4.1. RAZGRADNJA POLISAHARIDOV

Razgradnja �kroba poteka s pomočjo encima α-amilaze, pri kateri mora genski zapisvsebovati vsaj en dodaten α-amilazni gen (Verasselt in Vanderleyden 1992; Gerischer inDürre 1990). Izmed polisaharidov slu�i kot vir ogljika tudi ksilan, vendar je tu rastpočasna, pa tudi ksilan, ki je glavna sestavina hemiceluloz in lesa, je le delno hidroliziran spomočjo endoksilanaze in β-D-ksilozidaze. C. acetobutylicum pa ne raste na celulozi.

4.2. SPREJEM MONOSAHARIDOV IN DISAHARIDOV V CELICO

Za sprejem glukoze in fruktoze v celico so odgovorni fosfotransferazni sistemi, kjer sesnov, ki se transportira, spremeni (se fosforilira).

V primeru glukoze sistem vkjučuje encim I, HPr, encim IIAglu, encim IIglu. P-HPr jefosforiliran protein, ki nastane med HPr in fosfoenolpiruvatom (PEP), ki je energetskobogata spojina:

HPr fosfat -6-glukoza HPr -P glukoza II Encim + →+

HPr fosfat -1-fruktoza HPr -P fruktoza II Encim + →+


9

Druge substrate lahko celica sprejme prav tako s fosfotransferaznim sistemom (fruktoza), zABC transportnim sistemom ali pa s pomočjo simporterjev.Disaharidi, kot so maltoza ali saharoza, pa se cepijo pod vplivom ustrezne fosforilaze indobimo:

4.3. KATABOLIZEM DO PIRUVATA

C. acetobutylicum pretvori glukozo do piruvata po fruktoza-1,6-bifosfatni poti. To pomeni,da iz vsake molekule glukoze, ki vstopa v reakcije glikolize, nastanejo dve molekulipiruvata, dve reducirani molekuli koencima NADH in dve molekuli ATP.Pentoze se pretvorijo v riboza-5-fosfat in ksiluloza-5-fosfat, ki vstopata v pentoza fosfatnicikel, kjer nato metabolizem nastale fosfatne heksoze poteka po EMP poti.

4.4. NASTANEK PRODUKTOV

• Nastanek kislin

Laktat nastane iz piruvata pri pH vi�jem od 5 in minimalni koncentraciji �eleza 10µM.Encim, ki katalizira to redukcijo, je laktatdehidrogenaza, koencim je NADH.Glavni encim za pretvorbo piruvata pa je piruvat:feredoksin oksidoreduktaza, pri čemernastane acetil-CoA, CO2 in reduciran feredoksin. Iz acetil-CoA lahko nato nastane acetat inbutirat. Pri prvem reakcije katalizirajo fosfotransacetilaze in acetatkinaze, ki pa niso bileizolirane iz C .acetobutylicuma Nastanek komponent s �tirimi C-atomi se začne skondenzacijo dveh molekul acetil-CoA. Pod vplivom tiolaze nastane acetoacetil-CoA. Tase reducira v butiril-CoA tako, da najprej nastane α-hidroksibutiril-CoA (encim α-hidroksi-butiril-CoA dehidrogenaza, ki je bil izoliran iz Clostridium beijerinckii in ne izClostridium acetobutylicuma), nato krotonil-CoA (encim krotonaza) in nazadnje butiril-CoA (encim butiril-CoA dehidrogenaza). Nastanek butirata iz butiril-CoA kataliziratafosfotransbutirilaza, ki je občutljiva na spremembe pH (pri pH=6 je skoraj neaktivna) inbutirat kinaza.

Redoks bilanca reakcij:

glukoza + 2 NAD+ → 2 piruvat + 2 NADH + 2H+

2 piruvat → 2 acetil-CoA + 2 CO2 + 2H

piruvat HPr -P HPr PEP I Encim + →+

fosfat-1-glukoza glukoza fosfat maltoza maltoze afosforilaz + →+


10

2 acetil-CoA + 2 NADH + 2 H+ → butirat + 2 NAD+

sumarna enačba: glukoza → butirat + 2 CO2 + 2 H2

Do nastanka H2 pride pri oksidaciji reduciranega feredoksina. Med tvorbo kislin nenastaneta samo 2 molekuli H2/glukozo ampak pribli�no 2.3 H2/glukozo. Dodatnih 0.3 H2izvira iz NADH, ki se oksidira pod vplivom NADH: feredoksin oksidoreduktaze. Ta encimaktivira acetil-CoA in inhibira NADH. Ker je del NADH oksidiran s sprostitvijo H2, izacetil-CoA ne dobimo samo butirat ampak tudi acetat.

�krob

1

monosaharid

2

piruvat 13 laktat

3 12 CO2 H2

etanol 20 19 acetil-Co A 10 11 acetat

4 acetil-Co A

aceton 17 16 acetoacetil-Co A 5 18 CO2 6 izopropanol

7 15 14 8 9 butanol butiril-Co A butirat

Slika 2 Fermentacijske poti in nastanek topil (povzeto po Appl. Microbiol. Biotechnol.,1998 vol. 49)

1 amilaze; 2 fosfoenolpiruvat fosfotransferazni sistem in glikolitični encimi fruktoza-1,6-bifosfatne poti; 3 piruvat:feredoksin oksidoreduktaza; 4 tiolaza; 5 3-hidroksibutiril-CoAdehidrogenaza; 6 krotonaza; 7 butiril-CoA dehidrogenaza; 8 fosfotrans-butirilaza; 9 butirat


11

kinaza; 10 fosfotransacetilaza; 11 acetat kinaza; 12 hidrogenaza; 13 laktat dehidrogenaza;14 butiraldehid dehidrogenaza in aldehid/alkohol dehidrogenaza E;15 butanol dehidrogenaza in aldehid/alkohol dehidrogenaza E; 16 acetoacetil-CoA:ace-tat/butirat koencim-A transferaza; 17 acetoacetat dekarboksilaza; 18 primarna/sekundarnaalkohol dehidrogenaza; 19 acetaldehid dehidrogenaza; 20 etanol dehidrogenaza.

• Nastanek topil

Če �elimo, da pri fermentaciji z C. acetobutylicum dobimo kot končni produkt nekateraorganska topila, moramo zagotoviti določene pogoje (nizek pH, dostop do substrata,ustrezno količino fosfatov in sulfatov itd.)Nastanek acetona iz acetoacetil-CoA katalizirajo acetoacetil-CoA:acetat/butirat koencim Atransferaza in acetoacetat dekarboksilaza. Aceton se reducira v izopropanol. Za to jeodgovoren encim primarna/sekundarna alkohol dehidrogenaza, ki se nahaja v C.beijerinckii. Butanol se tvori iz butiril-CoA v reakcijah različnih butirilaldehid in butanoldehidrogenaz. Prva je bila izolirana iz C. acetobutylicum NRRL B643 in C. beijerinckiiNRRL B592. V obeh primerih je koencim NADH, bolj�i substrat pa je butiril-CoA kotacetil-CoA.Iz C. acetobutylicum ATCC 824 sta bila izolirana dva izoencima butanol dehidrogenaze.Butanol dehidrogenaza II rabi za svojo aktivnost Zn2+ ione, ima pH optimum pri 5.5 in jeverjetno prevladujoča alkohol dehidrogenaza, ki je vključena v produkcijo butanola.Novej�e raziskave pa so pokazale, da pri nastanku butanola v C. acetobutylicum-u verjetnosodelujejo najmanj tri različne butanol dehidrogenaze. Pri mikroorganizmu C. beijerinckiiso dobili podobne rezultate. Sev NRRL B592, ki proizvaja aceton, butanol in etanol,vendar ne izopropanol, izloča dve vrsti alkohol dehidrogenaz; le-ti se razlikujeta vkoencimu (eni lahko slu�i kot koencim samo NADPH, drugi pa NADPH ali NADH).


12

Slika 3 : Odvisnost pH in količine produktov od časa (povzeto po Biotechnology, 2nd

completely reved. Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo, VCH; Products ofprimary metabolism / ed. By M. Roehr)Fermentacija s pomočjo Clostridium acetobutylicum lahko razdelimo na dve fazi. V prvifazi (po trinajstih urah) fermentacija odgovarja tipu fermentacije butanojske kisline.Rezultat tega je akumolacija ocetne in butanojske kisline, pri čemer pride do padca pH-vrednosti na 4.5. V drugi fazi (po osemnajstih urah) se količina ocetne in butanojskekisline zmanj�uje, nastajata pa aceton in butanol kot glavna produkta fermentacije. V tejdrugi fazi pride do nevtralizacije kislin z dekarboksilacijo in redukcijo. Rezultat tega jepovi�anje pH-vrednosti v podalj�ani fermentaciji (encimi, ki so potrebni za nastajanjeacetona in butanola imajo nizki pH optimum).

5. BIOIN�ENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA

5.1. SPLO�NO

5.1.1. SUBSTRATI

Pri proizvodnji organskih topil lahko kot substrat uporabimo kar nekaj surovin (�krob,melasa, sirotka, monosaharide, disaharide itd). Lahko pa tudi uporabljamo različne


13

kombinacije, seveda odvisno od sposobnosti mikroorganizma. �krob in melasa sta očitnonajbolj raz�irjena presna substrata, ki se uporabljata v biolo�ki proizvodnji acetona inbutanola. Kakorkoli �e, lahko se poslu�ujemo tudi z drugimi ogljikovimi hidrati, ki jihmikroorganizmi fermentirajo. Tako lahko recimo kot substrat uporabimo tudi odpadkevolne in svile. Pri nekaterih vzorčnih raziskavah so kot substrat uporabljali tudi jabolčnobrozgo, ki je kot vir fermentirajočih sladkorjev vsebovala fruktozo in glukozo, sirotko(laktoza), in celulozo aloje (agavi podobna tropska rastlinaz debelimi mesnatimi listi). Čeprav je te celuloze veliko in je potencialno poceni bopotrebno opraviti �e veliko biokemijskih in genskih raziskav preden se bo lahkouporabljala v industrijskih, aceton-butanol fermentacijah. Sirotka je stranski produktproizvodnje sira, skute in tudi kazeina. S tem predstavlja enega glavnih odpadkovmlekarske industrije, ki pa je problematičen, če ga ne moremo kasneje kje uporabiti ali pacelo predelati. Sirotka vsebuje 4�5% laktoze, katero pa je Clostridium acetobutylicumsposoben neposredno fermentirati. Zaradi relativno nizke vsebnosti sladkorjev, ki so navoljo, je sirotka brez predhodnega koncentriranja neprimerna za uporabo v ostalihfermentacijskih procesih. Tak�na vsebnost sladkorjev pa je skoraj optimalna za aceton-butanol fermentacijo.

5.1.2. MIKROORGANIZMI

Mikroorganizmi, ki se uporabljajo za fermentacijo, kjer proizvajamo aceton, butanol inizopropanol so vrste iz rodu Clostridium. Mikroorganizem katerega je izoliral in uvedelWeizmann (leta 1919), je poznan kot Clostridium acetobutylicum. .Najbolj optimalnatemperatura fermentacije za Clostridium acetobutylicum je med 33 in 370C. Fermentacijalahko poteka tudi pri ni�jih temperaturah vendar se takrat čas same fermentacije podalj�a.Pri vi�jih temperaturah (cca. 420C) pa bi bil potek samega procesa oviran.Poleg tega je �epomembno, da so koncentracije prisotnih kislin pod kritično mejo (okoli 10 mmol L-1).Pomembno vlogo pri fermentacijah z C.acetobutylicum ima pH vrednost. Optimalen pH jeokoli vrednost 5, lahko pa je nekoliko ni�ji. C.acetobutylicumni toliko odvisen od prisotnosti kisika tako kot nekatere patogene vrste rodu ClostridiumKlitje spor na zraku ni mogoče tako kot pri fakultativnih mikroorganizmih. Zato so zaaktiviranje spor kot tudi za začetno stopnjo rasti potrebni popolnoma anaerobni pogoji.

5.2. BIOPROCES

5.2.1. PRIPRAVA INOKULUMA

Sevi vrste roda Clostridium morajo biti selekcionirani za kultivacijo na koruznih ali pamelasnih substratih. V praksi se danes v večji meri uporabljajo procesi na melasnihsubstratih, vendar mora biti tehnika priprave inokuluma prilagojena surovinam, ki jihuporabljamo. Kulturo, ki jo običajno dobimo v tako imenovanih »bankah«, kjer jih hranijopri zelo nizkih temperaturah, najprej razmno�imo. Tak�ne selekcionirane seve najprejnacepimo na predhodno sterilizirano podlago, npr. za kultivacijo na melasnem substratuuporabimo podlago iz 25% krompirja, 0.5% glukoze in 0.2% CaCO3. Po inokulaciji v


14

epruvetah, le te postavimo za 1 do 3 minut v vrelo vodo, saj je �e Weizmann ugotovil, dadajejo spore ki so bile izpostavljene toplotnemu �oku občutno bolj�i izkoristek na računproizvodnje organskih topil. Tak�ni postopki priprave inokuluma s pomočjo toplotnih�okov se skoraj vedno uporabljajo v tovarnah. Ker pa je potrebno ustvariti anaerobnepogoje lahko dodamo tudi parafinsko olje, ki ustvari nepropusten sloj. Po inkubaciji 24 urpri temperaturi 33 do 370C se ta laboratorijska kultura dalje razmno�i deset krat. Vendar sevsakič cepi v malo večji volumen tako da na koncu dobimo 1 do 2 litra inokuluma. Takopridobljena kultura se na to nacepi na �e večji volumen okoli 200 litrov ter �ele nato vindustrijski fermentor.

TABELA 4: Parametri bioprocesa in koncentracije produktov pri dvostopenjskem odprtemprocesu

FAZA 1 FAZA 2Parametri procesaPH 4.3 4.3Temperatura ( 0C) 37 33Stopnja obratov( h-1) 0.125 0.03Produkti (g L-1)Butanol 3.6 12.6Aceton 1.6 4.8Etanol 0.3 0.8Butirat 1.3 0.8Acetat 0.4 0.5Uporaba substratov (%) 40 99.7Izkupiček (g topila/g glukoze)

0.25 0.34

Produktivnost (g topila/L h) 0.08 0.44

5.2.2. GLAVNA FERMENTACIJA

Industrijski fermentorji se od običajnih goji�č razlikujejo po tem, da so opremljeni stermometrom in me�alom. Me�alo je dokaj pomembno za hiter prenos toplote pristerilizaciji substrata, kot tudi za preme�anje CaCO3 in pomaga, da pridejomikroorganizmi v bolj�i stik s substratom. Fermentor napolnimo samo do 3/4 volumna, kerlahko pride do penjenja med samim bioprocesom in bi se vsebina izlila. Običajno dodamo�e sredstva ki preprečujejo penjenje. Sterilizacija substrata se izvaja v fermentorju, lahkopa tudi predhodno, le da moramo takrat nujno predhodno sterilizirati prazen fermentor.Običajno polnimo fermentor s substratom, ki smo ga sterilizirali na pol-odprtemizmenjevalcu toplote. Na ta način prihranimo kar nekaj energije, saj para s katero smoogrevali substrat kondenzira in slu�i za predgretje napajalne raztopine oziroma substrata.Ko smo napolnili fermentor s substratom, ga inokuliramo s predhodno pripravljenim


15

inokulumom. Substrat je sestavljen iz 6% sladkorja iz melase, 0.4% amonijevega sulfata,0.8% kalcijevega karbonata in 0.06% superfosfata. pH po sterilizaciji je okoli 6,0. Medpotekom same fermentacije se jemljejo vzorci za določevanje pH in specifične te�e. Procesteče okoli 40 do 48 ur oziroma do takrat, ko preneha nastajati plin (ogljikov dioksid invodik). Takrat koncentracija skupnih topil zna�a okoli 21g/L. Ta koncentracija je sevedaodvisna od koncentracije sladkorja v melasi. Če bi bila koncentracija sladkorja večjanpr.7% bi lahko dobili tudi do24 g/L skupnih topil. Ampak efektivnost vrenja pada, če sekoličina sladkorja preveč poveča, ker nastala koncentracija topil inhibira delovanjemikroorganizmov. Tako količina pridobljenega topila varira glede na tip melase, ki smo jouporabili pri fermentaciji in se giblje med 27 in 35%. Za povečanje izkoristka v nekaterihtovarnah osnovnemu substratu dodajajo »povratno brozgo« v količinah od 20 in tudi do40% (fermantiran substrat kateremu smo oddestilirali topila). Vendar je potrebno dodajanjeobčasno prekiniti, da preprečimo kopičenje nepotrebnih metabolitov.Donos topil ni odvisen samo od podlage oziroma substrata, ki smo ga izbrali, ampak tudiod uporabljenega mikroorganizma. Pomembni so tudi encimi, ki privedejo reakcije dokončnih produktov. Odvisno od tega katero topilo �elimo proizvesti v večji meri, tak�ensev mikroorganizma si potem izberemo. Tako so dobili seve, ki proizvedejo 25% butanolanekateri tudi 20% acetona in 2 do 3% etanola glede na skupno količino nastalih topil.

5.2.3. MO�NOST UPORABE ODPRTIH POSTOPKOV

Poleg enostopenjske oziroma »�ar�ne« proizvodnje je mogoča tudi uporaba odprtihbioprocesov pri katerih je pa nujna uporaba večstopenjskih sistemov. Bistvo tak�nihpostopkov je v tem,da ločimo prvo fazo, kjer nastajajo kisline od druge faze, kjer nastajajotopila. Proces fermentacije, ki ga izvajamo neprekinjeno, ima kar nekaj prednosti v serijskiproizvodnji. Kot prvo, potrebujemo samo eno količino inokuluma dalj�o proizvodnjo.Večja produktivnost procesa in skraj�an čas fermentacije. Kljub nekaj prednosti, ki jihprina�a odprt način proizvodnje, je le malo poročil o tak�ni proizvodnji organskih topil z C.acetobutylicum. DRY (leta 1958) poroča o odprti proizvodnji acetona, butanola v sistemutreh do petih posodah po pretočnem sistemu. Čeprav je bila produktivnost pri tem procesutrikrat večja kot pri serijskih procesih so bili izkupički topil dokaj nizki in kisline nastale vprvi fazi se v naslednjih fazah niso pretvorile v topila. Zato če �elimo uporabiti odprtoproizvodnjo kot serijske procese, moramo nujno najprej povečati izkoristke. Ekonomskogledano je najbolj rentabilen proces v dveh stopnjah. Uporaba procesov po tak�ni poti imaeno veliko prednost, da lahko pogoje dela enostavno optimiziramo v prid proizvodnje topilin same rasti mikroorganizmov.V prvi fazi celice rastejo pod pogoji, ki povzročajo tvorbo topil. Druga stopnja pa jeprimarno posvečena pretvorbi preostanka sladkorjev v topila, dokler se na izčrpajo limitnirastni faktorji. Tak�en pristop ima dodatno prednost glede na stabilnost kulture. Pojavlja pase problem izroditve kulture in te�ave pri ohranitvi stalne ter enakomerne produkcije topilskozi dalj�e časovno obdobje. Vzrok tak�nim te�avam je sorazmerno visoka koncentracijatopil. Kot je bilo �e omenjeno v kontekstu, topila v preveliki koncentraciji delujejozaviralno na mikroorganizme. Uporabljeni so bili �e tudi drugi pretočni odprti procesi(uporaba prese�nih substratov, turbidostat, pH-auxsostat). Njihovi rezultati tudi podpirajopoglede na tak�ne odprte fermantacije, kot dobro izvedljive in uporabne.


16

H2 in CO2

Fermentacijska brozga Črpalka Fermantacijska brozga brez topil

Celični koncentrat Topila

PRIDOBIVANJE PRODUKTOV Reverzna osmoza Ekstrakcija tekoče-tekoče Adsorbcija itd.

1.FAZA Rast 2.FAZA Izhod celične mase Iniciacija topil Produkcija topil Formacija Rezervoar za RECIKLIRANJE ultrafiltrat Ultrafiltracija topila

Slika 4 : Potek kontinuirane fermentacije acetona, butanola s celično reciklacijo inpridobivanje integriranih produktov ( Biotechnology, 2nd completery reved. Weinheim;New York; Basel; Cambridge; Tokyo, VCH; Products of primary metabolism / ed. by M.Roehr )

5.2.4. IMOBILIZACIJA CELIC

Slabi izkoristki in nizke koncentracije topil v fermentacijski brozgi so glavnepomanjkljivosti procesa. Zato je bilo nujno potrebno najprej opraviti nekatere izbolj�ave vsamem procesu pred načrtovanjem aceton-butanol fermentacij. Imobilizacija celic jetehnično omejena z biokatalizo znotraj fermentacijskih procesov. Na ta način je verjetnovi�ja gostota celic posledica večje produktivnosti. Druga prednost je v uporabi takoimenovanih ne-rastočih medijev in dokaj la�ja ločitev celic od produktov. Paziti pa jepotrebno da ne po�kodujemo aktivnosti celic tekom imobilizacije. Za imobilizacijo seuporabljajo različni postopki npr. neskončne spirale ali pa ravni lističi z zarezami.Vračanjecelic v odprt sistem je ena od mo�nosti povečanja produktivnosti procesa. V industrijskiuporabi se izkori�ča mo�nost filtracije, ki ne po�koduje aktivnosti celic in je kot postopekdokaj enostaven za uporabo. Za uporabo je na voljo veliko variant novih membran v


17

različnih izvedbah (votla vlakna, cevaste membrane, filter plo�če), ki bi lahko pripomoglek bolj uporabnem procesu, v povezavi z bolj�im znanjem o fiziologiji C. acetobutylicum.

5.2.5. PRIDOBIVANJE PRODUKTOV

Tradicionalni način pridobivanja oziroma ločevanja nastalih topil iz fermentacijske brozgeje destilacija. Ker pa je koncentracija nastalih topil v brozgi dokaj nizka, se ob uporabitak�nih postopkov zelo zvi�a cena proizvoda. Dokler pa C.acetobutylicum ne bo postalodporen na vi�je koncentracije butanola ni mogoče izvesti večjih izbolj�av, ki bi pomagalek bolj ekonomični proizvodnji. Tak�ne probleme pa lahko re�imo z vračanjemfermentacijskih ostankov v sam sve�i substrat in s tem zmanj�amo negativen vplivproduktov na C.acetobutylicum. Po sami fermentaciji je potrebno ločiti nastala organska topila od preostankafermentacijske brozge. Zato topila iz fermentacijske brozge ločimo z destilacijo in s temdobimo destilat, ki vsebuje 40% zmes topil. Zmes topil nato vodimo v postopkefrakcionirane destilacije, kjer ločimo aceton in butanol od zmesi topil. Etanola inizopropanola ne ločujemo, ampak ju prodajamo kot zmes alkoholnih topil. Če pa tr�i�če aliporabnik zahteva tak�no topilo, se pusti fermentacijsko brozgo pred destilacijo nekaj časastati in takrat pride do pretvorbe acetona v izopropanol.Tehnike ločevanja lahko vključujejo uporabo membran (reverzna osmoza), adsorbentov,ekstrakcije tekoče-tekoče in nekatere kemijske postopke. Čeprav pa je večina delaposvečena mo�ni uporabi alternativnih metod pridobivanja topi, je opaziti dokaj velikozanimanje tudi za uporabo aceton-butanol fermentacije.

6. EKOLO�KI ASPEKT BIOPROCESA

Po odstranitvi topil se preostala brozga , ki vsebuje bakterije, posu�i in se uporablja kotdodatek krmi. Del te destilacijske brozge (20 do 30%) pa pogosto vračajo nazaj v proces,saj le-ta brozga vsebuje nekatere intermediate fermentacije in majhne količine preostalihsladkorjev, kar poveča hranilno vrednost sve�e brozge. Poleg tega vsebuje destilacijskabrozga �e vitamine B kompleksa, kot so riboflavin, pantotenska kislina, piridoksin,nikotinska kislina in holin.Drugi odpadek proizvodnje pa so plini, ki nastajajo med fermentacijo. Vodik se uporabljakot gorivo za pridobivanje toplote pri proizvodnji pare. Ogljikov dioksid pa se absorbira,čisti in komprimira, ter uporablja v suhem stanju ali kot plin v jeklenkah.


18

7. UPORABA ORGANSKIH TOPIL V DRUGIH TEHNOLOGIJAH

7.1. SPLO�NE ZNAČILNOSTI ORGANSKIH TOPIL

Organska topila so spojine, ki pretvarjajo trdne ali tekoče nehlapljive organske spojine vraztopine in se pri tem kemično ne spremenijo. Organska topila se uporabljajo v zmeseh, kijim dodajamo tudi druga sredstva za redčenje ali za polnitev, da raztopine dobijo zahtevanoviskoznost. Poleg tega dodajamo tudi plastifikatorje, ki zagotovijo elastičnost prevleke.Lastnosti, ki jih morajo imeti so lahka hlapljivost, da raztopijo masti in snovi podobnemastem, ne smejo menjati svojih lastnosti pod vplivom vode, kislin, alkalij itd., ne smejotvoriti stabilnih kemičnih spojin z materijo, ki jo raztapljajo, ne smejo korodirati kovin inkovinskih proizvodov itd.Industrijska organska topila so obse�na skupina organskih snovi, ki so zaradi svojihlastnosti nepogre�ljiva praktično v vseh industrijskih procesih, obrti in tudi vgospodinjstvu.Organska topila veliko uporabljajo v industriji v različnih proizvodno-tehnolo�kihprocesih, v proizvodnji lakov, barv, antikorozivnih zmesi, sredstev za impreganacijo, vproizvodnji gume in njenih proizvodov, umetnega usnja, industriji viskoznih proizvodov,tekstilni industriji, obdelavi lesa in proizvodnji papirja, za ekstrakcijo olja in masti, zarazma�čevanje kovinskih delov, za kemično či�čenje tkanin, razredčevanje barv in lakov, vkemični in farmacevtski industriji itd. Topila je mo�no regenerirati iz matičnih lu�nic, vkondenzatih po �ar�nem odparevanju tekoče faze v ekstrakcijskih zmeseh pri ekstrakcijitekoče-tekoče ali v raztopinah uporabljenih za či�čenje procesnih naprav.

�iroka tehnolo�ka uporaba pa ima mnogokrat negativen učinek na zdravje. Lastnostiorganskih topil, kot so relativno lahka topljivost ter topljivost v masteh ali mastempodobnih snoveh, določajo njihov karakter in stopnjo toksičnega delovanja na organizem.Razen prek dihal prodirajo v organizem skozi nepo�kodovano ko�o in imajo posebnoafiniteto do tkiv in organov, ki so bogati z ma�čobami in lipoidi, s čimer tudi razlo�imonjihovo nevrotoksično delovanje. Nekatera organska topila se izločajo iz organizma zizdihanim zrakom nespremenjena, druga pa spremenjena z ekskreti. Glede na koncentracijoin dol�ino izpostavljenosti param organskih topil je lahko zastrupitev v proizvodnihpogojih akutna ali kronična. Poleg nevarnosti zastrupitve je delo z organskimi topilipovezano tudi z veliko nevarnostjo eksplozije ali po�ara, ker gre za lahko vnetljive ineksplozivne snovi. Ker pa so topila tudi toksična , jih prav zato stalno kontroliramo,predvsem v farmacevtskih proizvodih. Topila najbolje analiziramo s plinskokromatografijo. Gre za vna�anje vzorca v plinski kromatograf, kjer lahko direktnouporabimo injiciranjem raztopine vzorca ali pa injiciramo samo plinsko fazo, ki je vravnote�ju s tekočim vzorcem.

Organska topila za plemenitenje tekstilij morajo biti predvsem cenena, regeneracija topil pačim popolnej�a. Za ugrevanje organski topil se porabi manj energije kot za ugrevanje vode.Blago barvano v organskih topilih se hitreje posu�ijo. Zaradi nizke povr�inske napetosti,topila tudi hitro in enakomerno omočijo material. V topilih vlakna manj nabreknejo kot vvodi, zato je nevarnost po�kodb tekstilnega materiala manj�a. Negorljivost pri normalnihpogojih in topilih se uporablja le v laboratorijskem in poliindustrijskem obsegu.


19

Organska topila so butanol, izopropanol, aceton, bencin, kerozin, benzen, toluen, katran,petrol eter, etilen glikol, trikloroetilen itd.

7.2. UPORABA ACETONA, IZOPROPANOLA, BUTANOLA

TABELA 7: Fizikalno-kemijske lastnosti organskih topil

LASTNOST ACETON BUTANOL IZOPROPANOLMolekulska te�a 58.08 74.12 60.1Tali�če pri 101.3 kPa -94.0C -90.2 0C -88.5 0CVreli�če pri 101.3kPa

56.1 0C 117.7 0C 82.3 0C

Specifičnagravitacija pri 200C

0.807 0.813 0.786

Vaporizacijskatoplota

29.1 kJ mol-1 43.8 kJ mol-1 39.8 kJ mol-1

Vaporski tlak pri200C

24.7 kPa 0.63 kPa 4.4 kPa

Gorilna toplota 1787 kJ mol-1 198.2 kJ mol-1 2005.8 kJ mol-1

Izopropanol ali 2-propanol pridobivamo s hidrogeniranjem propena.Uporabljamo ga tudikot antifriz in predstavlja del antifriza, kot topilo v hitro su�ečih oljih in barvah in sevedaje nepogre�ljiv v proizvodnji kozmetike za lotion za roke, after shave -vodica za po britju.Z vodo se me�a v vseh razmerjih. Izopropanol je kot 50-70% raztopina zelo učinkovitoantimikrobno sredstvo, ki učinkuje predvsem na vegetativne mikrobne celice, nima paučinka na spore. Njihova antimikrobna aktivnost je pogojena s sposobnostjo denaturacijepreteinov in po�kodb celičnih membran in celičnih sten gram negativnih bakterij oziromanjihove lipidne komponente. V �ivilski industriji se uporablja kot antiseptik na ko�i, patudi kot osnova nekaterih antiseptičnih pripravkov. V �elatinah za izoliranje endoproteinazpa sodeluje kot filtrat, za ekstrakcijo DNA iz rastlin... Podobno je za etanol. Uporabljamoga tudi v industriji polimerov, farmacevtski industriji kot 60% raztopina za disinfekcijomedicinskih rokavic, in za pridobivanje acetona in estrov. Izopropanol uporabljajo tudi vznanstvene namene. Če dodajamo 90 dni, 5000 ppm izopropanola podganam, le-tapovzroča reverzno nara�čanje motorne aktivnosti podgan. Princip določanjaspektrofotometrične metode procenta fosfatov je ločitev fosfatov s papirno kromatografijo,spektrofotometrična določitev posameznih lipidov. Pri kromatografiji se kot topilauporabljajo izopropanol skupaj z določenimi količinami triklorocetne kisline, destiliranavoda in NH4OH oziroma izopropanol in butanol v kombinaciji z 25% NH4OH, destiliranovodo v ustreznem pH območju 10,5.

Aceton ali 2-propanon je splo�no uporabno topilo za lake, acetatno svilo in v industrijipolimerov. Ker se me�a z vodo v vseh razmerjih je pomembna surovina v industrijieksplozivov in filmski industriji kot sredstvo za �eliranje. Danes se aceton in butanolproizvajata iz petrokemikalij. Uporaba acetona je tudi primerna za či�čenje policikličnih


20

aromatskih hidrokarbonov (PAH) tako, da jih spustimo skozi aktiviran silikagel zacetonom. Na drugi strani pa so acetoni tudi pomembni za uravnavanje količine ketonskihteles v krvi krav molznic, ki se pripravljajo za telitev.Butanol je v primerjavi z acetonom dobro topilo. Uporabljajo ga kot hranljivi ekstraktant v�ivilski industriji in v industriji arom. Zaradi svojih lastnosti ga največ uporabljajo vkemijski industriji in kot dodatek gorivom. Uporaben je tudi v plastični industriji. Butanol,etanol in petroleter imajo antimikrobno aktivnost proti �tirim vrstam bakterijam in tremgljivičnimi vrstami kot so Aspergillus flavus, Fusarium moniliforme, Candida albicaus...

8. ZAKLJUČEK

Aceton- butanojska fermentacija je skoraj �tirideset let veljala za eno od pomembnej�ihpanog v industrijski proizvodnji. Po zaprtju zadnjega fermentacijskega obrata je bilozaznati občuten dose�ek na področju fizioogije, biokemije in genetike Clostridiumacetobutylicum. Nadaljni razvoj, na področju neprekinjene fermentacije, postaja z uporaboproste ali imobilizirane celice obetajoč. Integracija kultiviranega produkta, zodstranitvenimi tehnikami v visoko produktivnem sistemu,lahko premaga �tevilneprobleme inhibicije produkta z butanolom. Tako je sedaj mogoče doseči vi�jofermentacijsko produktivnost, bolj�o izkoristljivost substrata in večji pridelek. Na pomenupa pridobivajo tudi odpadne snovi, njihova predelava, uporaba in vpliv na okolje. Vrh tega,da se napredek nana�a na raziskave zadnjih let, s spo�tovanjem do prvih raziskav naClostridium acetobutylicumu, se zdi, da je mogoče ustvariti izbolj�ave na področjukomercialne uporabe. V splo�nem rezultati ka�ejo, da je ekonomska sposobnost aceton-butanojske fermentacije po strokovni plati mo�na in da lahko pridobi tudi na industrijskilestvici.

9. REFERENCE


21

• Appl. Microbiol. Biotechnol., 1998 vol.49, 639 - 648 s.• Bilban, M. 1997 Strokovni posvet: Organska topila v delovnem okolju, RS Roga�ka

Slatina, 23-24. maj 1997. 14-17 s.• Biotechnology, 2nd completely reved. Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo,

VCH ; Products of primary metabolism / ed. by M.Roehr• »Bacteriology », »Pasteur,Louis »,«Weizmann,Chaim«, Microsoft ( R ) Encarta ( R ) 97

Encyclopedia. ( c ) 1993 - 1996 Microsoft Corporation.• Goren�ek, M. 1973. �tudija barvanja tekstilij- 1. faza, dipl. delo, Ljubljana.• Johanides, V. /Korčulanin, A. /Marić, V. /Divjak, S. /Vla�ić, D. 1976. Industrijska

mikrobiologija. Zagreb, Sveućili�na naklada Liber, 191 - 205 s.• Jones, B.L. Fornatinini, D.1998. Analytical Biochemistry, 263(2), 15. October 1998,

stran 214-220• Journal of Ethnopharmacology: Antimicrobical activity of extracts of herbal plants used

in the traditional medicine of Jordan, 64(3), March 1999, 271-276 s.• Kocijan, A. 1997. Optimiziranje metode za določitev organskih topil v zdravilih, dipl.

delo, Ljubljana.• Raspor, P. 1992. Biotehnologija, Ljubljana: Bia, 472 s.• Rehm, H.J. /Reed, G. v sodelovanju z Pühler, A. /Stadler, P. Vol.6. 1996.• Sarić, Z. 1989. Op�ta mikrobiologija,IRO »Naučna knjiga »,Beograd,197 s.• Schlegel, H. G. v sodelovanju z Schmidt, K. 1986. General microbiology. 6th ed.

Cambridge University Press, 97-99,293-298 s.• Schroeter, W. /Schnabel, A. 1993. Splo�ni priročnik kemije. Ljubljana,Tehni�ka zalo�ba

Slovenije, 523, 531 s.• Some organic solvents; Resin monomers and related compounds, pigments and

occupational exposures in paint manufacture and painting, IARC MONOGRAFI, 1989• Ti�ler, M. 1991.Organska kemija. 3.izdaja. Ljubljana, DZS.• Wayman, M. / Parekh, S. R.. 1990. Biotechnology of Biomass Conversion ; Fuels and

Chemicals from Renewable Resources. Open University Press Milton Keynes, 160- 165s.

Documents

INDUSTRIJSKI BIOPROCESI; PROIZVODNJA …web.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/1999_00/Topila.pdf · Leta 1973 je nastopila tako imenovana naftna kriza, kar je ponovno vzbudilo