Integrantes: Renato Naranjo Materia: Biología Molecular I Alejandro Olmedo Jennifer TorresPractica N°: 2 Fecha: 23/05/2012 Curso/Paralelo: Cuarto C

1. TEMA: Extracción de ADN de hojas de Beta vulgaris var. (acelga)

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Extraer ADN de un organismo vegetal Beta vulgaris var. (acelga), siguiendo la técnica respectiva y empleando los reactivos adecuados para comprender la función de cada uno de ellos y obtener ADN en calidad.

2.2 OBJETIVO ESPECÍFICOS

Utilizar el procedimiento respectivo para poder extraer el ADN de un tejido vegetal, siguiendo minuciosamente sus pasos.

Observar la acción del nitrógeno líquido al aplicarlo sobre la muestra vegetal. Comprender el mecanismo de acción en las células y tejidos de cada uno de los reactivos

empleados.

3. MARCO TEÓRICO

INTRODUCCIÓN

El ADN es un poli nucleótido de doble cadena cuya misión es conservar la información genética, especificando la secuencia de aminoácidos de todas y cada una de las proteínas. Constituye el otro tipo importante de poli nucleótidos en la célula que actúa en el proceso de expresión genética y como intermediario entre el ADN y la maquinaria de síntesis de proteínas (Radstrom et al. 2004).

El conocimiento de la distribución de la variabilidad genética es de suma importancia para el desarrollo de estrategias de conservación efectivas. Las técnicas de biología molecular y en particular el uso de marcadores moleculares permiten conocer, caracterizar y estimar la diversidad genética y las relaciones entre grupos de interés (Tuckerb et al. 2003).

Uno de los principales inconvenientes técnicos en el aislamiento y purificación de ADN vegetal es la obtención simultánea de fenoles, polisacáridos, otros productos secundarios, así como la poca cantidad y

ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITOFACULTAD DE CIENCIAS APLICADAS

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍAINFORME DE LABORATORIO

calidad del ADN obtenido .Entre los protocolos de extracción del ADN más utilizados en diferentes especies se destaca el descrito por Dellaporta et al. (1983), en la cual menciona sobre la aplicación de las diferentes técnicas empleadas en Biología Molecular para el análisis del genoma, que depende en gran medida de la habilidad para extraer el ADN (Evenden et al. 2000). Para lo cual se realizan diversos métodos de extracción, dependiendo del tipo de tejido a emplear (Mortis & Hills, 1990).

Uno de los problemas de trabajar con plantas es la composición de la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extracción de todo su contenido, incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por acción mecánica, pulverizando el tejido con hielo seco o con nitrógeno líquido. En seguida se deben destruir las membranas celulares de manera que el ADN, acompañado de otros compuestos como proteínas, enzimas, carbohidratos, etc, queden disponibles (Unicauca, 2005). Es por eso que para extraer el ADN primero es necesario romper las células y luego separar el ADN del resto de los componentes celulares como proteínas y membranas lipídicas (Chile-científico, 2008).

4. MATERIALES Y MÉTODO

4.1 MATERIALES

Hojas de acelga

Morteros

Centrífuga

Tubos Eppendorf

Micropipetas

Puntas

Imagen 1: Hoja de Acelga20 Mayo 2012, Olmedo Alejandro

Imagen 4:Tuboeppendorf con polvo de hoja congelada y DNA

zolReagent16 Mayo 2012, Olmedo Alejandro

Imagen 2: Mortero con muestra de hoja congelada y pulverizada.

16 Mayo 2012, Olmedo Alejandro

Imagen 5: MicropipetaImagen tomada de:

http://ca.wikipedia.org/wiki/Fitxer:Micropipeta_icona.png

Fecha Actualización: 24 Enero 2012

Imagen 3: Centrífuga programableImagen tomada de:

http://www.testmark.com.mx/index.php?main_page=product_info&products_id=16

Fecha Actualización: 20 Enero 2012

Reactivos:

DNA zolReagent Tris EDTA (TE)

Nitrógeno líquido Cloroformo

Imagen 5: Puntas MicropipetaImagen tomada de:

http://www.medssofia.com/pipetas.htmlFecha Actualización: 19 Febrero 2011

Imagen 6: Reactivo DNA ZolReagentImagen tomada de:

http://www.medssofia.com/DNAZOL.html

Imagen 7: Buffer Tris EDTAImagen tomada de:

http://www.medssofia.com/pipetas.htmlFecha Actualización: 19 Febrero 2011

Imagen 8: Nitrógeno líquidoImagen tomada de:

http://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno_l%C3%ADquido

Fecha Actualización: 01 Febrero 2011

Imagen 9: CloroformoImagen tomada de:

http://www.cosasquecontar.com/2010/10/nuestro-amigo-el-cloroformo/

Fecha Actualización: 01 Febrero 2011

Etanol

4.2 MÉTODOS

Homogenización de tejidos: Colocar la muestra de tejido vegetal en un mortero Posteriormente colocar nitrógeno líquido y macerar (tejido congelado) en morteros congelados. Colocar la muestra en un tubo eppendorf Añadir 1ml de DNAzol por 25-50mg de tejido Mezclar a fondo utilizando una pipeta Incubar por 5-10 minutos a temperatura ambiente mezclando por inversión o rotación mecánica. Añadir 300 μl de cloroformo al 50% y lo mezclamos en un vortex.

Centrifugación: Centrifugar por 10 minutos a 10 rpm a 4° C o TA Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo (remueve tejidos insolubles, RNA, exceso de polisacáridos

del homogenizado, aisla DNA del material extracelular o celular).

Precipitación: Precipitar con 0.5 ml etanol 100% por 1 ml de DNA zol usado. Mezclar por inversión y almacenar a temperatura ambiente por 1-3 minutos. Centrifugar a 4rpm por 1-2 minutos a TA o 4° C. Eliminamos el sobrenadante.

Lavado: Lavar el precipitado dos veces con 500μl de etanol 75%. En cada lavado invertimos el tubo de 3-6 veces. Almacenar los tubos verticalmente por 30 segundos o 1 minuto para depositar ADN en el fondo,

eliminamos el etanol.

Suspensión: Secar el DNA a TA por 10-15 minutos.

Imagen 10: Alcohol EtílicoImagen tomada de:

http://sciencechimie.blogspot.com/2010/12/el-diablito.htmlFecha Actualización: 01 Febrero

2011

Colocamos 100 μl Tris EDTA (TE).

5. RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Homogenización de Tejidos 1. Al introducir el nitrógeno liquido en la muestra (hojas de acelga) colocada en los morteros congelados, se procedió a macerar la muestra (foto1). Hasta obtener un polvillo de color amarillo- verdoso. (Peña, 2012)Se utilizo el nitrógeno líquido ya que las hojas pueden volver a hidratarse, perdiendo en gran parte el contenido de ADN. (Michiels et al, 2003).

2. Al colocar el DNA zol en la muestra ya macerada de las hojas en los tubos Eppendorf , esta recupera su humedad y toma el color característico de las hojas de acelga (verde intenso)(foto2). (Peña, 2012)

3. Al incubar la muestra manualmente y en el bortex por pocos minutos, se puede apreciar una respectiva homogenización de la muestra. Antes de la adición del cloroformo (Naranjo, 2012).

4. Antes de proceder a la centrifugación de la muestra. Adicionamos cloroformo ya que es un disolvente muy fuerte, el cual desnaturaliza todas las proteínas y además disuelve todos los lípidos, permitiendo que al momento de la centrifugación pueda haber una buena separación de las fases (Molinari, 2001).

Centrifugación 1. Al realizar la respectiva centrifugación de la muestra a 1000 rpm por 10 minutos, se obtuvo una muestra separada en dos fases (foto3). (Naranjo, 2012).

1 fase => sobrenadante2 fase => pellet

2. Para continuar con la extracción de DNA tomamos con una micropipeta el sobrenadante de la muestra y colocamos en otro tubo (foto4). Posteriormente desechamos el pellet ya que posee muchos excesos y tejidos insolubles. (Peña, 2012).

Precipitación 1. Para obtener la precipitación del sobrenadante se adiciono etanol al 100%, y se procedió a la inversión por 3 minutos. (Peña, 2012).

2. La muestra obtenida se somete a centrifugación a 4000 rpm en 2 minutos.En este momento ya se pueden apreciar pequeñasAglomeraciones de DNA (foto5) a manera de hebras muy finas. (Peña, 2012).

3. Eliminamos el sobrenadante. Quedando en el fondo del tubo estas pequeñas aglomeraciones de un color blanco característico. (Peña, 2012).

Lavado 1. Al realizar el respectivo lavado con etanol al 95% e invirtiendo los tubos que contienen la muestra de DNA. Se logro apreciar el DNA de la muestra con más claridad pero en menores proporciones en las paredes del tubo Eppendorf, luego de realizar la respectiva eliminación del etanol. (Olmedo, 2012).

2. Se utiliza etanol al 95 % ya que nos ayuda a obtener una muestra más limpia. Pero se pierde un poco de DNA de la muestra. (Sarabia, 2005).

Suspensión 1. En esta parte de la práctica se adiciono el Buffer TE al DNA de la muestra. Para que proceda la respectiva suspensión (foto6). Posteriormente se lo agita en el bortex. (Peña, 2012).

2. Se almaceno la muestra por una semana.

Foto1: Mortero con muestra de hoja congelada y pulverizada.

16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

Foto3: Muestra Centrifugada. Obtención del sobrenadante y pellet

16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

6. DISCUSIÓN

En la práctica realizada se pudo evidenciar resultados esperados, ya que en primer lugar al colocar el nitrógeno líquido la muestra se congela inmediatamente al contacto con el mismo y se procedió a la trituración del tejido para romper la pared y membranas celulares sin que ocurra daños en las células; se realizó de una manera rápida para que la muestra no se oxide, y tomó la coloración verde amarillento, si la muestra se hubiera oxidado hubiera tomado una coloración verde oscura.Luego de colocar la muestra en el tubo eppendorf, se colocó el DNA ZolReagent el cual contiene un detergente de origen no fenólico (no tóxico) derivado de la guanidina que hidrolizó el RNA y es selectivo con el DNA. Después se colocó el cloroformo el cual desnaturalizó proteínas y removió lípidos. Así, luego de centrifugar se observaron tres fases, de las cuales la fase superior nos serviría. Luego al agregar el etanol con pureza del 100%, después de hacer varias inversiones se pudo observar unas pequeñas fibras pegadas al tubo eppendorf, ya que el etanol cumple la función de precipitar los ácidos nucleicos. Luego de centrifugar nuevamente, eliminar la fase superior, manteniendo el pellet y lavando con etanol al 95% se pudo apreciar que las fibras pequeñas seguían pegadas al tubo por lo que todo iba correctamente en el proceso y finalmente se dejó agregando una sustancia buffer de Tris EDTA, la cual se encarga de quelar iones de magnesio que son cofactores de enzimas nucleasas, inhibiendo su actividad en conjunto con el mantenimiento del pH alcalino, manteniendo la molécula de DNA intacta hasta el posterior uso de la misma en distintas técnicas moleculares, en nuestro caso, iremos a cuantificar el mismo.

7. CONCLUSIONES

El etanol al 100% nos permite precipitar la muestra, mientras que el etanol al 75% que utilizamos durante esta práctica nos permite jugar con los OH para de esta manera obtener una muestra más limpia aunque se pierda un poco de DNA.

Durante el proceso de lavado de la muestra obtenida, debemos ser cuidadosos para de esta manera no perderla.

Uno de los problemas al trabajar con plantas es la composición de la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extracción de todo su contenido, incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por acción mecánica, pulverizando el tejido con hielo seco o con nitrógeno liquido.

Foto6: DNA de la muestra adicionado

Buffer TE para su respectiva suspensión 16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

Foto5: Precipitación del DNA. 16 Mayo 2021, Olmedo Alejandro

Después de haber realizado la centrifugación el sobrenadante que obtuvimos es mucho más claro.

Para la extracción del ADN en una forma correcta se debe usar todos los reactivos con una cantidad adecuada de la misma para que se produzca los efectos deseados con el detergente que hidroliza el ARN, el cloroformo que desnaturaliza proteínas y el TE que evita que enzimas nucleasas actúen sobre nuestro ADN

8. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la función que cumple el DNA zolReagent?

Reactivo preparado para aislar el ADN en un solo paso. Contiene un detergente, derivado de la guanidina, que hidroliza al ARN y es selectivo para la obtrención de ADN a partir de lisados celulares. Los disolventes orgánicos de este reactivo son no fenólicos, obviando la toxicidad del mismo (Chomeczynski et al, 1997). El DNAzol Reagent es un reactivo muy completo y no tóxico (Traverso, 2005).

Existen tres versiones del reactivo con funciones específicas:

DNAzol para usos con tejidos, células y muestras líquidas DNAzol ES específico para DNA de plantas DNAzol BD específico para DNA genómico o viral de sangre

2. ¿Con qué otros reactivos se puede realizar extracción de DNA? y describa brevemente un protocolo.

Se puede utilizar Tris-HCL pH8 que alcaliniza el medio dándole mayor estabilidad al DNA, además, emulcifica las grasas y permite separar el DNA de las proteínas al degradarlas con fenol. Se aumenta EDTA para quelar los iones de magnesio y NaCl para estabilizar el ADN evitando así su degradación. Se agrega el detergente CTAB para eliminar las grasas y destruir las membranas celulares. Se necesita de un buffer PVP para remover los polifenoles al formar puentes de hidrógenos con ellos y separándolas con centrifugación. (Traverso, 2005).

3. ¿Por qué es importante mantener a temperatura ambiente el DNA zolReagent?

El reactivo DNA zol se mantiene estable entre 15 y 30 °C, límites que representan la temperatura ambiente promedio, por lo que si se mantiene a una temperatura que esté bajo o que exceda estos límites el reactivo se volverá inestable y ya no funcionará eficientemente. Esto se debe a que el DNAzol es estable a temperatura ambiente, pero se activa con un cambio de ella (Traverso, 2005).

9. BIBLIOGRAFÍA

ATIENZAR. F, EVENDEN. A, JHA. A, SAVVA. D, DEPLEDGE. M. 2000. “Optimized RAPD analysis gener ates high qualitygenomic ADN profiles at high annealing temperature” .Biotechniques; Cap 28: 52-54.

DELLAPORTA, S., J. WOOD y J. HICKS. (1983). “ A plant minipreparation: Version II” . Plant Molecular Biology Report Cap 1. 19-20.

HILLS DM, MORTIZ C. 1990, “Molecular Systematics”. Sinauer Associates, INC Publishers. Sunderland, Massachu- setts. USA.; 238 p.

MICHIELS A, ENDEA V, TUCKERB M, LIESBET V, LAEREA A. (2003). “Extraction of high-quality genomic DNA from latex- containing plants”. Analytical Biochemistry. USA; Cap 1, 85-89.

MOLINARI, H. y M. CROCHEMORE. (2001). “Genome DNA EXtraccion from Passiflora ssp. For PCR-RAPD analyses”. Bras. Frutic. Cap 23: 447-450.

CHOMCZYNSKI P., KAROL MACKEY, ROMAN DREWS Y WILLIAM WILFINGER . DNAzol®: A Reagent for the Rapid Isolation of Genomic DNA. Molecular Research Center, Cincinnati. 1997

RADSTROM, P. et al. (2004) “Pre-PCR processing: Strategies to generate PCR-compatible samples” . Mol. Biotechnol. Cap 26, 133– 46.

SARABIA, JUAN. “Comparación de Técnicas de Extracción De ADN en Pinus Teocote Schiede Ex Schlechtendal ” . Universidad de Chapingo. México. 2005

TRAVERSO GUTIÉRREZ, JOSÉ. Caracterización Génica, Proteínica y Funcional de Tiorredoxinas de guisante (Pisum sativum).Universidad de Granada. 2005

Artículo en revista:

ROGERS, S y BENDISH, A.J. (1988), “Extraccion Of Dna From Plant Tissues. Plant Molecular Biology Manual”. A6:1-10. Kluwer Academic Publishers, Belgium.