Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна 661

Selaković V, et al. Vojnosanit Pregl 2002; 59(6): 661−667.

UDC 616.831−005.4: 612.017.1.08

Inflamatorna reakcija i athezijski molekuli uishemiji mozga

Vesna Selaković, Miodrag Čolić, Petar Milosavljević

Vojnomedicinska akademija, Institut za medicinska istraživanja, Beograd

K lj u č n e r e č i : mozak, ishemija; ćelije, athezijski molekuli; zapaljenje;endotel krvnih sudova; citokini; zapaljenje, medijatori.

K e y w o r d s : brain ishemia; cell athesion molecules; inflammation;endothelium, vascular; cytokines; inflammationmediators.

Tokom poslednjih nekoliko godina mnoga istraživanjasu usmerena na ulogu razvoja inflamatorne reakcije nakonpovrede CNS u najširem smislu. Naime, osnovu inflamaciječine lokalna vazodilatacija, povećana vaskularna propustlji-vost, povećana akumulacija proteina plazme i tečnosti i na-gomilavanje leukocita, a centralno zbivanje predstavlja is-poljavanje athezijskih molekula. Noviji radovi pokazuju dau zoni ishemije mozga dolazi do migracije leukocita krozlokalni vaskularni endotel i njihove akumulacije na mestulezije, što se dešava već prvih sati od početka ishemije. In-flamatorna reakcija je zajednički odgovor moždanog paren-hima na različite forme ishemije mozga. U slučaju akutnoginfarkta mozga porast broja leukocita u parenhimu mozgaprisutan je 2−3 dana nakon infarkta, a visok nivo polimor-fonukleara u ishemijskom području već 6−8 sati nakon in-farkta, što ukazuje na značajnu ulogu ovih ćelija u progredi-ranju ishemije ka infarktu mozga (1−8).

Postoje brojni mehanizmi preko kojih leukociti ošte-ćuju ishemični parenhim (sl. 1). Naime, leukociti mogu za-pušiti male krvne sudove i dovesti do nemogućnosti kom-pletnog oporavka protoka krvi u ishemičnom području na-kon uspostavljanja reperfuzije. Začepljenje krvnih sudovaleukocitima tokom ishemije može biti rezultat njihove inte-rakcije sa endotelnim ćelijama posredovane athezijskimmolekulima i/ili smanjenja njihove deformabilnosti usledpolimerizacije aktina i pseudopodnih projekcija. Pored toga,mogući su i drugi štetni efekti leukocita tokom ishemije:oslobađanje medijatora vazokonstrikcije kao što je superok-sidni anjon, tromboksan A2, endotelin-1 i prostaglandin H2,zatim poremećaj vazoreaktivnosti arterija mozga i osloba-

đanje citotoksičnih enzima, reaktivnih oksidativnih materi-ja, azot oksida i produkata fosfolipidne kaskade (sl. 1). Da-lje, oslobađanje proteolitičkih enzima kao što je elastaza idr. može dovesti do oštećenja membrane endotelnih ćelija ibazalne membrane, što oštećuje krvno−moždanu barijeru iomogućava formiranje postishemijskog edema mozga. Ta-kođe, nastali poremećaj integriteta endotelnih ćelija i bazal-ne lamine može olakšati izlazak eritrocita u tkivo i hemora-gijsku transformaciju infarkta (1−4, 9−14).

Leukocit

Aktivacija Oksidanti

IshemijaCitokini

Oksidanti

ProteazeLigand Integrin

Endotelna ćelija

Ksantinoks.

Ksantindex.

Oksidanti

Bazalna membrana Oštećenje tkiva

O2

Sl. 1 − Mehanizmi oštećenja endotela leukocitima u ishe-mijsko-reperfuzionoj povredi. Ksantin deh.-ksantin dehid-

rogenaza; Ksantin oks.-ksantin oksidaza.

Migracija ćelija je kompleksan proces koji zavisi odpopulacije ćelija koja je obuhvaćena, mesta njihove aktiva-

Страна 662 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Број 6

cije i načina interakcije sa endotelom. Migracija leukocitapodrazumeva vezivanje cirkulišućih ćelija za vaskularni en-dotel i njihovo kretanje između ili kroz endotelne ćelije i,drugo, posle prolaska kroz endotel ćelije migriraju ka mestuzapaljenja vođene hemotaksičkim stimulusima. Ovaj procesje kontrolisan delimično preko molekula na površini migri-rajućih ćelija koji omogućavaju interakciju sa endotelom,tkivnim ćelijama ili vanćelijskim matriksom, a delimičnopreko različitih solubilnih signalnih molekula, kao što suhemokini i drugi hemotaksički molekuli (sl. 2).

Bazalnamembrana Lumen krvnog

suda

Eritrocit

Endotelna ćelija

Endotelni athezijski molekuli:E-, P-Selektin, VCAM-1, ICAM-1

Leukocitni athezijski molekuli:L-Selektin, Integrini

Solubilni oblici leukocitno-endotelnih adhezijskih molekula

Ekstravazacija vezanihaktivisanih ćelija

Sl. 2 − Shema interakcije leukocita i endotela i migracijeleukocita u parenhim.

Generalno, migracija leukocita kroz endotel zavisi odpovršinskog opterećenja prisutnih ćelija, hemodinamskihsila vaskularnog korita i ispoljavanja komplementarne grupeathezijskih molekula na leukocitima i endotelnim ćelijama.Sa ovog aspekta značajna je migracija leukocita kroz post-kapilarne venule, jer je tu protok krvi usporen, hemodinam-ske sile slabije, a značajno selektivno ispoljavanje athezij-skih molekula (sl. 2). Migracija leukocita je kontrolisanapreko athezijskih molekula na leukocitima i endotelu, prekomigratornog kapaciteta leukocita i prisustva hemotaksičkihagensa u tkivu (1−3, 8, 15−18).

Athezijski molekuli

Athezija leukocita za površinu endotela i njihova posle-dična migracija u moždani parenhim posredovana je različi-tim molekulima lokalizovanim na endotelu i samim leukoci-tima. Athezijski molekuli koji kontrolišu migraciju leukocitamogu biti ćelijski athezijski molekuli iz familije imunoglobu-lina, selektini i njihovi ugljenohidratni ligandi i integrini. Ufiziološkim uslovima athezijski molekuli uopšte nisu ili su

veoma malo ispoljeni na ćelijskoj površini, ali njihovo ispo-ljavanje može biti indukovano raznim patofiziološkim proce-sima, kao što je ishemija mozga, pri čemu je njihova pozitivnaregulacija posredovana citokinima (1−3, 15−21).

Intercelularni athezijski molekuli su proteini vezani zamembranu, koji omogućavaju jednoj ćeliji da se veže zadrugu. Često su ovi molekuli vezani za citoskelet ćelije, štoomogućava da se ćelije pomeraju ka drugoj ćeliji ili vanće-lijskom matriksu. U mnogim slučajevima jedan athezijskimolekul može vezivati više od jednog liganda, za koje imarazličita vezujuća mesta. Ćelije mogu modulirati interakcijusa drugim ćelijama porastom broja athezijskih molekula nasvojoj površini ili menjanjem njihovog afiniteta. Takođe,ćelije mogu menjati nivo ispoljavanja athezijskih molekulazadržavajući ove molekule u unutarćelijskim vezikulama,koje se mogu usmeriti ka ćelijskoj površini nekoliko minutanakon aktivacije ćelije i alternativno, novi molekuli se mo-gu sintetisati i transportovati na površinu ćelije u roku odnekoliko časova (3, 15−22).

Endotelni athezijski molekuli iz porodiceimunoglobulina obuhvataju ICAM-1 (intercelularni at-hezijski molekul-1), ICAM-2 (intercelularni athezijski mo-lekul-2), VCAM-1 (vaskularni ćelijski athezijski molekul) iMAdCAM-1 (mukozni athezijski molekul-1). Svi članoviove porodice se ispoljavaju ili indukuju na vaskularnom en-dotelu. Kao transmembranski glikoprotein ICAM-1 se ispo-ljava, pored endotela, i na epitelnim ćelijama, limfocitima,monocitima, eozinofilima, keratinocitima, dendritičnim će-lijama, hematopoeznim stem-ćelijama, hepatocitima i fibro-blastima. Ima 5 ekstracelularnih domena i negovi najvažnijiβ2 integrinski ligandi su LFA-1 (CD11a/CD18) i Mac-1(CD11b/CD18), koji se ispoljavaju na leukocitima. Regula-cija ispoljavanja ICAM-1 je ćelijski specifična i važno je dapozitivnu regulaciju obično pokreću inflamatorni citokini, anegativnu antiinflamatorni agensi (npr. glukokortikoidi). Namestu inflamacije oslobođeni inflamatorni citokini indukujuispoljavanje ICAM-1 na vaskularnim endotelnim ćelijama iaktivaciju leukocitnih integrina, što je neophodan korak umigraciji leukocita na mesto zapaljenja. Transmembranskiglikoprotein VCAM-1 ima 6 vanćelijskih domena i njegovnajvažniji integrinski ligand je VLA-4. Ispoljavaju ga neu-roni, endotelne ćelije, glatke mišićne ćelije, fibroblasti imakrofagi. Cirkulišuće forme ovih molekula kod ljudi naj-verovatnije nastaju proteolitičkim oslobađanjem njihovihvanćelijskih domena. Međutim, funkcionalni značaj ovihsolubilnih, cirkulišućih formi još uvek je nedovoljno poz-nat. Pretpostavlja se da je oslobađanje athezijskih molekulavažan mehanizam regulacije migracije leukocita na mestuzapaljenja i da je pojava cirkulišućih formi ovih molekulaznak aktivacije na sistemskom nivou (3, 15−22).

Integrini su uključeni u atheziju za endotel ili vanće-lijski matriks i predstavljaju veliku grupu athezijskih mole-kula, prisutnih na mnogim ćelijama, uključujući i leukocite.Svi članovi ove velike porodice molekula se sastoje od dvanekovalentno vezana peptida (α i β), koji prelaze membra-nu. Vezivanjem različitih α i β subjedinica nastaje preko 20

Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна 663

različitih heterodimera. Značajne su 3 glavne porodice zavi-sno od toga da li imaju β1, β2 ili β3 lanac. Integrini β1 suuključeni u vezivanje ćelija za vanćelijski matriks, β2 suuključeni u vezivanje leukocita za endotel ili druge imunskećelije, a β3 (citoathezijski) u interakcije trombocita i neutro-fila u uslovima inflamacije ili vaskularnog oštećenja (3,15−22).

Selektini su grupa athezijskih molekula na leukoci-tima, trombocitima i endotelu koji se vezuju za ugljene hid-rate. E-selektin (endotelno-leukocitni athezijski molekul) iP-selektin (trombocitno-endotelni athezijski molekul) se is-poljavaju na endotelu i trombocitima, a L-selektin (leuko-citni athezijski molekul) na leukocitima. To su transmem-branski molekuli sa brojnim vanćelijskim domenima. E-selektin preko N-terminalnog lektin domena se vezuje zaugljenohidratne ligande ispoljene na leukocitima i ima zna-čajnu ulogu u lokalizaciji zapaljenjske reakcije na mestuoštećenja i inicijalnom kotrljanju i vezivanju leukocita zaendotel. Cirkulišuće forme selektina su dokazane, ali njiho-vo nastajanje i funkcionalni značaj su još uvek nedovoljnopoznati (3, 15−22).

Ugljenohidratni ligandi za selektine se vezuju zarazličite glikoproteine na leukocitima i endotelu. Ovi ligan-di mogu biti vezani sa različitim proteinima: E-selektin seispoljava na aktivisanom endotelu i vezuje za specifičan(sialyl Lewis-X) ugljenohidratni deo CD15 molekula, pri-sutan na mnogim leukocitima (3, 15−22).

Mehanizmi migracije leukocita u CNS tokominflamacije

Proces migracije leukocita kroz endotel i njihovog na-kupljanja na mestu inflamacije obuhvata nekoliko uzastop-nih koraka. Athezijski molekuli kontrolišu ćelijsko veziva-nje i transendotelnu migraciju.

Prvi korak - vezivanje leukocita za endotelnećelije. Inicijalni korak ulaska leukocita u CNS je vezivanjecirkulišućih leukocita za endotelne ćelije krvnih sudova.Sporocirkulišući leukociti u kapilarima i postkapilarnim ve-nulama se najpre slabo vezuju za endotel, što dovodi do tzv.kotrljanja leukocita duž zida krvnog suda, usled neprekid-nog pričvršćivanja i odvajanja athezijskih molekula. U slu-čaju neutrofila ovo „kotrljanje“ obuhvata athezijske mole-kule klase selektina, koji se vezuju za specifične ugljenohid-ratne strukture. Ne zna se mnogo o uključivanju selektina unakupljanje leukocita u CNS-u, ali povećanje koncentracijesolubilnog E-selektina i L-selektina opisano je kod bolesni-ka sa multiplom sklerozom, a u vezi je sa epizodama akutneinflamacije. Neutrofili se prvi pojavljuju na mestu akutneinflamacije i to je delimično kontrolisano preko citokinskeindukcije E-selektina na površini endotela ovog područja. Invitro stimulacija endotela citokinima, kao što su IL-1 iTNF-α, dovodi do ispoljavanja E-selektina u periodu od 4do 12 časova, ali ono prestaje tokom 24 časa, a i in vivo seovi molekuli pojavljuju rano tokom inflamatorne reakcije(sl. 3).

Vreme

Stimulacijaendotela

P-SELECTIN

E-SELECTINICAM-1, VCAM-1

ICAM-2

Sl. 3 − Vremenska zavisnost indukcije i ispoljavanjaendotelnih athezijskih molekula nakon stimulacije endotela

sa TNFα, IL-1 i IFNγ.

Ovo je prvi kritični korak u migraciji leukocita. Za mi-graciju neutrofila, limfocita i monocita značajni su i β2- inte-grinski ligandi, LFA-1 i Mac-1, koji se ispoljavaju na leuko-citima i vezuju za endotelne celularne athezijske molekule izfamilije imunoglobulina. LFA-1 se vezuje za ICAM-1 iICAM-2 ispoljenim na vaskularnom endotelu. In vitro, endo-telno ispoljavanje ICAM-2 je konstitutivno, što ukazuje daICAM-2 determiniše bazalni nivo vezivanja limfocita za raz-ličite tipove endotela. Ispoljavanje ICAM-2 je relativno malou moždanom endotelu, a i migracija ćelija kroz normalan mo-ždani endotel je takođe mala. Nasuprot tome, ICAM-1 jenormalno prisutan u maloj koncentraciji na endotelu, ali možebiti indukovan citokinima (TNFα, IL-1 i IFNγ). In vitro sti-mulacija endotela citokinima, kao što su IL-1 i TNF-α, indu-kuje ispoljavanje ICAM-1 nakon 8−96 časova, pa je on odgo-voran za kasniji dolazak monocita i limfocita na mesto zapa-ljenja (sl. 3). U toku inflamatornog procesa indukcija VCAM-1 vremenski odgovara indukciji ICAM-1 (sl. 3). VCAM-1 sevezuje za integrin VLA-4, prisutan na limfocitima. Takođe,pokazano je da postoji razlika u tome koji citokini indukujuE-selektin, ICAM-1 i VCAM-1 zavisno od specijesa i vrstevaskularnog korita.Vezivanje limfocita za endotel može semodulirati primenom antitela za athezijske molekule na lim-focitima ili endotelu, ili primenom solubilnih athezijskih mo-lekula u terapiji bolesti za koje su važne ove imunopatološkepromene (3, 15−22).

Susretanje specifičnih aktivirajućih ili hemoatraktant-nih signala inicira prolaznu interakciju leukocita sa endote-lom. Sekundarna, čvršća interakcija nastaje posredstvomintegrina i njihovih endotelnih struktura. Ova heterogenafamilija athezijskih molekula ima β1 i β2 subjedinice ispo-ljene na limfocitima i monocitima i odgovorne su za čvršćuatheziju za endotelne ćelije. LFA-1 i VLA-4 posreduju čvr-šće vezivanje limfocita za endotelne ćelije i ćelijske linijeporeklom iz CNS-a, sa odgovarajućim ligandima ICAM-1 iVCAM-1. Konstitutivno ispoljavanje ICAM-1 se postižeputem endotelnih ćelija, a aktivacija tih ćelija tokom infla-macije indukuje ispoljavanje VCAM-1 i pozitivnu regula-

Страна 664 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Број 6

ciju ICAM-1. Vezivanje limfocita za endotelne ćelije krv-no-moždane barijere je manje nego za endotelne ćelije vanCNS-a, što je u saglasnosti sa činjenicom da je CNS imun-ski privilegovan (3, 15, 16, 20).

Drugi korak - transendotelna migracija. Drugikorak tokom nakupljanja leukocita u CNS je njihova migra-cija kroz endotel. Endotelne ćelije CNS-a imaju neke kara-kteristične crte, uključujući uske veze između susednih će-lija, koje doprinose funkciji barijere. Migracija limfocitakroz monosloj aktivisanih moždanih endotelnih ćelija je za-visna od interakcija LFA-1/ICAM-1 i VLA-4/VCAM-1.Migracija ćelija kroz endotel je regulisana preko hemotaksi-čkih faktora, kao što su C5a i CC hemokini. Ovi molekuli seproizvode i oslobađaju na mestu oštećenja. Prekomerna mi-gracija leukocita u kasnijem stadijumu inflamacije oštećujeendotel i doprinosi povećanju propustljivosti krvno-moždane barijere (15−20).

Rečeno je da hemotaksički molekuli podstiču migra-ciju i kontrolišu kretanje leukocita do mesta inflamacije.Između ostalog, za migraciju leukocita kroz endotel neop-hodni su integrini prisutni u nefunkcionalnom obliku na po-vršini ćelija ili u unutarćelijskim granulama iz kojih se os-lobađaju na površinu pod dejstvom signala koji ih aktivišu.Aktivacioni signali mogu poticati direktno iz endotelnih će-lija ili mogu dolaziti iz signalnih molekula oslobođenih iztkiva i zadržanih u endotelu. Mnogi od ovih signalnih mo-lekula su, takođe, hemotaksički. Tu spadaju C5a, leukotri-en-B4 (LTB4) i različiti citokini male molekulske mase,hemokini (IL-8, MIP-α, MIP-1β). Hemokini predstavljajugrupu od oko 18 molekula vezanih za heparin uključujući iIL-8, koji se oslobađaju tokom inflamacije. Oni deluju pre-ko grupe od 3 do sada identifikovana receptora ispoljena urazličitim populacijama leukocita. Neki od tih hemokinadeluju selektivno na određene populacije leukocita: npr.MIP-1β selektivno stimuliše CD8+T ćelije. Vezivanjem zaendotel oni mogu da pokrenu ćelije aktivišući njihove inte-grine i inicirajući migraciju, čime se obezbeđuje da leukocitispolji odgovarajući integrin, a endotel odgovarajući ligand(3, 14−21, 23, 24).

Treći korak - ulazak u perivaskularni prostor.Nakon migracije leukocita kroz monosloj endotelnih ćelija iprolazak kroz unutrašnju membranu leukociti ulaze u peri-vaskularni prostor, koji se nalazi između unutrašnje mem-brane endotela i spoljašnje membrane glije limitans paren-hima CNS-a. U perivaskularnom prostoru su smešteni peri-citi i perivaskularni makrofagi. Periciti predstavljaju tip će-lija lokalizovanih na strani endotela i prave zatvorene kon-takte sa endotelnim ćelijama preko procesa penetracije krozpore u unutrašnjoj bazalnoj lamini. Ovi zatvoreni ćelijsko-ćelijski kontakti olakšavaju transport krvnih sastojaka uCNS, dok su periciti uključeni u nakupljanje leukocita. Invitro je pokazano da periciti oko krvnih sudova blizu mestaoštećenja ispoljavaju VCAM-1 i ICAM-1, što je posredova-no putem interakcije VLA-4/VCAM-1 i u manjem stepenuLFA-1/ICAM-1. Drugi ćelijski tip prisutan u perivaskular-nom prostoru pacova su ED2-pozitivni makrofagi. Oni su

brojno manji od pericita, a predstavljaju važan izvor IL-1,koji može stimulisati susedne endotelne ćelije, što dovodido pozitivne regulacije ispoljavanja VCAM-1 i ICAM-1.Stvaranje IL-1 putem makrofaga prethodi masivnom influk-su limfocita i monocita. Očigledno je da perivaskularni pro-stor i glija limitans igraju važnu ulogu u procesu nakuplja-nja i zadržavanja leukocita u ovom prostoru tokom infla-matornog procesa (3, 13−24).

Četvrti korak - migracija u parenhim. Da bi ušleu tkivo, neke ćelije mogu reagovati sa proteinima vanćelij-skog matriksa (kolagen, laminin, fibronektin i dr.). Za inte-rakciju mnogih leukocita sa vanćelijskim matriksom neop-hodni su β1 integrini koji su receptori za kolagen (VLA-2 iVLA-3), laminin (VLA-3 i VLA-6) i fibronektin (VLA-3,VLA-4 i VLA-5). Neki od ovih molekula se pojavljuju kas-nije nakon aktivacije limfocita, što ukazuje da ćelije prolazekroz program diferencijacije i da se sposobnost za interak-ciju sa vanćelijskim matriksom razvija kasnije (3, 13−24).

Ovaj korak u procesu nakupljanja ćelija u CNS-u jeprolazak kroz gliju limitans i interakcija sa astrocitimakoji se tu nalaze. Smatra se da astrociti čine sastavni deokrvno-moždane barijere, jer su svojim produženim ćelij-skim nastavcima posrednici između krvnih sudova i neu-rona, učestvujući u transportu materija i produkata meta-bolizma. Pored toga, astrociti obezbeđuju supstrat za mi-graciju leukocita u CNS, jer izduživanje astrocita predsta-vlja vodič u penetraciji leukocita u parenhim. Ćelijska in-terakcija je posredovana putem α4 integrina. Pokazano jeda kao ligand za α4 integrine i kao athezijski molekulfunkcioniše astronektin, protein vanćelijskog matriksa uastrocitima, koji sadrži unakrsnoreaktivne epitope sličneCS1 domenu fibronektina. Suprotno od drugih proteinavanćelijskog matriksa astrocita, koji igraju značajnu uloguu procesu migracije neuronskih ćelija i izrastanju aksonatokom histogeneze CNS-a, astronektin je ispoljen u zre-lom CNS-u i može biti uključen u neuromodulatorne iliregenerativne odgovore (3, 13−24).

Već je rečeno da ishemija mozga predstavlja centralnipatofiziološki mehanizam kod mnogih akutnih i hroničnihoboljenja i da se ishemija sa subsekventnom reperfuzijomkarakteriše, između ostalog, infiltracijom leukocita i infla-matornom reakcijom koja ima značajnu ulogu u nastankuishemijom pokrenute disfunkcije i oštećenja. Tokom posle-dnjih 4−5 godina istraživanja su usmerena na inflamatornureakciju u zoni ishemijske penambre. Značaj interakcije iz-među leukocita i moždanog endotela u regulisanju infla-matornog procesa potkrepljen je sledećim nalazima ekspe-rimentnih studija: a) sniženje broja cirkulišućih leukocitadovodi do redukovanja veličine infarkta i edema na modelufokalne ishemije mozga; b) povećano nakupljanje leukocitau mozgu za vreme ishemije/reperfuzije praćeno je poveća-nim ispoljavanjem athezijskih molekula u moždanim krv-nim sudovima; c) davanje eksperimentnim životinjama an-titela protiv athezijskih molekula ispoljenim na leukocitimai endotelu pre i/ili posle ishemije snižava veličinu infarkta iedem mozga i d) miševi sa delecijom gena za ICAM-1 po-

Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна 665

kazuju smanjenu osetljivost na oštećenje mozga izazvanoishemijom/reperfuzijom (10−12, 25−29).

Inflamatorni citokini, kao i vazoaktivni peptidi stimu-lišu ispoljavanje athezijskih molekula ICAM-1, VCAM-1 iE-selektina. Međutim, još uvek se malo zna o vanćelijskim iunutarćelijskim procesima koji kontrolišu indukciju i ispo-ljavanje athezijskih molekula u ishemiji. Generalno posmat-rano, veruje se da reperfuzija ishemičnog tkiva rezultujestvaranjem proinflamatornih medijatora, kao što su IL-1 iTNF-α, koji indukuju atheziju i emigraciju neutrofila iz po-stkapilarnih venula. Upravo je pokazano da izlaganje hu-manih mikrovaskularnih endotelnih ćelija inflamatornimcitokinima u trajanju od 4 do 24 sata ima za posledicu zna-čajno povećanje ispoljavanja ICAM-1 i VCAM-1, kao i E-selektina. Citokinima indukovano povećano ispoljavanje at-hezijskih molekula smanjuje se kada se ćelije tretiraju tran-skripcijskim inhibitorima, što ukazuje da je njihova pozitiv-na regulacija transkripcijski kontrolisana. Dalje, inflamator-ni citokini i hemokini olakšavaju penetraciju leukocita uCNS pozitivnim regulisanjem endotelnih athezijskih recep-tora i povećanim vezivanjem leukocita za endotel (10−12,29−33).

Takođe, in vitro studije pokazuju da povećano ispolja-vanje athezijskih molekula indukovano sa TNFα i IFNγ, uznajveći stepen vezivanja limfocita za moždani endotel, od-govara vremenu maksimalnog ispoljavanja LFA-1 i VLA-4,kao i da primena anti-LFA-1 i anti-VLA-4 antitela blokiravezivanje ICAM-1 i VCAM-1 za moždani endotel. Nekestudije pokazuju da davanje monoklonskih antitela protivathezijskih molekula, ispoljenih na leukocitima i endotelu,smanjuje akumulaciju leukocita i oštećenje mozga nakontranzitorne fokalne ishemije. Pokazano je da rana tromboli-za (jedan sat) nakon embolijskog infarkta mozga kod paco-va, izazvana primenom rekombinantnog humanog tkivnogaktivatora plazminogena (rhtPA), smanjuje vaskularnu imu-noreaktivnost za E-selektin, P-selektin i ICAM-1, dok pri-mena rhtPA četiri sata nakon infarkta povećava vaskularnuimunoreaktivnost za ove athezijske molekule, kao i da isto-vremena primena rhtPA i anti-ICAM-1 antitela četiri satanakon infarkta značajno smanjuje akumulaciju neutrofila ivolumen infarkta (22−24, 30, 31, 34−36).

Izlaganje humanih mikrovaskularnih endotelnih ćelijaishemiji, u odsustvu egzogeno dodatih citokina, takođe re-zultuje povećanom transkripcijom i ispoljavanjem athezij-skih molekula. Tačan mehanizam kojim ishemija aktivišetranskripciju ICAM-1, VCAM-1 i E-selektina, još uvek nijepoznat. Mogući medijator ove reakcije je nuklearni faktor κB (NF-κB), koji ima važnu ulogu u regulisanju transkripcijeathezijskih molekula, a aktiviran je različitim faktorima in-dukovanih ishemijom, uključujući reaktivne oksidativnematerije, TNF-α, IL-1β itd. Ovako aktiviran NF-κB indu-kuje ispoljavanje gena za proteine akutne faze, athezijskemolekule, receptore na površini ćelija i citokine. Ispoljava-nje athezijskih molekula, koje je stimulisano ishemijommože biti i rezultat autokrinih efekata IL-1α i/ili PAF, s ob-zirom na to da je za oba ova medijatora pokazano da stimu-

lišu atheziju neutrofila, kao i da ih sekretuju endotelne ćelijeizložene ishemiji (6, 7, 29, 37−40).

Eksperimentno je pokazano da fokalna ishemija mozgapredstavlja veoma snažan stimulus koji pokreće u mozgujak odgovor genoma u vidu multiplog genskog ispoljavanja(sl. 4). Naime, u kori mozga pacova sekvencijalno vremen-sko ispoljavanje gena nakon ishemije podrazumeva veomarano pojavljivanje, ali i brzo ižčezavanje (prvih nekolikosati ishemije) transkripcionih faktora (c-fos, c-jun, zif286,jun-B). Drugi „talas“ podrazumeva ispoljavanje mRNK za„heat shock“ proteine (HSP-70 i HSP-72) unutar 1−2 sata iižčezavanje dva dana nakon ishemije (sl. 4). Najznačajnijije treći „talas“ koji podrazumeva porast ispoljavanja mRNKza citokine, athezijske molekule i faktore rasta. Tu su cito-kini TNFα, IL-1β, IL-6, IL-ra, zatim hemokini IL-8, imuno-reaktivni protein-10 (IP-10) i monocitni hemoatraktantniprotein-1 (MCP-1), koji imaju značajnu ulogu u infiltracijitkiva mononuklearima i monocitima (sl. 4). Treći „talas“podrazumeva, takođe, i porast ispoljavanja mRNK za athe-zijske molekule ICAM-1, VCAM-1, E-selektin i P-selektinunutar 1-3 sata nakon ishemije, kao i faktora rasta (faktorrasta nerva -NGF, moždani faktor rasta -BDNGF i tumor-supresorskog gena p53). Četvrti „talas“ uključuje ispoljava-nje mRNK za proteolitičke enzime (metaloproteinaze,Co192), značajne za oštećenje vanćelijskog matriksa uakutnoj fazi inflamacije. Peti „talas“ ispoljavanja gena uk-ljučuje medijatore kao što je TGFβ, koji mogu biti značajniza remodeliranje tkiva (sl. 4) (10, 11, 41).

Leukocit

dani

Sl. 4 − Dinamika ispoljavanja gena nakon ishemije mozga.IEG-veoma rani geni; HSP-„heat shock“ proteini; Cytk-citokini; AdMol-athezijski molekuli; GroF-faktori rasta;

ProtE-proteolitički enzimi; RemodF-remodulirajući faktori.

Sve je veći broj studija koje pokazuju da je inflama-torni proces uključen u patofiziološka zbivanja tokom ishe-mije mozga. Na animalnim modelima pokazano je da u zoniishemije i ishemijske penambre prisutni leukociti i ćelije pa-renhima mozga sekretuju mnogobrojne različite citokine,hemokine i druge medijatore inflamacije, od kojih mnogiindukuju ćelijsko oštećenje i učestvuju u ishemijsko-

Страна 666 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Број 6

reperfuzijskoj povredi mozga. Takođe, ozbiljan predmet is-traživanja brojnih studija su i moguće terapijske interven-cije u smislu antagonizovanja inflamatornog procesa kodishemije mozga na različitim nivoima, prvenstveno u smislublokiranja procesa athezije, što je do sada na eksperimental-nim modelima imalo nepotpune efekte (42−44).

Egzaktna patogenetska uloga athezijskih molekula to-kom ishemije mozga kod ljudi još uvek nije potpuno definisa-na. Još uvek nije poznato da li je opseg ispoljavanja ovih at-hezijskih molekula i njihovih solubilnih formi povezan sa kli-ničkim poremećajima i oporavkom bolesnika sa ishemijommozga, kao ni vremenska dinamika ovih promena kod ljudi.Takođe, još uvek je nepoznato kakve su razlike u ispoljavanjuovih athezijskih molekula kod bolesnika sa različitim oblici-ma ishemije mozga. Odgovori na ova otvorena pitanja moglibi se značajno uplesti u buduću terapijsku strategiju ishemijemozga usmerenu na zapaljenjsku reakciju, ali mogu biti zna-čajni i za kliničku praksu u smislu određivanja težine obolje-nja i oporavka tokom inicijalne faze ishemije mozga. Rezul-tati dobijeni u našim istraživanjima pokazuju da u akutnomperiodu ishemije mozga dolazi do značajnog porasta broja le-ukocita u perifernoj krvi, i to progresivno sa težinom obolje-

nja, kao i značajne korelacije između broja leukocita u plazmii težine neurološkog deficita. Takođe, rezultati naših istraži-vanja ukazuju da u akutnom periodu ishemije mozga postojirazličita dinamika promena koncentracija solubilnih athezij-skih molekula u plazmi i cerebrospinalnoj tečnosti zavisno odtežine ishemije, što ukazuje da koncentracija ovih molekulamože biti pokazatelj intenziteta sekundarne inflamatorne rea-kcije tokom ishemije mozga (8, 45).

Na osnovu iznetih podataka može se konstatovati da ka-da ishemijom izazvano oštećenje neurona dostigne određenupragovnu vrednost, dolazi do oslobađanja toksičnih supstanci,koje sekundarno oštećuju gliju i vaskularno tkivo, a ove se-kundarne promene (inflamacija) mogu potencirati već posto-jeće oštećenje neurona, ali i dovesti do daljeg širenja ošteće-nja na očuvane neurone. Kako između nastanka primarnog isekundarnog oštećenja postoji određena vremenska latenca,može se opravdano očekivati da upravo ova saznanja dajumogućnost primene terapije koja sprečava nastajanje i širenjesekundarnog oštećenja. Na osnovu navedenog logično je oče-kivati da bi odnos (ravnoteža) proinflamatornih i imunoindu-ktivnih (imunomodulatornih) procesa određivao smer patofi-zioloških zbivanja u akutnoj fazi ishemije mozga.

L I T E R A T U R A

1. Iadecola C, Alexander M. Cerebral ischemia and in-flammation. Curr Opin Neurol 2001; 14(1): 89−94.

2. Pantoni L, Sarti C, Inzitari D. Cytokines and cell athe-sion molecules in cerebral ischemia: experimentalbases and therapeutic perspectives. ArteriosclerThromb Vasc Biol 1998; 18(4): 503−13.

3. Roitt I, Brostoff J, Male D. Cell migration and inflam-mation. In: Cook L, editor. Immunology. London:Mosby Inc; 1996. p.1−9.

4. Gehrmann J, Banati RB, Wiessner C, Hossmann K,Kreutzberg GW. Reactive microglia in cerebral is-chaemia: an early mediator of tissue damage? Neu-ropathol Appl Neurobiol 1995; 21(4): 277−89.

5. Stanimirović D, Satoh K. Inflammatory mediators ofcerebral endothelium: a role in ischemic brain inflam-mation. Brain Pathol 2000; 10(1): 113−26.

6. Park LC, Zhang H, Sheu KF, Calingasan NY, KristalBS, Lindsay JG, et al. Metabolic impairment inducesoxidative stress, compromises inflammatory responses,and inactivates a key mitochondrial enzyme in micro-glia. J Neurochem 1999; 72(5): 1948−58.

7. Sedgwick JD, Ford AL, Foulcher E, Airriess R. Cen-tral nervous system microglial cell activation and pro-liferation follows direct interaction with tissue-infiltrating T cell blasts. J Immunol 1998; 160(11):: 5320−30.

8. Selaković V. Promene koncentracija solubilnih athezi-jskih molekula, S-100 proteina i neuron specifičneenolaze u cerebrospinalnoj tečnosti i plazmi bolesnika

u akutnoj fazi ishemijske bolesti mozga [doktorskadisertacija]. Beograd: Vojnomedicinska akademija;2001.

9. Tailor A, Granger DN. Role of athesion molecules invascular regulation and damage. Curr Hypertens Rep2000; 2(1): 78−83.

10. Feuerstein GZ, Wang X, Barone FC. Inflammatorygene expression in cerebral ischemia and trauma. AnnN Y Acad Sci 1997; 825: 179−93.

11. Sharp FR, Lu A, Tang Y, Millhom D. Multiple mo-lecular penumbras after focal cerebral ischemia. JCereb Blood Flow Metab 2000; 20(7): 1011−32.

12. Kogure K, Yamasaki Y, Matsuo Y, Kato H, OnoderaH. Inflammation of the brain after ischemia. Acta Neu-rochir 1996; 66: 40−3.

13. Ritter L, Orozco JA, Coull BM, McDonagh PF. Leu-kocyte accumulation and hemodynamic changes in thecerebral microcirculation during early reperfusion afterstroke. Stroke 2000; 31(5): 1153−61.

14. del Zoppo GJ. Microvascular responses to cerebral is-chemia/inflammation. Ann N Y Acad Sci 1997; 823:: 132−47.

15. Krieglstein CR, Granger DN. Athesion molecules andtheir role in vascular disease. Am J Hypertens 2001;14(6 Pt 2): 44S−54S.

16. Lee SJ, Benveniste EN. Athesion molecule expressionand regulation on cells of the central nervous system. JNeuroimmunol 1999; 98(2): 77−88.

Број 6 ВОЈНОСАНИТЕТСКИ ПРЕГЛЕД Страна 667

17. Carlos TM, Harlan JM. Leukocyte - endothelial athe-sion molecules. Blood 1994; 84(7): 2068−101.

18. del Zoppo G, Ginis I, Hallenbeck JM, Iadecola C,Wang X, Feuerstein GZ. Inflammation and stroke: pu-tative role for cytokines, athesion molecules and iNOSin brain response to ischemia. Brain Pathol 2000;10(1): 95−112.

19. Gearing AJ, Newman W. Circulating athesion moleculesin disease. Immunol Today 1993; 14(10): 506−12.

20. Laan L. Multistep recruitment of leukocytes during in-flammation in the CNS. In: Laan L, editor. Macrophagereceptors: role in myelin phagocytosis and inflamma-tion. London: Vrije Universiteit; 1998. p.118−53.

21. Smith W. Cellular athesion and interactions. In: Rich R,editor. Clinical immunology. London: Mosby Inc;1996. p.176−91.

22. DeLisser HM, Christofidou-Solomidov M, Sun J, Na-kada MT, Sullivan KE. Loss of endothelial surface ex-pression of E-selectin in a patient with recurrent infec-tions. Blood 1999; 94(3): 884−94.

23. Male D, Rahman J, Pryce G, Linke A. Lymphocytemigration intro the CNS modelled in vitro: roles ofLFA-1, ICAM-1 and VLA-4. J Neuroimmunol 1992;40(2−3): 167−71.

24. Persidsky Y. Model systems for studies of leukocytemigration across the blood-brain barrier. J Neurovirol1999; 5(6): 579−90.

25. DeGraba TJ. The role of inflammation after acutestroke: utiliti of pursuing anti-athesion molecule ther-apy. Neurology 1998; 51(3 Suppl 3): 62−8.

26. Stanimirović DB, Wong J, Shapiro A, Durkin JP. In-crease in surface expression of ICAM-1, VCAM-1 andE-selectin in human cerebromicrovascular endothelialcells subjected to ischemia-like insults. Acta Neurochir1997; 70: 12−6.

27. Soriano SG, Lipton SA, Wang YF. Intracellular athe-sion molecule-1 deficient mice are less susceptible tocerebral ischemia-reperfusion injury. Ann Neurol1996; 39(5): 618−24.

28. Maroszynska I, Fiedor P. Leukocytes and endotheliuminteractions as rate limiting step in the inflammatoryresponse and a key factor in the ischemia-reperfusioninjury. Ann Transplant 2000; 5(4): 5−11.

29. Stoll G, Jander S, Schroeter M. Inflammation and glialresponse sin ischemic brain lesions. Prog Neurobiol1998; 56(2): 149−71.

30. Neumar RW. Molecular mechanisms of ischemic neu-ronal injury. Ann Emerg Med 2000; 36(5): 483−506.

31. Kim JS. Cytokines and athesion molecules in stroke andrelated disaeases. J Neurol Sci 1996; 137(2): 69−78.

32. Bryan RM Jr, Steenberg ML, Marrelli SP. Role of en-dothelium in shear stress-induced constrictions in ratmiddle cerebral artery. Stroke 2001; 32(6): 1394−400.

33. Willam C, Schindler R, Frei U, Eckardt KU. Increasesin oxygen tension stimulate expression of ICAM-1 andVCAM-1 on human endothelial cells. Am J Physiol1999; 276(6 Pt 2): H2044−52.

34. Morikawa E, Zhang SM, Seko Y, Toyoda T, Kirino T.Treatment of focal cerebral ischemia with syntheticoligopeptide corresponding to lectin domain of se-lectin. Stroke 1996; 27(5): 951−5.

35. Zhang RL, Zhang ZG, Chopp M. Trombolysis with tis-sue plasminogen activator alters athesion molecule ex-pression in the ischemic rat brain. Stroke 1999; 30(3):: 624−9.

36. Becker K, Kindrick D, Relton J, Harlan J, Winn R.Antibody to the alpha4 integrin decreases infarct sizein transient focal cerebral ischemia in rats. Stroke2001; 32(1): 206−11.

37. Li C, Browder W, Kao RL. Erly activation of tran-scription factor NF-κB during ischemia in perfused ratheart. Am J Physiol 1999; 276(2 Pt 2): H543−52.

38. Clemens JA, Stephenson DT, Smalstig EB, Dixon EP,Little SP. Global ischemia activates nuclear factor-κBin forebrain neurons of rats. Stroke 1997; 28(5):: 1073−81.

39. Hess DC, Howard E, Cheng C, Carroll J, Hill WD.Hypertonic mannitol loading of NF-κB transcriptionfactor decoys in human brain microvascular endothe-lial cells blocks upregulation of ICAM-1. Stroke 2000;31(5): 1179−86.

40. Stanimirovic D, Shapiro A, Wong J, Hutchison J, DurkinJ. The induction of ICAM-1 in human cerebromicrovas-cular endothelial cells (HCEC) by ischemia-like condi-tions promotes enhanced neutrophil/HCEC athesion. JNeuroimmunol 1997; 76(1−2): 193−205.

41. Papadopoulos MC, Giffard RG, Bell BA. An introduc-tion to the changes in gene expression that occur aftercerebral ischemia. Br J Neurosurg 2000; 14(4): 305−12.

42. Castillo J, Leira R. Predictors of deteriorating cerebralinfarct: role of inflammatory mechanisms. Would itsearly treatment be useful? Cerebrovasc Dis 2001;11(Suppl 1): 40−8.

43. Fisher M, Schaebitz W. An overview of acute stroketherapy: past, present, and future. Arch Intern Med2000; 160(21): 3196−206.

44. Iwai M, Abe K, Kitagawa H, Hayashi T. Gene therapywith adenovirus-mediated glial cell line-derived neu-rotrophic factor and neural stem cells activation afterischemic brain injury. Hum Cell 2001; 14(1): 27−38.

45. Selaković V, Jovanović MD, Jovičić A, Mršulja BJ,Maličević Ž, Ninković M, et al. Index of lipid peroxi-dation and glucose utilization in the cerebrospinal fluidin patients with cerebral infarction. Vojnosanit Pregled2000; 57 (4): 375-9.Rad je primljen 31. I 2002. god.