PROIZVODNJA ACETONA IN IZOPROPANOLAweb.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/2000_01/Aceton.pdf · Naftna kriza v letu 1973 pa je ponovno postavila na prvo mesto biotehnoloıko

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNI�KA FAKULTETA

�IVILSKA TEHNOLOGIJA

PROIZVODNJA ACETONA IN IZOPROPANOLA

Ur�ka DOBER�EK, Martina ČUFER, Jernej ČOPI, Branka DJUKIĆ

(�tudentje tretjega letnika �tudija �ivilske tehnologije)

prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Pa� (mentorja)

Ljubljana, 2001 *Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Industrijski bioprocesi: proizvodnja acetona in izopropanola, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2001. 2

POVZETEK

Aceton in izopropanol sta spojini, ki ju pridobivamo s kemijskimi in biotehnolo�kimi procesi. Slednji temeljijo na fermentaciji bakterij rodu Clostridium. Kot modelna organizma smo uporabili C. acetobutylicum in C. beijerinckii. Začetki uporabe bioprocesa, v katerem nastajajo aceton, butanol in izopropanol, segajo v prva desetletja dvajsetega stoletja. Ta proces se je v industriji uporabljal le, kadar je bilo to ekonomsko ugodno, odvisno od cen substratov. Z genskim in�eniringom izbolj�ujejo delovne organizme, da s tem povečajo njihovo produktivnost. Kot običajni substrati se uporabljajo ogljikovi hidrati (enostavni in sestavljeni), katerih razgradnja poteka po poti glikolize ali pa po Entner-Doudoroffovi poti. Sedaj se zaradi ekonomskih pogojev največ uporabljajo integrirani bioreaktorji, v katerih lahko vodimo tako �ar�ne kot tudi kontinuirne procese. Produktivnost se lahko poveča tudi z imobilizacijo celic in reciklom biomase. Tako aceton kakor tudi izopropanol sta toksična za ljudi, �ivali in nekatere mikroorganizme, zato se ne uporabljata neposredno v proizvodnji hrane, temveč le kot topila in sredstva za obarjanje ter ekstrakcijo.

SUMMARY

Acetone and isopropanol are substances produced by chemical or microbiological processes. The latter are based on Clostridium fermentation process. We used C. acetobutylicum and C. beijerinckii as model organisms. Butanol-acetone fermentation has been used since the begining of this century when economics were favorable, depending on prices of raw material. Genetic engineering is used for strain improvement in order to enlarge productivity. Usually carbohydrates, mono and polysaccharides are used as substrates. Degradation takes Embden-Meyerhof-Parnas or Entner-Doudoroff pathway. Out of economical reasons the integrated bioreactors are mainly in use, where we can have batch or continuous process. Productivity can also be enlarged with cell immobilisation and cell recycle. Both acetone and isopropanol are toxic for humans, animals and some microorganisms. That is why they are not used directly in food production. However, they are used as solvents, precipitants and extractants.


KAZALO VSEBINE 1. Uvod............................................................................................................................................ 5

2. Zgodovina bioprocesa ................................................................................................................. 6

2.1 Prva odkritja.................................................................................................................... 6 2.2 Prva svetovna vojna ....................................................................................................... 7 2.3 Medvojno obdobje in druga svetovna vojna ................................................................. 7 2.4 Obdobje po letu 1945 ..................................................................................................... 8

3. Mikrobiolo�ke osnove bioprocesa ............................................................................................. 8

3.1 Mikroorganizmi ............................................................................................................. 8 3.2 Encimi ........................................................................................................................... 9 3.3 Regulacija sinteze produktov ...................................................................................... 10 3.4 Izbolj�ava sevov .......................................................................................................... 10

4. Biokemijske osnove bioprocesa .............................................................................................. 12

4.1 Izkori�čanje substratov .................................................................................................. 12 4.1.1 Razgradnja polimerov ..................................................................................... 12 4.1.2 Izkori�čanje mono- in disaharidov .................................................................. 13 4.2 Intracelularni metabolizem do piruvata ......................................................................... 13 4.3 Sinteza produktov .......................................................................................................... 14

5. Bioin�enirske osnove bioprocesa ............................................................................................ 15

5.1 Pripravljalni postopki ................................................................................................. 16 5.1.1 Izbira substrata .................................................................................................... 16 5.1.1.1 Običajni substrati ........................................................................................ 16 5.1.1.2 Alternativni fermentacijski substrati ........................................................... 16 5.1.2 Sterilizacija substratov in opreme ....................................................................... 17 5.1.3 Izbor, priprava in shranjevanje biokultur ............................................................ 17 5.1.4 Imobilizacija celic ............................................................................................... 19 5.2 Potek bioprocesa ........................................................................................................ 19 5.2.1 �ar�no gojenje .................................................................................................... 19 5.2.2 Kontinuirno gojenje ............................................................................................ 20 5.2.3 Nadzor bioprocesa .............................................................................................. 20 5.3 Zaključni postopki ...................................................................................................... 21 5.3.1 Recikel biomase .................................................................................................. 21 5.3.2 Izolacijski postopki ............................................................................................. 21


6. Ekolo�ki vidik bioprocesa ....................................................................................................... 23

6.1 Vpliv na ljudi .............................................................................................................. 23 6.1.1 Vpliv bakterij ...................................................................................................... 23 6.1.2 Vpliv izopropanola ............................................................................................. 24 6.1.3 Vpliv acetona ...................................................................................................... 24 6.2 Vpliv na okolje .......................................................................................................... 24 6.2.1 Vpliv na �ivali ..................................................................................................... 24 6.2.1.1 Vpliv bakterij ........................................................................................... 24 6.2.1.2 Vpliv acetona in izopropanola ................................................................. 25 6.2.2 Vpliv na rastline .................................................................................................. 25 6.2.3 Vpliv na druge mikroorganizme ......................................................................... 25 6.2.3.1 Vpliv bakterij ........................................................................................... 25 6.2.3.2 Vpliv acetona in izopropanola .................................................................. 26 6.2.4 Vpliv na naravne procese .................................................................................... 26 6.2.4.1 Vpliv bakterij ........................................................................................... 26 6.2.4.2 Vpliv acetona in izopropanola ................................................................. 26

7. Uporaba bioproizvodov v proizvodnji hrane .......................................................................... 26

8. Reference .................................................................................................................................. 27


Slika 2. Bakterije rodu Clostridium (Hagedorn, 2000).

1. UVOD Aceton in izopropanol sta naravna produkta nekaterih anaerobnih bakterij. V prvi polovici tega

stoletja so ju pridobivali predvsem s fermentacijo. Bioproces, v katerem nastajajo aceton, butanol in izopropanol, po uporabi v svetu na drugem mestu, pred njim je le alkoholna fermentacija kvasovk. Po letu 1950 je pomen tega procesa skokovito upadel, kajti proizvodnja acetona in izopropanola iz nafte je postala ekonomsko ugodnej�a. Naftna kriza v letu 1973 pa je ponovno postavila na prvo mesto biotehnolo�ko proizvodnjo.

Za pridobivanje acetona in izopropanola se uporabljajo bakterije rodu Clostridium. Te bakterije so obligatno anaerobne, Gram-pozitivne, sporogene (endospore) in ubikvitarne. Najbolje rastejo na krvnem agarju pri 37oC. Imajo fermentativni metabolizem, nekatere vrste so sposobne nesimbiotske akumulacije vezave du�ike. Nekaj vrst je tudi patogenih.

Te bakterije so sposobne kot substrat uporabiti veliko organskih spojin. Produkti fermentacije so mlečna in ocetna kislina, butanol, aceton, izopropanol ter velike količine du�ikovega dioksida in vodika.

Bakterije tega rodu imajo več različnih encimov kot bakterije kateregakoli drugega rodu. To jim omogoča izkori�čanje velikih biolo�kih molekul in zato imajo pomembno vlogo v biorazgradnji in ogljikovem ciklu. Nekatere vrste so pomembne v �ivilski mikrobiologiji, ker fermentirajo laktozo v mleku in povzročajo proteolitično zorenje mesa. Nekatere pa so uporabne v industriji, saj proizvajajo etanol in aceton (C. acetobutylicum) in tudi izopropanol.

V zadnjih petdesetih letih so veliko raziskovali

fiziologijo, biokemijo in genetiko pri organizmu Clostridium

acetobutylicum. Veliko obeta tudi razvoj odprtega bioprocesa in imobilizacije celic, saj oba pripomoreta k večji

produktivnosti bioprocesa. Izpopolnjene separacijske metode pa so povečale izkoristek biorocesa.

Odprti bioproces omogoča vi�je izkoristke, hitrej�e in bolj učinkovito odvzemanje produktov.

Slika 1. Bakterija rodu Clostridium (Hagedorn, 2000).


Preglednica 1. Fizikalni in kemijski parametri acetona in izopropanola (Dürre in Bahl, 1996; Merck KGaA 100992; Merck KGaA 100012; ) Vrednost Aceton Izopropanol Molekulska te�a [g/mol] 58,08 60,1 Tali�če pri 101.3 kPa [oC] -94,6 -88,5 Vreli�če pri 101.3 kPa [oC] 56,1 82,3 Specifična te�a pri 20oC 0,807 0,786 Specifična se�igna toplota [kJ/mol] 1787 2005,8 Specifična izparilna toplota [kJ/mol] 29,1 39,8 Parni tlak pri 20oC [kPa] 24,7 4,4 Gostota pri 20°C [g/cm3] 0,79 0,786 Rektifikacijski indeks pri 20°C 1,35868 pH 5-6 (vodna raztopina 359 g/L) 7 (20°C) Vonj sadni oster, karakterističen Barva brezbarvna brezbarvna

Nekaj fizikalnih in kemijskih parametrov acetona in izopropanola je zbranih v preglednici 1.

Aceton je pomemben intermediat v proizvodnji metilakrilatov, metil izobutil ketona in je topilo za lake, barve. Me�a se z vodo v vseh razmerjih. Izopropanol se uporablja kot topilo v hitro su�ečih se oljih in črnilih, v kozmetiki kot lotion za roke ali lotion za po britju. Tudi izopropanol se me�a z vodo v vseh razmerjih.

Aceton in izopropanol pa lahko pridobivamo tudi z različnimi kemijskimi metodami. Kemijsko pridobivanje acetona: - z oksidacijo pri 500oC iz 2-propanola, katalizator je baker ali srebro (Kornhauser, 1994;

Kra�ovec, 1976); - z dehidrogeniranjem 2-propanola pri 400oC, če je prisoten ZnO kot katalizator (Kra�ovec,

1976); - z oksidacijo propena z zračnim kisikom pri 90 do 120oC, katalizator so paladijevi in bakrovi

kloridi (Kornhauser, 1994; Kra�ovec, 1976); - s kumenskim postopkom: alkiliranje benzena s propilenom kumen, ki ga nato oksidirajo v vodni

emulziji v kumenhidroperoksid, tega nato cepijo aceton in fenol (Kra�ovec, 1976). Kemijsko pridobivanje izopropanola: - iz propena z adicijo vode pri 220-250 oC, pritisku 22 MPa in prisotnosti katalizatorja, ki je lahko

volframov ali cinkov oksid na nosilcu SiO2 (Kornhauser, 1994) - indirektna hidracija propena z �veplovo kislino (Kra�ovec, 1976). 2. ZGODOVINA BIOPROCESA 2.1 PRVA ODKRITJA

Beijerinck (1893, cit. po Dürre in Bahl, 1996) je prvi opisoval bakteriji, ki sta proizvajali butanol. To sta bili Granulobacter saccharobutyricum in Granulobacter butylicum. Slednja proizvaja tudi izopropanol, kar pa ni bilo znano pred letom 1920 (Folpmers, Osburne in Werkman, 1935, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Kasneje so dokazali, da je G. butylicum pravzaprav Clostridium butylicum in da spada v vrsto C. beijerinckii.


Biolo�ka produkcija izopropanola (skupaj z butanolom) je bila prvič opisana leta 1906 pri C. americanum (Pringsheim, 1906, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Schardinger (1905, cit. po Dürre in Bahl, 1996) je prvi opisal aceton kot produkt mikrobiolo�ke sinteze. Organizem, ki ga je proizvajal, se je imenoval Bacillus macerans. Poleg acetona pa so nastajale �e druge snovi (etanol, format in acetat).

Aceton in butanol sta bila najdena kot produkta fermentacije zelo različnih mikroorganizmov. Odkritje njune skupne sinteze pri enem organizmu je bilo povezano z uspehi pri kemični proizvodnji sintetične gume. Fernbach (cit. po Dürre in Bahl, 1996) je izoliral proizvajalca acetona in butanola leta 1911. Weizman je uspel izolirati organizem, ki so ga kasneje poimenovali Clostridium acetobutylicum, in je proizvajal aceton in butanol iz �kroba v večjih količinah kot Fernbachovi organizmi. Kot substrat je bil v tem primeru uporabljen krompir. To je bila prva popolnoma aseptična fermentacija (Stabury in Whitaker, 1984). 2.2 PRVA SVETOVNA VOJNA

Z začetkom prve svetovne vojne je naraslo zanimanje za aceton. Le-ta je bil potreben v velikih količinah za proizvodnjo brezdimnega smodnika. Industrijska proizvodnja se je začela v Royal Naval Cordite Factory v Pooleu.

Zaradi nem�ke blokade ni bil mogoč uvoz koruze in �it v Veliko Britanijo v potrebnih količinah. Ker ni bilo �krobnih materialov, ki so se uporabljali kot hrana mikroorganizmov, se je proizvodnja acetona in butanola v Veliki Britaniji opustila. Leta 1916 so proizvodnjo skupaj s tehnologijo prestavili v Toronto v Kanado. Tam in pa v Indiani v ZDA se je pridobival aceton do konca prve svetovne vojne. V tistem času je bilo malo povpra�evanja po butanolu, ki je ostajal v velikih količinah in so ga skladi�čili (Dürre in Bahl, 1996).

Preglednica 2. Zgodovina opisa in izolacije bakterij, ki tvorijo topila (Dürre in Bahl, 1996). Ime mikroorganizma Produkt Leto prvega opisa Avtor(ji) Bacillus macerans aceton 1905 Schardinger Clostridium americanum butanol, izopropanol 1906 Pringsheim Bacillus amylobacter butanol, propanol 1909 Bredemann Clostridium acetobutylicum aceton, butanol 1926 McCoy in sod. 2.3 MEDVOJNO OBDOBJE IN DRUGA SVETOVNA VOJNA

Po vojni se je začela �iriti avtomobilska industrija, kjer so bile potrebne velike količine lakov. Butanol in njegov ester, butil acetat, sta odlični topili za lake. Tako se je med vojno proizveden butanol uporabil tu. Medvojne razmere, velika potreba po acetonu in skoraj nobene po butanolu, so se kmalu obrnile na glavo. Sedaj se je potreboval butanol in ne aceton. Leta 1923 se je proizvodnja acetona in izopropanola skoraj ustavila, kajti bakterije so napadli bakteriofagi in jih uničili (Ogata in Hongo, 1979, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Leta 1924 je dnevna proizvodnja butanola v ZDA zna�alo pribli�no 100 ton. Po vojni so s proizvodnjo acetona in butanola začeli ponovno tudi v Veliki Britaniji. Kot substrat so uporabljali melaso tako v V. Britaniji kot v ZDA, ker je bila cenej�a od �it. Bakterije Clostridium acetobutylicum so sedaj proizvajale s fermentacijo do 6,5% sladkorja in 2% topil, kar je pomenilo veliko zni�anje stro�kov za proizvodnjo.

Po letu 1936 se je proizvodnja butanola in acetona raz�irila po celem svetu. Proizvodne linije so odprli v nekdanji Sovjetski zvezi, Indiji, Japonski, Avstraliji in Ju�ni Afriki. Proizvodnja je tekla


tudi med drugo svetovno vojno. Leta 1945 je 66% butanola in 10% acetona, proizvedenega v ZDA, pri�lo iz fermetativne industrije (Dürre in Bahl, 1996).

2.4 OBDOBJE PO LETU 1945

Okrog leta 1950 pa je proizvodnja acetona in izopropanola s pomočjo fermentativnih bakterij močno upadla zaradi nara�čajoče petrokemične industrije in nara�čajočih cen melase. Kmalu so zaprli skoraj vse tovarne, kjer so s pomočjo bakterij pridobivali aceton in butanol.

Velik problem pri uporabi bakterije C. acetobutylicum za fermentativno pridobivanje topil je velika te�nja tega organizma k degeneraciji, izgubi fermentativnih sposobnosti in sporulaciji. Aktivacijo spor pri sve�e inokulirani kulturi inducira toplotni �ok, kjer temperaturo zvi�amo za 90 s na 70oC.

Industrijsko pridobivanje topil s fermentativnimi bakterijami do leta 1973 z ekonomskega vidika ni bilo donosno, ker so bile cene substratov zelo visoke, imeli so majhne izkoristke, velike količine odpadkov, potrebovali so veliko energije za destilacijo, poleg vsega tega pa ima bakterija Clostridium acetobutylicum �e zelo majhno toleranco na prisoten butanol, kajti pri koncentraciji 200 mM butanola je rast teh mikroorganizmov popolnoma zavrta. Enaki koncentraciji acetona ali izopropanola pa nimata tak�nega učinka (Moreira in sod., 1981, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Leta 1973 pa se je zaradi zvi�anih cen nafte močno povi�alo zanimanje za biotehnolo�ko pridobivanje butanola, acetona in izopropanola. Ta način proizvodnje je tudi danes cenovno najugodnej�i, saj kot substrat uporabljajo organske odpadke, ki nastajajo pri predelavi zelenjave in sadja.

3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA 3.1 MIKROORGANIZMI

Samo nekatere bakterijske vrste proizvajajo aceton in izopropanol več kot le v sledovih. Najpomembnej�i rod med njimi je Clostridium (Bahl in Dürre, 1993), kjer prednjači vrsta C. acetobutylicum, zraven pa sodijo tudi vrste, ki so prikazane v Tabeli 3. Produkti, ki jih te bakterije proizvajajo, le rahlo variirajo (preglednica 3). Bakterija C. aurantibutyricum in sevi C. beijerinckii (George in sod., 1983, cit. po Dürre in Bahl, 1996) ter bakterija C. butyricum (Zoutberg in sod., 1989b, cit. po Dürre in Bahl, 1996) pa producirajo tudi izopropanol, ki ga ne proizvaja nobena druga vrsta.

Če je substrat glukoza, dobimo kot produkt fermentacije z uporabo bakterije C. acetobutylicum butanol in aceton v razmerju 2:1; če pa uporabimo bakterije vrst C. puniceum in C. beijerinckii pa dobimo razmerje butanol proti acetonu 10:1 (Holt in sod., 1988 in Chen in sod., 1986, cit. po Dürre in Bahl, 1996) iz česar sledi, da produkcija topil zavisi od vrste klostridija.

Kulture C. acetobutylicum nadaljujejo produkcijo topil tudi v stacionarni fazi rasti, medtem ko bakterijske vrste C. puniceum to počno samo do faze stacionarne rasti.

Obogatitev in izolacija klostridijev sta relativno enostavni; dober vir so vzorci zemlje s koreninskih delov krompirja in fi�ola (Calam, 1979, cit. po Dürre in Bahl, 1996) ali zdrobljeni koruzni medij (Weizmann, 1919, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Izolacijo čiste kulture pa dose�emo z uporabo tehnik, ki pogosto vključujejo striktno anaerobne bakterije (Breznek in Costilow, 1994, cit. po Dürre in Bahl, 1996).

Preglednica 3. Vrste bakterij iz rodu Clostridium, ki proizvajajo topila v kompleksnem mediju z 2% vsebnostjo glukoze (Dürre in Bahl, 1996).


Sintetizirani produkti (mmol L-1) Organizem aceton izopropanol

C. acetobutylicum 14,0 - C. aurantibutyricum 20,5 4,5 C. beijerinckii 6,0 9,8 C. butyricuma - 7,0 C. puniceum 16,8 -

a Različica, ki oblikuje agregat z uporabo 2,7% glukoze. V nadaljnji razpravi bo največji poudarek namenjen bakteriji C. acetobutylicum, ker ta

bakterijska vrsta sintetizira in tolerira največje koncentracije topil in se zato pogosto uporablja v industrijskih procesih, medtem ko bo bakterija C. beierinckii vključena kot modelni organizem za proizvodnjo izopropanola.

C. acetobutylicum je Gram-pozitivna, pravilno oblikovana paličasta bakterija velikosti 2,4 - 4,7 mikronov; vegetativne celice se gibljejo s peritrihimi flagelami, oblikujejo pa se subterminalne jajčaste spore; optimalna temperatura rasti je 37°C, kot rastna faktorja pa se uporabljata biotin in α-aminobenzoat (Rubbo in sod., 1941, cit. po Dürre in Bahl, 1996).

Preglednica 4. Lastnosti bakterij, ki proizvajajo aceton in butanol (Dürre in Bahl, 1996). Sladkorji Bakterija Hidroliza

�elatine Motnost Produkcija

lipaz Hidroliza

�kroba glukoza fruktoza laktoza maltoza sukroza

C. acetobutylicum - + - + + + + + + C. beijerinckii - + - + - + + + + + 3.2 ENCIMI

Bakterije rodu Clostridium imajo več različnih encimov kot katerekoli bakterije drugega rodu. To jim omogoča izkori�čanje velikih biolo�kih molekul (pektin in �krob), veliko različnih substratov (sladkorji) in produkcijo veliko različnih snovi (etanol, butanol, ogljikov dioksid, vodik, mlečna kislina, ocetna kislina, propionska kislina in sukcinat) med katerimi sta tudi aceton in izopropanol. Nekaj encimov, ki imajo pomembno vlogo pri produkciji acetona in izopropanola, je bilo izoliranih in proučenih (preglednica 5).

Za nas najzanimivej�a encima (zaradi produkcije acetona in izopropanola) sta nativna acetoacetat dekarboksilaza bakterij C. beijerinckii B592 in B593 ter primarna/sekundarna alkohol dehidrogenaza bakterij C. beijerinckii B592, ki katalizirata reakcijo redukcije acetona v izopropanol (v in vitro pogojih pa slednji encim omogoča tudi pretvorbo acetaldehida v etanol) (Chen, 1993, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Alkohol dehidrogenaza bakterije C. acetobutylicum pa v tem organizmu opravlja vsaj dve različni vlogi: sodeluje pri formaciji etanola in regulira razpolo�ljive količine NADPH, ki ga dovaja NADPH : ferodoksin oksidoreduktaza, saj je alkohol dehidrogenaza odvisna od NADPH (Michels, 1990, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Bakterija C. beijerinckii B592, ki proizvaja aceton, ne pa tudi izopropanola, pa vsebuje dva tipa encima alkohol dehidrogenaze in sicer lahko ena izkori�ča tako NADPH kot tudi NADH, druga pa le NADPH (Chen, 1993, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Preglednica 5. Encimi bakterij C. acetobutylicum in C. beijerinckii, ki sodelujejo pri razgradnji piruvata (Dürre in Bahl, 1996).


encim gostitelj koencim izolacija molekulska masa [kDa]

velikost podenote [kDa]

kloniranje sekveniranje

Piruvat:ferodoksin OR CA TPP, CoASH

+ / 123 - -

Acetaldehid DH CA NADH - / / - - Alkohol DH CA NADPH + / 44 + + NADPH:ferodoksin OR CA NADPH - / / - - CoA transferaza CA + 93 23, 24 + + CoA transferaza CB + 85 23, 28 - - Acetoacetat DC CA + 330 28 + + Acetoacetat DC CB + 200-230 - - Aldehid alkohol DH CA / - 96 + + Primarna/sekundarna alkohol DH

CB NADPH + 100 38 + +

Alkohol DH CB NAD(P)H - 80 40, 40.5 - - OR � oksidoreduktaza CA - C. acetobutylicum DH � dehidrogenaza CB - C. beijerinckii DC � dekarboksilaza / - ni znanih podatkov

3.3 REGULACIJA SINTEZE PRODUKTOV

Prehod z acidogeneze (faze, v kateri bakterije proizvajajo kisline) v solventogenezo (faza, kjer teče produkcija topil (aceton, izopropanol, butanol)), pri kulturi C. acetobutylicum se prične proti koncu rasti in pri pH pod 5 v kompleksnem mediju (Oxford in sod., 1940, cit. po Dürre in Bahl, 1996) in v povezavi s sporulacijo (Long in sod., 1984a, b, cit. po Dürre in Bahl, 1996), čeprav ta ni predpogoj. Solventogeneza pri bakteriji C. acetobutylicum in bakteriji C. beijerinckii je karakterizirana z zmanj�anjem aktivnosti nekaterih acidogenskih encimov (Andersch in sod.., 1983; Hartmanis in Gatenbeck, 1984, cit. po Dürre in Bahl, 1996) istočasno pa se inducirajo ali derepresirajo encimi, potrebni za solventogenezo (Andersch in sod., 1983; Dürre in sod., 1987; Hartmanis in Gatenbeck, 1984; Yan in sod., 1988, cit. po Dürre in Bahl, 1996). 3.4 IZBOLJ�AVA SEVOV

Poleg proučevanja fiziologije mikroorganizmov in mehanizmov, ki regulirajo delovanje ključnih encimov različnih metabolnih poti pri zagotavljanju kultivacijskih pogojev, je veliko zanimanja namenjenega tudi odstranitvi nekaterih limitnih faktorjev pri bakteriji C. acetobutylicum.

Izbolj�ave mikroorganizmov naj bi vključevale: povečano rezistenco na butanol in temperaturo, pridobivanje točno določenih produktov (npr. brez acetonov) in mo�nost izkori�čanja več substratov (npr. celuloza). Limitni faktor pri doseganju maksimalne količine topila (aceton, butanol, etanol) v fermentacijski brozgi je toksičnost butanola. Splo�no je znano, da je celična membrana ena izmed tarč alkoholnega delovanja (Ingram, 1986, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Ker alkoholi zaradi amfipatičnega značaja topijo membranske lipide, na ta način zvi�ajo njihovo permeabilnost (Dombeck in Ingram, 1984, cit. po Dürre in Bahl, 1996) in prizadenejo fluidnost membrane (Vollherbst-Schneck in sod., 1984, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Na ta način visoke koncentracije butanola vodijo do popolnega poru�enja pH gradienta, zni�ujejo intracelularni nivo ATP, povzročajo sprostitev intracelularnih metabolitev in inhibirajo izkori�čanje sladkorjev (Moreira in sod., 1981; Gottwald in Gottschalk, 1985; Bowels in Ellevson, 1985; Hutkins in Kashket, 1986, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Ti efekti jasno poka�ejo pomen odpornosti celične membrane na butanol,


vendar bi bilo zelo te�ko izolirati seve bakterije C. acetobutylicum z bistveno vi�jo toleranco na butanol ravno zaradi teh kompleksnih posledic.

Mo�nost uporabe genetike in tehnik rekombinantne DNA za izbolj�avo sevov se je močno povečala. Na razpolago je velika različica vektorjev vnosa, bodisi z bakterijo E. coli ali B. subtilis kot alternativnim gostiteljem (Azeddoug in sod., 1992; Lee in sod., 1992; Minton in sod., 1993; Strätz in sod., 1994; Truffaut in sod., 1989; Yoon in sod., 1991; Yoshino in sod., 1990, cit. po Dürre in Bahl, 1996), transformacija in elektroporacija (Lin in Blaschek, 1984; Mermelstein in sod., 1992; Oultram in sod., 1988a; Reid in sod., 1983; Reysset in sod., 1988; Reysset in Sebalt, 1993, cit. po Dürre in Bahl, 1996) in tudi premestitev DNA s konjugacijo (Oultram in Young, 1985; Oultram in sod., 1987, 1998b; Reysset in Sebalt, 1985; Wilkinson in Young, 1994; Williams in sod., 1990; Young, 1993; Yu in Pearce, 1986, cit. po Dürre in Bahl, 1996) in izolacija filamentnih fagov, ki je privedla do konstrukcije fagemida (Kim in Blaschek, 1991, 1993, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Zelo pomembno je odkritje, da mora biti DNA pred transformacijo v C. acetobutylicum metilirana, da bi se izognili restrikciji (Merlmeistein in Papoutsakis, 1993, cit. po Dürre in Bahl, 1996).

Nedavno je bil skonstruiran umetni operon (ace operon), ki pripomore k povečani sposobnosti proizvodnje acetona pri bakteriji C. acetobutylicum. Genska manipulacija za spreminjanje sposobnosti tvorbe produktov je torej na dosego in lahko pripelje do ponovne uvedbe tega bioprocesa na industrijsko lestvico.

Elektroporacija je fenomen, pri katerem postane membrana celice, izpostavljene električnim sunkom visoke poljske jakosti za kratek čas (milisekunde) nestabilna in zato močno prepustna za molekule njenega okolja. Če se celice v času destabilizacije njihovih membran stikajo, lahko pride do njihovega zlitja, čemur pravimo elektrofuzija. Obstaja tudi mo�nost zdru�evanja posameznih izoliranih celic z določenimi tkivi in vitro kot tudi in vivo. To je fizična metoda, ki ima prednost pred drugimi metodami, saj je neinvazivna, ni kemijska, ni posebno toksična in ne spremeni biolo�ke strukture in funkcije tarčnih celic (Gasparič in Komel, 1996).

Transformacija je proces, pri katerem celica sprejme in izrazi eksogeno DNA. Proces ima več stopenj: predkompetenca (notranja/zunanja kontrola spro�i začetek procesov); indukcija kompetence (izra�ati se začno geni za kompetenco); vezava DNA na membranske proteine; sprejem DNA v celico; rekombinacija (vključevanje transformirane DNA v genom recipientske celice z rekombinacijo). Umetna transformacija zahteva različne kemične, fizične in encimske obdelave (z ustrezno koncentracijo soli, protoplastiranje celic in polietilenglikol (PEG), elektroporacija, streljanje DNA na ustreznem nosilcu v celice, mikroinjekcija �)(Gasparič in Komel, 1996).

Konjugacija je biolo�ki proces, pri katerem pride do prehoda genske informacije iz donorske v recipientsko celico, če sta celici v neposrednem kontaktu. Osnovni model je model kotalečega se kroga pri prehodu plazmida F iz donorske v recipientsko celico. Ena od sklenjenih verig plazmida F se odpre in s 5'-koncem potuje po konjugacijskem mostičku v drugo celico. Obenem poteče sinteze komplementarnih verig v donorski in recipientski celici. Plazmid F se integrira v bakterijski kromosom in v recipientsko celico mobilizira dele DNA donorske celice(Gasparič in Komel, 1996).

Poznamo dva tipa transpozicije: konzervativna (transpozicijski element se izre�e iz prvotnega in se vrine na novo mesto) in replikativna (element se ob prenosu podvoji). Transpozicijski elementi mutirajo in preurejajo genome svojih gostiteljev, »pobirajo« gene, prej nemobilne in same po sebi v nobenem sorodstvu s transpozicijskimi elementi, in se stabilno vključujejo v genom (Gasparič in Komel, 1996).


4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA 4.1 IZKORI�ČANJE SUBSTRATOV

Proces pridobivanja substratov poteka v 2 ali 3 fazah: 1. razgradnja polimerov z izločenimi encimi, 2. izkori�čanje razgradnih produktov in drugih nizkomolekularnih substratov 3. intracelularni metabolizem ogljikovih hidratov. 4.1.1 RAZGRADNJA POLIMEROV

Le malo podatkov imamo na razpolago o ekstracelularnih encimih, ki sodelujejo pri razgradnji �kroba, čeprav je bil ta polimer prvi uporabljen kot industrijski subtrat pri obravnavanemu bioprocesu.

Med rastjo bakterije C. acetobutylicum na �krobu se producirata α-amilaza in glukoamilaza (Hockenhull in Herbert, 1945; French in Knapp, 1950; Scott in Hedrick, 1952; Ensley in sod., 1975, cit. po Dürre in Bahl, 1996), prvotno znani kot maltazi. Sinteza teh encimov je podvr�ena represiji z glukozo in indukciji s �krobom ali njegovimi produkti razgradnje (Hockenhull in Herbert, 1945; Chojecki in Blaschek, 1986, cit. po Dürre in Bahl, 1996).

Nedavno je bila oči�čena in karakterizirana α-amilaza iz bakterije C. acetobutilycum ATTC 824 (Paquet in sod., 1991, cit. po Dürre in Bahl, 1996) z molekulsko maso 84 kDa, izoelektrično točko 4,7 in optimalnim pH 5,6 ter občutljivostjo na temperaturno inaktivacijo.

Večjo aktivnost so zaznali pri visokomolekularnih substratih v primerjavi z nizkomolekularnimi maltooligosahardi; glikogen in polulan se hidrolizirata počasi, medtem ko dekstrani in ciklodekstrini ostajajo intaktni.

Zanimivo je spoznanje, da ima produkt amilaznega gena bakterije C. acetobutylicum, ki ga je kloniral Verhasselt s sod. (1989, cit. po Dürre in Bahl, 1996) molekularno maso samo 53,9 kDa in da ta gen ni identičen skraj�anemu čitalnemu okvirju z značilno podobnostjo α-amilaznega gena Bacillus subtilis, ki sta ga identificirala Gerischer in Dürre (1990, cit. po Dürre in Bahl, 1996); torej obstaja verjetnost, da bakterija C. acetobutylicum producira različne amilaze za izkori�čanje �kroba.

Ksilan lahko slu�i kot izvor ogljika za bakterijo C. acetobutylicum (Lee in sod:, 1985a; Lemmel in sod., 1986, cit. po Dürre in Bahl, 1996); rast je počasna in ksilan macesnovega lesa se le delno hidrolizira.

Oči�čene in karakterizirane so bile dve endoksilanazi in β-D-ksilozidaza bakterije C. acetobutylicum (Lee in sod., 1985a, 1987, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Najmanj�i oligosaharidi, ki jih degradirajo ksilanaze A in B so ksiloheksaoze in ksilotetraoze; ksilanaza A tudi pospe�uje karboksimetil celulazno aktivnost.

Bakterija C. acetobutylicum ne raste na celulozi, čeprav so detektirali dve aktivnosti celulaznega kompleksa v določenih sevih tega mikroorganizma (Allcock in Woods, 1981, cit. po Dürre in Bahl, 1996).

Lee in sod. pa so dokazali, da dva, izmed 21 testiranih sevov, producirata ekstracelularne endo- 1,4-β-glukanaze in celobiaze (β-D-glukozidaze med rastjo na celobiozi).


4.1.2 IZKORI�ČANJE MONO- IN DISAHARIDOV

O transportu substrata v C. acetobutylicum je malo znanega; fosfotransferazni sistem (PTS) naj bi bil odgovoren za izkori�čanje glukoze in fruktoze (von Hugo in Gottschalk, 1974; Hutkins in Kashket, 1986, cit. po Dürre in Bahl, 1996); glukoza + P-HPr encim II glukoza-6-fosfat + HPr fruktoza + P-HPr encim II fruktoza-1-fosfat + HPr P-HPr je fosforiliran protein, generiran iz HPr s PEP kot virom energijsko bogatega fosfata: PEP + HPr encim I P-HPr + piruvat P-HPr je ATP, HPr je ADP in PEP je fosfoenolpiruvat. Encim II je heksoza fosforilaza, encim I pa piruvat kinaza.

Nedavno je bila podana podrobna biokemijska �tudija glukoza fosfotransferaznega sistema bakterije C. acetobutylicum (Mitchell in sod., 1991, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Ugotovljena je prisotnost �tirih komponent sistema, encima I, HPr, encima IIAglu in encima IIglu. Fosfotransferazni sistem bakterije C. acetobutylicum ka�e torej isto osnovo kot pri ostalih bakterijah.

Ostali substrati bakterije C. acetobutylicum se tako lahko prena�ajo s PTS (Mitchell, 1992, cit. po Dürre in Bahl, 1996), z ABC transportnimi sistemi (Higgins, 1992, cit. po Dürre in Bahl, 1996), ali z mehanizmi simporta s transmembranskim protonskim gradientom.

Disaharide, kot sta saharoza in maltoza, je potem mo�no razcepiti s primernimi fosforilazami, npr., maltoza + fosfat maltoze fosforilaza glukoza + glukoza-1-fosfat prosta glukoza pa se lahko konvertira v glukoza-6-fosfat s heksokinazo. Pri bakteriji C. acetobutylicum poteka razgradnja heksoz po naslednji shemi:

Heksoze butanol + acetat- + aceton + etanol + H2 + CO2.

4.2 INTRACELULARNI METABOLIZEM SLADKORJEV DO PIRUVATA

V splo�nem se v klostridijih odvija glikoliza pri razgradnji heksoze fosfatov (Thauer in sod:, 1977; Gottschalk, 1993, cit. po Dürre in Bahl, 1996); kar velja tudi za bakterijo C. acetobutylicum. Ustrezna shema je prikazana na sliki 4; sladkorne kisline, kot je glukonat, se razgradijo s pomočjo modificirane Entner-Doudoroffove poti (Endreesen in Gottschalk, 1969, cit. po Dürre in Bahl, 1996): D-glukonat se dehidrira v 2-keto-3-deoksi glukonat, ki se zatem fosforilira in razcepi v piruvat in 3-fosfogliceraldehid (slika 3).

Pentoze se konvertirajo v riboza-5-fosfate in ksiluloza-5-fosfate, ki se vključijo v pentoza fosfatni ciklus; produkti heksoznih fosfatov so naprej katabolizirjo v glikolizi.


Slika 3. Bakterijska razgradnja glukonata po Entner � Doudoroffovi poti (bakterije rodu Clostridium) (Dürre in Bahl, 1996). (1) glukonat dehidrataza; (2) 2-keto-3-deoksiglukonat kinaza; (3) 2-keto-3-deoksi-6-fosfoglukonat aldolaza. 4.3 SINTEZA PRODUKTOV

Laktat je glavni fermentacijski produkt bakterije C. acetobutylicum, ki nastane z redukcijo piruvata pod vplivom delovanja laktat dehidrogenaze (Ldh) in se nato lahko porabi, če pH dose�e vrednost pod 4,5 in če koncentracija �eleza ni več limitni faktor rasti.

Produkti fermentacije so tudi acetat in etanol, butirat in butanol ter za nas najpomembnej�i aceton, ki je osnova za nadaljnjo sintezo izopropanola. Nekateri sevi v določenih alkohol dehidrogenaznih reakcijah uporabijo NADP+/NADPH+H+ kot koencim namesto NAD+/NADH+H+, kar je prikazano na sliki.

Za prehod iz acidogeneze v solventogenezo (tvorbo topil) morajo biti zagotovljeni določeni pogoji: nizek pH, dostop do substratov, dose�en koncentracijski prag acetata in ustrezne limitni dejavniki rasti kot so fosfati ali sulfati (Bahl in Gottschalk, 1984, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Pri sevu NCIMB 8052, ki sodi v skupino C. beijerinckii, se začne sinteza acetona pri nevtralnem pH z dodano visoko koncentracijo acetata (HOLD in sod., 1984, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Preden se solventogeneza začne, se sintetizirajo novi encimi. Produkcijo acetona katalizira acetoacetil-CoA: acetat koencim A transferaza (CoA transferaza ali Ctf) in acetoacetat dekarboksilaza. Pretvorbo acetona v izopropanol pa nato v sevu C. beijerinckii katalizira primarna/sekundarna alkohol dehidrogenaza.


Slika 4. Tok ogljika (debelej�e pu�čice) in elektronov (tanj�e pu�čice) med fermentacijo heksoz pri bakterijah vrst C. acetobutylicum in C. beijerinckii (Dürre in Bahl, 1996). Encimi, ki v tem procesu sodelujejo, so označeni sledeče: (1) gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza; (2) laktat dehidrogenaza; (3) piruvat: ferodoksin oksidoreduktaza; (4) hidrogenaza; (5) NADH: ferodoksin oksidoreduktaza; (6) acetaldehid dehidrogenaza; (7) etanol dehidrogenaza; (8) izopropanol dehidrogenaza. 5. BIOIN�ENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA

Tradicionalni industrijski bioproces proizvodnje acetona in butanola je bil v uporabi dolga leta, več kot 40 let, vendar je bil vedno pogojen z ekonomskimi faktorji. Največji vpliv so bile spreminjajoče cene izhodnih substratov, ki so se zato skozi leta tudi spreminjali.

Cena substratov je bila 60% dobička produktov (Ross, 1961, cit. po Dürre in Bahl, 1996). S teoretičnim izračunom (uporabili so mikroorganizem C. acetobutylicum), so ugotovili da je maksimum pridobljenih produktov (alkohola, butanola, etanola) samo 0,38g iz 1g glukoze, torej je bil izkoristek relativno majhen. Vendar je bil to le teoretični izkoristek, v praksi je bil proizvod �e manj�i, �e posebej če so uporabljali melaso. Poleg tega ima bakterija C. acetobutylicum zelo majhno toleranco na prisoten butanol. Največjo koncentracijjo, ki jo prenese je 20 kg/m3, nato je rast teh organizmov zavirana. Tudi nadaljnja separacija (ponavadi destilacija) je bila draga. Gorivo za paro je bilo 15-20% vsega dobička od produkta in glede na majhno koncentracijo le tega, je bilo odpadne snovi zelo veliko, česar posledica je bil problem odlaganja smeti.


Po naftni krizi (1973/74) pa je cena olja narasla in tako se je zopet pojavilo zanimanje za ta bioproces, za produkcijo goriva ter kemikalij iz biomase, biotehnolo�ko pridobivanje acetona, butanola in izopropanola. Pri iskanju novega izbolj�anega procesa so bili pomembni trije faktorji: − končna koncentracija produktov (g raztopine/ L); − izkoristek ali donos (kg / kg sladkorja) in − produktivnost (g / Lh). Slika 5. Vplivi na biotehnolo�ki postopek (Raspor, 1996). 5.1 PRIPRAVLJALNI POSTOPKI 5.1.1 IZBOR IN PRIPRAVA SUBSTRATOV

Delovnim organizmom moramo dati prave mno�ine pravih snovi ob pravem času, da dobijo iz njih energijo za svoje delovanje, gradnike lastnih snovi ter produktov takrat, ko jih rabijo. Sestava mikroorganizma in produkta nam data prvi nasvet, katere snovi moramo dati v postopek; več pa nam pove poznavanje metabolnih in sinteznih poti, odločilna pa sta tehnolo�ki preizkus in ekonomika postopka.

Vire hranilnih snovi delimo v kemijsko definirane (poznamo njihovo kemijsko zgradbo; primeri: deionizirana glukoza ali saharoza, vitamini in zelo čiste soli) in kompleksne (poznamo le identičnost in vsebnost le nekaterih spojin, ki sestavljajo kompleksno snov; primeri: kuruzna moka, sojine tropine, melasa). Na uporabnost snovi v industriji močno vpliva njihova dostopnost v velikih količinah, stalnost kakovosti in sestave, nujnost njihove predhodne obdelave, dostopnost naprav in stro�ki za to in njihova uporabnost za druge, nujnej�e in bolj donosne namene.

Vire hranilnih snovi delimo tudi na konvencionalne (tiste, ki so v določenem času običajni) in na nekonvencionalne (tiste, ki niso običajni) (Perdih, 1996). 5.1.1.1. OBIČAJNI (KONVENCIONALNI) SUBSTRATI

Za rast C. acetobutylicum se uporabljajo različni mono- in disaharide ter sorodne komponente (celobioza, D-manoza, D-galaktoza, D-glukonat, D-galakturonat, D-glukozamin, D-riboza, D-ksiloza, L-arabinoza, L-ramnoza in glicerol), polisaharide, kot so �krob in ksilan, pa lahko fermentiramo. Te substrate pa pridobivamo na različne načine: 1. razgradnja polimerov z izločenimi encimi,

Spremljanje in vodenje bioprocesov

Zaključni postopki

Bioreaktorsko in�enirstvo

Biokulture Pripravljalni procesi v biotehnologiji

Spreminjanje in karakterizacija biokultur


2. izkori�čanje razgradnih produktov ter drugih nizkomolekularnih substratov in 3. intracelularni metabolizem ogljikovih hidratov.

Tradicionalna surova materiala za biolo�ko pridobivanje acetona in izopropanola sta �krob in

melasa.

5.1.1.2 ALTERNATIVNI (NEKONVENCIONALNI) SUBSTRATI

Potencialni substrati so tudi drugi fermentativni sladkorji, iz drugih virov, tudi iz odpadkov. Primer alternativnega substrata je jabolčna ka�a, ki vsebuje fruktozo, glukozo in saharozo kot fermentativnime sladkorje (Voget in sod., 1985, cit. po Dürre in Bahl, 1996); sirotka, ki vsebuje laktozo (Maddox in sod., 1994, cit. po Dürre in Bahl, 1996); jeruzalemske artičoke, ki vsebujejo fruktan (Marchal in sod., 1985, cit. po Dürre in Bahl, 1996) in lignoceluloza, ki vsebuje ksilane in celulozo (Maddox in Murray,1983; Yu in Saddler, 1983; Yu in sod., 1985; Fond in sod., 1983, cit. po Dürre in Bahl, 1996).

Sirotka je zelo primeren alternativni substrat za to fermentacijo. Nastaja kot stranski produkt pri proizvodnji sirov, kazeina in predstavlja velik problem kot odpadni material, saj se v mlekarnah ne uporablja dalje (na primer za proizvodnjo laktoze). Sirotka vsebuje 4-5% laktoze in bakterija C. acetobutylicum je sposobna laktozo fermentirati direktno. Odvisno od vrste mikroorganizma so v proces vključeni encimi β-galaktozidaze in/ali fosfo-β-galaktozidaze (Yu in sod., 1987; Hancock in sod., 1991, cit. po Dürre in Bahl, 1996). Količina substrata, ki ga bakterije lahko uporabijo, je omejena z nastankom butanola, ki je inhibitor delovanja teh mikroorganizmov. Pomembno je tudi razmerje med produktoma, ki nastajata v tej fermentaciji istočasno, acetonom in butanolom. Če je substrat �krob ali melasa, je razmerja 1:2, če pa uporabimo sirotko kot substrat, je razmerje manj ugodno za pridobivanje acetona, saj zna�a 1:10. To razmerje pa ni pomembno le za količino dobljenega določenega substrata, ampak tudi za ihibicijo (če nastaja več acetona in manj butanola, so bakterije sposobne fermentirati dalj časa).

Optimiziran proces pridobivanja acetona, izopropanola in butanola iz sirotke je opisal Maddox s sodelavci leta 1994 (cit. po Dürre in Bahl, 1996). Ta proces vključuje reaktor z lebdečim slojem, v katerem so imobilizirane celice. Za odstranjevanje produktov se uporablja pervaporacija.

Na Sliki 7 je narisan mo�en diagram optimiziranega procesa obravnavanega bioprocesa. 5.1.2 STERILIZACIJA SUBSTRATOV IN OPREME

Za sterilizacijo substratov uporabljamo mokro toplotno sterilizacijo, tak�na kontinuirna sterilizacija poteka v namensko izdelanih kontinuirnih sterilizatorjih. Napajalni medij hitro segrejemo na temperaturo 140-145oC, ga zadr�ujemo na tej temperaturi 2-3 minute in ga nazadnje ohladimo na temperaturo fermentacije. Osnovna razlika med kontinuirno in �ar�no sterilizacijo je uporaba vi�je temperature in kraj�i zadr�evalni čas pri kontiniurnem postopku. Prednost tega postopka je enostavnej�a avtomatska kontrola temperature, manj�a poraba pare in kraj�i zadr�evalni časi, posledica tega pa je manj�a razgradnja substratov s sterilizacijo, vi�ja produkcija metabolitov in kraj�e trajanje vseh sterilizacijskih ciklov.

V praksi sta poznani dve osnovni izvedbi kontinuirnega sterilizatorja, ki se razlikujeta v načinu kontaktiranja pare in medija, ki se sterilizira. Izvedba s plo�čnim toplotnim menjalnikom (paralelno nanizane plo�če ali spiralno zavita plo�ča) preprečuje neposredni kontakt medija in pare, kar pa omogoča izvedba z injektorjem.

�ar�na sterilizacija bioreaktorjev z goji�čem običajno poteka s pomočjo kombiniranega segrevanja z vodno paro preko povr�in za toplotni prenos ali direktnega uvajanja vodne pare v sam


medij (Rade�, 1996). Sterilizacija bioreaktorjev običajno poteka z uporabo t.i. CIP-sistema či�čenja. To so posebne �obe povezane z mediji za či�čenje in porazdeljene na najbolj kritična mesta bioreaktorja, kjer zagotavljajo bistveno bolj�e in avtomatizirano či�čenje.

Kot kritične faze navajajo: sterilno izvajanje inokulacije (dodajanj med procesom), tesnenje bioreaktorja in vseh priključkov, vstop in izstop zraka in plinov iz fermentatorja, tesnenje osi pri me�alih, vzorčenje in druge. Osnovni energetski medij pri kontinuirni in �ar�ni sterilizaciji ostaja nasičena vodna para, čeprav delajo vedno več raziskav na področju iskanja novih načinov sterilizacije (npr. mikrovalovi) in proučevanja njihove uporabnosti v kontinuirnih sistemih.

5.1.3 IZBOR, PRIPRAVA IN SHRANJEVANJE BIOKULTUR

Načini oz. tehnike izbora novih industrijskih biokultur so različni, saj so prilagojeni vrsti organizma in iskani aktivnosti. Osnovna strategija selekcijskih programov vsebuje nekaj kjučnih faz, ki so skupne vsem postopkom izbora: 1. definicija �eljene aktivnosti biokulture oz. njenega proizvoda; 2. pregled obstoječih informacij o biokulturah z �eleno aktivnostjo; 3. iskanje virov �elene biokulture; 4. direktna izolacija ali razvoj obogatitvane tehnike oz. selekcijskih parametrov na izolacijo

biokulture; 5. razvoj metodologije in kriterijev za nadaljni selekcijski postopek.

Načini oz. tehnike identifikacije so specifične za posamezne vrste biokultur (klasična identifikacija temelji na testiranju fenotipskih značilnosti, ki so odvisne od ekspresije genov in zato podvr�ene določeni stopnji variabilnosti; vedno bolj pa se uveljavljajo molekularno biolo�ke tipizacije industrijskih biokutur).

Priprava biokultur vključuje postopke, s katerimi trajno ali začasno shranjeno biokulturo privedemo v stanje, v katerem je direktno uporabna za inokulacijo (nacepitev).

1. REVITALIZACIJA (reaktivacija): zagotoviti �elimo čim bolj�o pre�ivelost in fenotipsko/genotipsko identično kopijo biokulture, ki je bila shranjena (liofilizirana ali globoko zmrznjena). Revitalizacijo običajno omogoči rehidracija (dodatek tekočega goji�ča). Pri bakteriji C. acetobutylicum se za revitalizacijo uporablja temperaturni �ok (90s v vreli vodi) za aktivacijo močno termorezistentnih spor pred nacepitvijo tekočega goji�ča.

2. PRIPRAVA INOKULUMA (vcepka): postopek je večstopenjski. Proizvesti moramo dovolj veliko količino biomase, ki je hkrati tudi v optimalnem fiziolo�kem stanju, da razvije maksimalno produktivnost med samim bioprocesom. Za začetno laboratorijsko izolacijo biokulture uporablajmo običajno čvrsta goji�ča, za nadaljnja stopenjska namno�evanja pa tekoče goji�če. Priprava poteka v več manj�ih bioreaktorjih preden kulturo cepimo v proizvodni bioreaktor.

Volumen inokuluma običajno predstavlja 10% volumna substrata. Bolj kot volumen pa so pomembni: količina biomase, fiziolo�ko stanje in aktivnost biomase in morfolo�ko stanje biomase. Za razvoj biokulture so pomembni tudi kemijski in fizikalni parametri (lahko so enaki kot v proizvodni fazi, pogosteje pa so prilagojeni zahtevam biokulture v posameznih fazah priprave inokuluma) (Mo�ina � Smole, 1996). Pri obravnavanem bioprocesu se uporablja inokulum, ki po volumnu predstavlja le eno desettisočino bioreaktorja (Lurie, 1975 cit. po Stanbury in Whitaker, 1984).

Metode ohranjanja aktivne delovne biokulture ter začasnega in trajnega shranjevanja industrijskih biokultur morajo zagotoviti: �ivost biokulture, čistost (preprečiti kontaminacijo z drugimi mikroorganizmi), fenotipsko stabilnost (nespremenjeno morfolo�ko stanje in visoko encimsko aktivnost biokulture) in genotipsko stabilnost (nespremenjena količina, struktura in


organizacija kromosomske, plazmidne in mitohondrijske DNA) (Mo�ina � Smole, 1996). Sporulacija je pripravna metoda za hranjenje bakterije Clostridium acetobutylicum in ohranjanje njihove sposobnosti tvorjenja topil. Spore lahko hranimo v sterilni suhi zemlji ali pesku (Spivey, 1978, cit. po Dürre in Bahl, 1996), liofilizirane (Lapage in sod., 1970, cit. po Dürre in Bahl, 1996) ali v mlečnem mediju (Bahl in sod., 1982a, cit. po Dürre in Bahl, 1996).

Slika 6. Splo�na shema izbora novih industrijskih biokultur (Mo�ina - Smole, 1996). 5.1.4 IMOBILIZACIJA CELIC

Nizka produktivnost in nizka končna koncentracija produktov sta največji problem. Razvoj v tej smeri je zelo pomemben za proces fermentacije in njeno nadaljnjo uporabo.

Celična stabilizacija je metoda za omejitev biokatalizatorjev znotraj sistema bioprocesa. Z natančnimi razmerami vodimo v ustreznem nosilcu določeno encimsko aktivnost in s tem, ko uspemo ujeti biokulturo na določeno mesto v/na nosilcu ter obdr�ati �ivljenjsko in katalitično učinkovitost celic skozi dalj�e obdobje, smo zadostili osnovnim zahtevam imobilizacije (Raspor, 1983).

Postopki imobilizacije so: flokulacija, agragacija, precipitacija, polimerizacija in polikondenzacija. Z njimi se adsorbira kovalentno ali/in navzkri�no ve�e in omre�i biokulture. Biokultura se močno koncentrira na enoto volumna in s tem se dose�e na nosilcu primerna trdnost biokatalizatorja (Raspor, 1983).

Prednosti teh postopkov so stalna kontrola biokatalizatorja, izkori�čanje encimske aktivnosti biokatalizatorja in la�ja separacija celic od produktov.

Definicija �elene aktivnosti

Identifikacija znanih biokultur z �eleno aktivnostjo

Iskanje virov biokultur (izolacija iz okolja, zbirke biokultur)

Izolacija in identifikacija biokulture Razvoj obogatitvene tehnike

Razvoj kriterijev in postopkov izbora

Primarni izbor

Optimizacija proizvodnega postopka, razvoj izdelka

Mutacija, genska manipulacija

Prenos v industrijsko merilo

Proizvodnja Patent Nadaljnje raziskave in razvoj


Imobilizacijo bakterije C. acetobutylicum izvajajo s kalcijevim alginatom, ki ujame celice in jih s tem fiksira, poleg tega pa tudi z adsorbcijo celic na povr�ino. Celice so uspe�no z intervalnim doziranjem hranil adsorbirali na bukov les. Vendar je bila koncentracija končne raztopine �e zmeraj nizka, zato so uporabili sev C. acetobutylicum P 262, nesporogeno bakterijo, s katero so dosegli 5x večjo koncentracijo pri podobni koncentraciji (Largier in sod., 1985).

Na splo�no se je ohranila velika produktivnost (2,4-2,8 g/Lh), čeprav je izkori�čanje substratov in koncentracija produktov majhna (1,5-4,5 g/L). Drugi problem je aktivnost bakterije C. acetobutylicum v ne-rastnem mediju, kar pa so malo omejili z dodajanjem hranil. 5.2 POTEK BIOPROCESA 5.2.1 ZAPRTI BIOPROCES

To je najenostavnej�i primer nestacionarnega procesa. Vtoka in iztoka glavne mase tekočine ni. Po začetku bioprocesa ničesar ne dodajamo in ne odvzemamo (volumen ostane konstanten). Nestacionarnost pogojev in s tem spreminjanje okolja med bioprocesom je slaba stran tega procesa, poleg tega pa je zaradi faz postopka, ko so či�čenje, polnjenje, sterilizacija in praznenje, produktivnost slab�a kot v primerih, ki sledijo. Zaradi časovno zmanj�ane mo�nosti kontaminacije in manj�e verjetnosti mutacij pa ima ta način gojenja v primerjavi z odprtim bioprocesom določene prednosti (Pavko, 1996).

Slika 7. Shema odprtega bioprocesa, v katerem nastajata aceton in izopropanol, z reciklom biomase in integrirnim odvajanjem produktov (Dürre in Bahl, 1996).


5.2.2 ODPRTI BIOPROCES

V tem primeru imamo konstanten pretok medija skozi bioreaktor. Prednost pred zaprtim bioprocesom je v tem, da imajo zaradi konstantnega okolja mikroorganizmi bolj�e pogoje za razvoj, operater pa za vodenje in regulacijo. Tudi produktivnost je večja, vendar pa je večja mo�nost kontaminacije in mutacij. Ta način ni primeren za proizvodno sekundarnih metabolitov. Lahko ga dopolnimo tudi z reciklom biomase (Pavko, 1996).

Odprti bioproces ima prednost pred tradicionalnim zaprtim zaradi večje produktivnosti. Čas polnjenja, sterilizacije, hlajenja in či�čenja opreme se zmanj�a, ker je potrebna le ena serija inokuliranja mikroorganizmov za dolg proces. Čas bioprocesa pa zmanj�amo tudi tako, da eliminiramo prvo kislinsko fazo (acidogenezo), ki zavira rast mikroorganizmov. Prav tako s lahko zmanj�amo tudi volumen posode, na da bi se zmanj�ala koncentracija produkta.

Čeprav je imel odprti proces večje prednosti pa se ni uporabljal pogosto. Produktivnost je res bila 3x večja vendar je začetna koncentracija substratov in tako končni izkoristek manj�i, pa �e kisline, ki so nastajale v prvi kislinski fazi se niso kovertirale v topila. Ekonomski faktorji pa so zahtevali večji izkoristek, vsaj tako velik kot pri večkratni fermentaciji, in večjo produktivnost. 5.2.3 VPLIVI NA BIOPROCES

Noben posamezen faktor (acidogeneza, vpliv temperature, pH vrednosti, hitrost razredčevanja (D), maksimalna mo�na koncentracija raztopine in produktov ter stabilnost kontinuirnih kultur) ne more vplivat na produkcijo in s tem na končno koncentracijo produktov. Pomembna je interakcija med vsemi; pokazalo se je, da so nekatera hranila bolj primerna. Če uporabimo kot sestavine substrata glukozo, du�ik ali magnezij, imamo majhen izkoristek. Nasprotno dobimo velik izkoristek, če uporabimo kot sestavino substrata fosfate ali sulfate. Tudi butirat in acetat kot sestavini substrata pri bioprocesu povečata produkcijo, zato je dobro, da so v kontinuirnem procesu prisotne kisline, saj omogočijo povečano produkcijo topil (aceton, butanol, izopropanol).

pH vrednost ima zelo velik vpliv na obravnavani bioproces. Optimalna vrednost variira, odvisno od seva C. acetobutylicum, vendar nikoli ne prese�e vrednosti 5. Tudi temperatura ima določeno vrednost 33-37°C, vendar ima manj�i vpliv kot D (hitrost razredčevanja). Večje razredčevanje substrata ima za posledico večjo produktivnost, vendar je to na račun slab�ega izkoristka substrata in manj�e koncentracije produktov. Vendar pa to ne velja pri dvo stopenjskem procesu z limitnim faktorjem fosfatom (Bahl in sod., 1982b, cit. po Dürre in Bahl, 1996), kjer lahko pogoje v različnih fazah spremenimo glede na rast ali pa nastajanje raztopine. V prvi fazi celice rastejo pod pogoji, ki povzročijo začetek formacije produktov, v drugi fazi pa se predvsem �e ostali sladkorji pretvarjajo v produkte, rasti ni več.

Sedaj so v uporabi integrirani bioreaktorji, kjer odvajamo produkte, ki povzročajo inhibicijo biomase. Tu sočasno potekajo: biosinteza, separacija in či�čenje produktov. To imenujemo tudi in situ separacija produktov iz bioprocesne brozge. Mo�ne so kombinacije odprtih in zaprtih bioreaktorjev. Prednost integriranega kontinuirnega / odprtega bioreaktorja je v tem, da omogoča enakomerno in stalno kvaliteto produkta, manj�e vnose moči in s tem manj�o porabo energije, enostavnej�o kontrolo bioprocesa in bolj�i izkoristek kontaktne povr�ine za snovni prenos, kar vpliva na večjo ekonomičnost procesa (Rački in Berovič, 1996).


5.3 ZAKLJUČNI POSTOPKI 5.3.1 RECIKEL BIOMASE

Recikel biomase je alternativa za porast produktivnosti s ponovno uporabo �e izrabljenega

substrata v odprtem sistemu. V tem primeru lahko obratujemo pri vi�jih hitrostih razredčevanja (D) ne da bi pri tem padla končna koncentracija in tudi produktivnost bakterije C. acetobutylicum se poveča (Afschar in sod., 1985; Schlote in Gottschalk, 1986, cit po Dürre in Bahl, 1996). Z reciklom med odprtim načinom gojenja dose�emo večjo stabilnost sistema. 5.3.2 IZOLACIJSKI POSTOPKI

Ena izmed glavnih pomanjkljivosti pri uporabi destilacije kot izolacijskega postopka pri fermentativnem pridobivanju acetona in izopropanola je majhna količina topil kot produktov, česar posledica je drag postopek. Če bi bila vrsta C. acetobutylicum bolj tolerantna na vi�je koncentracije butanola, bi bil proces veliko bolj ekonomičen. Z razvojem kontinuirnega procesa se je postopek pocenil, vendar pa je visoka produktivnost procesa pogosto povezana s slab�o izrabo substratov in manj�o koncentracijo produktov. Te probleme bi lahko re�ili z recikliranjem izrabljenega substrata (uporabili bi ga �e enkrat in ga s tem bolje izkoristili), uporabi visoko aktivnih biokatalizatorjev, visoko koncentracijo biomase ter z učinkovitej�im in kontinuirnim odvajanjem produktov (tako bi se izognili inhibiciji, ki jo povzroča butanol).

Izolacijske tehnike, ki uporabljajo membrane (reverzno osmozne), pervaporacijo, adsorbente, ekstrakcijo tekoče-tekoče ali kemične metode, so učinkovitej�e. Natančnej�i pregled teh metod in njihove uporabe v prihodnosti je opisal Ennis in sod. (1986a, cit po Dürre in Bahl, 1996). Solventna ekstrakcija lahko poteka in situ v fermentacijski posodi ali pa zunaj bioreaktorja v posodi za recikel brozge (Linden in sod., 1986, cit po Dürre in Bahl, 1996). Ekstrakcijska sredstva ne smejo vplivati na celično rast in aktivnost. Kot tak�na sredstva se uporabljajo: koruzno olje, parafinsko olje, kerozen, dibutil ftalat (Wang in sod., 1979, cit po Dürre in Bahl, 1996) in oleil alkohol (cis-9-oktadecen-1-ol) (Taya in sod., 1985, cit po Dürre in Bahl, 1996). Kot adsorbent se uporabljata aktivno oglje in silikalit (Maddox, 1983, cit po Dürre in Bahl, 1996).

Rezultat uporabe pervaporacije v �ar�nih postopkih je povečanje izrabe glukoze, v kontinuirnih postopkih z uporabo imobiliziranih celic pa večja izraba glukoze in večja produktivnost (Groot in sod., 1984,a,b, cit po Dürre in Bahl, 1996).

Za separacijo produktov iz fermentacijske brozge je bila uporabljena tudi reverzna osmoza. Ugotovili so, da uporaba membranskih tehnologij re�i probleme z nizko produktivnostjo in zmanj�a koncentracijo butanola. Razvoj na področju membranskih tehnologij je eden izmed faktorjev, ki vplivajo na ceno fermentativnega pridobivanja acetona in izopropanola.

�e vedno pa je vpra�anje, katera izmed na�tetih metod bo res najbolj primerna za ta bioproces. Največje potenciale imata ekstrakcija tekoče-tekoče in pervaporacija (Groot in sod., 1992, cit po Dürre in Bahl, 1996). Metoda »gas stripping« pa ima največjo produktivnost (Maddox in sod., 1994, cit po Dürre in Bahl, 1996). PERVAPORACIJA je posebna tehnika razvita za izločanje nizkomolekularnih molekul. Prenos snovi pri tem vključuje mobilno fazo (npr. alkohol), sorpcijo na membrani, difuzijo skozi membrano in desorpcijo mobilne faze z membrane. Po desorpciji alkohol izpari skupaj z nosilnom plinom ali vakuumom, potem pa ga ponovno kondenzirajo. Na ta način je omogočen nemoten razvoj biomase in izolacija glavnih bioproduktov (Vasić-Rački in Berinovič, 1996).


Alkohol kondenzacija Voda Celice Proteini difuzija Sladkor Soli Slika 8. Princip pervaporacije (Vasić-Rački in Berinovič, 1996). EKSTRAKCIJA TEKOČE � TEKOČE je separacijski proces, ki bazira na različni porazdelitvi topljenca med dve tekoči fazi (Knez, 1996). vtok zmesi A + C ekstrakt B + C rafinatna faza ekstraktna faza topilo rafinat Slika 9. Shema procesa solventne ekstrakcije (Knez, 1996).

6. EKOLO�KI VIDIK BIOPROCESA

Clostridium acetobutylicum je anaerobna, saharolitična in proteolitična bakterija, ki je bila izolirana v mnogih okoljih. Čeprav drugi člani rodu proizvajajo nekatere od najbolj nevarnih nevrotoksinov, je Clostridium acetobutylicum označena kot benigni organizem (ni nevarna svojemu okolju). Kljub dolgoletni uporabi pri pridobivanju acetona in butanola, ni bilo nikoli nobenih poročil o učinkih na člove�ko zdravje ali na okolje. Bakterija ni patogena ali toksična za ljudi, �ivali ali rastline. Potencialna tveganja povezana z uporabo v fermentativnih tovarnah so majhna. Čeprav ta bakterija ni patogena, je sposobna sintetizirati bakteriocin pri koncu eksponentne rasti. Ta bakteriocin je inhibitor drugim sevom Clostridium acetobutylicum in tudi C. felsineum. Ta bakterija ve�e atmosferski du�ik, vendar nima velikega vpliva na okolje, saj večino časa pre�ivi v obliki spor in ne porablja du�ika. 6.1 VPLIV NA ČLOVEKA 6.1.1 VPLIV BAKTERIJ

Bakterija Clostridium acetobutylicum je del naravne mikroflore v člove�kem prebavnem traktu, ni pa prisotna v velikih količinah (McNeil in Kristiansen,1986; Jones in Woods,1986; Awang in sod., 1988, cit. po Final risk�, 1997). Razen tega, da so to bakterijo izolirali iz člove�kega blata, ni

C


povezana z ljudmi. V literaturi ni nobenih podatkov, da bi ta bakterija imela sposobnost tvorbe toksinov nevarnih za človeka ali encimov, ki bi bili povezani v z virulenco.

Teoretično je mo�no, da bi tudi pri bakteriji C. acetobutylicum pri�lo do konjugacije (prehoda genske informacije iz donorske v recipientsko celico, če sta celici v neposrednem kontaktu). Recipient bi bila v tem primeru bakterija vrste C. acetobutylicum, donor pa katerakoli bakterija rodu Clostridium, ki ima genski zapis za produkcijo toksinov. To je tudi največja nevarnost, ki jo ta bakterija predstavlja za človeka. Dokazano je �e bilo, da pride do konjugacije med sorodnimi vrstami bakterij C. baratii in C. butyricum klostridijskimi patogenci. Opisani so primeri botulizma pri otrocih, ki so ga povzročile bakterije vrst C. baratii in C. butyricum (McCroskey in sod.,1986; Aureli in sod.,1986; Hall in sod., 1985, cit. po Final risk�, 1997). Dokazano je bilo, da ti dve vrsti res proizvajata tip F in tip E nevrotoksine, ki so zelo podobni toksinom, ki jih producira patogenec C. butulinum. V literaturi zaenkrat �e ni nobenih dokazov, da C. acetobutilycum res lahko prevzame genetski material drugih bakterij. Kljub temu pa je bilo narejenih nekaj raziskav na področju genskega prenosa pri tej bakteriji.

Zelo malo verjetno pa je, da bi ti otroci oboleli za botulizmom zaradi uporabe C. acetobutylicum v industriji. Kot prvo, bi ta bakterija res morala prevzeti genetski material, da bi bila sposobna proizvajati botulinske toksine. Kot drugo, bi ta otrok priti v tovarno, kjer uporabljajo to vrsto bakterij za fermentacijo in bi tam moral zau�iti velike količine spor te bakterije, ki bi imele sposobnost razvoja vegetativnih celic v člove�kem prebavnem traktu. V praksi teh tovarn je, da ne spu�čajo otrok v proizvodne obrate. Zaradi vsega tega je skrb, da bi se otro�ki botulizem raz�iril zaradi industrijske uporabe teh mikroorganizmov, povsem odveč. (Edberg, 1991, cit. po Final risk�, 1997)

Če delavci v teh tovarnah uporabljajo za�čitne obleke in skrbijo za higieno, ne morejo zboleti za travmo povezano z botulizmom.

Ker je zelo neverjetno, da bi pri�lo do konjugacije pri bakteriji C. acetobutylicum, je vpliv na ljudi zelo majhen, kar pomeni, da ta vrsta bakterij človeku ne predstavlja nevarnosti (Final risk�, 1997).

6.1.2 VPLIV IZOPROPANOLA

Metabolizem izopropanola v člove�kem organizmu je podoben kot pri etanolu. Namesto ocetne kisline nastane pri večjem zau�itju izopropanola klinična slika kot pri zastrupitvi z acetonom. Slednji ima močnej�i anestetični učinek od etanola. Deluje lokalno dra�eče. Hitro se absorbira iz prebavil in dihal, absorbcija skozi ko�o je slaba. Pribli�no 20% se ga izdiha nespremenjenega, skozi ledvice se ga izloči do 30%, ostanek se metabolizira v jetrih.

Simptomi zastrupitve in njen potek: pare izopropanola delujejo pri vi�jih koncentracijah narkotično, mo�no je ote�eno dihanje, dra�enje oči in dihalnih poti. Stik s tekočino vodi do močnega dra�enja oči in razmastitve ko�e. Simptomi: dra�enje sluznice v očeh, nosu in �relu, ka�elj, glavobol, omotica, zaspanost, omamljenost, padec krvnega pritiska, nezavest in motnje pri dihanju do zastoja dihanja. Pri ponaljajoči inhalaciji in zelo visokih odmerkih lahko nastopijo simptomi kronične zastrupitve.

Terapevtski ukrepi: dekontaminacija (ponesrečenca prenesemo na sve� zrak). Po zau�itvi izpiramo ustno votlino, damo piti veliko vode, ne izzivamo bruhanja. Izpiramo �elodec, damo aktivno oglje in salinično odvajalo. Če pride izopropanol v stik z očmi obi�čemo okulista. Zau�itje velikih količin lahko povzroči paralizo dihalnih organov in tudi komo.


Preglednica 7. Toksikolo�ke vrednosti (Merck KGaA 100012, Merck KGaA 100992). Aceton Izopropanol LD 50 oralno 5800 mg/kg (podgane) 5045 mg/kg (podgane) LDLo oralno 3570 mg/kg (ljudje) 6.1.3 VPLIV ACETONA

Po vdihovanju par pride do pordečitve ko�e in omotice. Pri velikih količinah pa se pojavi glavobol, bruhanje, vrtenje in omedlevica. Ne pride pa do kome.

Pri stiku s ko�o nastane rahlo pordečenje ko�e na istem mestu in ko�a se izsu�i. Pri stiku z očmi pride do pordečitve, pri zau�itju pa se pojavi glavobol, bruhanje, driska, omedlevica, omotičnost, vrtenje in lahko tudi koma. Terapevtski učinki: po inhalaciji prenesemo ponesrečenca na sve� zrak, če je potrebno mu nudimo tudi umetno dihanje. Pri stiku s ko�o ali očmi izpiramo s hladno vodo, pri zau�itju pa damo ponesrečencu piti veliko vode. 6.2 VPLIV NA OKOLJE 6.2.1 VPLIV NA �IVALI 6.2.1.1 VPLIV BAKTERIJ

Bakterija C. acetobutylicum ni patogena za �ivali (McClug,1991; Hill, 1981, cit. po Final risk�, 1997). Ta bakterija ne proizvaja toksinov, encimov ali virulenčnih faktorjev, ki bi bili nevarni za sesalce (Edberg, 1991, cit. po Final risk�, 1997).

Bakterija bi bila navarna, če bi pridobila sposobnost produciranja toksinov, ki povzročajo botulizem. Ti toksini so toksični za mi�i in kure (fazane, purane, domačo koko�). (Gross in Smith, 1971; Cato in sod., 1986, cit. po Final risk�, 1997) 6.2.1.2 VPLIV ACETONA IN IZOPROPANOLA

Metabolizem izopropanola v organizmih sesalcev je enak kot pri metabolizmu v člove�kem telesu. Pri zajcih se pojavi rahla pordečitev ko�e, če pride ko�a v stik z izopropanolom ali acetonom. Izopropanol ni kancerogen za �ivali in tudi ne teratogen. Tudi nima vpliva na reprodukcijo.

Izopropanol je toksičen za ribe in plankton. Preglednica 8. Toksikolo�ki podatki za izopropanol (Merck KGaA 100012, Priročnik o �, 1998). Podgana Ribe Kunec LD 50 dermalno [mg/kg] Praktično nestrupeno 12800 LD 50 oralno [mg/kg] 5045 LC 50 inhalacija 46,5 [mg/l/4h] 9640 [mg/l/96h] Stik s ko�o ne dra�i Stik z očmi dra�i


Tabela 9. Toksikolo�ki podatki za aceton (Merck KGaA 100992, Priročnik o �, 1998). Podgana Ribe Kunec LD 50 oralno [mg/kg] 5800 LD 50 dermalno [mg/kg] 20000 LC 50 inhalacija 76 [mg/l/4h] 8300 [mg/l/96h] Stik s ko�o dra�i Stik z očmi dra�i 6.2.2 VPLIV NA RASTLINE

V literaturi ni nobenih opisov, da bi bila ta vrsta bakterije nevarna rastlinam. Noben član rodu Clustridium ni znan kot rastlinski patogenec.

Aceton in izopropanol sta toksična za alge (Merck KGaA 100012 in Merck KGaA 100992). 6.2.3 VPLIV NA DRUGE MIKROORGANIZME 6.2.3.1 VPLIV BAKTERIJ

C. acetobutylicum proizvaja bakteriocin ob koncu eksponentne faze rasti (Barber in sod., 1979, cit. po Final risk�, 1997). Bakteriocini so znani, da imajo bakteriocidno učinkovanje na isto vrsto ali na druge klostridijske vrste. Dokazali so, da ima ta bakteriocin ihibitorne učinke na člane iste vrste in člane sorodne vrste C. felsineum. Ta bakteriocin ni imel inhibitornih učinkov na Achromobacter, Escherichia coli, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium in Bacteroides fragilis (Barber in sod., 1979, cit. po Final risk�, 1997).

Proizvodnja bakteriocinov v naravi ni velika, ker bakterija te vrste večino časa pre�ivi v obliki spore, in zato ne povzroča skrbi. Tudi če bi spustili v naravo bakteriocine skupaj z odpadki, ki nastajajo pri fermentaciji, ne bi imeli bakteriocini velikega vpliva na okolje. Količina članov rodu Clostridium je največ 106 organizmov na gram zemlje (Alexander, 1977, cit. po Final risk�, 1997). 6.2.3.2 VPLIV ACETONA IN IZOPROPANOLA

Aceton ne deluje mutageno na mikroorganizme: Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Escherichia coli. Pač pa je njegovo delovanje toksično in sicer za M. aeruginosa EC 5: 530 mg/l/8 d in za Ps. putida EC 5: 1700 mg/l/16 h. Izopropanol ne deluje mutageno (Ames-Test je negativen), ampak toksično in sicer za Ps. putida EC 5: 1050 mg/l/16 h in za M. aeruginosa EC 5: 1000 mg/l/8 (Merck KGaA 100012 in Merck KGaA 100992). 6.2.4 VPLIV NA NARAVNE PROCESE 6.2.4.1 VPLIV BAKTERIJ

Ta bakterija ve�e atmosferski du�ik, vendar nima velikega vpliva na okolje, saj večino časa pre�ivi v obliki spor in ne porablja du�ika. Poleg tega pa je količina du�ika, ki ga ve�e ta bakterija, zelo majhna v primerjavi s količino du�ika, ki ga ve�ejo simbiotske bakterije. �tevilo bakterij rodu Clostridia, ki ve�ejo atmosferski du�ik je v območju 102 do 106 na gram zemlje (Final risk�,1997).


Nekatere vrste C. acetobutylicum proizvajajo encime celulaze, ki omogočajo uporabo rastlin kot substrat za fermentacijo. Vendar to ni problem za okolje, saj ti mikroorganizmi v okolju �e obstajajo in je �e vzpostavljeno ravnote�je med mikrobi in okloljem. Poleg tega pa ta vrsta večino časa pre�ivi v obliki spor in ne porabljajo hrane. (Alexander,1977 cit. po Final risk�, 1997). 6.2.4.2 VPLIV ACETONA IN IZOPROPANOLA

Biolo�ka razgradnja acetona poteče 91% v 28 dneh, izopropanola pa 95% v 21 dneh. Aceton se ne nalaga v okolju (Merck KGaA 100012 in Merck KGaA 100992). 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PROIZVODNJI HRANE

V na�em primeru obravnavamo kot bioproizvoda aceton in izopropanol, ki v nadaljnji bioproizvodnji nimata esencialnega pomena.

Aceton se neposredno ne uporablja v proizvodnji hrane. Uporabljamo ga posredno bodisi kot topilo, bodisi kot sredstvo za obarjanje in ekstrakcijo. Tako so leta 1996 japonski znanstveniki (Fuji in sod.) izolirali in karakterizirali prolidazo, neobčutljivo na EDTA (prolin dipeptidase, EC.3.4.13.9.). Omenjeni prolin-specifični encim, ki je eden ključnih encimov pri katabolizmu peptidov, je bil izoliran iz brezceličnega ekstrakta bakterije Aureobacterium esteraromaticum, za samo ločevanje encima iz ekstrakta pa je bilo poleg ionsko-izmenjevalne in gelske kromatografije uporabljeno tudi predhodno obarjanje beljakovin (encima) z acetonom. Prav tako je bil aceton uporabljen kot obarjalno sredstvo pri poskusu, kjer so (Shimada s sod., 1996) izolirali lipazo iz plesni Rhizopus delemar. Ta encim je bil nato uporabljen pri proizvodnji strukturnih lipidov.

Uporabe izopropanola v proizvodnji hrane v literaturi nismo zasledili, kot obarjalno sredstvo pa je omenjen pri izolaciji RNA iz rastlinskega tkiva, ki so jo izvajali Schneitz s sodelavci leta 1997. Največja ovira za njuno morebitno neposredno uporabo v proizvodnji �ivil je njuna toksičnost za člove�ki organizem.

Aceton in izopropanol se uporabljata tudi kot sredstvi za ekstrakcijo pri analizi �ivil in sicer oba za ekstrakcijo fenolov in antioksidantov, le aceton pa za ekstrakcijo mikotoksinov.


8. REFERENCE Clostridium. 1995. University of Texas, Houston Medical School. http://www.medic.med.uth.tmc.edu/path/00001496.htm (17.11.2000) Dürre P., Bahl H. 1996. Microbial Production of Acetone / Butanol / Isopropanol. V: Rhem H.J., Reed G., Puehler A., and Stadler P. 1996 Biotechnology. Second edition. Roehr, M. Products of Primary Metabolism. Weinheim, New York, Cambridge, Tokyo, VCH, s.229-268. Final risk assessment of Clostridium acetobutylicum. 1997. EPA � United States Environmental Protection Agency. http://www.epa.gov/docs/fedrgstr/EPA-TOX/1997/April/Day-11/support/fra/fra003.htm (18.11.2000) Fujii et al. 1996. Purification and Characterization of a Prolidase from Aureobacterium esteraromaticum. Bioscience, biotechnology, biochemistry 60, s.1118-1122. Gasparič A., Komel R. 1996. Metode izbolj�anja delovnih mikroorganizmov. V: Raspor, P. (ur.). 1996 Biotehnologija, Osnovna znanja. Druga izdaja. Ljubljana, BIA d.o.o., s.185-212. Hagedorn C., 2000. Environmental microbiology, a course of Soil- and Aquatic-Microbiology. Virginia Polytechnic Institute and State University, Department of Crop and Soil Environmental Sciences. http://www.bsi.vt.edu/chagedor/biol_4684/Microbes/clost.html (27.12.2000) Knez �. 1996. Termodifuzijski separacijski procesi. V: Raspor, P. 1996 Biotehnologija, Osnovna znanja. Druga izdaja. Ljubljana, BIA d.o.o., s.347-396, 423-435, 551-608. Kra�ovec F. 1976 Pregled organske kemijske tehnologije. Maribor, Visoka tehni�ka �ola Maribor, s.76-77. Kornhauser A. 1994 Organska kemija II, Organske kisikove spojine, Lipidi, Ogljikovi hidrati. Ljubljana, DZS, s.50-51, 87. Lederberg J. 2000 Encyclopedia of Microbiology, Second Edition. New York, The Rockefeller University, s.836-838. Madigan M. T., Martinko J. M., Parker J. 1997. Brook, Biology of Microorganisms. 8th edition. New Jersey, Prentice Hall International, Inc., s. 455, 514, 726. MERCK KGaA 04.2000 s CD-ROM 2000/1, Catalogue No.:100992, date of issue 18.6.1999, Darmstadt. MERCK KGaA 04.2000 s CD-ROM 2000/1, Catalogue No.:100012, date of issue 1.12.1999, Darmstadt.

http://www.medic.med.uth.tmc.edu/path/00001496.htm

http://www.bsi.vt.edu/chagedor/biol_4684/Microbes/clost.html


Mo�ina � Smole S. 1996. Izbor, priprava in shranjevanje industrijskih biokultur. V: Raspor, P. (ur.). 1996 Biotehnologija, Osnovna znanja. Druga izdaja. Ljubljana, BIA d.o.o., s.347-366. Nollet L.M.L. 1996. Handbook of Food Analysis. Volume 1,2. Ghent, Marcel Dekker, Inc., s. 1089-1146, 1536, 1770-1773, 1842. Pavko A. 1996. Masne bilance in načini vodenja bioprocesov. V: Raspor, P. (ur.). 1996 Biotehnologija, Osnovna znanja. Druga izdaja. Ljubljana, BIA d.o.o., s. 423-435. Perdih A. 1996. Izbor in priprava substratov. V: Raspor, P. (ur.). 1996 Biotehnologija, Osnovna znanja. Druga izdaja. Ljubljana, BIA d.o.o., s. 367-382. Priročnik o tehnolo�kih lastnostih pesticidov v republiki Sloveniji. 1998. Ministerstvo za zdravstvo. Ljubljana. http://www.bf.uni-lj.si/ag/fito/akt/sezakt.htm (12.11.2000) Qureshi N., Blaschek H.P. 2000. Pervaporative recovery of butanol from fermentation broth of hyper butanol producing Clostridium beijerinckii BA 101. University of Illinois, Food science and Human Nutrition Department. http://www.ilcorn.org/reports/98011902ui.htm (17.11.2000). Rade� I. 1996. Sterilizacija substratov in opreme. V: Raspor, P. (ur.). 1996 Biotehnologija, Osnovna znanja. Druga izdaja. Ljubljana, BIA d.o.o., s. 383-396. Raspor P. 1983. Imobilizirane celice. Biokulture. V: Adamič J., Pokorn J., Raspor P. 1983. Mikrobiologija, seminar. Ljubljana, VTOZD za �iv. teh., BF, s.22-35. Raspor P. (ur.). 1996. Biotehnologija, Osnovna znanja. Druga izdaja. Ljubljana, BIA d.o.o. Reith V.E., Pfister H. Aceton. Fachverlag im Bereich EDV, Hydrologie und Umweltschutz. http://www.reith-pfister.de/aceton.htm (12.11.2000) Schneitz K. 1997. Total RNA Isolation. University of Zurich, Institute of Plant Biology. http://www.unizh.ch/botinst/Cyto_Website/schneitzLab/Methods/ProtocolsRNA/totalRNA.html (20.12.2000) Shimada Y., Sugihara A., Maruyama K., Nagao T., Nakayama S., Nakono H., Tominaga Y. 1996. Production of Structured Lipid Containing Docosahexaenoic and Caprilc Acids Using Immobilized Rhizopus delemar Lipase. Journal of fermentation and bioengineering 81, 4, s.299-303. Stanbury, Whitaker. 1984. Principles of fermentation technology. Oxford, Pergamon Press, s.7, 112, 120. Vasić � Rački Đ., Berovič M. 1996. Integrirani bioreaktorji. V: Raspor, P. (ur.). 1996 Biotehnologija, Osnovna znanja. Druga izdaja. Ljubljana, BIA d.o.o., s. 551-608. Windholz M., Budavari S. 1983. The Merck Index, 10th edition. Rahway, Merck & Co., Inc., s. 57, 5064.

http://www.ilcorn.org/reports/98011902ui.htm

http://www.reith-pfister.de/aceton.htm

http://www.unizh.ch/botinst/Cyto_Website/schneitzLab/Methods/ProtocolsRNA/totalRNA.html

Documents

PROIZVODNJA ACETONA IN IZOPROPANOLAweb.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/2000_01/Aceton.pdf · Naftna kriza v letu 1973 pa je ponovno postavila na prvo mesto biotehnoloıko