PROIZVODNJA ETANOLA*web.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/2000_01/...Industrijski bioprocesi: Proizvodnja etanola, Seminar, Biotehniıka fakulteta, −tudij živilske tehnologije,

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA �TUDIJ �IVILSKA TEHNOLOGIJA

PROIZVODNJA ETANOLA*

Urša ADAMLJE, Nataša ARTNAK, Katarina BAŠA, Blaž BRATINA

(�tudentje tretjega letnika �ivilske tehnologije)

prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Paš (mentorja)

Ljubljana, 2001

*Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Industrijski bioprocesi: Proizvodnja etanola, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2001 2

Povzetek Produkcija etanola je en izmed najbolj raz�irjenih industrijskih bioprocesov, kar jih poznamo. V seminarju so opisane nekatere fizikalne in kemijske lastnosti etanola, zgodovina bioprocesa pridobivanja etanola od prazgodovine s spontano fermentacijo, do sedanje natančno nadzorovane masovne produkcije. Podrobno so opisani substrati, njihova priprava v bioreaktorju in potek industrijskega bioprocesa. Mikrobiolo�ki del opisuje mikroorganizme, ki v procesu sodelujejo, njihovo izolacijo in kultivacijo ter ohranitev starter kultur. Omenjen je tudi način izbolj�ave mikroorganizmov s pomočjo genske manipulacije. V zadnjem delu pa je pokazana vloga etanola in snovi, ki vsebujejo etanol v vsakdanjem �ivjenju, tako v �ivilski industriji kot farmaciji pa tudi v avtomobiski industriji kot dodatek pa tudi kot nadomestek fosilnih goriv. Summary The production of ethanol is one of the most wide spread industrial bioprocess known to man. This seminar includes some physical and chemical facts about ethanol and also the long history of its production, from the beginning with spontaneous fermentation until recent carefully controlled mass production. Substrates used in the bioprocess, their preparation in bioreactor and process of industry bioprocess are shown in biochemical basics section of this seminar. In microbiological section the micro organisms are described. Their isolation, cultivation, preservation of starter cultures and also the gene manipulating techniques for micro organisms improvement. In last part of the seminar we show the role of ethanol and substances containing ethanol in our every day life. Not just its role in food industry, pharmacy but also in car industry as a additive and a supplement for fossil fuel.


KAZALO: 1. UVOD 4 1.1. Alkoholi 4 1.1.1. Etanol 4 1.1.2. Proizvodnja etanola 4 1.1.3. Uporabnost etanola 4 2. ZGODOVINA BIOPROCESA 5 3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA 6 3.1. Kvasovke 6 3.1.1. Uvod 6 3.1.2. Taksonomija 7 3.2. Bakterije 8 3.2.1. Uvod 8 3.2.2. Klasifikacija 9 3.3. Termofilni organizmi 10 3.4. Metode izolacije in kultivacije biokultur 11 3.5. Shranjevanje biokultur 12 4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA 12 4.1. Kvasna fermentacija 12 4.2. Etanolna fermentacija 13 5. BIOIN�ENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA 14 5.1. Substrati za industrijsko pridobivanje alkohola 14 5.1.1. Sladkorni pridelki 14 5.1.1.1. Sladkorni trs 14 5.1.1.2. Sladkorna in krmna pesa 15 5.1.1.3. Sadje 15 5.1.2. �krob 15 5.1.2.1. Koruza 15 5.1.2.2. Kasava 15 5.1.2.3. Sladki krompir 15 5.1.2.4. Topinanbur 15 5.1.2.5. Encimi za razgradnjo �kroba 16 5.1.3. Lignoceluloze 16 5.1.3.1. Mikroorganizmi, ki izkori�čajo lignin 17 5.1.3.2. Kislinska hidroliza 17 5.1.3.3. Encimska hidroliza 17 5.1.4. Odpadki industrijsko �ivilskih obratov 17 5.1.4.1. �veplove odplake 17 5.1.4.2. Sirotka 17 5.2. Priprava substratov za industrijski bioproces pridobivanja etanola 18 5.2.1. Pridobivanje etanola iz koruze 18 5.2.2. Pridobivanje etanola iz korenin kasave 19 5.2.3. Pridobivanje etanola iz krompirja 19 5.2.4. Pridobivanje etanola iz rastline topinanbur 19 5.2.5. Pridobivanje etanola iz celuloze 19 5.2.5.1. Proces pridobivanja etanola iz lesa z razredčeno �vepleno kislino 19 5.2.5.2. Proces hidrolize z močno kislino 20 5.2.5.3. Proces pridobivanja etanola iz časopisnega papirja z encimsko hidrolizo 20 5.2.6. Pridobivanje etanola iz trdnih mestnih odpadkov s kislinsko hidrolizo 20 5.2.7. Pridobivanje etanola iz odpadnih sulfitnih lu�nic 20 5.2.8. Pridobivanje etanola iz sirotke 21 6. EKOLO�KI VIDIK BIOPROCESA 21 6.1. Etanol - avtomobilsko gorivo prijaznej�e za okolje 22 6.1.1. Zmanj�ana emisija �kodljivih plinov z uporabo etanolne me�anice goriva 22 6.1.1.1. CO2 - Ogljikov dioksid 22 6.1.1.2. CO - Ogljikov monoksid 23 6.1.1.3. O3 - Ozon 23 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PROIZVODNJI HRANE 23 7.1. Vino in pivo 23 7.2. Uporaba etanola kot konzervansa 24 7.3. Ostala uporaba etanola 24 8. REFERENCE 25


1. UVOD 1.1. ALKOHOLI Alkoholi so spojine z strukturo alkana v katerem se je med ogljikov in vodikov atom vrinil atom kisika. Beseda »alkohol« prihaja iz arabske besede al kuhul in pomeni fini pra�ek (dejansko antimonov sulfid). Izraz se je nato prenesel na vse pra�ke, ki so sublimirali in nato na tekočine pridobljene z destilacijo. Zaradi vodikovih vezi med molekulami alkohola imajo le ti vi�ja vreli�ča in se lahko me�ajo z vodo v vseh razmerjih. Solvatacija ionov in polarnost omogočata raztapljanje ionskih in polarnih topljencev. Me�anje v vodi in topnost pa z nara�čanjem molske mase alkohola padata saj disperzijske sile, ki alkilne skupine dr�ijo skupaj postanejo močnej�e od vodikovih vezi med alkoholom in vodo. Lastnosti vezi kisik-vodik pa dejejo alkoholom sposobnost reagiranja kot �ibka kislina ali �ibka baza (Schroter W., 1993). 1.1.1. ETANOL Etanol, poznan tudi kot etilni alkohol, s formulo CH3CH2OH, je za človeka nedvomno najpomembnej�i alkohol kar jih poznamo. Pri sobni temperaturi je to lahkohlapna, brezbarvna bistra tekočina, brez vonja. Tali�če ima pri �114,1oC in vreli�če pri +78,5oC merjeno pri nomalnem zračnem tlaku. Molska masa etanola je 46,07g/mol gostota pa 0,789 g/ml pri 20oC. V naravi je prisoten pri mnogih fermentacijskih procesih.

SLIKA 1: Model molekule etanola

1.1.2. PROIZVODNJA ETANOLA Etanol, ki se uporablja v prehrani in več kot polovica industrijskega etanola se �e vedno pridobiva s fermentacijo sladkorjev s pomočjo kvasovk. Samo majhen del industrijskega etanola se pridobi iz etilena ter acetilena. Letna svetovna proizvodnja etanola pa sega v 1011 litrov. 1.1.3. UPORABNOST ETANOLA Uporaba etanola pa ni omejena samo na eno področje industrije temveč njegovo uporabnost zasledimo v medicini kot razku�ilo in topilo za določena zdravila, v �ivilstvu kot sestavni del alkoholnih pijač in drugih izdelkov, v avtomobilski industriji kot gorivo, v kozmetiki za kozmetične preparate, v industriji barv kot topila itd.


2. ZGODOVINA BIOPROCESA Ni znano kdaj so prvič pridobili etanol kot produkt fermentacije sladkorjev vendar naj bi začetki segali v 5. tisočletje p.n.�t.. Prvi zapisi o naravni fermentaciji so zapisani v egipčanski knjigi »Knjiga mrtvih« 3000 let p.n.�t. (prva dinastija, Menes, 3110-2884), 1800 let p.n.�t. pa so Babilonci prvi postavili normative oz. kar zakone za proizvodnjo piva s fermentacijo. Okoli leta 800 p.n.�t. so Kitajci z iznajdbo prve destilirne naprave dosegli vi�je koncentracije etanola pri destilaciji ri�evega �ganja. Vino, pivo, fermetirani izdelki, ter seveda posredno etanol, torej spremljata človeka skoraj od samega začetka dana�nje civilizacije. V 13. stoletju je francoski zdravilec označil alkohol (etanol) kot univerzalno zdravilo, ki naj bi ozdravilo vse bolezni. Imenuje ga aqua vitae. Prvi pravi dokaz za obstoj mikrobiolo�kega sveta je leta 1680 dal nemec Antony van Leeuvenhoek, brusač leč, s pomočjo doma narejenega mikroskopa z eno lečo. Kvasovke je opisal kot majhna ovalna ali sferična telesca, skiciral jih je in ugotovitve poslal članom Royal Society of London. To veliko odkritje pa v 17. stol. ni dalo novih spodbud za raziskovanje. Destilacija za pridobivanje vi�jih koncentracij (do 96%) etanola se je pojavila v drugi polovici 18. stoletja. Vse do 19. stol. je bil termin kvasovke v mnogih jezikih povezan s fermentacijo. �Yeast� angle�ko in podobno �gist� nem�ko prihajata iz gr�ke besede �zestos�, kar pomeni vreti; francosko �levure� pa prihaja iz latinske besede �levere�-vzhajati. V 19. stol. je �tudija Louisa Pasteura jasno pokazala, da �ive kvasne celice pod anaerobnimi pogoji fermentirajo sladkor v ogljikov dioksid in etanol. Etanol pa je kot pogonsko gorivo leta 1908 prvi uporabil Henry Ford v svojem avtomobilu Model-T. Masovna proizvodnja industrijskega etanola se je začela med II. svetovno vojno. Zaradi pomankanja nafte so začeli pridobivati etanol kot gorivo za tanke in ostala vozila. Potrebe po etanolu, kot nadomestku goriva, se zopet pojavijo leta 1970, ko svetovna industrija zapade v naftno krizo. V osemdesetih letih zgradijo ogromno tovarn za proizvodnjo etanola. Te delujejo �e danes z lastno letno produkcijo preko 5 milijard litrov etanola. V dana�njem času je prozvodnja etanola s fermentacijo sladkorjev zelo raziskan proces, a se zaradi vsestranske uporabnosti te spojine, nenehno i�čejo cenej�e in bolj izpopolnjene metode za pridobivanje (http://starfire.ne.uiuc.edu/~ne201/1997/richard/history.html, 2000).


3. MIKROBIOLOŠKE OSNOVE BIOPROCESA 3.1. KVASOVKE 3.1.1. UVOD Poznamo več kot 70000 vrst gliv, od teh 500 vrst priznavamo za kvasovke. Torej kvasovke predstavljajo le majhen del v kraljestvu gljiv. Enostavno definirati termin kvasovke je skoraj nemogoče, saj vemo, da ima veliko neceličnih oblik kompleksne �ivljenjske cikle. V splo�nem pa lahko kvasovke opi�emo kot mikroskopsko majhne, enocelične prave glive, od 2 do 8 µm �iroke in od 10 do 30 µm dolge (večje kot večina bakterij). So močno raz�irjene v naravi, imajo dobro razvito jedro s kromosomi, obdano z jedrno membrano, so torej evkarionti (Hui, 1991).

SLIKA 2: Celice kvasovk Saccharomyces cerevisiae med multilateralnim brstenjem (posneto s SEM).

Kvasne celice so lahko ovalne, okrogle, cilindrične, srpaste, tudi limonaste oblike. Nekateri rodovi kvasovk pa so manj pravilnih oblik: apikulatne - na polih zo�ene in nekoliko podalj�ane (Hanseniaspora, Kloeckera), na enem polu podalj�ane in koničasto zo�ene (Brettanomyces, Dekkera), podobne steklenici (Pityrosporum), trikotne (Trigonopsis) (Adamič, 1992). Rastejo kot saprofiti ali paraziti, razmno�ujejo pa se običajno vegetativno z brstenjem oziroma nekatere s cepljenjem. Večina kvasovk se razmno�uje tudi generativno ali spolno in jih tako razvr�čamo med askomicete in bazidiomicete. V splo�nem se s kopulacijo dveh kvasnih celic oziroma spor začne spolni krog, ki vodi v oblikovanje asko- oz. bazidiospor. Kvasovke nimajo fotosintetske sposobnosti in niso mobilne (nimajo lokomotornih organov). V aerobnih razmerah metabolirajo �tevilne sladkorje, medtem ko imajo v anaerobnih razmerah sposobnost fermentacije samo nekatere vrste. Redke izjeme so lahko tudi patogene (Raspor, 1996).


3.1.2. TAKSONOMIJA Zaradi tako velike genske variabilnosti kvasovk, morfolo�kih, fiziolo�kih ter biokemijskih značilnosti, se je moral razviti enostaven in učinkovit sistem razlikovanja, metode, ki so različne lastnosti ovrednotile. Klasifikacija, ki se danes največ uporablja, je osnovana na fenotipski karakterizaciji in morfologiji vegetativnega in seksualnega razmno�evanja ter �tevilnih fiziolo�kih tipih rasti na različnih goji�čih. KLASIFIKACIJA INDUSTRIJSKIH KVASOVK Kraljestvo: Fungi Oddelek: Eumycota Pododdelek: Ascomycotina (drugi pododdelki: Basidiomycotina, Deuteromycotina) Razred: Hemiascomycetes Red: Endomycetales Dru�ina: Saccharomycetaceae (ostale dru�ine: Endomycetaceae, Spermophthoraceae) Poddru�ina: Schizosaccharomycetoideae Red: Schizosaccharomyces Poddru�ina: Nadsonoideae Red: Nadsonia, Saccharomycodes, itd. Poddru�ina: Lipomycetoideae Red: Lipomyces Poddru�ina: Saccharomycetoideae Red: Saccharomyces, Kluyveromyces, itd. Kvasovke so sposobne izkoristiti veliko �tevilo substratov (tabela 1). Nasplo�no lahko rastejo in učinkovito fermentirajo pri pH od 3,5 do 6 in temperaturah od 28 do 35ûC. Čeprav je začetna etanolna produkcija pri vi�ji temperaturi vi�ja, je celotna fermentativna produktivnost zni�ana zaradi inhibicije produkta � etanola. Tehnolo�ko je rod Saccharomyces najpomembnej�i pri fermentaciji različnih substratov, zato je tudi najbolj raziskan. Z genetskega in biokemičnega stali�ča pa ima nekaj slabih strani, kot so omejena sekrecija produktov in izkori�čanje ogljikovih hidratov, nizka toleranca alkohola in koncentracije substrata. Za izbolj�anje lastnosti uporabljamo genski in�iniring (fuzija protoplastov, transformacija z rekombinantno DNA tehniko). Tako so s pomočjo teh dveh metod Pacysolen tannophilus, Pichia stipitis in Candida shehatae fermentirajo ksilozo od leta 1980 (Rheim, 1996).


TABELA 1: Sposobnost fermentacije sladkorjev kvasovk vrst Saccharomyces in Kluyveromyces. (Jones, 1981)

Kvasovke �tevilo ogljikovih atomov

Sladkor Osnovne enote Saccharomyces

cerevisiae Saccharomyces uvarum

Kluyveromyces fragilis

glukoza glukoza + + + maltoza glukoza + + - maltotrioza glukoza + + - celobioza glukoza - - - trehaloza glukoza +/- +/- - galaktoza galaktoza + + + manoza manoza + + + laktoza glukoza,

galaktoza - - +

melibioza glukoza, galaktoza

- + +

fruktoza fruktoza + + - sorboza sorboza - - + saharoza glukoza,

fruktoza + + +

rafinoza glukoza, fruktoza, galaktoza

+/- + +/-

6

deoksiriboza 2-deoksiriboza

+/- +/- +/-

arabinoza arabinoza - - - 5 ksiloza ksiloza - - -

3.2. BAKTERIJE 3.2.1. UVOD Bakterije so zelo heterogena skupina prokariontskih mikroorganizmov. Premer bakterijske celice je samo 1 µm, venar ima zaradi majhnosti ta organizem prednost v boju za obstanek. Razmerje med povr�ino in volumnom je visoko, kot posledica pa je visoka tudi metabolična aktivnost, kratek generacijski čas in prilagodljivost na okolje. Na sliki 2 so prikazane običajne oblike bakterij (sferična, paličasta, zavita) in formacije celic, ki so odvisne od načina delitve bakterijskih celic. Če ne pride do ločitve hčerinskih celic, nastanejo pari (diplokoki), grozdi (stafilokoki), veri�ice (streptokoki, streptobacili) ali paketi po 4 ali 8 celic (sarcine). Bakterijska celica je po svoji strukturi zelo enostavna. Ima celično steno, citoplazmo, citoplazmino membrano, ribosome, jedrni material in razne celične vključke, nekatere pa �e kapsule ali sluzne ovoje, bičke, fimbrije in spore.


SLIKA 3: Osnovne oblike bakterij (Smole - Mo�ina, Marić, 1992) 1-sferične oz. koki, 2-diplokoki, 3-streptokoki, 4-stafilokoki, 5-sarcine, 6-paličaste 7-vibrii, 8-zavite 3.2.2. KLASIFIKACIJA Vse prokariontske organizme uvr�čamo v kraljestvo Procaryotae. Osnovna taksonomska skupina je vrsta, definirana podobno kot pri kvasovkah na osnovi morfolo�kih, biokemijskih, fiziolo�kih in genetskih lastnosti organizma. Po temeljnem delu bakterijske klasifikacije Bergey�s Manual of Systematic Bacteriology ločimo:

1. Gramnegativne bakterije, pomembne v medicini in industriji 2. Grampozitivne bakterije (brez aktinomicet) 3. Arhebakterije, cianobakterije in ostale gramnegativne bakterije 4. Aktinomicete (Smole - Mo�ina, Marić, 1992)

Glede na primarni izvor energije in ogljika opredelimo metabolične tipe organizmov. Tako bakterije pridobivajo energijo s fermentacijo, aerobno respiracija (obligatno in fakultativno aerobni organizmi) in aerobno respiracijo (nitratna, sulfatna, karbonatna, fumaratna respiracija in respiracija z �elezom). Pri nekaterih vrstah bakterij se kot končni metabolni produkti izločajo le delno oksidirane snovi, ki so prav tako komercialno zanimivi proizvodi. �tevilne bakterije etanolno fermentirajo, vendar je pri mnogih etanol le stranski produkt poleg drugih alkoholov (butanol, izopropilalkohol, 2,3-butendiol), organskih kislin (ocetna, maslena, mravljična, mlečna, propionska kislina), poliolov (arabitol, glicerol, ksilitol), ketonov (aceton) ali različnih plinov (metan in ogljikov dioksid � bioplin, vodik). Mikroorganizmi, ki so sposobni producirati etanol kot glavni produkt (minimalno 1 mol etanola /mol uporabljene glukoze), so navedeni v tabeli 2 (Rheim, 1996).


TABELA 2: Bakterijske vrste, ki producirajo etanol kot glavni fermentacijski produkt (Wiegel, 1980). Mezofilni organizmi mmol etanola na mmol glukoze Clostridium sporogenes do 4,15 Clostridium indolis (patogen) 1,96 Clostridium sphenoides 1,8 (1,8) Clostridium sordelli (patogen) 1,7 Zymomonas mobilis (anaerob) 1,9 Zymomonas mobilis (aerob) 1,7 Spirochaeta aurantia 1,5 (0,8) Spirochaeta stenostrepta 0,84 (1,46) Spirochaeta litoralis 1,1 (1,4) Erwinia amylovora 1,2 Leuconostoc mesenteroides 1,1 Streptococcus lactis 1,0 Sarcina ventriculi 1,0 Termofilni organizmi Tmax [oC] mmol etanola na mmol glukoze

Thermoanaerobacter ethanolicus

78 1,9

Clostridium thermohydrosulfuricum 78 1,6

Bacillus stearothermophilus 78 1,0 Thermoanaerobium brockit 78 0,95 Clostridium thermosaccharolyticum 68 1,1

Clostridium thermocellum 68 1,0 Tabela ka�e, da lahko tudi bakterije producirajo relativno visok dele� etanola. Čeprav nekaj mezofilnih sevov rodu Clostridium pri fermentaciji sladkorja proizvaja etanol, pa je za proizvodnjo etanola pomembna samo Zymomonas mobilis. Z genskim in�iniringom so pridobili bakterijo, ki učinkovito fermentira vse sladkorje prisotne v lignocelulozi. Operon gena za alkohol dehidrogenazo in piruvat dekarboksilazo so iz Z. mobilis prenesli v bakterije z naravno sposobnostjo metaboliranja različnih sladkorjev. Razvili so mikroorganizem, ki fermentira celobiozo, ksilobiozo, maltozo, maltotriozo in druge oligomerne sladkorje brez predhodne depolimerizacije sladkorjev. 3.3. TERMOFILNI ORGANIZMI Uporaba termofilnih mikroorganizmov, v produkciji etanola za gorivo, je nujna, saj kvasovke niso odporne na visoke temperature (blizu 50°C). Prednosti fermentacije pri visoki temperaturi pa so:

• Termofili ka�ejo vi�jo katabolno aktivnost pri vi�jih temperaturah, ker so take temperature optimalne za njihovo rast. Rezultat je kraj�i fermentacijski čas, vi�ja produktivnost in učinkovitost fermentacije.

• Topnost kisika in drugih plinov v fermentacijski brozgi pada z nara�čajočo temperaturo, kar pomaga pri vzdr�evanju anaerobnih pogojev. Optimalna temperatura


ekstremnih termofilov je 66 do 69°C, tu pa je topnost kisika za 80% ni�ja kot pri 30°C.

• Substratu, ki se pri sobni temperaturi slabo topi, pri optimalni fermentacijski temperaturi povečamo topnost, tako da lahko v proces vstopa več substrata.

• Tudi viskoznost fermentacijske brozge pade s povečano temperaturo, zato se zni�a energija potrebna za me�anje.

• Izhlapevanje etanola se poveča, zato ne pride tako hitro do zasičenja s produktom. • Metabolna aktivnost mikroorganizmov in trenje nastalo pri me�anju sta vir toplote. Ta

dodatna energija pomaga vzdr�evati �eljeno temperaturo v fermentacijski posodi, potreba po sterilizaciji pa je minimalna (Rheim, 1996).

Zanimivi so tudi ekstremni termofilni kemoorganotrofni anaerobi. Thermoanaerobacter ethanolicus ima zaradi ekstremno termofilne narave (T optimum je 69°C) dve glavni prednosti v primerjavi z drugimi mikroorganizmi:

1. Ima �irok pH optimum od 5,5 do 8,5 ( raste v pH od 4,5 do 9,5). 2. Za proizvodnjo etanola lahko izkori�ča �tevilne substrate (�krob, celulozo, laktozo in

različne pentozne sladkorje) (Smole-Mo�ina, 1999). 3.4. METODE IZOLACIJE IN KULTIVACIJE BIOKULTUR Osnovni vir biokultur je tudi v dana�njem času �e vedno narava s svojo biolo�ko pestrostjo in raznovrstnostjo. Kvasovke in bakterije najpogosteje najdemo v zelo velikem �tevilu v tleh, na cvetovih, sadnem drevju, plodovih,� Izolacija bakterij in kvasovk, ki etanolno fermentirajo, navadno ni problematična v habitatih, v katerih predstavljajo večji del prisotne mikroflore. Čisto kulturo iz nativnega vzorca mikroorganizmov ponavadi izoliramo z uporabo mikroskopa (Lindnerjeva metoda z razredčevanjem, izolacija ene same celice ali spore z mikromanipulatorjem), z metodo izolacije čiste kulture s cepilno zanko (razmazovanje na agarski plo�či, �črtanje�) ali z razredčevanjem vzorca po Koch-u. Te metode omogočajo diferenciacijo na osnovi morfologije kolonij, posameznih celic in določanje koncentracije celic v vzorcu. Mnogo klasičnih rastnih medijev omogoča rast več vrstam bakterij in kvasovk, mikroskopska preiskava vzorca pa je edini način, da ugotovimo, katere vrste so na goji�ču zrasle. Za izolacijo in razmno�evanje kvasovk se uporablja SA goji�če (sladni agar). Osnovno neselektivno goji�če � hranljivi agar (NA) pripravimo tako, da 14 g �e pripravljene me�anice za NA agar in 1,5 g glukoze zatehtamo v steklenico za sterilizacijo in dodamo 500 ml dest. vode, segrejemo na gorilniku v vodni kopeli, me�amo, da se vse sestavine raztopijo, na koncu pa steriliziramo v avtoklavu 20 min pri 121°C. Uporaba obogatitvene tehnike za izolacijo mikroorganizmov s specifičnimi lastnostmi iz specifičnih naravnih okolij do�ivlja v dana�njem času nov razvoj (Smole-Mo�ina, 1996). S skrbno izbranimi pogoji v goji�ču namno�imo le eno vrsto organizmov. Eden od takih selektivnih goji�č za kvasovke je tudi OGY agar.


Priprava agarja: • zatehtamo: kvasni ekstrakt 2,5 g glukoza 5,0 g (NH4)2SO4 0.5 g agar 10,0 g • vse prenesemo v erlenmajerico in dodamo 500 ml dest. vode. Segrejemo na gorilniku

v vodni kopeli, me�amo, da se vse sestavine raztopjo; • steriliziramo v avtoklavu 20 min pri 121°C; • pred uporabo goji�ču, ohlajenemu na cca 50°C, dodamo 0,05 g oksitetraciklina

(antibiotik, ki zavira rast bakterij); • na razlito goji�če v petrijevki z ezo nacepimo me�ano kulturo kvasovk in bakterij

(preveritev selektivnosti). Inkubiramo pri 30°C. Bakterije inkubiramo v MPB (mesno-peptonskem bujonu, peptoni so organski vir du�ika). Selektivno obogatitveno goji�če za bakterije pa je BP, agar za izolacijo stafilokokov. Priprava:

• 29 g �e pripravljene me�anice za BP agar zatehtamo v steklenico za sterilizacijo in dodamo 457 ml dest. vode;

• segrejemo na gorilniku v vodni kopeli, me�amo, da se vse sestavine raztopijo; • steriliziramo v avtoklavu 20 min pri 121°C; • pred uporabo goji�ču, ohlajenemu na cca 50°C, dodamo 25 ml �e pripravljene

emulzije jajčnega rumenjaka in telurita (toksičen za večino mikroorganizmov, le za stafilokoke ne);

• na razlito goji�če v petrijevki z ezo nacepimo me�ano kulturo kvasovk in bakterij (preveritev selektivnosti). Inkubiramo pri 30°C (Smole-Mo�ina, 1999).

3.5. SHRANJEVANJE BIOKULTUR Metode ohranjanja, začasnega in trajnega shranjevanja morajo zagotoviti:

1. �ivost kulture, 2. čistost biokulture, 3. fenotipsko stabilnost, 4. genotipsko stabilnost.

Najresnej�i problem pri ohranjevanju bakterijskih biokultur predstavlja infekcija z bakteriofagi. Za trajno shranjevanje najpogosteje uporabljamo liofilizacijo (vakuumsko su�enje oz. odstranjevanje ledu iz zamrznjene kulture s sublimacijo) in zamrzovanje ter hranjenje pri zelo nizkih temperaturah v mehanskih zamrzovalnikih do �18°C ali med �156°C in �196°C v tekočem du�iku ali njegovih parah. Kvasovke imajo pri liofilizaciji slabo pre�ivelost, med bakterijami pa so bolj občutljive gram negativne kot gram pozitivne (Smole-Mo�ina, 1996).


4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA 4.1. FERMENTACIJA S KVASOVKAMI Kvasovke pod anaerobnimi pogoji presnavljajo glukozo v etanol prvenstveno z Embden � Meyerhofovo metabolno potjo. Skozi zapleteno mre�o reakcij se tvori 2 mol etanola, ogljikov dioksid in ATP na en mol glukoze. Na ta način da vsak gram glukoze 0,51 g alkohola, praktično pa pridobimo le 90 do 95% od teoretične vrednosti. SLIKA 4: Poenostavljen prikaz aerobnega in anaerobnega katabolizma Saccharomyces cerevisiae (ADP: adenozin difosfat; ATP: adenozin trifosfat; TCA: citratni cikel) (Rheim, 1996). V začetni fazi fermentacije moramo kvasovkam zagotoviti nizko koncentracijo kisika za njihovo lastno biosintezo, rast in razmno�evanje. Vi�je koncentracuje kisika pa inhibirajo fermentacijo, kar označujemo kot Pasteurjev efekt. Poleg kisika rabijo kvasovke za pravilno vodenje vrenja tudi ogljik, du�ik, vodik, manj�e količine fosforja, �vepla, natrija in magnezija. Minerali kot so Mn, Co, Cu, Zn, organski rastni faktorji (aminokisline, nukleinske kisline in vitamini) pa morajo biti zastopani v sledovih. Dodatni nutritienti, ki jih moramo kvasovkam priskrbeti kot posamezne komponente pa so amonijeve soli in natrijev fosfat. Kvasovke so zelo občutljive za etanolno inhibicijo. �tudije so pokazale, da je alkoholna toleranca odvisna od ma�čobnokislinske sestave kvasnih plazminih membran (Rheim, 1996).

ADP iz biosinteze

Glikoliza 1 mol glukoza 2 piruvat

acetaldehid 2 etanol

2 CO2

anaerobno

aerobno

Reducirani nukleotidi

TCA cikel

6 CO2

Reducirani nukleotidi

2 ATP zaloga ATP

V biosintezo

Elektronska transportna veriga

3 O2

6 H2O

Celična masa

ADP

36 ATP

Oksidirani nukleotidi


4.2. FERMENTACIJA Z BAKTERIJAMI Bakterije kot Enterobacteriaceae, Spirochaeta, Bacteroides in druge, enako kot kvasovke metabolirajo glukozo po Embden�Meyerhof-ovi metabolni poti. Entner�Doudoroff-ova pot pa je drugi način izkori�čanja glukoze nekaterih drugih bakterij. Glukoza se fosforilizira in potem oksidira v 6-fosfoglukonat. V tej točki se nadalje z dehidrogenacijo oblikuje 2-keto-3-deoksi-6-fosfoglukonat (KDPG), ki se nato razcepi z KDPG aldolazo. Končni produkt je 2 mol piruvata na 1 mol glukoze in 1 mol ATP. �tevilni drugi končni produkti se producirajo z mikroorganizmi kot so entero skupina anaerobnih fermentativnih bakterij. Te fermentirajo po kislinskem tipu fermentacije. Fosfoenolpiruvat, ki nastane pri glikolizi, lahko preide v različne končne produkte kot so etanol, acetat, sukcinat, laktat in 2,3-butandiol (Rheim, 1996). SLIKA 5: Metabolne poti oblikovanja produktov fermentacij me�anih kis(Rheim, 1996). 5. BIOINŽENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA Poznamo različne surovine za pridobivanje etanola preko fermentacije z od nekdaj je znano alkoholno vrenje mo�ta. Glavne surovine za induetanola so polisaharidi in sladkorji. Od sladkornih surovin se največ upsirotka in le izjemoma sadne surovine. Za fermentacijo rabimo sladkor, za izhodno surovino npr. �krob ali celulozo, izvesti encimsko ali kisliuspe�no opravljeno alkoholno vrenje je treba paziti na primerno konprimeren pH in temperaturo. Mikroorganizem, ki se uporablja za fermentacijo, mora prenesti vsladkorja in etanola in mora hitro fermentirati prisoten sladkor. V proi

fosfoenolpiruvat

CO2

oksalacetat

Pi

NADH

ADP

ATP

piruvat

NADH2 NAD

NADH2

Laktat dehidrogenaza

piruvat

CoA

Piruvat dehidrogenaza

laktat

CO2 α-acetolaktat

CO2

acetoin

NAD

Acetil-CoA

format

H2

CO2

2,3-butandiol

P CoA

Acetil-fosfat

Acetat kinaza

ADP

ATP

acetat

CoA

acetaldehid

NADH2

NAD

NADH2

NAD

Actaldehid dehidragenaza

Etanol dehidrogenaza

etanol

lin in 2,3-butandiola

mikroorganizmi . �e strijsko proizvodnjo orablja melasa, nato zato moramo, če gre nsko razgradnjo. Za centracijo sladkorja,

isoke koncentracije zvodnji se uporablja

2

malat

H2O

fumarat

NAD

sukcinat

NADH2

NAD


največ Saccharomyces cerevisiae. Ta hitro fermentira D-fruktozo, D-glukozo, saharozo, maltozo počasneje pa D-manozo in D-galaktozo. Pri proizvodnji etanola iz laktoze (sirotka) pa se uporablja Saccharomyces fragilis. Alkoholno vrenje izvajamo v zaprtih vrelnih posodah običajno pri 28oC-30oC. Je eksotermen proces. Prisotnost kisika je nujna samo na začetku za namno�itev potrebne količine mikroorganizmov. Med fermentacijo pa �e nastaja CO2, ki vzpostavi anaerobne pogoje. Le-ta se odvaja stran iz vrelne posode in čisti v posebni aparaturi. Fermentacija je običajno končana po petdesetih urah ali manj, kar je odvisno od vrste kvasovk, temperature vrenja, koncentracije sladkorja, itd. Po destilaciji dobimo patočna olja in etanol. Tako dobljeni etanol, ki mu v industriji rečemo �pirit, vsebuje majhne količine neza�elenih primesi, kot so aldehidi, estri, organske kisline, itd. Pri odstrajevanju teh primesi je potrebna ponovna destilacija in rektifikacija (Johanides, 1976). 5.1. SUROVINE ZA INDUSTRIJSKO PRIDOBIVANJE ALKOHOLA 5.1.1. SUROVINE, KI VSEBUJEJO SLADKOR 5.1.1.1. SLADKORNI TRS Pridelujemo ga prvenstveno za produkcijo saharoze in melase, pa tudi kot surovino v etanolni fermentaciji. Fermentirajoči ogljikovodiki iz sladkornega trsa lahko direktno izkori�čamo v obliki trsnega soka in melase. Trsni sok pripravljamo z mletjem sve�e rastline, nato ekstrakcijo, bistrenjem z apnenim mlekom, z dodatkom H2SO4 pa oborimo organske komponente. Tako dobimo zeleno lepljivo tekočino, nekoliko bolj viskozno od vode, z 12,13% saharozno vsebnostjo. Soku z izparevanjem odstranimo vodo, da dobimo �eljeno koncentracijo in ga direktno uporabimo za fermentacijo. Slaba lastnost trsnega soka je, da ni stabilen v primeru dalj�ega skladi�čenja. Melasa (sladkorni sirup) je nekristalizirajoči ostanek potem, ko je saharoza �e kristalizirala. Ta visoko viskozni material je sestavljen iz saharoze, glukoze in fruktoze (invertirani sladkor) v koncentraciji 50 � 60 %. Melasa je dolgo obstojna, razredčujemo pa jo lahko neposredno pred uporabo (Rehm, 1996). 5.1.1.2. SLADKORNA IN KRMNA PESA Sladkorna pesa je bolj raz�irjena kot sladkorni trs, ker lahko raste v različnih klimatskih in pedolo�kih pogojih, zato jo najdemo v Evropi, Afriki, Avstraliji, Novi Zelandiji in ZDA. Vsebuje manj fermentirajočih sladkorjev kot sladkorni trs, vendar pa lahko pridelek pese prese�e pridelek trsa na enoto pridelovalne povr�ine, če so pogoji kultivacije ugodni. Pesno melaso pridobivamo enako kot pri sladkornem trsu. Neobdelana surovina pese vsebuje du�ikova in druga organska, pa tudi neorganska hranila, ki so potrebna za uspe�en začetek fermentacije, tako da jih v reaktor ni potrebno dodajati (Rehm, 1996). 5.1.1.3. SADJE Kvasovke lahko fermentirajo sladkor (navadno 6 - 12 % fruktoze) tudi iz predhodno neobdelanega sadja kot so marelice, hru�ke, ananas, vendar se ta način pridobivanja alkohola le redko uporablja. Sadje je zelo občutljivo na mehanske po�kodbe, pa tudi na mikrobiolo�ki kvar, kar vodi do znatnih izgub fermentirajočih sladkornih komponent.


Zelo pomembna surovina iz katere kvasovke kot stranski produkt proizvedejo etanol je grozdje. Uporablja se pri proizvodnji vina, za produkcijo industrijskega etanola pa uporaba grozdja kot surovine ni ekonomično smotrna (Rehm, 1996). 5.1.2. SUROVINE, KI VSEBUJEJO ŠKROB Za fermentacijsko proizvodnjo etanola se uporablja več različnih vrst �kroba (�krob iz koruze, kasave, manjoke, tapijoke, sladkega krompirja, jeruzalemske artičoke). Izbira primernega substrata zavisi od �tevilnih faktorjev, kot je tudi klima, geografska lega, kjer je mesto produkcije. Tako so koruza, p�enica, ri�, krompir in sladkorna pesa najpogostej�i substrati v Evropi in Severni Ameriki, sladkorni trs, melasa, kasava, balasu oreh in sladki krompir pa vir za produkcijo etanola v tropskih de�elah, kot je Brazilija (Rehm, 1996). 5.1.2.1. KORUZA Je najbolj pogosto uporabljena surovina za produkcijo etanola, ima relativno velik pridelek, �iroko območje rasti in ker je razmerje energije, ki je potrebna za rast rastline in energije, ki jo na koncu odda rastlina, vi�je od drugih pridelkov z izjemo sladkornega trsa. Zelo pomembno je tudi, da lahko koruzo izkori�čamo takoj po pobiranju pridelka. Pribli�no 66 % koruznega zrnja pridelanega v ZDA se porabi za hrano ali krmo in le 5 % zrnja je neustreznega in to surovino lahko uporabljajo za alkoholno produkcijo (Rehm, 1996). 5.1.2.2. KASAVA Kasavina korenina vsebuje 20 - 35 ut. % �kroba in 1 - 2 % proteinov, razvili pa so tudi sorte z 38 % �kroba. Prednosti kasave kot surovine za etanolno proizvodnjo daje: visok alkoholni izplen na hektar, raste tudi v predelih s slab�imi pogoji, odporna je na bolezni, med obiranjem in predelavo lahko poteče 48 ur, ne da bi nastopil kvar, kasavini odpadki se lahko su�ijo v plinskem kotlu in so kot taki primerni za hrambo do enega leta, pri fermentaciji niso potrebne dodatne kisline ali hranila, lahko poteče pri nevtralnem pH (ne pride do korozije na strojih) (Rehm, 1996). 5.1.2.3. SLADKI KROMPIR Sladki krompir vsebuje veliko �kroba. Prah sladkega krompirja, ki ga dobimo z zmrzovalnim su�enjem in drobljenjem, ima 64,4 % �kroba na suho te�o (Rehm, 1996). 5.1.2.4. TOPINANBUR Kot surovino uporabljamo gomolje. Rastlina raste tudi v revnej�i zemlji, je odporna na �kodljivce in rastlinske bolezni, pa tudi na nizke temperature. Ima visok hektarski donos (9 ton/ha za krmo in 45 ton/ha gomoljev) in veliko vsebnost ogljikovih hidratov (18 %), ki slu�ijo kot dober vir fermentacijskih sladkorjev za proizvodnjo etanola. Izkoristek je 80 - 90 %-ni, pridelek etanola pa 3,9 - 4,5 l/ha (Rehm, 1996).


5.1.2.5. ENCIMI ZA RAZGRADNJO �KROBA - α - amilaze so endoamilaze, ki hidrolizirajo glikozidne vezi v notranjosti �krobne molekule. Povzročajo hidrolizo α-1,4 vezi: v �krobu najprej v srednje velike molekule, nato pa med počasno reakcijo v maltoze, glukoze in razvejane oligosaharide. Le-ti nastanejo zaradi α-1,6 vezi, ki jih α-amilaze ne morejo razgraditi, zato to vez encim preskoči in deluje na naslednjo α-1,4 vez. Encim pa najdemo v rastlinah, tkivih sesalcev in mikroorganizmih (Rehm in sod., 1996) - β - amilaze so eksoamilaze, ki odcepljajo maltozo zunaj iz nereducirajočega konca �krobne molekule. Prav tako cepijo α-1,4 glikozidne vezi in tako dobimo maltozo, glukozo in limitne dekstrine, ker β-amilaza ni sposobna hidrolizirati α-1,6 glikozidnih vezi v �krobu. Najdemo jo v večini vi�jih rastlin, producirajo pa jo tudi v bakteriji rodu Bacillus. - Glukoamilaze so encimi, ki cepijo α-1,3, α-1,4 in α-1,6 glikozidne vezi iz nereducirajočega konca �krobne verige. Glukoamilaza ni sposobna popolnoma hidrilizirati �kroba do glukoze, za to potrebuje sodelovanje endoencima. Razdelimo jih na dve skupini: glukoamilaze I:

Adsorbirajo se direktno na �krob in ga s svojo visoko razgrajevalno sposobnostjo relativno hitro razgradijo. Njihova aktivnost je povečana v prisotnosti α-amilaze.

glukoamilaze II: V nasprotju z glukoridozami I se ne morejo direktno vezati na �krob in ka�ejo �ibkej�o razcepno sposobnost od le-teh. Njihovo počasno hidrolizacijo ne pospe�i niti prisotnost α-amilaze. Glukoza, posebej pa maltoza inhibirata adsorpcijo encima, pa tudi hitrost razgradnje �kroba.

Saharifikacija s pomočjo encimov je la�je izvedljiva z �itnim �krobom, kot pa s koreninskimi, izjema je le �krob surove kasave, ki je z amilazami la�je razgradljiv kot pa koruzni �krob. Poleg encimske razgradnje �kroba lahko izvedemo tudi kislinski hidrilizo �kroba; tako da kislinska hidroliza kasavinega �kroba več kot 98,8 % reducirajočih sladkorjev, vendar pa postopek ni priporočljiv, saj daje nizek alkoholni pridelek (pribli�no 75 % teoretične vrednosti), to pa pripisujemo nastanku nefermentirajočih in/ali inhibitornih stranskih produktov (Rehm, 1996). 5.1.3. SUROVINE, KI VSEBUJEJO LIGNOCELULOZE Uporaba lignoceluloznih materialov kot vir fermentiranih produktov, kot je etanol, je v zadnjih desetletjih vedno bolj zanimiva, ker je svetovna zaloga celulozne biomase trenutno večja kot vsi drugi viri ogljikovih hidratov. Celuloza je linearni biopolimer amiloglukoznih enot povezanih z β-1,4 glikozidnimi vezmi. Ligninske komponente celulozne biomase so glavni vzrok te�av, ki so neločljivo povezane s celulozno hidrolizo. Ligninski matriks, ki oblikuje ovoj okrog celuloznih miofibril daje za�čito pred hidrolizo, k njej pa prispeva tudi nativna konformacija celuloze. Tako za ločevanje celuloze od njenega za�čitnega ligninskega ovoja uporablajmo različne fizikalne ali kemične metode, od povečevanja povr�ine celuloznega kristalita, zmanj�anja, do napihovanja (Rehm, 1996).


5.1.3.1. MIKROORGANIZMI, KI IZKORI�ČAJO LIGNIN �tevilni mikroorganizmi producirajo encime, ki razgrajujejo lignin. Uporaba le-teh daje pomebne stranske produkte pri proizvodnji etanola. Za tak�en način biolo�ke predobdelave rabimo manj stresnih pogojev, kot za vse ostale kemične metode, zato tudi pridobimo veliko manj stranskih reakcij in manj inhibitornih snovi. Od mikroorganizmov, ki so vključeni v ligninsko razgradnjo je znana Partia monticola in druge rjave gnilobne plesni (Rehm, 1996). 5.1.3.2. KISLINSKA HIDROLIZA Komercialni postopki za produkcijo etanola iz celuloznih materialov uporabljajo kislinsko hidrolizo za spro�čanje fermentirajočih sladkorjev iz naravnih zalog. Poznamo dva tipa kislinske hidrolize: 1. Kislinsko hidrolizo z visoko koncentracijo kisline pri nizki temperaturi (72 % H2SO4 ali

42 % HCl), vendar je slaba stran uporabe kisline ta, da je ne mormo reciklirati. 2. Nizka koncentracija kisline pri visoki temperaturi (Rehm, 1996). 5.1.3.3. ENCIMSKA HIDROLIZA Celulaze - encimi, ki so jih na�li v �tevilnih mikroorganizmih različnega izvora, so sposobni hidrolizirati celulozo in druge podobne komponente. Celulaze so inducirani encimi in se producirajo le, ko mikroorganizem raste v okolju s celulozo, celobiozo, laktozo, saharozo ali drugimi glukani, ki vsebujejo β-1,4 vezi. So inhibirani s produktom, zato med potekom hidrolize odstranjujemo njene produkte. Slaba stran teh encimov je hitra denaturacija (Rehm, 1996).

5.1.4. ODPADKI INDUSTRIJSKIH OBRATOV �ivilska industrija je vir različnih odpadnih snovi. Izkori�čanje le teh je zelo ote�eno, saj moramo odpadke predhodno obdelati. 5.1.4.1. �VEPLOVE ODPLAKE Odplake nastanejo pri obdelavi lesa za pulpo in pri proizvodnji papirja. Glavne sestavine odplak pa so lignosulfonati in pentozni sladkorji. Predriprava teh odplak pred fermentaacijo ni zahtevna. Potrebno je parno ali aeracijsko odvzemanje SO2 pri nizkem pH, ker SO2 inhibira mikrobno rast. Po aeraciji pa moramo pH naravnati na optimum z du�ikovimi in fosfatnimi hranili (Rehm, 1996). 5.1.4.2. SIROTKA Je odpadna tekočina, ki nastane pri proizvodnji sira in kazeina. Sladka sirotka nastane pri izdelavi različnih trdih in mehkih sirov, sirotkina kislina pa pri produkciji skute (Rehm, 1996).


5.2. PRIPRAVA SUBSTRATOV ZA INDUSTRIJSKI BIOPROCES PRIDOBIVANJA ETANOLA 5.2.1. PRIDOBIVANJE ETANOLA IZ KORUZE Zrna najprej obrusimo, da izpostavimo jedro. Dodamo vodo, reguliramo pH in zrna kuhamo, da �krob �elira. Nato dodamo glivno amilazo in kvas. Fermentacija poteka 48 ur pri 32oC. Pri tem se 90% �kroba pretvori v alkohol. Po končani fermentaciji destiliramo do 50 vol.% alkohola. Z nadaljno destilacijo pa odstranimo aldehide, ketone ter patočna olja in dobimo 95% alkohol. Če hočemo dobiti anhidridni etanol, moramo ta 95% etanol dehidrirati. V destilacijski kotel dovajamo preostalo vodo, v kateri so raztopljene in neraztopljene snovi in jo nadalje centrifugiramo. 50% netopnih snovi vodimo v izparilnik in zme�amo s snovmi iz centrifuge. To zmes su�imo na 10% vla�nost in uporabljamo kot hrano za �ivino. Iz 816,5 .

103 kg �ita dobimo 175,0 . 103 kg CO2 in 95 kg stranskih produktov (Rehm, 1996). Ogljikov dioksid 175 t/dan

Aldehidi

(patočna olja) 95 kg/dan Anhidriran etanol 227000 l/dan �ivalska krma 195 t/dan SLIKA 6: Poenostavljen prikaz bioprocesa proizvodnje etanola iz koruze (Rehm, 1996; po Scheller, 1976)

Namno�evanje kvasovk in encimov

Mletje in kuhanje Fermentacija

Destilacija

Dehidracija

Su�enje Koncentriranje tekočine

Pivs

ka d

estil

acija

Koruza


5.2.2. PRIDOBIVANJE ETANOLA IZ KORENIN KASAVE Kasava je bila prva komercialna rastlina na svetu za pridobivanje etanola. Sve�e korenine kasave stehtajo, operejo, olupijo in zmeljejo v ka�o. Del te ka�e su�ijo in naredijo moko. Suha kasava je namreč lahko shranjena zelo dolgo, ne da bi pri tem izgubila �krob, tako kot sladkorni trs. α - amilaza za razgradnjo �kroba je dodana v dveh korakih. Iz �kroba dobimo glukozo in nazadnje iz nje alkohol. Pridelek alkohola iz kasave je 165 � 180 l/t. Največji problem pri pridobivanju etanola iz kasave je velika količina energije, ki je potrebna za pretvorbo �kroba v fermentacijski sladkor. Za alkohol, pridelan iz kasave, porabimo okrog 1,8 kg pare za 1 kg kasave (Rehm, 1996). 5.2.3. PRIDOBIVANJE ETANOLA IZ KROMPIRJA Krompir se zdrobi in zme�a z vodo v me�alcu. Encim, ki se uporablja, je Termamyl 60, izdelan v Novo Industri. Po encimski obdelavi se masa segreva na 90�95oC s hitrim dodatkom pare v kondenzatorju. Ta masa se prenese v kotel, segret na 150oC in pritiskom 10,1 MPa. Tu se zadr�i tri minute; hitrost je pribli�no 3 m/s. Maso nato na hitro dovajamo v atmosferski tlak, para, ki se ob tem sprosti , pa segreje �krobno zmes. Nato se masa ohladi na 70oC in doda industrijsko amilazo bakterijskega izvora. Včasih je potrebna �e pH regulacija. Masa se ohladi na 30oC, nato se napaja v posodi s kvasovkami, kjer po poteku fermentacije dobimo etanol (Rehm, 1996). 5.2.4. PRIDOBIVANJE ETANOLA IZ RASTLINE TOPINANBUR Sok iz gomoljev proizvedemo v dveh stopnjah, ki na koncu vsebuje 12-15% sladkorjev. Sok je encimsko hidroliziran pri 56oC 2 uri in pri pH 3,8. V rastlini je prisotnih dovolj encimov, �e posebej če je bila �etev spomladi. Po ohladitvi se sok fermentira, 90% pridelek etanola je pridobljen po 28-tih urah (Rehm, 1996). 5.2.5. PRIDOBIVANJE ETANOLA IZ CELULOZE 5.2.5.1. PROCES PRIDOBIVANJA ETANOLA IZ LESA Z RAZREDČENO �VEPLENO KISLINO Je eden prvih procesov industrijske hidrolize, ki se je razvil med prvo svetovno vojno (Ewen in Tomlison, 1914-1918). Ostanki lesa se zme�ajo z vročo vodo in �vepleno kislino pri povi�ani temperaturi in tlaku. Po 70-tih minutah je masa vodena v posodo s pritiskom 456 kPa in nato v posodo z atmosferskim pritiskom. Kondenzati iz teh posod pa vsebujejo furfural in metanol, zato izvedemo destilacijo, da dobimo ta dva produkta. Po tem dvostopenjskem procesu dobimo raztopino, ki vsebuje sladkor. Etanol destilirajo do 95 vol.%. V �vici so razvili proces hidrolize z razredčeno kislino (Mendelsohn in Wettstein, 1981), pri katerem uporabljajo mehki les, iz katerega dobijo prek saharifikacije etanol za gorivo. Hidroliza poteka pri tlaku 1 kPa in pri temperaturi 140-180oC. Hemiceluloza in celuloza iz lesa se hidrolizirata z razredčeno kislino. Raztopino kisline in sladkorjev odstranijo iz


reaktorja, lignocelulozno maso, ki zapu�ča reaktor, pa nevtralizirajo s CaCO3 pri zni�ani temperaturi. Nato dodajo hranila in kvasovke. Po fermentaciji dobijo gorivo etanol, katerega skoncentrirajo z destilacijo. Pridelek alkohola je 240 l/t suhega lesa (Rehm, 1996). 5.2.5.2. PROCESI HIDROLIZE Z MOČNO KISLINO Neosu�en les dajo v kolono in z razredčeno �vepleno kislino odstranjo hemicelulozo. Ligninsko celulozo vodijo v kolono kjer jo hidrolizirajo do glukoze z �vepleno kislino. Ko raztopina glukoze in �veplene kisline zapu�ča vrh stolpa, se glukoza loči z elektrodializno membrano. To glukozo pred fermentacijo nevtralizirajo in deionizirajo. Lignin, ki zapu�ča kolono na dnu ločijo od kisline s filtracijo in pranjem (Rehm, 1996). 5.2.5.3. PROCES PRIDOBIVANJA ETANOLA IZ ČASOPISNEGA PAPIRJA Z ENCIMSKO HIDROLIZO Časopisni papir je uporabljen kot substrat ker vsebuje veliko celuloze. Glavna dela stro�kov celotnega procesa sta produkcija encimov in predhodna obdelava substrata. Najbolj�i način, da dobimo maksimalno količino celuloze, je mletje s kroglami, vendar je metoda draga (Rehm, 1996). 5.2.6. PRIDOBIVANJE ETANOLA IZ TRDNIH MESTNIH ODPADKOV S KISLINSKO HIDROLIZO Komponente, ki vsebujejo celulozo v teh odpadkih, so bistvene surovine za konverzijo v sladkorje s kislinsko hidrolizo. Najbolj�i pogoji za hidrolizo so pri visoki koncentraciji kisline (80% H2SO4 ali 41% HCl) pri temperaturi 40oC. Hidrolizati iz lignoceluloze vsebujejo heksoze in tudi veliko pentoz. Produkcija etanola iz celuloze je bolj�a (heksoze � glukoza) kot iz hemiceluloze (pentoze, heksoze). Ksiloza daje etanol s pomočjo bakterij (E.coli). V reaktorjih s kontroliranim pH so proučevali okoli�čine ki vplivajo na njeno rast in metabolizem: pH, koncentracija ksiloze, obogatenost s hranili, izkoristek C5/C6 me�anic, občutljivost na kisik, odpornost na ocetno kislino. Maksimalna produktivnost je 0,76g/lh s Ca(OH)2 in SO2 kot katalizatorjem (Rehm, 1996). 5.2.7. PRIDOBIVANJE ETANOLA IZ SULFITNIH LUŽNIC Prve raziskave fermentacije sladkorjev iz sulfitnih lu�nic so bile na �vedskem (Wallih in Ekstrom, 1907). Pridelava v Belingamu poteka pri 90oC. Dodane so kvasovke, amoniak ali urea. Koristnih je pribli�no 95% fermentabilnih heksoz (sladkorjev) v ciklu, ki traja 15-20 ur. Okrog 80% sladkorjev je fermentiranih v prvih dveh kolonah in ostalih 15% v drugih kolonah, napolnjenih s Saccharomyces cerevisiae. Fermentacijska tekočina vsebuje okrog 1% kvasovk na volumen in se loči s centrifugacijo v dva pretoka. Prvi vsebuje 15% kvasovk na volumen in se vrne v prvo vrelno posodo in nadaljne destilira. Na koncu procesa dobimo 95 vol.% alkohol (Rehm, 1996).


5.2.8. PRIDOBIVANJE ETANOLA IZ SIROTKE Na Irskem proizvajajo etanol iz sirotke, ki ostane pri predelavi sira. Sirotka najprej teče skozi sita in se nadalje loči s posebno ultrafiltracijo. Tekočina pronica v �est vrelnih posod, od katerih ima vsaka kapaciteto pribli�no 200 m3. Ekonomska analiza alkohola proizvedenega iz sirotke je pokazala, da se lahko primerja s produkcijo sintetičnega alkohola iz etilena. Iz sirotke, ki vsebuje 30-35% trdne snovi, dobimo 6,5% etanolnega pridelka (s pomočjo Saacharomyces cerevisiae in kisline) (Rehm, 1996). 6. EKOLOŠKI VIDIK BIOPROCESA Ekolo�ka zavest ljudi je v zadnjem času zelo narasla. Le kdo je pred nekaj desetletji govoril o varstvu narave ali sploh vedel, kaj pomeni beseda ekologija? Danes srečamo ta problem na vsakem koraku. Zato se čedalje več ljudi vedno bolj zavzeto ukvarja z enim izmed največjih problemov - z varstvom okolja. Veliko vlogo pri tem igra gorivo s svojimi strupenimi izpu�nimi plini (www.greenfuels.org/ethaair.html, 2000) 6.1. ETANOL - AVTOMOBILSKO GORIVO PRIJAZNEJŠE ZA OKOLJE Fermentacija sladkorjev v alkohol je do sedaj najbolj razvita metoda kemijske konverzije biomase. Tak postopek se najobse�nej�e razvija v Braziliji, kjer letno pridobijo okoli milijon ton etanola za pogon vozil. Brazilija je največji svetovni porabnik etanolnega goriva saj skoraj polovica njihovih avtomobilov deluje na čisti etanol. Danes veliko dr�av okoli sveta testira kisikova in čista (blizu 100 %) alkoholna goriva. V zdru�enih dr�avah Amerike so etanolne me�anice dosegle uporabo pribli�no 12 % celotnega trga. Etanol je alternativno gorivo prihodnosti. Kot obnovljivo visoko oktansko motorno gorivo je veliko bolj prijazno za okolje. Etanol je precej fizikalno in kemično različen od nafte in ima bolj�e lastnosti. Ena izmed njih je, da je etanol pridobljen iz �itaric ali iz drugih obnovljivih poljedeljskih rastlin. Prevladujoči viri so koruza, p�enica in sladkorni trs, odvisno od lokacije, cene in uporabnosti. Druge �itarice; sladkorna pesa, krompirjevi odpadki in sirno vodo (sirotka), tudi uporabljajo, a le če je dobavljivo po zmerni ceni. Trenutno potekajo raziskave kako bi iz celuloze, trave, slame, odpadnega papirja (kartona), celo iz mestnih odpadkov izdelovati etanol veliko cenj�i od fosilnih goriv. V Braziliji večinoma uporabljajo me�anico bencina, ki vsebuje 10% etanola, kar pa �e zelo pripomore k zmanj�anju emisij strupenih plinov v ozračje (http://kit.kibla.org/-marjan/vegan/predal/Etanol.htm, 2000). 6.1.1. ZMANJŠANA EMISIJA ŠKODLJIVIH PLINOV Z UPORABO ETANOLNE MEŠANICE GORIVA 6.1.1.1. CO2 - OGLJIKOV DIOKSID Ogljikov dioksid je normalen produkt gorenja in se spu�ča v ozračje, ko etanol pa tudi druga goriva gorijo v avtomobilskih motorjih.


Večino tekočih goriv (bencin, diesel,�) pridobivamo iz fosilnih ostankov ogljikovodikov. Vsa ta goriva pa povzročajo povečanje emisije CO2 v atmosfero. Nasprotno pa uporaba obnovljivega goriva kot je etanol zmanj�a vsebnost CO2 v ozračju za 6-10 %. Ta CO2 se asimilira v rastlinah skozi fotosintezo, nekaj pa se ga reciklira v organskem tkivu rastlin. 6.1.1.2. CO - OGLJIKOV MONOKSID Ogljikov monoksid nastaja z nepopolnim izgorevanjem goriva predvsem takega, ki v svoji strukturi ne vsebuje kisika. Ker pa etanol vsebuje kisik, omogoča v motorjih bolj popolno izgorevanje goriva in s tem manj�i izpuh. S tem je zmanj�ana emisija ogljikovega monoksida v ozračje. Raziskave so pokazale, da je izhajanje tega strupenega plina v atmosfero z uporabo goriva kot etanolne me�anice za več kot 30 % zmanj�ana. 6.1.1.3. O3 - OZON Ozon se tvori, ko se v zrak spu�čajo izpu�ni plini (ogljikovodiki , CO2 in organski du�ikovi oksidi z NO skupino), tam pa ob prisotnosti sončne svetlobe in toplote reagirajo. Ta zemeljski ozon ima �kodljiv vpliv na dihalne funkcije, po�koduje mnogo rastlin in ogro�a zdravje dreves in druge vegetacije. Zemeljski ozon nima nobene povezave z ozonom v stratosferi, ki varuje zemljo pred sončnimi �kodljivimi ultravijoličnimi �arki. Etanolna gorivo v primerjavi z navadnim gorivom posredno močno zmanj�a nastajanje zemeljskega ozona . 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PROIZVODNJI HRANE Etanol je prisoten v mnogih �ivilih. Dejstvo je, da etanol najdemo v fermentirani hrani in v hrani ki jo obogatimo z etanolom (npr. rum, liker). Pojavlja se tudi v pekarskih fermentiranih produktih kot je kruh, v sledovih celo po pečenju. Uporablja se tudi kot konzervans. Etanol, kot produkt metabolizma zorenja in staranja, je vedno prisoten v sve�em sadju in zelenjavi, v njihovi aromi. Vsebnost etanola v hrani lahko nara�ča od 0% (v primeru brezalkoholnih napitkih) do 50% (ali več - v zelo močnih alkoholnih pijačah). Pomembna vloga etanola v hrani je tudi antimikrobna aktivnost. Etanol igra v hrani skozi tisočletja različne vloge. Včasih je bila velika poraba alkoholnih pijač pri u�ivanju hrane in pri navezovanju medsebojnih odnosov. Dandanes pa smo spoznali alkohol kot resen zdravstveni in socialni problem (www.uniud.it/ffe/cost96/lerici.htm, 2000). 7.1. VINO IN PIVO Vino nastane, ko kvasovke v mo�tu izkori�čajo sladkor s fermentacijo (anaerobno). Stranske proizvode tega anaerobnega biopocesa (etanol in ogljikov dioksid) pa izločajo v medij. Etanol ostane v tekočini, ogljikov dioksid pa se sprosti v ozračje. Izjema so peneča vina. Pri aerobnih pogojih pa se v vinu namno�ijo ocetnokislinske bakterije, ki etanol izkori�čajo kot vir energije. Če pustimo ciknjeno vino (vino v katerem so se �e začele razvijati ocetne bakterije), da stoji �e nekaj tednov bodo ocetne bakterije nadaljevale presnovo etanola v ocetno kislino do visokih koncentracij � nastane kis. Pivo je tudi alkoholna pijača, čeprav vsebuje manj etanola kot vino, torej so tudi v pivovarnah kvasovke glavni dejavnik (http://refosk.obala.net/clanki/IzMostaPrekoVinaVKis.html, 2000).


7.2. UPORABA ETANOLA KOT KONZERVANSA Konzervansi so snovi naravnega ali umetnega izvora, ki se dodajajo v �ivilo za za�čito proti mikrobiolo�kem kvaru oz. za podalj�anje obstojnosti �ivila. Etanol se ne uporablja kot konzervans, vendar njegova prisotnost v �ivilih ugodno vpliva na mikrobiolo�ko stabilnost, ter poveča aktivnost dodanim konzervansom (Pokorn, 1990). 7.3. OSTALA UPORABA ETANOLA • v kozmetični industriji • kot topil pri proizvodnji barv, smolnih barv, lakov, organskih kemikalij, itd • kot razku�ilo (bolnice, muzeji) • za sterilizacijo povr�in in drobne opreme • kot antifriz v avtomobilskih motorjih • pri izdelavi eksploziva (Schroter, 1993)


8. REFERENCE Adamič J., 1992. Gljive. V: Raspor P. (ur.). 1992. Biotehnologija, BIA d.o.o., Ljubljana, s. 64 Cör S., 1997. Vpliv sestave jabolčnika na kakovost jabolčnega kisa. Diplomska naloga. Biotehni�ka fakulteta, Oddelek za �ivilstvo, Ljubljana, 5 s. Hui Y. H., 1991. Encyclopedia of food science and technology. Awiley � Interscience Publication, 3 s. Johanides V., Korčulanin A., Marić V., Divjak S., Vla�ič D., 1976. Industrijska mikrobiologija, s. 159-164 Pokorn J., 1990. Mikrobiologija v �ivilskih procesih. UL, Ljubljana, 3 s. Raspor P., 1996. Kvasovke. V: Raspor P. (ur.), 1996. Biotehnologija, Bia d.o.o., Ljubljana, 3s. Rehm H. J., Reed G., Pühler A., Stadler P., 1996. Biotechnology Second, completely revised edition. Weinheim, s. 121-198 Schroter W., Lautenschlager K.-H., Bibrack H., Schnabel A., 1993. Kemija, Splo�ni priročnik Tehni�ka zalo�ba Slovenije. Ljubljana, 2 s. �ikovec S., 1993. Vinarstvo od grozdja do vina. ČZP Kmečki glas, Ljubljana, 4 s. Smole � Mo�ina S., 1996. Izbor, priprava in shranjevanje industrijskih biokultur. V: Raspor P. (ur.). 1996. Boitehnologija, BIA d.o.o., Ljubljana, s. 350, 359-361 Smole - Mo�ina S., Jamnik P., 1998. Eksperimentalne vaje iz �ivilske mikrobiologije, splo�na mikrobiolo�ka tehnika, za �tudente 1. letnika �ivilske tehnologije, Biotehni�ka fakulteta. Ljubljana, 1 s. Smole � Mo�ina S., Marić V., 1992. Bakterije. V: Raspor P. (ur.). 1992. Biotehnologija, BIA d.o.o., Ljubljana, s. 30-32 Stryer L., 1991. Biochemistry, �kolska knjiga. Zagreb, 4 s. Zlatič E., 2000. Raziskave vpliva etanola na bisintezo in oksidacijo α-farnezena v jabolkih "Granny smith". Diplomska naloga. Biotehni�ka fakulteta, Oddelek za �ivilstvo. Ljubljana, 10s. http://calvin.biotech.wisc.edu/jeffries/, 2000 http://kit.kibla.org/-marjan/vegan/predal/Etanol.htm, 2000 http://refosk.obala.net/clanki/IzMostaPrekoVinaVKis.html, 2000 http://starfire.ne.uiuc.edu/~ne201/1997/richard/, 2000


http://starfire.ne.uiuc.edu/~ne201/1997/richard/history.html, 2000 http://www.cnie.org/nle/eng-12.html, 2000 http://www.comalc.com/, 2000 http://www.csusm.edu/DandB/Ethanol.html, 2000 http://www.ethanol.org/ethanol_info2.html, 2000 http://www.greenfuels.org/ethaair.html, 2000 http://www.learnaboutenergy.org/focus/part7.htm, 2000 http://www.pacificcoast.net/~mycolog/chapter6.htm, 2000 http://www.uniud.it/ffe/cost96/lerici.htm, 2000 http://www.whfreeman.com/ENVCHEM/ETH99.HTM, 2000

Documents

PROIZVODNJA ETANOLA*web.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/2000_01/...Industrijski bioprocesi: Proizvodnja etanola, Seminar, Biotehniıka fakulteta, −tudij živilske tehnologije,