Inibizione enzimatica

Fondamenti di Chimica Farmaceutica

Cinetica enzimatica

La reazione catalizzata dall’enzima avviene in due passaggi: • la formazione del complesso enzima-substrato: una

reazione per la quale si stabilisce un equilibrio; • la formazione del prodotto: una reazione invece

irreversibile, perché il prodotto viene continuamente rimosso.

𝑬 + 𝑺

𝒌𝟏

𝒌−𝟏

𝐄𝐒 𝒌𝟐 𝑬 + 𝑷

Cinetica enzimatica

ES è un intermedio di reazione con bassa energia di attivazione per l’effetto catalitico dell’enzima. ES raggiunge uno stato di equilibrio dinamico e la sua concentrazione si mantiene costante nel tempo; si raggiunge così uno stato stazionario (steady state).

𝑬 + 𝑺

𝒌𝟏

𝒌−𝟏

𝐄𝐒 𝒌𝟐 𝑬 + 𝑷

Cinetica enzimatica

L’equazione di Michaelis−Menten

𝒗 =𝒗𝒎𝒂𝒙[𝑺]

𝒌𝑴 + [𝑺]

La velocità dipende dalla concentrazione del substrato e,

attraverso 𝒗𝒎𝒂𝒙 dalla quantità di enzima.

𝒗𝒎𝒂𝒙 è la velocità massima della reazione che viene

raggiunta quando tutto l’enzima disponibile è complessato dal substrato.

𝒌𝑴 è una caratteristica dell’enzima ed è uguale alla

concentrazione del substrato quando 𝒗 = 𝟏/𝟐𝒗𝒎𝒂𝒙

𝒌𝑴 misura l’efficienza dell’enzima, quanto più è piccolo,

tanto più l’enzima è potente.

Cinetica enzimatica

L’equazione di Michaelis−Menten

Inibizione enzimatica

I farmaci che hanno come bersagli gli enzimi in genere agiscono come inibitori. Sono molecole che inibiscono, cioè bloccano, l’enzima. Il meccanismo più comune è quello di andare ad occupare il sito catalitico, impedendo così al substrato di entrare, senza alcuna formazione di prodotti.

Inibizione enzimatica

I farmaci che hanno come bersagli gli enzimi in genere agiscono come inibitori. Sono molecole che inibiscono, cioè bloccano, l’enzima. Il meccanismo più comune è quello di andare ad occupare il sito catalitico, impedendo così al substrato di entrare, senza alcuna formazione di prodotti.

Inibizione enzimatica

Un inibitore enzimatico può essere: reversibile, quando l’inibitore si lega all’enzima attraverso forze intermolecolari non covalenti ed in questo modo il legame è reversibile; si stabilisce un equilibrio tra farmaco legato e non legato

E + I EI irreversibile, quando l’inibitore si lega all’enzima attraverso un legame covalente e blocca l’enzima permanentemente

E + I EI

Inibizione enzimatica Gli inibitori irreversibili si legano in genere a gruppi OH (es. serine) o SH (cisteine) di residui aminoacidici dell’enzima attraverso un meccanismo di sostituzione nucleofila. In genere si cerca di evitare l’uso di inibitori irreversibili, spesso fonte di effetti collaterali non facilmente controllabili.

IC50

Concentrazione di inibitore richiesta per ridurre del 50% l’attività dell’enzima

Ki Costante dell’equilibrio: EI E + I

EC50

Concentrazione di inibitore richiesta per ridurre del 50% l’effetto dell’enzima

Inibizione enzimatica

Inibitori competitivi

Gli inibitori reversibili possono avere vari profili farmacologici: competitivi: interagiscono allo stesso sito del substrato e competono con esso, finché l’inibitore rimane ancorato al sito il substrato non può essere trasformato; non competitivi: interagiscono ad un sito allosterico, non competono con il substrato ma attraverso adattamento indotto modificano il sito catalitico ed impediscono al substrato di legarsi; incompetitivi: si legano al complesso substrato enzima una volta che esso si è formato.

Inibitori competitivi

E + S ES E + P E + I EI E + P

In presenza di un inibitore competitivo si stabiliscono due equilibri in competizione:

Il processo globale:

EI + S E + S + I ES +I E + P+ I

Inibitori competitivi L’inibitore competitivo può essere spiazzato aumentando il livello del substrato naturale.

Inibitori competitivi L’equazione di Michaelis Menten in presenza di un inibitore competitivo diventa:

𝒗 =𝒗𝒎𝒂𝒙[𝑺]

𝒌𝑴(𝟏 +𝑰𝒌𝑰) + [𝑺]

kI è il rapporto tra le costanti cinetiche inversa e diretta della reazione di formazione del complesso EI

Inibitori competitivi L’effetto dell’inibitore competitivo è quello di far aumentare Km come se l’enzima fosse diventato meno efficace.

Equazione di Michaelis-Menten

V = Vmax [S]/([S] + KM)

Grafico di Lineweaver-Burk

1/V = 1/ Vmax + KM /(Vmax [S])

Grafico di Lineweaver-Burk

Invertendo i due termini dell’equazione di Michaelis-Menten si ottiene una relazione lineare tra 1/V e 1/[S]. Riportando in grafico 1/V vs 1/[S] si ottiene una retta di pendenza Km/Vmax, che incrocia l’asse delle ordinate al valore 1/Vmax e quello delle ascisse al valore -1/Km.

Grafico di Lineweaver-Burk

Inibitori non competitivi

Gli inibitori non competitivi sono quelli che pur legandosi reversibilmente non competono con il substrato. L’aumento della concentrazione di substrato quindi non spiazza questo tipo di inibitori dall’enzima. Gli inibitori reversibili non competitivi sono in genere degli inibitori allosterici. Tuttavia in alcuni casi anche l’inibizione allosterica può essere competitiva. Possono essere considerati non competitivi anche tutti gli inibitori irreversibili. L’effetto dell’inibitore non competitivo è quello di impedire ad una parte di enzima di interagire con il substrato: è come se ci fosse minor quantità di enzima.

Inibitori non competitivi

L’equazione di Michaelis-Menten in presenza di inibitore non competitivo diventa:

𝒗 =

𝒗𝒎𝒂𝒙

(𝟏 +𝑰𝒌𝑰) [𝑺]

𝒌𝑴 + [𝑺]

La presenza dell’inibitore non competitivo in pratica abbassa il valore di Vmax, lasciando invariato kM.

E’ come se ci fosse meno enzima con la stessa efficacia.

Inibitori non competitivi

Inibitori non competitivi

Inibitori incompetitivi

Grafico di Lineweaver-Burk

Grafico di Lineweaver-Burk

Inibitori irreversibili Esempi di inibitori irreversibili sono i gas nervini, le penicilline (solo nei batteri). L’Orlistat è un inibitore irreversibile della lipasi pancreatica usato nella cura dell’obesità.