UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNI−KA FAKULTETAweb.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/2000_01/Ocetna.pdf · * Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija. Proizvodnja ocetne

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNI�KA FAKULTETA

�IVILSKA TEHNOLOGIJA

PROIZVODNJA OCETNE KISLINE*

Janez Zavir�ek, Kristina Zidar, Veronika Zubin, Vesna Zupančič

(�tudentje tretjega letnika �tudija �ivilske tehnologije)

prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Pa� (mentorja)

Ljubljana, 2001

* Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Proizvodnja ocetne kisline, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije 2

POVZETEK Ocetna kislina imenovano tudi etanojska kislina (CH3COOH) in je pomembna karboksilna kislina. Je čista, brezbarvna tekočina. Čista 100% ocetna kislina imenujemo tudi ledocetna kislina, ker zmrzuje v led �e pri 16,6°C. Po vsem svetu poznajo ocetno kislino kot kis, če jo pridobimo s fermentacijo etanola s pomočjo ocetnokislinske bakterije. Mikroorganizmi, v tem primeru bakterija, pripadajo rodu Acetobacter. Ocetna kislina je glavna karakteristična komponenta kisa, saj njena koncentracija pogojuje jakost kisa. V kisu jo je pribli�no 4-6,5%. Poznamo tri načine pridobivanja kisa: Orleanski proces, Boerhaavejeva metoda in submerzna ali potopna metoda. Kis največ uporabljamo kot začimbo za vlaganje sočivja in gob in za uravnavanje kisline v predelanih �ivilih. Razen tega, da pridobivamo ocetno kislino kot kis, je ogromne količine pridelamo tudi sintetično. Etilni alkohol se spremeni z oksidacijo v ocetno kislino. Glavni proizvajalci sintetične ocetne kisline so Zdru�eni narodi, Zahodna Evropa, Japonska, Kanada in Mehika. Ocetnokislinske bakterije so po Gram-u negativne, obligatno aerobne bakterije, ki jih delimo v dva rodova: Acetobacter in Gluconobacter. Te bakterije imajo zmo�nost oksidacije alkoholov in sladkorjev. Rod Acetobacter je �e dolgo v uporabi za pridobivanje kisa, saj etanol pretvori v ocetno kislino. Oksidacija etanola poteka preko dveh zaporednih stopenj: oksidacije etanola v acetaldehid ter acetaldehida v acetat. Reakciji katalizirata encima alkohol dehidrogenaza in aldehid dehidrogenaza. Celokupna reakcija se glasi: 2 CH3CH2OH + O2 2 CH3COOH + 2 H2O. SUMMARY Acetic Acid also called Ethanoic Acid (CH3COOH), the most impotant of the carboxylic acids. It's a clear colorless, corrosive liquid. Pure 100% acetic acid is called glacial acetic acid, becouse it freezes to an ice-like solid at 16,6°C. There are three basic methods for making vinegar: the Orleans process, the Boerhaave method, and submerged fermentation. Vinegar controlling the growth of microorganisms; and enhancing flavors. Besides that produced as vinegar, vast amounts of acetic acid are prepared synthetically. Ethyl alcohol is converted industrially to acetic acid by oxidation. The major producers of synthetic acid are courrently the United States, Western Europe, Japan, Canada and Mexico. The acetic acid bacteria are Gram-negative and obligately aerobic bacteria consisting of two genera: Acetobacter and Gluconobacter. This bacteria are characterized by the strong activities to oxidized alcohols and sugars. Becouse of this activities, Acetobacter strains have been used since historic ages for the vinegar fermentation. The oxidation of ethanol proceeds according to the basic equation: 2 CH3CH2OH + O2 2 CH3COOH + 2 H2O. Acetic acid is produced by the two- step process. The first step is the oxidation of ethanol to acetaldehyde, the second is the oxidation of acetaldehyde to acetate. The reactions are catalyzed by enzymes: alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase.


KAZALO VSEBINE 1.UVOD��.��.��..�....3 2. ZGODOVINA BIOPROCESA��..��...�.4

2.1Biolo�ka proizvodnja��4 2.1.1 Orleanski proces��4 2.1.2 Proizvodnja z imobilizirano kulturo��..5

2.1.2.1 Starej�a metoda��...��..5 2.1.2.2 Novej�a metoda��...��..�5

2.1.3 Submerzni način��.��5 2.2 Kemijska proizvodnja��..��5

3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA��.�..��6 3.1Taksonomija ocetnokislinskih bakterij��6 3.2Izolacija in identifikacija ocetnokislinskih bakterij��..�..��7

3.2.1 Metode identifikacije��..��7 3.3 Pogoji, ki vplivajo na rast ocetnokislinskih bakterij��..��7

3.3.1 Koncentracija ocetne kisline��..��.7 3.3.2 Voda��8 3.3.3 Hranila��.�8 3.3.4 Kisik��..��.�.8 3.3.5 Etanol��..��8

3.4 Bakteriofagi��..�.��..8 3.5 Industrijsko uporabljeni rodovi��.��.��..8 3.6 Izbolj�anje aktivnosti ocetnokislinskih bakterij��..8

4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA��9 4.1 Aerobni proces��..��.10

4.1.1 Alkoholna fermentacija��.��..10 4.1.2 Ocetnokislinska fermentacija��..��..�.11

4.1.2.1 Etanol��..��.��...�11 4.1.2.2 Sladkor��..��..��12 4.1.2.3 Acetat��..��12 4.1.2.4 Ogljikovi hidrati��.�..��12 4.1.2.5 Du�ik��..��.�..��12 4.1.2.6 Rastni faktorji��.��.�.��13 4.1.2.7 Fiziologija��..��...��13

4.2 Anaerobni proces��..��..��.14 5. BIOIN�INIRSKE OSNOVE PROCESA ��..��...��14

5.1 Uvod��..�.��14 5.2 Pripravljalni postopki��....�..��.15

5.2.1. Postopki priprave za submerzni postopek pridobivanja ocetne kisline��.�..�..��15 5.2.2. Postopki priprave za pridobivanje kisa z uporabo povr�inske kulture��...��.��..��15 5.2.3. Postopki priprave za proizvodnjo z imobilizirano kulturo��.��..��.16

5.3 Potek bioprocesov��..��16 5.3.1. Potek submerznega postopka pridobivanja ocetne kisline��..��..�.��16 5.3.2. Potek pridobivanja ocetne kisline z uporabo povr�inske kulture��.��..�16 5.3.3. Potek pridobivanja ocetne kisline z imobilizirano kulturo��..��.�.�.��17

5.4 Zaključni postopki��..��17 5.4.1. Postopki bistrenja��..��..��17 5.4.2. Postopki konzerviranja��.��.�.��.17

6. EKOLO�KI VIDIK BIOPROCESA��..��.��18 6.1 Izpostavljanje in raz�irjenost��.��18 6.2 Učinki na zdravje��18 6.3 Varstvo in preprečevanje��..��.18 6.4 Učinki na okolje��..��18

7.UPORABA BIOPROIZVODA V PROIZVODNJI HRANE��..��18 7.1 Uporaba ocetne kisline��..��.18 7.2 Uporaba kisa��.��.�.19

8. REFERENCE��.��20


1. UVOD Ocetna kislina je najstarej�a organska kislina, ki so jo odkrili pri kisanju vina. V naravi je zelo raz�irjena, nekaj v obliki estrov, nekaj proste. Latinsko ime zanjo je Acidum aceticum (acetum = lat. ocet ), njene soli pa so acetati. Po nomenklaturi IUPAC pa je to etanojska kislina, soli etanoati. Je brezbarvna čista tekočina.

Tabela 1: Fizikalne in kemijske lastnosti ocetne kisline

Struktura CH3COOH Ionizacijska konstanta 1' 76 × 10-5 pri 25°C

pKa 4' 76 Tali�če -8' 5°C Vreli�če 118

okus Kisel vonj Oster

Čista 100% ocetna kislina imenujemo tudi ledocet, ker zamrzuje v led �e pri 16,5°C. Ocetna kislina je naravna kislina, vendar jo uporabljajo v industrijah pridelano iz nafte. Njena industrijska uporaba je zelo �iroka, saj z njeno pomočjo izdelujemo različne vrste: -kovinskih acetatov; uporaba v tiskalnih postopkih -vinil acetatov; v proizvodnji plastike in umetnih vlaken -celuloze acetatov; glavna sestavina v fotografskih filmih in tekstilu -hlapni organski estri; npr. etil in butil acetati, so topila barv, rastlinskih smol, lakov -� Ocetna kislina je tudi dodatek v bencinu, uporabljajo jo pogosto v kozmetiki npr: v lotionih za beljenje ko�nih pegic, v vodicah za roke in barvah za lase.

Vinilna plastikabarvelepila

Vinilacetat

Klor ocetnakislina

Farmacija Plastika

Lakiacetat

tekstilna vlaknafoto filmi

Anhidrid

Topila

Acetatniester

Tekstilfarmacevtski

kis

Nevtralizerjifungicidimesni

konzervansi

Soli

OCETNA KISLINA

Shema 1: Uporaba ocetne kisline (Cheryan, 1997)


Velike količine ocetne kisline uporabljamo kot kis. Francoska beseda za kis = vinagire in dobesedno pomeni »kislo vino«. Besedo uporabljajo Francozi tudi za druge kisle tekočine, ki temeljijo na alkoholu. Kis pridobivamo na različne načine, najbolj�e vrste kisa pa nastanejo po Orleanskem procesu. Da nastane kvaliteten kis, je potrebno kontrolirati hitrost in temperaturo kisanja. Če ne spremljamo pravilno sam potek, se proces kisanja lahko konča z izgubo arome ali pa se reakcija bakterij nadaljuje in povzroči neprijetno grenak okus. 2. ZGODOVINA BIOPROCESA V preteklosti so ocetno kislino uporabljali v medicini in verjetno je bila prvi znani antibiotik. V večini člove�ke zgodovine so jo pridobivali s fermentacijo sladkorja v etilni alkohol in njegovo poznej�o oksidacijo v ocetno kislino s pomočjo mikroorganizmov. Leta 1864 je francoski fizik Louis Pasteur dokazal, da je bakterija Acetobacter tista, ki je sposobna oksidirati alkohol v ocetno kislino. 2.1. Biolo�ka proizvodnja 2.1.1. Orleanski proces Orleanski proces velja za najstarej�o metodo. V sod velik pribli�no 200 litrov vlijemo drozgo (120 litrov), ki je sestavljena iz vina in ostalih alkoholnih komponent. Na začetku dodamo tudi manj�o količino oz. ostanek �e narejenega kisa iz prej�nje �ar�e, ki vsebuje kisno bakterijo. Na povr�ini se po določenem času namno�i ocetnokislinska bakterija, ki tvorijo film. Tej mreni pravimo tudi klobuk ali kisova matica, naredi pa se tam, kjer ima omogočen največji dostop do kisika. Te opne ne smemo sprati navzdol, zato so sodi opremljeni s posebnimi lijakom, ki omogoča dotakanje od spodaj in ne povr�insko. Nad nivojem tekočine je izvrtanih več luknjic, ki omogočajo prezračevanje. Vse luknjice so prekrite s tkanino, gazo, ki preprečuje dostop insektom (jeguljica, vinska mu�ica). Oskrbeti moramo �e konstantno optimalno temperaturo od 28 do 30 °C. Po treh ali �tirih mesecih se proces spreminjanja alkohola v ocetno kislino počasi zaključuje. Ko koncentracija ocetne kisline dose�e pribli�no 5% odtočimo kis skozi pipo na dnu sodčka. V na�em primeru pustimo 20-25 litrov za naslednji proces. Dotočimo isto količino vina, kot jo odtočimo. Opisani postopek je dobil ime po francoskem kralju Orleansu, kjer so ga �e v 16. stoletju uporabljali za industrijsko proizvodnjo kisa. Danes se uporablja le za lastne potrebe v gospodinjstvih in za prodajo v manj�ih količinah. Glavna slabost Orleanskega procesa glede na ostalo tehnologijo je v tem, da je dolgotrajen. Poleg tega je pri tem postopku za kisarne večjih zmogljivosti potrebna tudi velika proizvodnja povr�ina in večje �tevilo zaposlenih ljudi. Vendar pa obstajajo tudi �tevilne prednosti. Oprema je preprosta in relativno poceni ter potreba po energiji zanemarljiva. Podobni načini proizvodnje bi bili zato najbolj primerni v dr�avah, kjer so nizke cene zemlji�č in delovne sile. Kljub dejstvu, da z Orleanskim postopkom lahko dobimo izdelek najbolj�e kvalitete, je na ta način pridobljen samo majhen dele� svetovne proizvodnje kisa.


2.1.2. Proizvodnja z imobilizirano kulturo 2.1.2.1. Starej�a metoda V drugi polovici 17. Stoletja je danski tehnolog, Herman Boerhaave ugotovil, da je količina nastale ocetne kisline v proizvodnji kisa enaka povr�ini, ki je izpostavljena zraku. Izbolj�anje je zato temeljilo na večji povr�ini in bolj�em prezračevanju. Prva metoda, ki je upo�tevala ti dejstvi je izgledala takole: Dva lesena soda z dvojnim dnom so napolnili z gozdnimi peclji in tanj�imi vejicami vinske trte, preko katerih so vsakodnevno pretakali kisano tekočino iz enega soda v drugega. S tem so dosegli povečanje stične povr�ine med bakterijskim filmom in substratom, izbolj�ano prezračevanje ter znatno skraj�an čas metode. 2.1.2..2. Novej�a metoda Gornji sistem je do�ivel �tevilne izbolj�ave. Kapljalni proces je povr�inska fermentacija v kateri je mikrobna populacija pritrjena na primerno oporo (leseni ostru�ki,..) Tekočina se nič več ne pretaka iz soda v sod, temveč kontinuirano kro�i od dna generatorja na vrh, kjer ponovno kaplja navzdol preko polnila z adherirano kulturo, počasi pronica zopet do dna, dokler reakcija ni končana. Etanol se 88-90% spremeni v ocetno kislino, ostal substrat pa uporabimo v proizvodnji biomase ali pa preprosto izhlapi. Prednosti te metode so; nizka cena, preprosta kontrola, visoka koncentracija ocetne kisline, ne zavzema velikih povr�in. Slabosti pa; cena lesenih ostru�kov, dolg začetni čas ter izguba etanola pri izhlapevanju. 2.1.3. Submerzni način Naslednji tehnolo�ko naprednej�i korak je nastal leta 1949, ko sta Ebner in Hromatkar uporabila submerzno biotehnolo�ko tehniko za oksidacijo etanola v ocetno kislino. Startna koncentracija alkohola in ocetne kisline je natančno določena. Dobro prezračevanje je obvezno, saj v največji količini določa sam potek kisanja. Ko je v tekočini biotehnolo�kega postopka dose�ena koncentracija etanola na zastavljeno vrednost, izločijo določeno vrednost kisa iz bioreaktorja. Sledi polnjenje z novo drozgo do začetnih koncentracij za naslednji cikel. Praznjenje je hitro, polnjenje pa počasno pri konstantni temperaturi in me�anju. S tem preprečimo, da se bakterije ne po�kodujejo ali celo odmrejo. Tudi pena �kodljivo vpliva nanje, zato uporabljajo mehanski odstranjevalec pene. 2.2.Kemijska proizvodnja Leta 1916 je bila potreba po sintetičnem pridobivanju ocetne kisline mnogo večja od biolo�ke. Pridobivamo jo po reakciji 1:

CH2=CH2 + H2O CH3-CHO + O2 CH3-COOH acetilen acetaldehid ocetna kislina

Reakcija 1: Pretvorba acetilena v ocetno kislino


Prednost kemijske sinteze je velika proizvodnja koncentrirane ocetne kisline, slabosti pa je več in to so: potreba po visoki temperaturi, tlaku, nevarnost eksplozije, visoka cena katalizatorjev, odvisnost neobnovljivih surovih materialov, onesna�evanje. Tako proizvedeno ocetno kislino uporabljamo predvsem v industrijske namene in ne �ivilske. Proizvodnja od takrat nara�ča, kar nam pove zgovoren podatek, da je med 1993-1995 v ZDA narastla za celih 18%. 3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE PROCESA 3.1 Taksonomija ocetnokislinskih bakterij Ocetnokislinske bakterije so po Gramu negativne, 0.6-0.8mikro metrov dolge, elipsoidne ali paličaste bakterije. Imajo flagele, kar jim omogoča hitro premikanje. So obligatni aerobi, ki proizvajajo pigmente ali celulozo. Zmo�ne so mutiranja in z lahkoto spremenijo obliko. Najpomembnej�a sposobnost ocetnokislinskih bakterij je oksidacija etanola v ocetno kislino. To njihovo lastnost človek �e tisočletja uporablja za izdelovanje različnih vrst kisa (vinski, jabolčni, alkoholni, ri�ev, sladni in drugi). Prvi, ki je ločil različne vrste ocetnokislinskih bakterij je bil Hansen, leta 1879 ( Bacterium aceti, Bacterium pasteurianum, Bacterium kützingianum). Kasneje so ocetnokislinske bakterije uvrstili v dru�ino Acetobacteriaceae in znotraj dru�ine v rodova Acetobacter in Gluconobacter (De Ley s sod., 1984). Le-ta med seboj razlikujemo po sposobnosti oksidacije acetata in laktata do CO2 in H2O. To sposobnost imajo le vrste rodu Acetobacter, ne pa vrste iz rodu Gluconobacter. Med obema rodovoma ocetnokislinskih bakterij pa obstaja tudi značilna razlika v velikosti PCR-produktov medgenskih regij 16S-23S rDNK (�tevilo in velikost nukleotidov), kar nam omogoča hitro razlikovanje obeh rodov. (Trček, 1999) Znotraj rodu Acetobacter danes razlikujemo vrste: • A. aceti, (Beijerinck, 1898) • A. diazotrophicus, (Gillis s sod., 1989) • A. hansenii, (Gossele s sod., 1983) • A. liquefaciens, (Gossele s sod., 1983) • A. methanolicus, (Uhling s sod., 1986; Urakami s sod., 1989; Sievers s sod., 1994) • A. pasteurianus, (Beijerinck, 1916) • A. xylinus, (Yamada, 1983) • A. europaeus, (Sievers s sod., 1992) • A. intermedius, (Boesch s sod., 1998) • A. oboeediens, (Sokollek s sod., 1998) • A. pomorum, (Sokollek s sod., 1998) znotraj rodu Gluconobacter pa vrste: • G. asaii, (Mason in Claus, 1989) • G. frateurii, (Yamada in Akita, 1984) • G. oxydans (De Ley, 1961) • G. cerinus. (Mason in Claus, 1989). Razmi�ljanja znanstvenikov vodijo tudi v pridobitev ocetne kisline z anaerobno fermentacijo glukoze s Clostridium thermoaceticum.


3.2 Izolacija in identifikacija ocetnokislinskih bakterij Mikrobno naravo proizvodnje kisa je prvi odkril Künitz, leta 1837. Izoliral je ocetnokislinske bakterije in tako dokazal, da inokulum kisa vsebuje majhne organizme razporejene v verigah. Industrijski proces pridobivanja kisa se �e vedno začne z inokulumom, ki vsebuje nedefinirane mikroorganizme iz prej�njega oksidacijskega cikla. Pri izolaciji teh mikroorganizmov pa se pojavi problem, saj kulture filtrata iz industrijskega acetatorja za rast potrvbujejo goji�če z določenim pH-jem in nekaterimi drugimi začetnimi pogoji. Pri zahtevanih pogojih pa mikroorganizmi preplavijo posodo s starter kulturo, kar ote�uje njihovo identifikacijo. Hitro razmno�evanje jim omogoča kratka lag faza, toleranca na etanol in dokaj visoke koncentracije ocetne kisline ter druge ugodne lastnosti za razmno�evanje. Vzrok za to, da avtorji opisujejo različne vrste ocetnokislinskih bakterij, ki naj bi bile odgovorne za proizvodnjo kisa, je zagotovo v uporabi različnih izolacijskih goji�č in postopkov izolacije, ki ne dajejo enakih mo�nosti za rast vsem vrstam iz ocetnokislinske populacije, v uporabi različnih vrst kisa, kisa iz različnih geografskih področij in v različnih odstotkih ocetne kisline v vzorcih kisa v času izolacije bakterij. In ravno zaradi te�av pri izolaciji teh bakterij iz kisa bi bilo nujno razviti tehniko, ki bi omogočila direktno identifikacijo vrst iz ocetnokislinske populacije v bioreaktorju za proizvodnjo kisa. To bi omogočilo spoznavanje vrst v populaciji ocetnokisllinskih bakterij iz različnih stopenj oksidacije etanola v ocetno kislino in pripomoglo k bolj�emu poznavanju bioprocesa proizvodnje kisa. (Trček, 1999) 3.2.1 Metode identifikacije Ocetnokislinske bakterije lahko identificiramo z analizo profila plazmidov (Davies s sod.,1981). Plazmidi so okrogle, ekstrakromosomske DNK molekule, katerih profil je zelo specifičen za določeni rod bakterij. Razlike plazmidnih profilov predstavljajo osnovo tehniki za identifikacijo mikroflore . Raziskave zadnjih let so pokazale, da se profili plazmidov določenega rodu, tudi po petih letih mirovanja, ne spremenijo. V zadnjem času je bila za identifikacijo bakterijskih vrst uspe�no uporabljena regija med genoma za 16S in23S rRNK. Za hitro razlikovanje rodov Acetobacter in Gluconobacter pa obstaja značilna razlika v velikosti PCR-produktov medgenskih regij 16S-23S rDNK. Medvrstno razlikovanje rodu Acetobacter pa omogoča razlika v restrikcijskih mestih medgenskih regij 16S-23S rDNK (Trček, 1999). Za identifikacijo genov ocetnokislinskih bakterij, pa so uporabne manipulacijske tehnike DNK, ki temeljijo na gostiteljskemu vektorju. (Beppu, 1993) 3.3 Pogoji ki vplivajo na rast ocetnokislinskih bakterij 3.3.1 Koncentracija ocetne kisline Ocetnokislinske bakterije imajo relativno visoko toleranco na kislost (veliko rodov je zmo�nih rasti pri pH ni�jem od 5), tako da jih kislina ki jo proizvedejo ne ubije. So pa občutljive na hitre spremembe v koncentraciji ocetne kisline, ki po�kodujejo bakterije. Za�eljene so bakterije s čim vi�jo toleranco kislosti. Nara�čanje totalne koncentracije ocetne kisline ima na rastno krivuljo ocetnokislinskih bakterij večji vpliv pri kontinuirnem postopku kot pri semikontinuirnem postopku. (Ebner s sod., 1996)


3.3.2 Voda Paziti moramo, da voda ki jo dodajamo pri procesu nastanka kisa ne vsebuje snovi, ki uničujejo bakterije (Cl, ozon�). (Ebner s sod., 1996) 3.3.3 Hranila Za izdelavo alkoholnega kisa z do 15% ocetne kisline, potrebujejo ocetnokislinske bakterije glukozo, kalij, natrij, magnezij, kalcij, amonijev fosfat, sulfate, kloride in �e nekatere druge minerale. Ti dodatki so potrebni za optimalni nastanek ocetne kisline. (Ebner s sod., 1996) 3.3.4 Kisik Uporaba čistega kisika ali zraka bogatega s kisikom lahko rahlo po�koduje ocetnokislinske bakterije. (Ebner s sod., 1996) 3.3.5 Etanol Ocetnokislinske bakterije se prav tako po�kodujejo, če primanjkuje etanola. (Ebner s sod., 1996) 3.4 Bakteriofagi Acetobacter �specifični bakteriofagi, vidni pod elektronskim mikroskopom, naj bi bili odgovorni za probleme pri industrijskem postopku pridobivanja ocetne kisline (Teuber s sod.,1987). Postopek se upočasni , skoraj nikoli pa se ne ustavi popolnoma. Vsi fagi, ki so bili izolirani pri ocetnokislinski proizvodnji imajo enako strukturo. Imajo dolge repe in izometrične glave, tako da jih uvr�čamo v Bradley-evo A skupino in v dru�ino Myoviridae (Ackermann, 1987). 3.5 Industrijsko uporabljeni rodovi Industrija kisa je vedno uporabljala ocetnokislinsko bakterijo, ki v večini primerov ni bila pridobljena iz čistih kultur.Industrijski postopek pridobivanja kisa se začne s cepljenjem s »cepljivim kisom« oz. mikrobiolo�kimi ostanki prej�njega procesa kisanja. Pridobivanje ocetne kisline lahko traja več let brez prekinitve ali povečanja efektivnosti, če so zagotovljeni primerni pogoji. Iz industrijske rabe je znano, da se lastnosti ocetnokislinske bakterije, ki je izolirana, lahko zelo spremenijo. Bakterija poka�e lastnosti, ki so predvsem posledica privajanja na določeno koncentracijo ocetne kisline. Industrija kisa se zanima predvsem za uporabo vrste ocetnokislinske bakterije, ki tolerira visoke koncentracije ocetne kisline, zahteva malo hranil, preveč ne oksidira oblikovane ocetne kisline in ima zmo�nost večje proizvodnje. (Ebner s sod., 1996) 3.6 Izbolj�ave aktivnosti ocetnokislinskih bakterij V interesu industrije je proizvajati kis s čim vi�jimi odstotki ocetne kisline. Eden izmed pristopov, ki bi lahko izbolj�al naravno produktivnost proizvodnih sevov, je zagotovo povečanje �tevila kopij genov za alkohol- in aldehid-dehidrogenazo v genomu seva. Transformacija A. aceti subsp. xylinus z rekombinantnim plazmidom, z genom za aldehid dehidrogenazo, je povečala produktivnost seva na dvakratno vrednost in maksimalno koncentracijo ocetne kisline na 1.4-kratno v primerjavi s


sevom brez rekombinantnega plazmida (Fukaya s sod., 1989). Tako bi bilo mogoče s povečanjem �tevila kopij gena za acetaldehid dehidrogenazo (Thurner s sod., 1997) v A. europaeus ta tehnolo�ki parameter �e izbolj�ati. Za tak eksperiment je nujno potrebno imeti določena delovna orodja, med katerimi so tudi vektorji prenosa teh genov. Za genetsko izbolj�avo Acetobacter vezi je rekombinacija DNA zelo uporabna. Rod, ki ga vzgajamo pri 37°C in 4% koncentraciji ocetne kisline, in rod, ki ni zmo�en rasti pri 35°C in 5% koncentraciji ocetne kisline, sta bila sferično nane�ena in zme�ana. Dobljeni produkti so rasli pri 37°C in 5% koncentraciji ocetne kisline. Pri teh pogojih oba prej�nja rodova nista bila zmo�na rasti. Raziskave pridobivanja ocetne kisline pri visokih koncentracijah le te, so stalno v teku v laboratorijih Heinrich Frings GmbH&co., z namenom, da bi povečali toleranco vezi napram ocetni kislini. Te kulture so dobavljene tovarnam ocetne kisline po vsem svetu. 4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA

Ocetno kislino lahko pridobivamo s kemično sintezo iz naftnih komponent in kemikalij s tremi kemijskimi reakcijami: oksidacija acetaldehida, oksidacijo hidroogljika in karbonizacijo metanola. Drugi način pridobivanja ocetne kisline je po biolo�ki poti z aerobnim ali anaerobnim procesom. Kis je blaga raztopina ocetne kisline. Ocetna kislina je produkt delovanja ocetnokislinskih bakterij, ki so sposobne etanol v raztopini oksidirati do ocetne kisline. Za tvorbo ocetne kisline je potreben etanol, ki ga s svojim metabolizmom iz sladkorja proizvedejo kvasovke. Prva stopnja je tako produkcija etanola iz ogljikovih hidratov, v drugi stopnji pa se etanol oksidira do ocetne kisline. V industrijski proizvodnji ocetne kisline je v navadi uporaba nenaravnega etanola kot surovega materiala. V tem primeru prva stopnja procesa, pretvorba ogljikovih hidratov ob prisotnosti kvasovk, ni potrebna. Dogajanje pri katerem dobimo iz raztopin, ki vsebujejo sladkorje, v dveh stopnjah ocetno kislino, ponazarja shema 2.

Shema 2: Shematični prikaz produkcije kisa (Adams, 1985)


Po teoretičnih izračunih dobimo 0.67 g ocetne kisline (0.51 g etanola) na 1g glukoze (Encyclopedia of Microbiology, 2000). V praksi sta za 1% ocetne kisline v končnem izdelku potrebna vsaj 2% sladkorja v surovini (Adams, 1985).

Prva faza, ki jo izvajajo mikroorganizmi je produkcija etanola iz raztopine, ki vsebuje sladkorje. pH vrednosti v kislem območju (med 4 in 5) ter relativno velika začetna koncentracija sladkorja (okoli 10%) ustvarjajo pogoje, ki omogočajo prevlado kvasne mikroflore nad ostalimi prisotnimi mikroorganizmi. Med fermentacijo se pH vrednost ni�a, povečuje pa se koncentracija etanola, kar ima inhibitorni učinek na mnoge mikroorganizme. Zaradi nastajanja CO2 se postopoma vzpostavijo anaerobni pogoji, kar povzroči odmrtje morebitno prisotnih obligatno aerobnih mikroorganizmov. Trdimo lahko torej, da alkoholno fermentacijo v celoti izvedejo kvasovke (Adams, 1985). Alkoholna fermentacija je spontana, vendar ima slabe izkoristke, saj lahko sladkor namesto za nastajanje etanola za svoj razvoj izkori�čajo tudi drugi mikroorganizmi kot so mlečnokislinske bakterije, zato v kisarnah pogosto uporabljajo različne tehnike inokulacije kvasovk. V nekaterih primerih inokulum predstavlja biomasa, ki je po fermentaciji prehodne �ar�e ostala na stenah posode. Sodobne kisarne pa seveda sadni sok cepijo s čistimi kulturami kvasovk, ki so jih vzgojili sami ali pa kupili v različnih oblikah (aktivne v tekočih goji�čih, posu�ene, stisnjene). Največkrat so uporabljeni različni sevi Saccharomyces cerevisiae (Adams, 1985). Alkoholna fermentacija oziroma pretvorba heksoz v etanol, ki jo izvaja Saccharomyces cerevisiae, kemijsko opi�emo z enačbo, ki jo predstavlja shema 3.

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2

monosaharid etanol ogljikov dioksid

Shema 3: Pretvorba heksoze v etanol po Gay-Lusacu (Adams, 1985)

Etanol ne nastane direktno iz glukoze, temveč iz piruvata. Tega kvasovke tvorijo iz glukoze v zaporedju več reakcij, ki jim skupno pravimo Embdem-Mayerhoff-Parsova pot razgradnje glukoze. Teoretično iz 1g glukoze pri alkoholni fermentaciji nastane 0,511g etanola. Ta teoretična vrednost ni nikoli dose�ena zaradi tvorbe nekaterih drugih metabolitov (Bluhm, 1983). Proces je anaeroben, poteka pri temperaturi med 30 in 32°C, med njegovim potekom pa se spro�čajo tudi večje količine energije (cca. 239 kJ/mol glukoze, od česar cca. 30% uskladi�čijo kvasne celice v ATP, ostalo pa se sprosti v okolico kot toplota). Čas trajanja alkoholne fermentacije je odvisen od večjih dejavnikov, večinoma pa je zaključena v 48 do 72 urah. (Adams, 1985)

4.1. Pridobivanje ocetne kisline iz etanola po aerobni poti Med bioprocesom pridobivanja ocetne kisline se etanol skoraj kvantitativno oksidira do ocetne kisline. Običajni izplen je med 95 in 98%, ostanek je običajno izgubljen v izhajajočem plinu. Istočasno se primeren vir �estih ogljikovih atomov (za�eljena glukoza) oksidira. Končna produkta te

2 CH3CH2OH + O2 2 CH3COOH + 2 H2O

etanol kisik ocetna kislina voda Shema 4: Pretvorba etanola v ocetno kislino. (Saeki s sod., 1997)


oksidacije sta CO2 in H2O. Celokupno reakcijo prikazuje shema 4. Take oksidacijske reakcije vključujejo nepopolno oksidacijo alkohola, katero spremlja kopičenje oksidacijskega produkta v rastnem mediju. (Saeki s sod., 1997) 4.1.2. Faktorji, ki vplivajo na potek procesa

4.1.2.1. Etanol Oksidacija etanola s strani ocetnokislinskih bakterij poteka preko dveh zaporednih stopenj. Prva stopnja je oksidacija etanola v acetaldehid, druga stopnja pa oksidacija iz acetaldehida v acetat. Reakciji katalizirata alkohol dehidrogenaza (ADH) in aldehid dehidrogenaza (ALDH). Encima sta vezana na zunanjo povr�ino periplazmične membrane in katalizirata oksidacijske reakcije v periplazmičnem prostoru (prostor med citoplazemsko membrano in t.i. zunanjo membrano celične stene pri Gramm negativnih bakterijah).V obeh so prisotni citokromski elementi, ki sodelujejo pri prenosu elektronov. Njuna funkcija je povezana z dihalno verigo organizma. Alkohol dehidrogenaza je bila izolirana iz različnih ocetno kislinskih bakterij. Dokazano je bilo, da vsebuje pyrroloquinoline quinone (PQQ) kot tudi hem C kot prostetični skupini. Pokazano je bilo, da je alkohol dehidrogenaza ocetnokislinskih bakterij direktni donor elektronov ubikinonom v citoplazemskih membranah. Potemtakem je etanoloksidazna dihalna veriga pri ocetnokislinskih bakterijah sestavljena iz samo treh komponent alkohol dehidrogenaza, ubikinon in terminalna oksidaza. Dehidrogenaze quinoproteinov, glukoze, alkohola in aldehida, sodelujejo pri oksidaciji sladkorjev, kar jih povezuje z elektronskim transportnim sistemom v membrani oksidativnih bakterij. Alkohol dehidrogenaza in aldehid dehidrogenaza izolirana iz A. polyoxogenes sp. nov. roda, ustvarjenega v tovarni kisa, ka�eta večjo produkcijo kisa in večjo toleranco do ocetne kisline kot rodovi izolirani iz naravnih surovin. V nasprotju z alkohol dehidrogenaza in aldehid dehidrogenaza pridobljenih iz A. aceti in G. suboxydans, so bili encimi A. polyoxogenes dokaj stabilni. Zgleda, da je ta visoka stabilnost delno povezana z mo�nostjo, sposobnostjo A. poloxogenes, da proizvajajo visoke koncentracije ocetne kisline. Kemizem oksidacije etanola v ocetno kislino ponazarja shema 5. (Ebner s sod., 1996)

Shema 5: Shematični prikaz kemizma oksidacije etanola v ocetno kislino (Lafon-Lafourcade, 1983)


4.1.2.2. Sladkor Acetobacter razgrajuje sladkorje z heksoze monofosfatno potjo (HMP) in ciklom trikarboksilnih kislin, medtem ko je glikoliza �ibka ali je sploh ni. Encimi Enter-Doudoroffove poti so prisotni pri Glukonobacter in Acetobacter xylinum. Ti dve bakteriji sta znani po njuni sposobnosti za direktno oksidacijo sladkorjev, alkoholov in steroidov. ( Ebner s sod., 1996 ) 4.1.2.3. Acetat Rodovi Acetobacter so sposobni oksidirat acetat tako dobro kot laktat, četudi ob prisotnosti ali odsotnosti etanola z uporabo encimov cikla trikarboksilnih kislin. ( Ebner s sod., 1996 ) 4.1.2.4. Ogljikov dioksid Acetobacter potrebuje za svojo rast CO2. Ta se vgrajuje v celične snovi, kjer je pribli�no 0,1% celotnega ogljika prihaja iz CO2. Iz katabolizma CO2 prihaja zelo majhna vendar merljiva količina ocetne kisline. (Ebner s sod., 1996) 4.1.2.5. Du�ik Če je prisoten vir organskega ogljika, lahko določeno �tevilo ocetnokislinskih bakterij uporablja amoniak kot edini vir du�ika. Nekateri rodovi potrebujejo prisotnost aminokislin, nekateri potrebujejo kofaktorje kot so vitamini ali purini. Ni poznanih esencialnih aminokislin. (Ebner s sod., 1996) 4.1.2.6. Rastni faktorji Potreba po rastnih faktorjih je odvisna od zalog ogljika. Nekateri rodovi potrebujejo kot raste faktorje p-aminobenzojsko kislino, niacin, thiamin ali pantotensko kislino. Nekateri rodovi Acetobacter ob prisotnosti glukoze ne potrebujejo vitaminov. Vendar ima kombiniran dodatek glutationina z Naglutamatom komulativen efekt na rast Acetobakter aceti. Pyrroloquinoline quinone (PQQ), prostetična skupina pri ocetnokislinskih bakterijah, ka�e zanimiv rastno-stimulativen efekt za različne mikroorganizme. Eden od dveh učinkov pyrroloquinoline quinona je bila stimulacija obeh rastnih krivulj in celotnega celičnega donosa le z sledovi pyrroloquinoline quinona kot esencialnega rastnega faktorja. Drugi učinek pyrroloquinoline quinona, ki je bil splo�no opa�en, je bila redukcija lag faze pri mikrobni rasti, toda brez povečanja krivulje rasti pri sledeči eksponentni fazi ali pri totalnem celičnem doprinosu pri stacionarni fazi. V kulturnih goji�čih so skoraj vsi rodovi mikroorganizmov proizvedli pyrroloquinoline quinon. (Ebner s sod., 1996)

4.1.2.7. Fiziologija

Se�tevek etanola (vol%) in ocetne kisline (g na 100 mL) imenujemo totalna ali skupna koncentracija, ker je vsota dveh drugače nerazdru�ljivo merljivih količin in nam poda maksimalno koncentracijo ocetne kisline, ki jo lahko dobimo z zaključenim procesom. Ob odsotnosti izgub zaradi izhlapevanja in prekomerne oksidacije je skupna koncentracija konstantna tekom celotnega procesa acetifikacije. Etanol tako pogojuje maksimalno koncentracijo ocetne kisline v končnem produktu.


Med komercialno uporabo večine aerobnih mikroorganizmov je v navadi pustiti inokulum v fermentatorju določen čas, do nekaj dni, brez aeracije preden prenesemo v glavni fermentator. Pri pridobivanju ocetne kisline je aplikacija te procedure nemogoča. Narejeni so bili ekstenzivni testi, upo�tevajoč �kodljiv učinek ocetnokislinskih bakterij na prekinitev aeracje kot funkcije skupne koncentracije, ocetnokislinske koncentracije, stopnje acetifikacije in trajanja prekinitve aeracije. Dalj�a je prekinitev aeracije in vi�ja je totalna koncentracija ka�e, večji je efekt. Pri skupni koncentraciji 5% prekinitev aeracije za 2-8 min vodi do enake po�kodbe kot prekinitev za 15-60 sek pri skupni koncentraciji 11-12%. Pri konstantni skupni koncentraciji se �koda povečuje s povečanjem koncentracije ocetne kisline in s povečanjem stopnje acetifikacije. Prekinitev dotoka kisika prav tako povzroči oster padec aktivnosti vključenih encimov, alkohol in aldehid dehidrogenaze. Produkcija specifičnega celičnega materiala je ekstremno nizka. V razmerah industrijske produkcije ocetne kisline so mikroorganizmi podvr�eni znatnemu stresu zaradi visoke koncentracije ocetne kisline in omejene količine kisika. Visoka poraba kisika do 70% je lahko dose�ena v industrijski proizvodnji. Varčna, zmerna uporaba zraka je zelo pomembna zaradi hlapnosti etanola in ocetne kisline. Uporaba čistega kisika oz. zraka bogatenega s kisikom lahko rahlo po�koduje bakterijo. Ocetnokislinske bakterije se prav tako po�kodujejo, če pride do pomanjkanja etanola. Ta nastopi takrat, ko je proces pridobivanja ocetne kisline prenesen na točko, kjer je bil ves etanol oksidiran in je dodatek sve�e drozge, ki vsebuje etanol odlo�en. To je analogno po�kodbam, ki nastanejo zaradi prekinitve dotoka kisika in je tudi primarno odvisno od skupne koncentracije in trajanja pomanjkanja etanola. Pri semikontinuiranem procesu ob nara�čanju koncentracije ocetne kisline ni bilo padca specifične rastne krivulje, ta se pojavi pri nara�čanju skupne koncentracije. Specifična rastna krivulja pade iz 0,49 h-1 pri 5% na 0,16 h-1 pri 11%. V kontinuiranih kulturah pri skupni koncentraciji 12% specifična krivulja rasti pade iz 0,027 h-1 pri 4,5% etanola na 0,006 h-1 pri 1% etanola. Obstaja velika odvisnost med nastajanjem specifičnih produktov in koncentracijo ocetne kisline v kontinuiranih procesih pri 7% skupni koncentraciji. Maksimalnem nastajanju specifičnega produkta sledi rasti-pripisan mehanizem tako dolgo, kot je koncentracija ocetne kisline pod 3%. Pri vi�ji koncentraciji ocetne kisline od 7%, mora bit upo�tevan dodaten rasti nepripisan faktor. Polnjenje fermentorja mora biti izvedeno z drozgo enake skupne koncentracije in s hitrim me�anjem, ker lahko lokalno formiran visok koncentracijski gradient po�koduje bakterije. Naslednji cikel prične brez lag faze. Istočasno moramo vzdr�evati konstantno temperaturo, ker ponavljajoče spremembe temperature povzročajo podobne po�kodbe. Prekomerna oksidacija je neza�eljena oksidacija ocetne kisline v CO2 inH2O, ki mora bit preprečena s stalno prisotnostjo etanola in vzdr�evanjem skupne koncentracije na visokem nivoju. V trickle fermentatorju je to te�je doseči kot v submerzijskih fermentatorjih. (Ebner s sod., 1996) 4.2. Anaerobni proces Ocetno kislino lahko pridobimo tudi z anaerobno fermentacijo sladkorjev. Produkcija temelji na uporabi mikroorganizmov iz roda Clostridium, ki so sposobni glukozo, ksilozo in druge heksoze ter pentoze skoraj kvantitativno pretvorit v acetat. Clostridium thermoaceticum je sposoben pretvoriti sladkor s petimi ogljikovimi atomi v acetat po enačbi, ki je prikazana s shemo 6.

2 C5H10O5 5 CH3COOH sladkor acetat Shema 6: Pretvorba sladkorja v acetat po anaerobni poti. (Cheryan M., 2000)


Teoretično bi ta metabolna pot morala privesti do vi�je stopnje ocetne kisline za enoto glukoze. Glavna ideja za raziskovanje v laboratorijih je bila v potencialni rabi obnovljivih virov kot so surovi materiali, ni pa primerna za proizvodnjo hrane. 5. BIOIN�ENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA 5.1 Uvod Pri opisovanju proizvodnje ocetne kisline ki je precej sorodna proizvodnji kisa smo te dve proizvodnji povezali in jih tudi opisali eno s pomočjo druge in obratno. Proizvodnjo ocetne kisline ali tudi kisa lahko prvotno razdelimo v dve veliki skupini in sicer na tako imenovano domačo in industrijsko proizvodnjo. Industrijsko proizvodnjo lahko nato razdelimo �e naprej na več različnih postopkov. In sicer pridobivanje ocetne kisline s pomočjo destilacije suhega lesa , pridobivanje ocetne kisline s katalitično oksidacijo etanola oziroma acetaldehida, prdobivanje kisa z uporabo povr�inske kulture, pridobivanje kisa z uporabo imobilizirane kulture, submerzni postopek pridobivanja kisa in �e nekateri drugi specialni postopki. V na�i seminarski nalogi bomo podrobneje opisali submerzni postopek pridobivanja kisa in s tem tudi kot glavni produkt ocetno kislino, medtem ko bomo ostalim postopkom namenili le nekaj besed. 5.2 Pripravljalni postopki 5.2.1 Postopki priprave za submerzni postopek pridobivanja ocetne kisline Pri tem postopku se uporabljajo submerzni bioreaktorji in sicer med najpogostej�e uvr�čamo Frings Acetator ® iz dru�be Heinricha Frings, GmbH & Co. iz Bonna. Proizvedeni so iz nerjavečega jekla, nekateri pa iz lesa. Vse napeljave in armature pa so prav tako iz nerjavečega jekla ali pa umetnih mas (plastike,...). Za konstantno spremljanje razmer je Frings Acetator ® opremljen �e z Frings Alkograph ®, ki konstantno meri količino etanola v acetatorju po opisu Ebnerja in Enenkla, (1966). Ker pa je Alkograph ® meril z določenim zamikom so razvili izpopolnjeno napravo imenovano Frings Alkosens ®. Le ta temelji na tehnologiji sodobnih biosenzorjev z lastnostjo da je bil časovni zamik merjenja precej skraj�an. Ker pa je bila potrebna ponovna kalibracija Frings Alkosens ® ob vsaki spremembi koncentracije ocetne kisline je tudi to vodilo v razvoj �e sodobnej�ega Frings Alkosens II ®. Ta je �e bolj izpopolnjen in vsebuje večplastno membrano, novej�o tehnologijo senzorjev in posodobljeno računalni�ko opremo, ki omogoča popolnoma automatiziran proces kontrole kontinuirne, polkuntinuirne, enofazne in dvofazne fermentacije. Pomemben je tudi aerator v bioreaktorju, ta je avtovsesalnega tipa in se nahaja na dnu, sestavljen pa je iz motorja in turbine ki jo obkro�a stator. Turbina vrteča se z od 1450 � 1750 obr/min, vsrkuje zrak in ga prepu�ča v tekočino skozi �tevilne radialno razporejene luknje, ki so v nasprotni smeri rotacije. Ob tem pa nastaja tudi pena, zato je pomembno tudi, da je bioreaktor opremljen tudi z mehanskim razbijalcem pene.


5.2.2. Postopki priprave za pridobivanje kisa z uporabo povr�inske kulture Pri uporabi postopka za pridobivanje ocente kisline z uporabo povr�inske kulture je le ta glavni pojem postopka. Postopek je drugje po svetu tudi imenovan Orleanski postopek, pri katerem mirkofloro v sloju na povr�ini substrata vzdr�ujemo aktivno. Vendar je proces polkontinuiren, kar pomeni da je potrebno za vsako �ar�o ustvariti nov sloj mikroflore. Biorektor je v tem primeru posoda ki je najpogosteje iz lesa in ima na dnu pritrjeno pipo za odtakanje produkta. Na vrhu ima odprtino zama�eno z bomba�em in v njej je tudi lij s cevjo ki vodi globoko proti dnu bioreaktorja za inokulacijo kulture. Posoda ima ob strani nekje blizu vrha tudi odprtino za opazovnje zaprto s steklom in zračnik prekrit z muslinom. Pogosto je vgrajen tudi merilec nivoja substrata v bioreaktorju, ki pa običajno ne izmeri substrata nad 75% volumna bioreaktorja, ker je taka tudi zahteva postopka. Postopek je precej star in so ga v večini primerov zamenjali novej�i postopki, nekateri avtorji pa celo menijo da si ta postopek lahko ogledamo le �e v muzeju (Conner in Allgeier,1976). Postopek precej uporabljajo �e vedno na Japonskem, saj je proizvodnja cena kisa dosti ni�ja, vendar pa je ta postopek zelo počasen in je zato primernej�i za gospodinjsko in domačo proizvodnjo. Res pa je tudi, da je kakovost kisa pridobljenega po tem postopku dosti bolj�a kot pri submerznem. 5.2.3 Postopki priprave za proizvodnjo z imobilizirano kulturo Zapisi o tem postopku izvirajo nekje iz druge polovice 17. stoletja, vendar je ta postopek sedaj dosti bolj posodobljen pri katerem je znatno skraj�an čas proizvodnje. Za biotehnolo�ki postopek se uporablja cilindrični leseni bioreaktor ali tako imenovani generator, za nosilce pa različne keramične materiale. Biotehnolo�ka raztopina se v generatorju pretaka od dna navzgor, kjer se jo raz�kropi preko polnila z adherirano kulturo na keramiki in počasi pronicala zopet do dna (Adams,1985). Po lesenih se kasneje tudi pojavijo tudi bioreaktorji iz nerjaveče pločevine. Zaradi korozivnosti morajo biti tudi vse komponente generatorja iz nerjaveče pločevine ali pa umetnih mas in to je tudi dovolj velik razlog zakaj so se ohranili leseni bioreaktorji tako dolgo. Bioreaktorji iz nerjaveče pločevine pa so lahko napolnjeni tudi z bukovimi oblanci, po katerih prav tako biotehnolo�ko raztopino pr�imo z vrha navzdol. Z uporabo merilnikov lahko posodobimo tudi ta proces do polavtomatskega, kljub temu pa cel cikel traja pribli�no 7 dni. Pri tem postopku prihaja tudi do precej velikih izgub kisa zaradi hlapenja in sicer tudi do 20%. 5.3 Potek bioprocesov 5.3.1 Potek submerznega postopka pridobivanja ocetne kisline Je glavni postopek pridobivanja ocetne kisline po svetu. Proces vodimo polkontinuirno z začetno koncentracijo ocetne kisline med 7 in 8%, etanola pa je 5%. Ko se koncentracija alkohola zni�a na 0,1 do 0,3% se določen del kisa odtoči čim hitreje da se ne porabi ves alkohol, vendar le ta ne sme presegati več kot polovico celotnega volumna. Mankajoči volumen substrata se nato počasi nadomesti z novim substratom pri močnem me�anju, konstantni temperaturi in koncentracijah 0 do 2% ocetne kisline ter 12 do 15% alkohola. Dotakanje tega substrata se konča ko je dose�ena �elena skupna koncentracija alkohola, kar pa omogoča hitrej�e namno�evanje bakterij. Dotok je name�čen neposredno nad aeratorjem, da je zagotovljeno takoj�ne in učinkovito me�anje s celotno vsebino acetatorja. Tako se cikli nato ponavljajo nekje od 24 do 48 ur s 94% izkoristkom pri pretvorbi etanola v ocetno kislino (Adams, 1985).


Pri procesu moramo paziti na zračenje, ki je zelo pomembno saj �e kratek čas brez zračenja lahko pomeni zaustavitev procesa. Proti penjenju pa uporabljamo mehanske razpenilce, ki so pritrjeni na zgornji del bioreaktorja. Pomembni pa so zato, ker bi sicer pri�lo do zmanj�anje prenosa kisika in s tem zaviranja biotehnolo�kega procesa in tudi ob prevelikem penjenju pa se tudi povečuje mo�nost kontaminacije z neza�eljenimi mikroorganizmi (Adams, 1985). 5.3.2. Potek pridobivanja ocetne kisline z uporabo povr�inske kulture Postopek je v svetu znan tudi pod imenom »Orleanski proces« po Francoskem kralju Orleansu, ki je ta postopek �e v 14. stoletju uporabljal za industrijsko proizvodnjo kisa. Proces poteka v enem samem bioreaktorju. Optimalni začetni pogoji za potek biotehnolo�kega procesa pa so pri 2 do 3% ocetne kisline, 20 do 30 g/L alkohola in globini drozge 100mm. Pri delno napolnjenem sodu, nato biotehnolo�ki proces dose�e 4,5% ocetne kisline, zato je potrebno del kisa odstraniti, in dotoči sve� substrat (Higashide, 1992). Da se povr�inski sloj mikroflore tem manj po�koduje pa bioreaktorju dodan poseben lijak ki omogoča dotakanje substrata od spodaj in ne na povr�ino. Ena taka �ar�a se običajno izprazni po 80 dneh in nato se lahko napolni nova. Okus tako proizvedenega kisa je bolj�i od vseh ostalih metod in postopkov, vendar zaradi dolgega procesa proizvodnje se ga v industrijski uporabi ne uporablja več, le na Japonskem se �e vedno s to metodo proizvede od 60 do 70% vsega kisa. 5.3.3 Potek pridobivanja ocetne kisline z imobilizirano kulturo Pri tem postopku se torej uporablja bioreaktor imenovan generator, ki ga �e vedno precej uporabljajo tudi v industriji. Z zunanjim toplotnim menjalnikom omogočamo reguliranje temperaturnega optimuma ki je med 28 in 35 oC. Zadostna količina zraka ki zna�a od 0,8 do 0,9 m3/h pa zagotavlja umetno ampak kvalitetno prezračevanje z dna generatorja. Ob uporabi določenih merilnikov, lahko vodimo proces tudi polavtomatsko in sicer ob začetni koncentraciji alkohola od 4 do 5% na pribli�no končno koncentracijo 0,3%. Ko je ta koncentracija dose�ena je proces ustavljen, nato se del kisa odčrpa ter nadomesti s sve�im substratom. To pomeni kratko bakterijsko lag fazo, vendar pa je značaj proizvodnje zato polkontinuiren. Cikel običajno traja 7 dni, precej pa je odvisen od izpopolnjenosti generatorja. 5.4 Zaključni postopki Pri postopkih z ocetno kislino oziroma kisom po končani acetifikaciji, gre za največkrat za konzervirne postopke, izbolj�ave estetike in metod pakiranja ter shranjevanja. Z naravnimi biotehniolo�kimi postopki proizvodnje ocetne kisline dobimo koncentracijo ocetne kisline med 10 in 15% in ker je destilacija za proizvodnjo vi�jih koncentracij zelo zahtevna, se zato koncentriranje ocetne kisline pogosto izvaja z zmrzovanjem in odstranjevanjem ledenih kristalov vode (Adams, 1985). 5.4.1. Postopki bistrenja Pri tem postopku se najpogosteje �elimo znebiti prisotnih bakterij v surovem kisu ki nam povzročajo motnost. Tega problema nam pri uporabi povr�inske kultivacije ni potrebno re�evati, nastopi pa pri proizvodnjo ocetne kisline z generatorjem. Pri tem se običajno uporablja filterno stiskalnico z diatomejsko zemljo. Pri kisu pridobljenem s submerzno kultivacijo, kjer je biomasa suspendirana v njem, pa je potrebno bistrenje z različnimi sredstvi kot so ribji mehur, kazein


največkrat pa se uporablja bentonit. V zadnjem času pa se uporablja precej tudi bistrenje z ultrafiltracijo. 5.4.2 Postopki konzerviranja Kis običajno pasteriziramo pred polnenjem v embala�o s tem se tudi izognemo nastanku motnosti v embaliranem kisu. Pasterizacija poteka lahko pri različnih temperaturah z različnim časom in istim dose�enim učinkom smrtnosti mikroorganizmov. Inaktivacijo mikroorganizmov pa tudi lahko izvedemo z �veplanjem, ki je uradno dovoljeno in prav tako določeno s pravilnikom (Ebner in Follmann, 1983). 6. EKOLO�KI VIDIK BIOPROCESA 6.1. �kodljivi učinki ocetne kisline ter njeno preprečevanje Vsako leto pridelajo več milijonov ton industrijske ocetne kisline. Povsod jo raz�irijo predelana �ivila, nekateri kozmetični izdelki in bencinski hlapi. Delavci v tekstilni in papirni industriji in delavci, ki izdelujejo plastične snovi in delavci pri delu s topili so ji pogosto izpostavljeni na delovnih mestih. Seveda utrpi njihovo zdravje velike posledice. Toksikolo�ke lastnosti ocetne kisline ob navadnem izpostavljanju niso znane v podrobnostih. Velike količine v zraku dra�ijo oči, grlo in zavirajo osrednje �ivčevje. Ocetna kislina hudo vzdra�i sluznico, ko�o in oči. Razlita po ko�i izzove vnetje in ko�ne razjede. Koncentrirana ocetna kislina, ki pride po nezgodi v oči, lahko pronica skozi ro�enico in povzroči oteklino �arenice. Majhna količina koncentrirane hudo o�ge �relo, če jo človek popije. Dolgoročno izpostavljanje velikim količinam ocetni kislini je povzročilo pri ljudeh potemnitev ko�e, bronhitis, kronično vneto �relo in zobne okvare. Na domu se človek le redko sreča s �kodljivimi količinami ocetne kisline. V industriji pa jo povsod uporabljajo. Svetujejo, da se človek natančno pouči, kako se ji lahko izogne. Ocetna kislina v mestnem zraku prispeva pri nastajanju smoga, ker olaj�a nastajanje ozona , pomembnega onesna�evalca mestnega zraka. Ocetna kislina je največ uporabljena v �ivilski industriji kot kis. Danes je mo�na proizvodnja kisa brez kakr�negakoli onesna�evanja okolja. Izpu�ni plin vsebuje alkohol, ocetno kislino in etil acetat. Te izpu�ne pline hladijo z mrzlo vodo, kolikor je le mogoče. Zaradi absorbcije preostanka hlapov, čistimo �e z vodo, ki je reciklirana in se kasneje uporablja za pripravo drozge. Surov kis vsebuje bakterije, ki morajo biti odstranjene- filtriranje. Danes večina tovarn uporablja »cros-flow« filtracijo, brez pomoči raznih filtrov. Zelo majhne količine trdnih snovi, ki jih proizvedejo ocetnokislinske bakterije, ostane po postopku či�čenja �e vedno prisotnih v vodi ~ 100g na 1000 l kisa. V tovarnah, kjer predstavlja kis eno glavnih komponent in ga uporabljajo praktično v vseh proizvodih, (npr. vlaganje sadja in zelenjave) imajo poseben način shranjevanja odpadnega kisa. Kis je kisla tekočina in če bi vso to tekočino izpirali v vodo, bi pri�lo do velikega onesna�enja in poru�enja naravnega ravnovesja. Če pogledamo to s kemijskega stali�ča, se kisla voda v stiku z bazično nevtralizira. To pa je tudi eden od načinov s katerim se večje tovarne poslu�ujejo pri odlaganju tekočih odpadkov. Eta, največja slovenska tovarna, ki se ukvarja z vlaganjem sadja in zelenjave,odlaga odpadno kislo vodo v t.i. egalizacijski bazen. Ta bazen si deli z neko tekstilno tovarno v njeni bli�ini, katera odlaga alkalno vodo. Vodo iz egalizacijskega bazena potem �e dodatno oči�čijo oz. reciklirajo. Ta postopek je poceni, vendar pa nimajo vse tovarne te mo�nosti re�evanja perečega vpra�anja onesna�evanja okolja.


7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PROIZVODNJI HRANE 7.1. Uporaba ocetne kisline Ocetna kislina je naravna kemična spojina v jabolkih, siru, kakavu, grozdju, mleku, pomarančah, peter�ilju, breskvah, vrtnih jagodah, borovnicah, ipd. Čisto ocetno kislino ne uporabljamo pogosto v prehrambeni industriji, čeprav je priznana kot varna-GRAS (Generally Recognized As Safe). Kot tako jo največ uporabljamo kot aromo in zakisovanje v proizvodih kot; narezano, konzervirano sadje in zelenjave, majoneze, kečap, omake, solatni prelivi. Čista ocetna kislina je bolj pomembna v drugih industrijah (kemijska, tekstilna, kozmetična,..) 7.2. Uporaba kisa Mnogo �ir�o uporabo ocetne kisline v prehrambeni industriji predstavlja kis. Kis je razredčena raztopina ocetne kisline proizvedena v bioprocesu oksidacije etanola s pomočjo ocetnokislinskih bakterij, pri določenih pogojih. V industriji se najbolj pogosto uporablja submerzni način izdelovanja kisa. Nedvomno se prete�ni del proizvedenega kisa uporabi v prehrani. Ostrina kisline in aroma, ki prispevajo ostale sestavine kisa, dajeta jedem sve�ino in bogatej�i okus. Ker je kis dobro topilo za eterična olja zeli�č in di�av, je osnovna sestavina različnih omak. Kis najdemo tudi v mno�ici drugih �ivil, kot so ajvar in drugi zelenjavni namazi, majoneza, kečap, vlo�ena zelenjava, kot začimba za meso, perutnino, ribe, du�ene jedi, juhe, itd. Nekateri siri vsebujejo tudi izdelke, katerim je dodan kis. Vlaganje zelenjave v kis je poleg su�enja na soncu, soljenja in dimljenja ena od tradicionalnih metod konzerviranja hrane. Pomembna lastnost te tehnike je, da se osnovne senzorične lastnosti precej izgubijo, kljub temu pa je končni izdelek zelo okusen, zaradi česar se ta metoda veliko uporablja. Prednost pred modernej�imi postopki konzerviranja pa je nizka cena. �e 0.1% nedisocirane ocetne kisline inhibira rast večine bakterij, ki povzročajo zastrupitve, ter sporogenih bakterij, 0.3% pa tudi �e zavira rast mikotoksikogenih plesni. Učinek ocetne kisline se poveča ob dodatku soli in drugih snovi, ki zni�ujejo vodno aktivnost. V takih pogoji so sposobni pre�ivetja le redki mikroorganizmi. Antimikrobni učinek ocetne kisline ne temelji samo na nizkem pH,ampak je tudi posledica prisotnosti neioniziranih lipofilnih molekul ocetne kisline. Ugotovili so, da koncentracija ocetne kisline, ki predstavlja 3.6% vseh hlapnih sestavin izdelka, �e zagotavlja zadovoljiv učinek konzerviranja. Taka �ivila so stabilna dalj�e časovno obdobje, vendar bodo imela zelo kisel okus. Pred uporabo mora kis nekaj časa odle�ati, da pridobi aromatične snovi.S kisom lahko odstranimo tudi vodni kamen, made�e na armaturah in povečamo čistilni učinek delovnih povr�in. V industrijsko razvitih dr�avah je poraba kisa na prebivalca nekaj čez 2 litra letno preračunano na kis s 5% ocetne kisline.


8. REFERENCE

Adachi, O., Okamoto, K., Matsushita, K., Shinagawa, E., Ameyama, M. (1990), An idealbasal medium for assaying stimulating activity of pyrroloquinoline quinone with Acetobacter aceti, Agric. biol. Chem. 54, 2751-2752.

Adams, M. R. 1985. Vinegar. V: Microbiology of fermented foods. Vol. 1. Wood, B. J.ed. London

Elsevier Applied Science Publishers, s. 1-47. Agreda, V. H., and Zoeller, J. R. 1993. Acetic acid and its derivates. /ed. Dekker, J. New York. Ameyama, M., Adachi, O. (1982), Alcohol dehydrogenase from acetic acid bacteria, membrane

bound, in: Methdots in Enzymology, (Wood, W. A., Ed.) Vol. 89, s. 450-457. New York: Academic Press.

Ameyama, M., Matsushita, K., Ohno, Y., Shinagawa, E., Adachi, O. (1981), Existence of a novel

prostetic group, PQQ, in membrane bound, electron transport chain-linked, primary dehydrogenases of oxidative bacteria, FEBS Lett. 130 (2), 179-183.

Beppu, B. 1993.Genetic organization of Acetobacter for acetic acid fermentation.Department of

Agricultural Chemistry, Faculty of Agroculture, The University of Tokyo. Boscarol, M. (2000), Sekundarni metaboliti pri proizvodnji jabolčnega kisa, Dipl. Nal., Ljubljana,

Biotehni�ka fakulteta, 5-11. Cheryan, M.2000. Acetic acid production. V: Encyclopedia of Microbiology, vol.1.ed. Lederberg, J.

New York, Academic press, s. 13-17. Conner, H. A., Allgeier, R. J. (1976), Vinegar: Its history and development, Adv. Appl. Microbiol.

20. str. 81-133. Davies, E.L., s. sod., 1981. The value of plasmid profiles for strain identification in Lactic

streptococci and the relationship between Streptococcus lactis 712. ML3 and C2, J. Appl Bacteriol 51, 325-337.

De Ley, J., Kersters, K. (1964), Oxidation of aliphatic glycols by acetic acid bacteria, Bacteriol.

Rev. 28, 83-95. Ebner, H., Enenkel, A., (1966), Process and aparatus for the analysis of mixures of liquids, U.S. Patent 3290924. Ebner, H., and Follman, H. 1996. Biotechnology. V:Acetic acid, vol. 12. ed. Rehm H. J., Reed, G.

Verlag Chemie, Weinheim, s.383-401. Ebner, H., Follmann, H. (1983), Acetic Acid, in: Biotechnology, 1st Edn., Vol.3 (Rehm, H. J.,

Reed, G., Eds.), str. 387-407. Weinheim: Verlag Chemie.


Higashide, T., Shinada, C., Kawamura, Y., Hisamatsu, M., Yamada, T. (1992), Vinegarmaking. (I) Improvement of surface fermentation by continuous methods, Bull. Fac. Biores. Mie

Univ. Tsu 8, str. 43-49. Hromatka, O., Gsur, H. (1962), Investigations of the vinegar fermentation. YII. The influence of

radioactive 14CO2 on Acetobacter, Enzymologia 25, 81-86. Likar, M. 1998. Ocetna kislina. V: Vodnik po onesna�evalcih okolja. Zbornica sanitarnih Tehnikov in in�inirjev Slovenije, Grafika Gracer, Celje, 1998, 54-55 s. Milek, I. 2000. Stranski produkti ocetnokislinskega vrenja. Diplomska naloga. Ljubljana, Biotehni�ka fakulteta, Oddelek za �ivilstvo, 91 s. Plessi, M. 1993. Vinegar. V: Macrae, R. ed. / Robinson, R. K. ed. / Sedler, M. J. ed. Encyclopedia of Food Science, Food Technology and Nurtriton. Vol. 7. London, Academic Press, s. 4773-4779. Terček, J.1999. Molecular identification of the acetic acid bacteria isolated from vinegar an

plasmid vector construction for Acecetobacter spp. Doktorska dizertacija. Ljubljana, Biotehni�ka fakulteta, Oddelek za �ivilstvo.

http://www.britannica.com/ed/article/9/0,5/16,//409/5422,00.htm 26.12.2000 http://www.cookswares.com/discvinegar.htm 04.01.2001 http://www.fao.org/docrep/t0681E/t0681e08.htm 04.01.2001 http://www.frings.com/englisch/essig_e.html 04.01.2001

http://www.britannica.com/ed/article/9/0,5/16,//409/5422,00.htm

http://www.cookswares.com/discvinegar.htm

http://www.fao.org/docrep/t0681E/t0681e08.htm

http://www.frings.com/englisch/essig_e.html

Documents

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNI−KA FAKULTETAweb.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar_all/zivil/2000_01/Ocetna.pdf · * Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija. Proizvodnja ocetne