Deteccin de qurum reguladores de la virulencia de la expresin
gnica enVibrio cholerae1. Jun Zhu*,2. Melissa B. Miller,3. Russell
E. Vance*,4. Michelle Dziejman*,5. Bonnie L. Bassler, y6. John J.
Mekalanos*+Afiliaciones de los autores1. *Departamento de
Microbiologa y Gentica Molecular, Escuela Mdica de Harvard, 200
Longwood Avenue, Boston, MA 02115, yDepartamento de Biologa
Molecular, Universidad de Princeton, Princeton, NJ 08544-10141.
Escrito por John J. MekalanosLa seccin siguienteAbstractoLa
produccin de factores de virulencia como la toxina del clera y el
pilus coregulated toxinas en el ser humano patgenoVibrio
choleraeest fuertemente influenciada por las condiciones
ambientales.La seal bien caracterizados toxR cascada de transduccin
es el responsable de la deteccin y la integracin de la informacin
ambiental y el control del reguln de virulencia.Mostramos aqu que,
adems de los componentes conocidos del circuito toxR de sealizacin,
deteccin de qurum reguladores estn implicados en la regulacin de
laV.choleraevirulencia.Nos centramos en el Luxo reguladores y HapR
porque homlogos de estos qurum de control de dos protenas de
deteccin en la estrecha relacin luminosa marina bacteriaVibrio
harveyi.El uso de un modelo de ratn lactante, se encontr que
unluxomutante se presentan graves carencias en la colonizacin del
intestino delgado.Arreglos de genes se utiliza para la transcripcin
de perfil en elV.choleraetipo salvaje y elluxomutante.Estos
estudios revelaron que el reguln toxR se reprime en elluxomutante,
y que este efecto es mediado por otro regulador negativo, HapR.Se
demuestra que Luxo reprimehapRexpresin temprana en el crecimiento
de log-fase, y la expresin constitutiva dehapRbloques toxR-regulon
expresin.Adems, Luxo y HapR regulan una variedad de otros procesos
celulares, incluyendo la motilidad, la produccin de la proteasa, y
la formacin de biofilm.En conjunto, estos datos sugieren un papel
para la deteccin de qurum en la modulacin de la expresin de los
bloques de genes de virulencia de manera recprocaen vivo.Los
Gram-negative bacteriaVibrio choleraepor lo general habita en
ambientes acuticos naturales, pero es mejor conocido como el agente
causante del clera, una diarrea severa (1).Dos factores son
fundamentales paraV.choleraevirulencia del clera enterotoxina (CT)
y un factor de colonizacin intestinal conocida como pilus toxinas
coregulated (TCP).Mal caracterizado las seales ambientales influyen
en la expresin de la TC y TCPen vivo(2).Dos protenas sensoriales,
toxR y TCPP, probablemente juegan un papel en la deteccin de las
seales del medio ambiente, a continuacin, iniciar una cascada de
transduccin de seales que promueve la expresin de ToxT, que a su
vez, activa directamente la transcripcin de genes implicados en la
expresin de TCP y TC (3).Trabajos recientes han demostrado que
muchas especies de bacterias controlar su poblacin de clulas
densidades a travs del intercambio de molculas de sealizacin qumica
(llamada autoinductores) que se acumulan extracelular y
alteraciones en el comportamiento de disparo a alta densidad de
poblacin.Este fenmeno es conocido como quorum sensing (4,5).La
deteccin de qurum controla los procesos que incluyen la
bioluminiscencia, la virulencia, la formacin de biopelculas, y la
esporulacin en diferentes especies bacterianas.En general, la
deteccin de qurum regula los procesos que son efectivos slo cuando
una poblacin de bacterias acta de forma coordinada, pero no cuando
las bacterias actan como individuos.Bacterias Gram-negativas suelen
utilizar acil-homoserina lactonas como autoinductores (5,6),
mientras que las bacterias Gram positivas suelen utilizar
oligopptidos modificados como las seales de comunicacin (5-7).Un
vnculo entre la deteccin de qurum y la virulencia se ha establecido
slo para unos pocos patgenos bacterianos, especialmentePseudomonas
aeruginosa(8) yStaphylococcus aureus(9).La bacteria marinaVibrio
harveyiutiliza un complicado sistema de deteccin de qurum para
regular la bioluminiscencia y otros fenotipos (10).V.
harveyiproduce dos autoinductores, un autoinductor homoserina
lactona (AI-1) y un segundo de deteccin de qurum autoinductor
(AI-2) que se ha descubierto recientemente que un dister de borato
(11,12).Deteccin y respuesta a la IA-1 y AI-2 se produce en
paralelo a travs de dos circuitos de dos componentes de transduccin
de seales (10,13,14), y un regulador de respuesta compartida
llamada Luxo integra la informacin de estos dos circuitos (15).Luxo
regula negativamente la expresin de la luminiscencia, probablemente
por la activacin de un supuesto represor aguas abajo de la
luciferasa opern (luxCDABE) (16).Adems, un regulador positivo
llamado LuxR es necesaria para la transcripcin de los genes que
codifican la luciferasa (17,18).LuxR es un homlogo de cierre de
laV.choleraeproteasa HapR protena reguladora (19).El anlisis de los
completadoV.choleraegenoma (20) revela que, aunqueV.choleraecarece
de los genes necesarios para la produccin de luz (luxCDABE), que
posee los genes necesarios para la produccin y la respuesta a la
deteccin de qurum seal de AI-2 (luxS, PQ, OU).En consonancia con
este hallazgo, los trabajos anteriores demostraron
queV.choleraeproduce AI-2 (21,22).Sin embargo, elV.choleraeobjetivo
(s) controlados por esta supuesta deteccin de qurum circuito, en su
caso, sigue siendo desconocido.Aqu mostramos que elV.harveyi-como
la deteccin de qurum reguladores estn involucrados en el control
deV.choleraevirulencia de la expresin gnica.Sorprendentemente, a
diferencia de otras especies bacterianas en las que la deteccin de
qurum activa la expresin de genes de virulencia en altas densidades
de clulas, enV.cholerae, la deteccin de qurum parece reprimir toxR
regulados los genes de virulencia.Seccin anteriorSeccin
siguienteMateriales y MtodosCepas bacterianas, plsmidos, y
condiciones de cultivo.V. choleraeEl Tor cepa C6706 (23) fue
utilizado como la tensin de los padres en este estudio.El mtodo
utilizado para la construccin de lahapRyluxomutantes de delecin fue
el de Skorupski y Taylor (24).El phapRplsmido fue construido por la
clonacin dehapRORF en pBBR1MCS4 (25) aguas abajo de la
constituyente placpromotor.Un isopropil -D-tiogalactsido
(IPTG)-induciblehapR-expresando plsmido (pJZ146) fue construido por
la subclonacinhapRgen en pMal-c2x (New England Biolabs).pMal-c2x
contiene la ptacpromotor y
ellacIQgen.CromosmicasTCPP-lacZyhapR-lacZfusiones reportero
transcripcional fueron construidas por la amplificacin de PCR de
los 5 'del ADN deTCPPyhapR, respectivamente, y la clonacin de estos
fragmentos en pVIK112 (26).Los plsmidos resultantes fueron
integrados en el cromosoma en elTCPPyhapRloci, respectivamente, por
recombinacin homloga.Cuando la TC y la produccin de TCP se
requiere,V.choleraecepas fueron cultivadas en medio de la IRA como
se describe (27).En todos los dems experimentos,V.choleraecepas
fueron propagadas por el LB a 37 C.Los experimentos de
microarrays.La produccin de microarrays que contienen manchas de
larga duracin ORFs derivados deV.choleraeN16961 cepa ha sido
descrito (28).Se aisl el ARN de las clulas cultivadas en un medio
AKI mediante el uso de reactivo Trizol (Gibco / BRL), se extrae con
fenol caliente (pH 5.2, 65 C), y se purifica mediante un kit RNeasy
(Qiagen, Chatsworth, CA).CDNA marcado con fluorescencia fue
preparado por la incorporacin directa de fluorescentes anlogos de
nucletidos (Cy3 y Cy5-dCTP dCTP) durante la primera cadena de
reaccin al azar preparado transcripcin inversa.El ADNc
diferencialmente etiquetados se combinaron y se aplic
posteriormente a la superficie de la matriz en las condiciones que
favorecen la hibridacin (28).Diapositivas de microarrays fueron
escaneados mediante el uso de un aparato ScanArray 5000 (GSI
Lumonics, Watertown, MA).Por cada punto ORF especficos, la
intensidad de fluorescencia resultante de cada una de las etiquetas
se midi y compar con el sistema de software GenePix Pro 3.0 (Axon
Instruments, Foster City, CA).La deteccin de TC, TCP y de la
proteasa Hemaglutinina (HA).GM1 inmunoenzimtico ensayos de TC (29)
se llevaron a cabo despus de la incubacin deV.choleraecepas durante
5 horas a 37 C, con aireacin en el medio de la IRA.Celulares
extractos preparados a partir de cultivos utilizados para los
ensayos de TC fueron sometidos a SDS / PAGE, transferidos a
membranas de nitrocelulosa, probaron con anticuerpos anti-TCPA
(30), y se visualizan mediante el sistema de deteccin de
quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia).HA proteasa azocaseina
ensayos se realizaron como se describe (31).Zimogramas se llevaron
a cabo mediante la incorporacin de 0,2% (final) de gelatina en un
7% SDS / PAGE geles.Tampn de la muestra fue introducido en
sobrenadantes de cultivo que posteriormente se aplicaron a los
geles sin hervir.Despus de la electroforesis, los geles se lavaron
durante 30 minutos en el 2,5% y 1% de Triton X-100, seguido de tres
lavados en tampn de la proteasa (0,1 M Tris, pH 8/0.5 mM CaCl2).En
gel de actividad de la proteasa se dej transcurrir durante la noche
en el buffer de la proteasa a 37 C, despus de que los geles se
tieron con azul de Coomassie.Ensayos de biofilm.Cultivos de una
noche deV.choleraefueron inoculadas en una dilucin de 1:100 en
caldo LB y se incubaron en tubos de borosilicato de 18 horas a 22
C.Posteriormente, los tubos se lavaron con agua destilada luego se
llena con colorante cristal violeta.Despus de 5 minutos, los tubos
se enjuagan.El violeta biofilm asociado cristal se resuspendi con
DMSO, y el OD570de la suspensin resultante se midi.La colonizacin
del ratn lactante de ensayo.El ensayo de colonizacin del ratn
lactante ha sido descrito (32).En pocas palabras,V.choleraecepas
mutantes (Lac+) se mezclaron con la cepa de tipo salvaje (Lac-), y
aproximadamente 105clulas fueron inoculadas en 5 - 6 das de edad,
CD-1 en ratones lactantes.Despus de un perodo de 20 h de la
colonizacin, homogeneizados intestinal han sido recogidos, y la
proporcin de bacterias mutantes / de tipo salvaje se determin en
placas de agar LB que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil
-D-galactsido.Seccin anteriorSeccin siguienteResultadosLuxo es
requerida paraV.choleraede colonizar ratones.LaV.harveyi
luxCDABEopern se utiliz como blanco heterloga enV.choleraepara la
prueba de deteccin de qurum regulacin.Este estudio revel que de
tipo salvajeV.choleraeexpresa luminiscencia en un dependiente de la
densidad celular manera, unaluxomutante muestra luminiscencia
constitutiva mxima, y unahapRmutante produce ninguna luz (MBM y
BLB, trabajo no publicado).Estosluxpatrones de expresin se
corresponden exactamente con los de la anlogaV.harveyicepas, lo que
confirma que elV.harveyi-como la deteccin de qurum circuito est en
funcionamiento enV.cholerae, y tambin que elV.choleraeLuxo y
protenas HapR son homlogos funcionales de laV.harveyiLuxo y LuxR
protenas, por lo menos con respecto a la regulacin de la
luciferasa.Sin embargo,V.choleraeno posee un opern de la
luciferasa, por lo que no est claro cul es la deteccin de qurum
endgeno objetivos de control se encuentran en esta bacteria.El nico
papel que anteriormente se caracteriza por HapR en la regulacin de
la expresin de la proteasa de HA (19).En un esfuerzo por determinar
los objetivos de la deteccin de qurum enV.cholerae, hemos probado
si las mutaciones enluxoy / ohapRafectanV.choleraepatognesis.Para
ello se realiz unen vivoensayo de colonizacin mediante el modelo de
ratn lactante.CD-1 lactante de seis das de edad, los ratones fueron
infectados con mezclas 1:1 de la noche-culta de tipo salvaje
yluxomutantes y de tipo salvaje yhapRmutantes.Los ratones fueron
asesinados despus de 20 h, y el intestino delgado se analiz para
determinar la relacin de tipo salvaje a las bacterias mutantes.De
tipo salvaje bacterias podan distinguirse de las cepas mutantes en
virtud de unalacZde eliminacin que no afecta a la virulencia.La
Tabla1presenta los resultados.ElhapRmutante coloniza ratones
lactantes de la misma medida de tipo salvajeV.cholerae(ndice de
competitividad 1).En contraste, elluxomutante es profundamente
defectuoso en la colonizacin, como no hay un sololuxobacteria
mutante se recuper en el intestino delgado de cualquiera de los 12
ratones usados en el experimento.Por lo tanto, el ndice de
competitividad para elluxomutante es
