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INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL
CULTURA DE TECIDOS EM Phaseolus vulgaris L. VISANDO A REGENERAÇÃO E A ANDROGÊNESE IN
VITRO
FRANCINE LUNARDI FARIAS
Orientador: PqC. Dr. Sérgio Augusto Morais Carbonell Co – orientadora: PqC. Dra. Ilene Ribeiro da Silva Passos
Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Agricultura Tropical e Subtropical Área de Concentração em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia.
Campinas, SP Fevereiro 2009
Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico F224c Farias, Francine Lunardi Cultura de tecidos em Phaseolus vulgaris L. visando a regeneração e a androgênese in vitro / Francine Lunardi Farias. Campinas, 2009. 82 fls. Orientador: Sérgio Augusto Morais Carbonell Co-orientadora: Ilene Ribeiro da Silva Passos Dissertação (Mestrado em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia) - Instituto Agronômico
1. Feijão 2. Organogênese in vitro I. Carbonell, Sérgio Augusto Morais II. Passos, Ilene Ribeiro da Silva III. Título
CDD. 635.65
iii
“Existem apenas duas maneiras de ver a vida. Uma é pensar que não existem milagres
e a outra é que tudo é um milagre”.
Albert Einstein
iv
A Deus
DEDICO
Aos meus queridos pais,
Jose e Noilve
OFEREÇO
v
AGRADECIMENTOS
- Primeiramente agradeço a Deus pela realização deste trabalho, pois creio que sem Seu
consentimento nada nos é permitido realizar;
- Agradeço em especial ao pesquisador Dr. Sérgio Augusto Morais Carbonell pela
confiança, orientação, amizade e pelos ensinamentos transmitidos;
- Em especial também agradeço a pesquisadora Dra. Ilene Ribeiro da Silva Passos pela
maravilhosa co-orientação, confiança, amizade, carinho e dedicação ao trabalho;
- Ao pesquisador Alisson Fernando Chiorato pela amizade, pelos ensinamentos e pelo
auxílio na elaboração desta dissertação;
- A funcionária do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais Rauly M. R. Moretti
pela amizade e ensinamentos transmitidos;
- A estagiária do Centro de Recursos Genéticos Vegetais do IAC Silvia Letícia pela
amizade e auxílio na elaboração desta dissertação;
- Aos membros da banca Dr. Walter J. Siqueira e Dr. Lázaro E. P. Peres pelas
sugestões;
- A CAPES - Coordenadoria de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior, pela
concessão da bolsa de estudos;
- Agradeço a todos os professores do curso de Pós Graduação pelos ensinamentos e
experiências, que com muita boa vontade nos foram compartilhadas;
- Às secretárias da Pós-Graduação Adilza, Célia e Elizabeth pela amizade e apoio ao
decorrer do curso;
- Aos meus queridos pais Jose e Noilve, pelo grande amor incondicional, incentivo,
apoio emocional e financeiro que me proporcionaram durante estes dois anos e,
também, por toda a minha vida, talvez não haja no mundo seres com o coração tão
nobre.
- Aos meus irmãos Fábio e Felipe agradeço pelo apoio emocional e financeiro, carinho e
incentivo. Também agradeço ao meu sobrinho Vinícius pelo doce carinho e alegria
contagiante, que mesmo longe foi de muita importância neste momento;
vi
- Aos meus padrinhos Cesário Mattos e Margarete Farias Mattos, pelo apoio e incentivo
em todas as decisões da minha vida;
- A todos os amigos do curso de Pós Graduação do IAC;
- A todos os amigos e companheiros de trabalho que fizeram parte desta jornada e que
de forma direta e indireta auxiliaram na elaboração desta dissertação.
- Agradeço de forma especial aos queridos amigos e companheiros de todas as horas
Eliana e João Guilherme pela amizade, companheirismo, incentivo, auxílio e pelos
momentos de alegria compartilhados ao longo desses quase 3 anos de convívio. Fica
aqui a minha eterna gratidão por tudo aquilo que já fizeram por mim.
- Ao meu namorado Guilherme Bellinati de Carvalho agradeço pelo apoio, carinho e
incentivo a mim dedicado nessa ultima fase do mestrado.
vii
SUMÁRIO
ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................... x
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................... xi
RESUMO ...................................................................................................................... xiv
ABSTRACT .................................................................................................................. xvi
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................. 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................................... 3
2.1 A cultura do feijão (P. vulgaris L.) ............................................................................ 3
2.2 Desenvolvimento de plantas via micropropagação pela proliferação de gemas pré-
existentes em feijão (P. vulgaris L.)................................................................................. 5
2.3 Regeneração de plantas via organogênese in vitro em feijão (P. vulgaris L.) ........... 8
2.3.1 Efeito das citocininas aplicadas na germinação in vitro sob a organogênese in vitro
em feijão (P. vulgaris L.)................................................................................................ 12
2.3.2 A utilização de agentes antioxidantes no cultivo in vitro para controle dos
compostos fenólicos ....................................................................................................... 14
2.3.3 A importância da organogênese in vitro para a produção de plantas transgênicas
em feijão (P. vulgaris L.)................................................................................................ 17
2.4 Regeneração de plantas haplóides por meio da androgênese in vitro em feijão (P.
vulgaris L.) ..................................................................................................................... 19
2.4.1 Desenvolvimento in vitro do micrósporo .............................................................. 22
2.4.2 Fatores externos que induzem o micrósporo a entrarem na via esporofítica......... 24
2.4.3 Relação entre estádio de desenvolvimento de micrósporos e tamanho do botão
floral ............................................................................................................................... 27
3 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 28
3.1 Regeneração via organogênese direta e proliferação de gemas axilares de feijão
(P.vulgaris L.) ................................................................................................................ 28
3.1.1 Material Vegetal e estabelecimento in vitro das sementes de feijão (P.vulgaris L.)
........................................................................................................................................ 28
3.1.2 Efeito de explantes da região nodal entre os cotilédones e folhas primárias e região
nodal das folhas primárias de feijão (P.vulgaris L.)....................................................... 29
3.1.3 Efeito do ácido ascórbico na organogênese in vitro de feijão (P.vulgaris L.) ...... 30
viii
3.1.4 Efeito do uso do 6-BA e do TDZ em meio de indução na organogênese in vitro de
feijão (P.vulgaris L.) ...................................................................................................... 31
3.1.5 Efeito do uso do 6-BA e do TDZ na proliferação de gemas axilares de feijão
(P.vulgaris L.) ................................................................................................................ 32
3.1.6 Proliferação de gemas axilares a partir de ápices meristemáticos de caules de
feijão (P.vulgaris L.) in vitro.......................................................................................... 32
3.1.7 Aclimatação de plantas.......................................................................................... 33
3.1.8 Análise estatística .................................................................................................. 33
3.2 Regeneração de plantas haplóides por meio da Androgênese em feijão (P.vulgaris
L.) ................................................................................................................................... 33
3.2.1 Cultura de anteras em feijão (P.vulgaris L.) ......................................................... 34
3.2.2. Cultura de micrósporos isolados em feijão (P.vulgaris L.).................................. 34
3.2.2.1 Relação entre tamanho de botão floral e estádio de desenvolvimento do
micrósporo ...................................................................................................................... 34
3.2.2.2 Efeito de choque térmico sob os micrósporos .................................................... 35
3.2.2.3 Experimentos de isolamento e cultivo de micrósporos ...................................... 36
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 41
4.1 Regeneração via organogênese direta e proliferação de gemas axilares de feijão ... 41
4.1.2 Efeito de explantes da região nodal entre os cotilédones e folhas primárias e região
nodal das folhas primárias .............................................................................................. 41
4.1.3 Efeito do ácido ascórbico na organogênese in vitro de feijão ............................... 42
4.1.4 Efeito do uso do 6-BA e do TDZ na indução da organogênese in vitro de feijão
(P.vulgaris L.) ................................................................................................................ 45
4.1.5 Efeito do uso do 6-BA e do TDZ na proliferação de gemas axilares de feijão
(P.vulgaris L.) ................................................................................................................ 46
4.2 Proliferação de gemas axilares a partir de ápices meristemáticos de caules de feijão
(P.vulgaris L.) in vitro .................................................................................................... 49
4.3 Androgênese ............................................................................................................. 52
4.3.1 Cultura de anteras de feijão (P. vulgaris L.). ........................................................ 52
4.3.2 Cultura de micrósporos isolados de feijão (P. vulgaris L.) ................................... 53
4.3.2.1 Estudo da relação entre tamanho de botão floral e estádio de desenvolvimento de
micrósporos. ................................................................................................................... 53
4.3.2.2 Efeito de choque térmico sob os micrósporos .................................................... 54
4.3.2.3 Experimentos de isolamento e cultivo de micrósporos ...................................... 56
ix
4.2.2.4 Considerações gerais sobre os experimentos de cultivos de micrósporos isolados
........................................................................................................................................ 65
4.4 Considerações Finais ................................................................................................ 66
4.4.1. Organogênese in vitro em feijão........................................................................... 66
4.4.2 Androgênese em feijão .......................................................................................... 67
5 CONCLUSÕES........................................................................................................... 68
5.1 Organogênese in vitro em feijão............................................................................... 68
5.2 Androgênese em feijão ............................................................................................. 68
6 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 69
x
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 – Experimentos de cultura de micrósporos isolados do cultivar de feijão (P.
vulgaris L) IAC-Alvorada e suas especificações. ......................................... 36
Tabela 2 – Interação entre a região do explante do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC
– Alvorada e a concentração de ácido ascórbico na porcentagem média de
oxidação desses explantes. ............................................................................ 45
Tabela 3 – Interação entre o meio de germinação e o meio de indução na freqüência
média relativa de desenvolvimento de plantas do cultivar de feijão (P.
vulgaris L.) IAC – Alvorada, para explantes da região nodal das folhas
primárias sem corte das gemas axilares......................................................... 47
Tabela 4 - Relação entre tamanho dos botões florais e fases da meiose em Phaseolus
vulgaris L. IAC – Alvorada........................................................................... 54
Tabela 5 – Experimentos de cultura de micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris
L.), IAC- Alvorada incluindo as suas especificações e indicação os que
apresentaram mudança estrutural semelhante a divisão celular. ................... 57
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – Representação da plântula de feijão (P. vulgaris L.) e partes utilizadas
como explantes neste estudo. ................................................................ 29
Figura 2 - Freqüência média relativa de regeneração do cultivar de feijão (P.
vulgaris L.) IAC – Alvorada em função de diferentes regiões do
explante.................................................................................................. 42
Figura 3 – Porcentagem média de oxidação entre as diferentes concentrações de
ácido ascórbico sobre os explantes do cultivar de feijão (P. vulgaris L.)
IAC – Alvorada. .................................................................................... 43
Figura 4 – Porcentagem média de oxidação entre as diferentes regiões do explante
do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada........................... 44
Figura 5 - Freqüência média relativa de regeneração do cultivar de feijão (P.
vulgaris L.) IAC – Alvorada, sob diferentes concentrações hormonais: 0,
10 µM de 6-BA,15 µM de 6-BA e 10 µM de TDZ, para explantes da
região nodal das folhas primárias sem as gemas axilares...................... 46
Figura 6 - Freqüência média relativa de desenvolvimento de plantas do cultivar de
feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada para os diferentes tratamentos de
germinação e meios de indução para explantes da região nodal das
folhas primárias sem corte das gemas axilares...................................... 47
Figura 7 – (a, b e c) Explantes de tTCL’s da região nodal das folhas primárias do
cultivar de feijão (P. vulgaris L. ) IAC – Alvorada em meio contendo
10 µM de TDZ apresentando grande número de nódulos verdes; (d)
calos nesse meio com maior crescimento e (e e f) brotações provenientes
de gemas axilares multiplicadas. ........................................................... 48
Figura 8 – Explantes de tTCL’s provenientes da região nodal das folhas primárias
do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada em meio contendo
10 µM de 6-BA apresentando calos com nódulos e regenerações. ....... 49
Figura 9 – Número médio de formação de brotos provenientes de ápices de
plântulas do cultivar de feijão IAC-Alvorada cultivados em dois
diferentes meios..................................................................................... 50
Figura 10 - (a- 4 frascos da esquerda e b) Ápices do cultivar de feijão (P. vulgaris
L.) IAC – Alvorada, cultivados em meio MS + B5 + 3 µM de GA3,1 µM
xii
de 6-BA, 10 µM de AgNO3; ( a- 4 frascos da direita e c) ápices do
mesmo cultivar cultivados em meio MS + B5 + 3 µM de GA3. ............ 50
Figura 11 – Freqüência média de formação de raízes em brotos provenientes ápices
de plântulas do cultivar de feijão IAC-Alvorada cultivados em dois
diferentes meios..................................................................................... 51
Figura 12 - (a) Calo formado da cultura de antera do cultivar de feijão (P. vulgaris
L.) IAC- Alvorada. (b) Células do filete e/ou conetivo da antera
dividindo e dando origem a calo, do mesmo cultivar............................ 52
Figura 13 - Fotomicrografias de micrósporos de Phaseolus vulgaris L. IAC -
Alvorada: (a) partir de botão floral com 3,5mm de comprimento e
preparado em CPW-13; e (b) botão floral com 5 mm de comprimento e
preparado com carmim acético 1,2%. Aumento das fotos: X900. ....... 53
Figura 14 – Freqüência de diferentes tipos de micrósporos da testemunha, cultivar
de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada. ............................................. 55
Figura 15 – Freqüência de diferentes tipos de micrósporos do cultivar de feijão (P.
vulgaris L.) IAC- Alvorada com seis dias de choque de frio (8 ± 1ºC). 56
Figura 16 – (a) Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada:
os quais não sofreram reestruturação organizacional do citoplasma após
choque de frio, (b) e com reestruturação organizacional do citoplasma
após o choque de frio (8 ± 1ºC). ............................................................ 56
Figura 17 – Micrósporo do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada
inviável. ................................................................................................. 57
Figura 18 – (a) Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada,
na forma de grão de pólen, (b) e em estádio mononucleado. ................ 58
Figura 19 – (a) Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada,
em possíveis divisões na placa 1, após seis dias de cultivo, (b e c) placa
2 após sete dias de cultivo. .................................................................... 59
Figura 20 – Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada,
isolados em meio K8P, solidificado com agarose 0,6%, onde a seta
indica uma possível formação de lamela média oriunda de divisão
interna do micrósporo............................................................................ 60
Figura 21 - Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada,
inviáveis, em meio K8 1x...................................................................... 61
xiii
Figura 22 – Micrósporo do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada, “tipo
estrela” em meio K8P 1x. ...................................................................... 62
Figura 23 – Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada,
cultivado em meio K8 1x e gotas de agarose, após seis dias de cultivo
apresentando mudanças estruturais que podem indicar múltiplos
vacúolos na célula ou entrada de água na célula. .................................. 63
Figura 24 - Micrósporo do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada,
cultivado em meio K8 1x e gotas de agarose (placa 4), após dois dias de
cultivo com mudança estrutural semelhante a um micrósporo
multicelular............................................................................................ 64
xiv
FARIAS, Francine Lunardi. Cultura de tecidos em Phaseolus vulgaris L. visando a regeneração e a androgênese in vitro. 2009. 82f. Dissertação (Mestrado em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia) – Pós Graduação – IAC.
RESUMO Protocolos otimizados de regeneração de plantas a partir de células de plantas de feijão
(Phaseolus vulgaris L.) permitem a utilização da engenharia genética para
transformação dessas plantas e a obtenção de híbridos somáticos pela fusão de
protoplastos. A disponibilidade de um protocolo estabelecido para a androgênese em
feijão permite a obtenção de haplóides e duplo haplóides, o que certamente encurtará o
tempo para obtenção de um cultivar de feijão. O presente trabalho teve por objetivos
melhorar e adaptar um protocolo de regeneração in vitro e estabelecer um protocolo
para androgênese em feijão. Dessa forma, para estudos de regeneração in vitro,
utilizando o cultivar IAC-Alvorada, em camadas finas de células, foram testadas as
regiões nodais das folhas primárias e entre os cotilédones e folhas primárias. O efeito de
diferentes concentrações de 6-BA, TDZ e ácido ascórbico também foram avaliados.
Para a proliferação das gemas axilares a partir de ápices meristemáticos de caule, foi
avaliado o efeito de dois diferentes meios, contendo GA3 ou GA3, 6-Ba e AgNO3.
Observou-se uma freqüência média de 51% de regeneração via organogênese in vitro a
partir da região nodal das folhas primárias do cultivar IAC- Alvorada. O ácido ascórbico
foi mais eficiente no controle da oxidação nas concentrações de 0,14 µM e 0,3 µM para
explantes da região nodal das folhas primárias. O meio de germinação contendo 5 µM
de 6-BA foi mais eficiente na proliferação de gemas axilares em meio de indução
acrescido com 10 µM de TDZ. O meio de proliferação de gemas axilares, a partir de
ápices meristemáticos de caule, contendo 1 µM de 6-BA, 3 µM de GA3 e 10 µM
AgNO3, propiciou maior número de brotos (8,3) em relação ao meio contendo somente
3 µM de GA3 (3,4). Para estudos de androgênese, utilizando o cultivar IAC- Alvorada,
primeiramente foi testada cultura de anteras intactas e realizados estudos da relação
entre tamanho de botão floral e estádio de desenvolvimento do micrósporo e choque
térmicos de frio (8±2ºC). Posteriormente, foi realizada a cultura de micrósporos isolados
em meios complexos K8 e K8P. Foi observado que a cultura de anteras não foi
eficiente, no presente estudo, para estudos de androgênese em feijão, uma vez que foi
verificada interferência de tecidos somáticos. Botões florais de tamanho entre 2,5 e 4,5
xv
mm apresentaram micrósporos mononucleados. O período de seis dias de choque
térmico de frio a (8±2ºC) propiciou aumento de 6,2% de micrósporos induzidos em
relação a testemunha. A cultura de micrósporos isolados na forma líquida e gotas de
agarose (0,6%) em meio K8-P e em meio K8 na forma de gotas de agarose (0,6%)
proporcionaram modificações estruturais nos micrósporos que se assemelharam a
divisões celulares. Essas técnicas biotecnológicas podem ser ferramentas de grande
auxílio em programas de melhoramento de feijão, uma vez que o feijão apresentou
respostas positivas ao cultivo in vitro. Verifica-se, portanto, a necessidade da
continuidade destes estudos, visando assim estabelecer métodos confiáveis que possam
ser reproduzidos.
Palavras-Chave: feijão, organogênese in vitro, cultura de micrósporos, duplo-haplóides.
xvi
FARIAS, Francine Lunardi. Tissue culture in Phaseolus vulgaris L. aiming the regeneration and androgenesis in vitro. 2009. 82p. Dissertation (Master Program in Genetics, Plant Breeding and Biotechnology) – Postgraduate – IAC.
ABSTRACT
Efficient protocols for regeneration via organogenesis from bean (Phaseolus vulgaris
L.) plants cells allow us the use of genetic engineering for the transformation of those
plants and to get somatic hybrids through protoplast fusion. The availability of the
efficient androgenesis protocols for bean plants allow us to obtain haploids and double
haploids plants and it is important because decreases the time to get a new cultivar. The
objective of this work was to adapt and to improve the in vitro regeneration protocol
and to establish a protocol for androgenesis in bean. For studies of the in vitro
regeneration, using the IAC-Alvorada cultivar, in transverse thin cell layers (tTCL’s),
was tested the nodal regions of the primary leaves and between the primary leaves and
cotyledon. The effect of the different concentrations of the 6-BA, TDZ and ascorbic
acid was studied too. For the proliferation of the axillary buds from meristematic apices
of the stem was evaluated the effect of the two different medium containing GA3 or
GA3, 6-BA and AgNO3. In this work it was verified that tTCL’s from the nodal region
of the primary leaves of the IAC-Alvorada cultivar was efficient, with the average
frequency of the 51% of the regeneration for organogenesis in vitro. The ascorbic acid
was more efficient in control of the oxidation in the 0,14 µM and 0,3 µM concentrations
for explants from the nodal region of the primary leaves. The germination medium
containing 5 µM of the 6-BA was more efficient in the proliferation of the axillary buds
in the medium of induction increased with 10 µM of the TDZ. For the proliferation of
the axillary buds from meristematic apices of the stem, the medium supplemented with
1 µM of the 6-BA, 3 µM of the GA3 and 10 µM of the AgNO3 resulted in the great
number of shoots (8,3) compared with the medium that had only 3 µM de GA3 (3,4).
For androgenesis studies, using the IAC-Alvorada cultivar, firstly it was tested the
anther culture, the size of the flower button and relation with the development of the
microspore and the thermal shock (8±1ºC) in the microspores. Subsequently was made
the culture of isolated microspores in complex medium K8 and K8P. It was observed
that the anthers culture was not efficient for the androgenesis, because it was verified
the somatic tissue interference. The flower buttons of size between 2,5 to 4,5 mm
xvii
presented mononuclear microspores. We observed that the microspores that received
thermal shock (8±1°C) for six days presented greater number of induced microspores
than the witness. The microspore culture in the liquid form and drops of agarose (0,6%)
in medium K8-P and in medium K8 in the drops of agarose (0,6%) provide structural
modifications in the microspores that are similar with the cellular division.
Biotechnological techniques are important tools for bean crop breeding of bean because
it showed positive responses to the in vitro cultivation. It is necessary to continue these
studies aiming consistent methods that can be reproduced.
Key Words: common bean, organogenesis in vitro, microspore culture, double-haploid
1
1 INTRODUÇÃO
O Brasil destaca-se na produção mundial de feijão (Phaseolus vulgaris L.) e,
também, por encontrar nesta leguminosa uma alta fonte de proteína vegetal, é
considerado o maior consumidor. A produção brasileira de feijão referente à safra de
2007/08 foi 3,6 milhões de toneladas em uma área de aproximadamente 3,9 milhões de
hectares, distribuídos em todos os Estados brasileiros. No entanto, a média nacional de
produtividade foi considerada baixa, em torno de 885 kg/ha, embora algumas regiões
tenham atingido aproximadamente 1.800 kg/ha.
Durante muitos anos se tem atribuído o aumento de produtividade de feijão
principalmente aos esforços despendidos pelos programas de melhoramento genético da
cultura, pela alta taxa de aplicação de insumos agrícolas (fertilizantes, herbicidas e
pesticidas), mecanização e a melhoria das práticas agrícolas.
O melhoramento genético do feijão vem buscando responder ou atender
demandas específicas dos produtores. Um cultivar de feijão deve atender às
características de produtividade, de resistência às principais doenças da cultura, tal
como antracnose e mancha angular, qualidade tecnológicas (como redução no tempo de
cozimento), qualidades nutricionais (aumento de proteínas e fibras) e tipo de caldo. A
escolha de critérios racionais e eficientes para a identificação de linhagens superiores a
serem utilizadas em cruzamentos facilita o trabalho do melhorista. Além disso, a
escolha de genitores com maior potencial genético para recombinação aumenta a chance
de obtenção de cultivares mais produtivos e estáveis, bem como facilita a seleção dos
genótipos com características agronômicas desejáveis.
Apesar dos programas de melhoramento genético de feijão contribuírem de
forma clara para progresso de produtividade da cultura, seus trabalhos sofrem
influências negativas pela baixa herança de caracteres de importância, como os de
componentes de produtividade e produtividade total, além de outros fatores de
resistência a fatores bióticos e abióticos. Além de que, por se tratar de uma espécie
autógama são necessários em torno de 8 ciclos de autofecundação para que o genótipo
se encontre estável e com seus genes em homozigose.
2
Alternativas na busca de novos patamares de produtividade podem ser obtidas
pela realização de cruzamentos interespecíficos, os quais são de grande importância
para a introdução de, principalmente caracteres de resistência a doenças, seca e solos
com baixa fertilidade, provenientes de materiais selvagens. No entanto, problemas como
abortamento de embrião é comum nestes cruzamentos.
Neste contexto métodos e sistemas biotecnológicos podem ser ferramentas muito
úteis aos programas de melhoramento genético a fim de superar essas limitações e
impulsionar o progresso da cultura. Algumas das principais vantagens que podem ser
obtidas são: aumento a resistência ou tolerância às doenças e pragas, bem como a
estresses ambientais, melhoria da qualidade de sementes e arquitetura de plantas,
alteração no modo de reprodução ou desenvolvimento de esterilidade citoplasmática
(VELTCHEVA et al., 2005).
As técnicas de cultura de tecidos, as quais têm sido ferramentas muito valiosas
para o melhoramento genético de muitas espécies, podem incrementar e acelerar a
obtenção de cultivares melhorados de feijão. A utilização de técnicas biotecnológicas
como ferramenta para o melhoramento genético do feijão pressupõe a disponibilidade
de protocolos eficientes. Protocolos otimizados de regeneração de plantas a partir de
células e tecidos do feijão permitem a utilização da engenharia genética para
transformação dessas plantas e a obtenção de híbridos somáticos pela fusão de
protoplastos, além da multiplicação in vitro. Protocolos otimizados para a androgênese
em feijão vão permitir a obtenção de haplóides e duplo haplóides, o que certamente
encurtará o tempo para obtenção de um cultivar de feijão.
Em 2008 o IAC registrou o cultivar de tipo de grão carioca IAC-Alvorada que
apresenta alto potencial produtivo (4.351 kg/ha) e estabilidade de produção. Apresenta
resistência moderada as principais doenças do feijoeiro e excelente qualidade
tecnológica, com grãos cheios (27,5 g/100 sementes) e resistência ao escurecimento.
Este cultivar mostrou-se competente ao cultivo in vitro em estudos preliminares. Devido
a esta competência e as características agronômicas e tecnológicas de interesse, foi o
escolhido para o presente estudo.
Desta maneira, o presente trabalho teve por objetivos: a) estudar e otimizar um
protocolo de regeneração de plantas de feijão, baseado no proposto por CRUZ DE
CARVALHO et al. (2000), estudando parâmetros e adaptando-o às condições de
trabalho do programa de melhoramento de feijão do IAC; b) Estabelecer um protocolo
3
para a obtenção de haplóides ou duplo – haplóides de feijão via cultura de micrósporos,
partindo de estudos básicos até o cultivo de micrósporos isolados.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A cultura do feijão (P. vulgaris L.)
O feijão comum (P. vulgaris L.) é uma planta que pertence à família fabaceae,
subfamília faboideae e gênero Phaseolus, originária do continente americano.
Admitem-se dois locais de domesticação para esta cultura, sendo um Andino e um
Mesoamericano. Seu ciclo varia de 61 a 110 dias, o que o torna segundo AIDAR
(2007), uma cultura apropriada para compor desde sistemas agrícolas intensivos
irrigados, altamente tecnificados, até aqueles com baixo uso tecnológico, principalmente
de subsistência.
Segundo dados do CONAB, em relação à safra brasileira, o feijão das águas (1a
safra), com semeadura em agosto/setembro ocupou uma área de 1.300.000 ha, com
produção de 1.240.000 toneladas e produtividade média de 953 kg.ha-1. O feijão da seca
(2a safra), com semeadura em janeiro/fevereiro ocupou uma área aproximada de
1.860.000 ha, com produção de 1.440.000 toneladas e apresentou produtividade média
de 774 kg.ha-1. O feijão de inverno (3a safra), com semeadura em abril/maio, apresentou
uma área utilizada para semeadura de 820.500 ha, com uma produção de 827.000
toneladas e produtividade média de 1.010 kg.ha-1.
No estado de São Paulo, o cultivo e a colheita do feijão se concentram nas três
safras, ou seja, épocas das águas, da seca e de inverno de acordo com o zoneamento
ecológico (PINZAN et al., 1994). Segundo a CONAB - Companhia Nacional de
Abastecimento, a produção para o Estado de São Paulo referente à safra de 2007/2008 o
feijão das águas (1a safra), apresentou uma produção de 100.300 toneladas e
produtividade média de 1.441 kg.ha-1 em uma área total de 69.600 ha; o feijão da seca
(2a safra), ocupou uma área de 50.000 ha, com uma produção de 80.800 toneladas e
produtividade média de 1.616 kg.ha-1, e o feijão de inverno (3a safra), com área utilizada
para semeadura de 59.300 ha, produção de 96.000 toneladas, apresentando
produtividade média de 1.618 kg.ha-1.
O produto final da cultura é o grão de feijão, um dos alimentos básicos de vários
povos, principalmente do brasileiro, constituindo a sua principal fonte de proteína
4
vegetal. O teor protéico encontrado nas sementes varia de 15 a 33%, é um alimento
energético e fonte de vitaminas e minerais (ARAUJO et al., 1996)
Dentre as diferentes espécies do gênero Phaseolus, o feijão comum é a espécie
mais cultivada e segundo dados da FAO existem 107 países produtores. O Brasil
destaca-se na sua produção e é considerado o maior produtor seguido do México
(YOKOYAMA, 2007).
Devido à sua importância na alimentação humana, tem merecido grande
destaque no cenário nacional e internacional por suprir as necessidades dos
consumidores como fonte básica e barata de proteínas e calorias. É um produto de alta
expressão econômica e social, visto que, juntamente com o arroz, é a base da
alimentação nacional, fornecendo ricas quantidades de proteína vegetal e carboidratos.
É ainda complementar em termos de aminoácidos essenciais, sendo considerado por
especialistas, de excelente valor nutritivo. Além da importância do feijão na
alimentação da população brasileira e mundial, a cadeia de produção, beneficiamento e
comercialização, geram ocupação e renda, principalmente a classe menos privilegiada
(FACHINI et al., 2006).
De acordo com WANDER (2006), o feijão sempre fez parte da dieta dos
brasileiros, no entanto, nos últimos anos observa-se uma redução constante no consumo
per capita de feijão. Entre o período de 1975 a 2002 essa redução foi de 12%, onde o
consumo que estava em torno de 18,5 kg/hab/ano caiu para 16,3 kg/hab/ano. Em nível
mundial essa redução foi de 18% e o consumo passou de 2,8 kg/hab/ano em 1975 para
2,3 kg/hab/ano. Atualmente o consumo desta leguminosa não ultrapassa os 16
kg/hab/ano, preocupando a sua cadeia produtiva.
O feijão comum é cultivado ao longo do ano, na maioria dos estados brasileiros,
proporcionando constante oferta do produto no mercado. A Região Sul ocupa lugar de
destaque no cenário nacional, seguido pelas Regiões Sudeste, Nordeste, Centro-Oeste e
Norte, respectivamente.
No Brasil, a preferência do consumidor é regionalizada e diferenciada
principalmente quanto à cor, o tamanho e o brilho do grão. O feijão de tegumento preto
é mais popular no Rio Grande do Sul, Santa Catarina, sul e leste do Paraná, Rio de
Janeiro, sudeste de Minas Gerais e sul do Espírito Santo. No restante do país, este tipo
de grão tem pouco valor comercial ou aceitação. Os feijões de grão tipo carioca são
aceitos em praticamente todo o Brasil, sendo que 53% da área cultivada é semeada com
5
este tipo de grão. O feijão mulatinho é mais aceito na Região Nordeste e os de tipo roxo
e rosinha são mais populares nos estados de Minas Gerais e Goiás (AIDAR, 2007).
Na produção internacional de feijões, são plantados anualmente, em média, 27
milhões de hectares, colhendo-se aproximadamente 20 milhões de toneladas, em mais
de 100 países. Deste total, 60% da produção mundial se concentram em seis países:
Brasil, Índia, China, Mianmar (antiga Birmânia), México e Estados Unidos (PICHEL,
2006). Diferentemente do que ocorre no Brasil, na Índia e no México, que consomem
praticamente tudo o que produzem, ainda importam quantidades consideráveis do
produto. Países como os Estados Unidos, Canadá, Argentina, Chile, Mianmar e
Austrália são os principais exportadores.
O melhoramento genético do feijão no Brasil é realizado por instituições
públicas e privadas de âmbito nacional e estadual. O objetivo destas pesquisas é
produzir novas cultivares de feijão que sejam produtivas e estáveis quanto à produção,
porte ereto de planta visando facilitar a colheita mecânica, alta qualidade tecnológica de
grão com boa aceitação comercial e resistência múltipla às principais doenças do feijão,
principalmente para antracnose, mancha angular, murcha de fusarium. Para alcançar
estes objetivos, estas instituições organizam equipes multidisciplinares de pesquisadores
das áreas de melhoramento, fitopatologistas, entomologistas, fitotecnistas e
recentemente, biotecnologistas, bioestatísticos e químicos/nutricionistas. Instituições
que não possuam estes pesquisadores têm procurado aperfeiçoar parcerias
interinstitucionais para atingir estes objetivos.
Apesar da sua importância nutricional, a sua produção vem decaindo no Brasil e
regiões Andinas, e esse decréscimo é resultado de doenças, ataque de insetos,
deficiências nutricionais e falta de tolerância a seca. Em conseqüência disso, há grande
interesse na introdução de características agronômicas úteis no feijão por meio de
melhoramento tradicional e engenharia genética (ARAGÃO et al., 1996).
Para tanto para se obter sucesso na transformação genética de plantas há a
necessidade de um protocolo eficiente de regeneração de plantas completas.
2.2 Desenvolvimento de plantas via micropropagação pela proliferação de gemas
pré-existentes em feijão (P. vulgaris L.)
Um dos mais interessantes e importantes aspectos da cultura in vitro de células e
tecidos é a capacidade de regenerar e propagar plantas a partir de células e tecidos
cultivados. O mais simples tipo de propagação in vitro de plantas é o estímulo ao
6
desenvolvimento de gemas axilares. Essa técnica utiliza a rota ontogênica normal para o
desenvolvimento de ramos pelos meristemas axilares. As gemas axilares sofrem
tratamento com hormônios para haver a quebra da dormência e produzem brotos a partir
desses ramos (PHILLIPS & HUBSTENBERGER, 1995).
A proliferação in vitro de plantas inteiras, a partir da cultura de gemas e
meristemas, é basicamente uma extensão da propagação vegetativa feita em muitas
espécies. Esta metodologia vem sendo aplicada em grande número de plantas herbáceas
e lenhosas, sendo geralmente o mais rápido, eficiente e confiável método de
micropropagação (HUSSEY, 1986).
O feijão foi considerado durante muito tempo como recalcitrante à regeneração
in vitro. HAMMATT et al. (1986) sugeriu que a recalcitrância de grande número das
leguminosas pode ser resultado dos seus históricos de autofecundação e seleção para
alta performance dos genótipos, levando a uma redução da variabilidade genética nos
cultivares modernos.
As populações e suas estruturas genéticas são entidades dinâmicas. O processo
do fluxo gênico, o isolamento genético, a deriva genética, a seleção e a mutação estão
continuamente agindo e modificando a biodiversidade das populações, quer estejam elas
sob o manejo do homem quer estejam isoladas na natureza. No longo prazo, é
praticamente impossível manter, de forma estática, a variabilidade genética presente nas
populações (Borém, 2007). O homem tem alterado os rumos evolutivos de muitas
espécies, especialmente daquelas que foram domesticadas (Baker, 1972; Ledig, 1992).
Alguns autores, como Brown (1992), argumentaram que seria difícil encontrar
uma espécie que não tivesse sido alvo, de alguma forma direta ou indireta, de seleção.
Durante a domesticação das espécies, algumas divergiram profundamente dos seus
ancestrais como resultado da seleção dirigida pelo homem (Borém, 2007) Em geral,
essa seleção torna as espécies mais úteis ao homem, porém com menor habilidade de
sobrevivência em competição ou em ambientes silvestres (Raamsdonk, 1995).
Somente a partir da década de noventa é que trabalhos sobre regeneração in vitro
de feijão, com resultados mais consistentes começaram a surgir. Resultados
preliminares de regeneração via cultura de meristemas em P. vulgaris L. foram
realizados por KUENEMAN (1976), HERSELMAN & MIENIE (1995) e GRUM et al.,
(1998), os quais desenvolveram procedimentos para produção de sementes livres de
patógenos por cultura de meristemas, principalmente para a eliminação da
patogenicidade por bactérias.
7
CROCOMO et al. (1979) apontaram a variação na taxa de auxina/citocinina
como controladora do desenvolvimento in vitro de eixos embrionários de feijão.
BENEDICIC et al. (1997) encontraram que a indução de gemas é dependente das
concentrações de 6-benzyl-amino-purina (6-BA) e ácido giberélico (GA3)
KARTHA et al. (1981) relataram a obtenção de plantas desenvolvidas a partir de
meristema apical de P. vulgaris L. tendo como objetivo a criopreservação de
germoplasma, e esse sucesso foi atribuído à adição de 6-BA ao meio de cultura.
MARTINS & SONDAHL (1984a) desenvolveram plantas a partir de meristemas
axilares.
ALLAVENA (1984) e MARTINS & SONDAHL (1984b) observaram os
primeiros estádios de embriogênese somática em calos e culturas de células em
suspensão de feijão, porém esses embriões não se desenvolveram em plantas.
Em 1985, RUBLUO & KARTHA observaram a característica de genótipo
dependência em diferentes meios de regeneração. RUIZ et al. (1986) estudou a
capacidade de regeneração de seis genótipos de feijão cultivados em meios contendo
diferentes fitorreguladores (2,4- D, NAA, cinetina e 6-BA) e a regeneração da parte
aérea foi observada em meio suplementado com 6-BA.
Modificação no estádio fisiológico inicial das plantas é um dos fatores que pode
afetar a capacidade regenerativa in vitro (MALIK & SAXENA, 1991; MOHAMED et
al., 1992a,b, 1996; ZHANG-ZHANG et al., 1997; SANTALLA et al., 1998; CRUZ de
CARVALHO et al., 2000). Estudos também estabeleceram como crucial a taxa de 6-
BA, Thidiazuron (TDZ) e CPPU em pré-cultivos para a determinação da regeneração in
vitro, porém os mecanismos fisiológicos e moleculares ligados ao uso de citocininas no
pré-cultivo de plântulas ainda são desconhecidos.
MALIK & SAXENA (1992) apresentaram um novo protocolo onde
acrescentaram ao estudo o uso da citocinina sintética TDZ, visando assim aumentar o
número de brotações por explantes que se limitavam de quatro a oito. Um aspecto
notável deste protocolo de desenvolvimento de plantas é a diferenciação direta de
brotações a partir de plântulas intactas eliminando-se a necessidade de preparar o
explante. Com uma concentração de 10µM de TDZ, 30 e 46 brotações foram produzidas
da gema axilar e do ápice do caule, respectivamente, após quatro semanas de cultura,
enquanto que para a melhor concentração de 6-BA (80 µM) foi obtido no máximo 30
brotos.
8
MOHAMED et al. (1992a) propuseram um novo protocolo para multiplicação
de gemas e desenvolvimento de plantas de P. vulgaris e P. acutifolius a partir de eixos
embrionários de 1 a 2 mm cultivados em meio B5 (GAMBORG et al., 1968)
suplementado com 6-BA. Nesse trabalho os autores observaram que explantes do
genótipo Xan - 159 e linhagens de P. acutifolius expressaram uma alta competência
para a multiplicação de brotos e formação de novas gemas em comparação com as
outras linhagens de P. vulgaris avaliadas, onde foi possível obter de seis a oito
brotações por explante. Devido a isso, tais autores propuseram que essa competência
relatada do genótipo Xan - 159 ocorre pela sua relação genética com o P. acutifolius,
pois é um material derivado de um cruzamento interespecífico entre P. vulgaris e P.
acutifolius.
Para desenvolvimento das brotações obtidas MOHAMED et al. (1992b)
utilizaram um meio secundário acrescido de 2 µM 6-BA e 4 µM GA3 e obtiveram um
crescimento uniforme de parte aérea, porém não houve formação de raízes. Com essa
combinação de 6-BA e GA3 foi observado um rápido alongamento em duas semanas,
porém os brotos apresentaram área foliar reduzida e quando permaneceram mais que
uma semana nesse meio, as plantas começaram a ficar muito alongadas, finas e com
folhas amareladas.
A partir de então alguns autores como MOHAMED et al. (1992a,b) propuseram
que o feijão era recalcitrante a regeneração in vitro e que somente os genótipos
resultantes do cruzamento interespecíficos entre P. vulgaris e P. acutifolius, família
Xan, eram responsivos à regeneração in vitro, tratando-se assim de uma herança do P.
acutifolius.
2.3 Regeneração de plantas via organogênese in vitro em feijão (P. vulgaris L.)
A regeneração de plantas na cultura de tecidos pode ser obtida pela cultura de
seções de tecidos sem um meristema pré-formado (origem adventícia) ou de calos ou
cultura de células (origem de novo) (PHILLIPS & HUBSTENBERGER, 1995).
Segundo esses mesmos autores a regeneração adventícia ocorre em tecidos
menos usuais na cultura de tecidos como internódios, haste das folhas, cotilédones ou
zona alongada da raiz, onde os meristemas não ocorrem naturalmente. A regeneração
adventícia de plantas é freqüentemente dependente da presença de tecidos organizados
no explante. Em comparação a regeneração de novo ocorre a partir de células de calos e
9
de cultura de células na ausência de tecidos organizados. Independente de ser adventícia
ou de novo a regeneração ocorre por um desses dois processos.
A organogênese é o processo pelo qual um ser vivo dará origem aos seus órgãos,
no caso das plantas o caule, raízes, folhas, flores e frutos. A organogênese in vitro nada
mais é do que tentar reproduzir esse processo artificialmente através da manipulação
dos reguladores de crescimento em meio de cultura. Em plantas esse processo só foi
possível de ser realizado após um conhecimento mais aprofundando desses reguladores.
SKOOG & MILLER em 1957 demonstraram que a formação de dois órgãos in vitro,
caules e raízes eram controlada pelas concentrações relativas entre auxina e citocinina
(PERES, 2002).
A organogênese in vitro pode ser dividida em dois processos diferentes, a
organogênese direta onde o explante já possui células meristemáticas, e a organogênese
indireta quando há a necessidade de desdiferenciação do explante, com a conseqüente
formação de calo prévia ao estabelecimento das células competentes (PERES, 2002).
A habilidade de fazer com que células de plantas formem órgãos e até plantas
inteiras é uma importante ferramenta no melhoramento de qualquer espécie, permitindo
o acesso a técnicas como a mutagênese in vitro, seleção in vitro, utilização de variantes
somaclonais, rápida micropropagação e em especial a transformação genética
(GAMBORG & PHILLIPS, 1995).
O estabelecimento de um sistema eficiente de regeneração de plantas de P.
vulgaris L. pode contribuir grandemente com o avanço da cultura do feijão, visto que
técnicas biotecnológicas altamente dependentes disso, como a transformação genética e
a fusão de protoplastos poderiam ser incluídas como ferramentas de auxílio aos
programas de melhoramento genético.
Um explante específico é necessário para se obter sucesso na regeneração de
muitas espécies ou variedades de plantas (GENGA & ALLAVENA, 1991). A idade e o
estado fisiológico da planta doadora podem contribuir para o sucesso da organogênese
in vitro.
Trabalhos prévios têm descrito que a expressão de genes ligados à regeneração
em plantas é modulada pelas citocininas. Mudanças nos padrões de proteínas foram
observadas em explantes quando cultivados na presença desses hormônios
(FERNADEZ-CASO et al., 1996).
O primeiro trabalho de regeneração via organogênese direta de feijão P. vulgaris
L. foi realizado por CROCOMO et al. (1976) onde somente foram regeneradas duas
10
plantas oriundas de explantes de folha em um meio contendo extrato de semente de
feijão cuja composição é desconhecida.
MALIK & SAXENA (1991) obtiveram regeneração via organogênese direta, de
plantas, do cultivar de feijão “Kinghorn”, utilizando como explantes o pecíolo com uma
porção do limbo foliar, cultivados em meio MS (MURASHIGUE & SKOOG, 1962)
suplementado com 6-BA (6-Benzilaminopurina) e gelrite como agente geleificante.
MOHAMED et al. (1992b) estudaram o pré -condicionamento no escuro e a
ação de hormônios como o CPPU e o TDZ na organogênese direta de explantes nodais
de plântulas de feijão e de feijão-vagem (Vicia faba). Neste trabalho, os hormônios
vegetais foram testados no meio de germinação das sementes como já verificado por
MALIK & SAXENA (1992). Os explantes utilizados constaram do nó cotiledonar e nó
primário, os quais foram então raspados nas regiões axilares para romper qualquer
meristema pré-existente e estimular a organogênese adventícia. Esses autores
verificaram que concentrações de 2,5 e 5 µM de CPPU e TDZ foram inadequadas para a
regeneração de plantas e, portanto fizeram testes com concentrações mais baixas, ou
seja: 0,25; 0,5; 0,75 e 1 µM. As plântulas que se desenvolveram no escuro possuíam nós
claramente distinguíveis e brotações axilares longas que foram facilmente removidas. A
maior porcentagem de explantes regenerativos e de brotações por explantes foram
observados para os explantes de nós cotiledonares provenientes de sementes germinadas
no escuro. Para nenhum desses parâmetros houve diferença significativa entre as
concentrações de TDZ ou CPPU.
KLU (1997) desenvolveu plantas de feijão via organogênese direta de tecidos
dos nós cotiledonares. Estudos histológicos de gemas desenvolvidas de células dos nós
cotiledonares revelaram a natureza adventícia dessas estruturas.
ARAGÃO & RECH (1997) verificaram que a utilização de altas concentrações
de 6-BA na indução a multiplicação de brotos produziu brotos finos e abscisão dos
mesmos. Esse fato pode estar relacionado com a produção de etileno, desde que a
síntese de etileno é estimulada pelas citocininas (IMASEKI et al., 1975).
Segundo SANTALLA et al. (1998) nós cotiledonares são um sistema eficiente
para propagação de P. vulgaris e P. coccineus, o qual pode ser explorado para formação
de múltiplos híbridos em ambas espécies.
Mais recentemente, CRUZ DE CARVALHO et al. (2000) desenvolveram um
protocolo de desenvolvimento de plantas de feijão via técnica de camadas transversais
finas de células (tTCL-Transverse thin cell layer). Esses autores afirmaram obter uma
11
média de 68 brotos bem desenvolvidos por plântula, atestando assim uma alta
freqüência de multiplicação de gemas. O cultivar utilizado no trabalho foi o feijão
‘Carioca’, porém sem especificação de genótipo, onde os explantes (epicótilos fatiados)
foram repicados a cada duas semanas para meios frescos de diferentes formulações.
Desde a germinação da semente até a aclimatação em casa de vegetação levam-se ao
todo 11 semanas. Os meios são compostos de hormônios vegetais como TDZ, 6-BA,
GA3 e NAA (ácido naftaleno-acético). Nesse caso três fatores foram primordiais para
alterar a eficiência do método: a germinação das sementes com TDZ, utilização de
explantes na forma de tTCL’s e aplicação de 6-BA e AgNO3 para o desenvolvimento
dos brotos. Embora tenham observado uma freqüência alta de multiplicação de gemas
em um determinado explante, não relataram a porcentagem de explantes responsivos, o
que é fundamental para um protocolo eficiente de transformação genética.
VELTCHEVA & SVETLEVA (2005) cultivando o pecíolo, como explante, por
duas semanas em meio de indução, MS suplementado com 2 µm de TDZ, 0,6 µm de
NAA e 2 µm de Paclobutrazol, obteve a maior média de número de brotos total, 27,3
com uma média de 3,11 brotos por explante. Calos organogênicos, obtidos desse meio
de indução, foram classificados como marrons-verdes com estruturas granulares.
Análises histológicas mostraram que tais calos foram constituídos de agrupamentos de
células em desenvolvimento de brotos e não de células desorganizadas.
O primeiro protocolo de organogênese de novo de células desdiferenciadas de
calos foi publicado por MOHAMED et al. (1993). Esses autores descreveram a
organogênese em calos induzidos a partir de explantes de pedicelo para duas linhagens
de feijão Xan - 159 e GN ’Tara’. Foi o primeiro trabalho apresentando organogênese a
partir de calos. Nesse trabalho os autores testaram a utilização dos meios: B-5 e MS
contendo TDZ e/ 6-BA e/ ou AIA. Esses autores também utilizaram o ácido ascórbico
(0,42 µM e 0,84µM) como antioxidante no meio de cultura, o que propiciou um
aumento na proliferação dos calos de quatro para seis repicagens.
ARELLANO & FUENTES (2008) relatam um protocolo de regeneração via
organogênese indireta para 10 cultivares de feijão, dentre eles um genótipo carioca. Os
explantes utilizados foram meristema apical e nós cotiledonares retirados de eixos
embrionários de sementes germinadas em condições especificas por dois dias. Para a
indução de calos o meio que propiciou a melhor produção foi acrescido com 1,5 µM de
2,4-D, durante duas semanas. Posteriormente esses calos foram transferidos para meios
de brotações, onde permaneceram por quatro semanas. O meio contendo 22,2 µM de 6-
12
BA que propiciou maior número de regenerações, 0,5 por calo. Análises histológicas
dos regenerados confirmaram se tratar de organogênese indireta.
Para que ocorra a regeneração é necessário que as células se encontrem em um
estádio fisiológico específico. Em feijão a organogênese tem se limitado a regiões que
circundam tecidos embrionários de pedicelos de gemas de florais (MOHAMED et al.,
1996), cotilédones (MOHAMED et al., 1992a,b; YANCHEVA et al., 1999), eixos
embrionários (MOHAMED et al., 1992a,b) e embriões imaturos (GEERTS et al., 2000).
Apesar de CRUZ de CARVALHO et al., (2000) ter relatado um método
altamente eficiente para regeneração direta em feijão o que pode ter influenciado esse
trabalho foi justamente a utilização do explante de uma região próxima aos meristemas
apicais, tal como muitos trabalhos acima já foram relatados.
O que fica claro nos trabalhos até agora publicados é que o método mais
utilizado na regeneração de plantas de feijão é via organogênese direta, utilizando-se
principalmente de tecidos próximos a regiões nodais e meristemáticas. Mesmo tendo
esses protocolos de regeneração via organogênese direta publicados em revistas
especializadas, a reprodutibilidade destas técnicas é muito baixa o que dificulta os
trabalhos nessa linha de pesquisa.
Um protocolo de regeneração via organogênese indireta a partir de calos
somente foi conseguido por MOHAMED (1993) e agora recentemente por
ARELLANO & FUENTES (2008), e isso dificulta principalmente a aplicação de
técnicas de transformação genética via Agrobacterium ou mesmo bombardeamento de
calos. A melhor forma para obter transgênicos estáveis de leguminosas é através da
regeneração in vitro indireta, definida como a indução de regeneração de embriões
somáticos ou brotações de calos morfogenéticos (ARELLANO & FUENTES, 2008).
A dúvida que fica na regeneração de plantas de P. vulgaris é se a espécie não é
competente à regeneração, visto que não se consegue publicar um sistema eficiente e de
alta repetibilidade, ou se os processos envolvem muitos fatores tais como fisiológicos,
exógenos e condições de cultura os quais interferem grandemente na competência da
espécie à regeneração.
2.3.1 Efeito das citocininas aplicadas na germinação in vitro sob a organogênese in
vitro em feijão (P. vulgaris L.)
Em geral as citocininas são substâncias derivadas da purina adenina as quais
causam divisão celular nas plantas, em geral por uma interação com auxinas. São
13
produzidas nas raízes e transportadas até as folhas e redistribuídas para outros órgãos
pelo xilema (METIVER, 1979). Algumas citocininas sintéticas têm sido utilizadas em
pesquisas de cultura de tecidos. Dentre esses hormônios sintéticos estão o
Forchlorfenuron (CPPU) e Thidiazuron (TDZ), na qual apresentam um efeito mais forte
que as citocininas convencionais para um grande número de espécies como amora
(OHYAMA & OKA, 1982), maçã (NIEUWKERK et al., 1986), azaléia (FELLMAN et
al., 1987) e soja (MOHAMED – YASSEEN & SPLITTSTOESSER, 1990).
Trabalhos realizados por Van Staden e também por David Letham fornecem
evidências de que o thidiazuron pode atuar inibindo a enzima citocinina oxidase, a
principal enzima envolvida na degradação de citocininas endógenas como a zeatina,
isopentenil adenina e seus derivados (PERES, 2002)
Estudos também estabeleceram que os papéis do 6-BA, TDZ e CPPU na
germinação das sementes, em pré-cultivo para a retirada dos explantes, são cruciais para
se obter sucesso na regeneração e embriogênese em feijão (MALIK & SAXENA, 1991;
MOHAMED et al.,1992a, b, 1996; ZHANG-ZHANG et al., 1997; SANTALLA et al.,
1998; CRUZ DE CARVALHO et al., 2000).
MALIK & SAXENA (1991) pela primeira vez observaram que o pré-tratamento
da plântula doadora com 6-BA (5µM) incrementava a reposta organogênica dos
explantes, não somente no número de explantes responsivos que aumentou de 8% para
60%, como no número de brotações por explante que aumentou de dois para quatro.
Segundo VELTCHEVA & SVETLEVA (2005) o uso de 1µM 6-BA na
germinação de feijão aumentou de cinco a sete vezes o número de regenerados por
explante. O uso 6-BA pode não ter sido o fator determinante no processo de
regeneração, mas se presume que ele aumenta a capacidade regenerativa por estimular a
competência na divisão celular. Além disso, tais autores constataram que explantes de
materiais com sete dias de germinação foram mais competentes para a regeneração in
vitro que aqueles com 14 dias de germinação. Presumivelmente, pré-cultivo de plântulas
em 6-BA (TDZ ou CPPU) ativa e/ou induz a proliferação de células competentes pré-
existentes no tecido (VELTCHEVA et al., 2005).
Apesar de saber que o pré-cultivo de plântulas com citocininas aumenta a
freqüência de regeneração dos explantes, os mecanismos fisiológicos, bioquímicos e
moleculares que aumentam esse sistema são desconhecidos. VELTCHEVA et al. (2005)
sugeriram que provavelmente as citocininas ativam ou induzem a proliferação de
células competentes pré-existentes no tecido.
14
2.3.2 A utilização de agentes antioxidantes no cultivo in vitro para controle dos
compostos fenólicos
PREECE & COMPTON (1991) caracterizaram as substâncias encontradas em
meio de cultura para algumas espécies lenhosas e as identificaram como sendo fenóis,
flavonóides e taninos, e responsáveis pela oxidação.
A oxidação é a reação do O2 com íons metálicos (+) dos outros compostos do
meio de cultivo. Os explantes a serem inoculados no meio de cultura podem liberar
exudados que tornam o meio de cultivo escuro. Esse tipo de escurecimento é
conseqüência da liberação de fenóis dos ferimentos ocasionados no processo de
extração dos explantes (SANTOS et al., 2001).
Compostos fenólicos ocorrem como metabólitos secundários em todas as
espécies de plantas a são geralmente caracterizados por um anel benzeno e um grupo
hidroxila (ANTOLOVICH et al., 2000, KEFELI et al., 2003).
Os compostos fenólicos e seus glicosídeos são comuns nas plantas, possuindo
um papel metabólico variável. Existem vários trabalhos relatando o efeito dos
compostos fenólicos sobre o crescimento das plantas em condições in vitro (LAMEIRA
et al., 1997). Segundo ARNALDOS et al. (2001) os compostos fenólicos de plantas são
moduladores do catabolismo do ácido indol acético AIA. Alguns monofenóis como o
ácido sináptico e o ácido ferúlico, em baixas concentrações, inibe a oxidação enzimática
do AIA e isso resulta em alongamento e divisão celular e subseqüente crescimento e
desenvolvimento das células.
A oxidação fenólica é um dos sérios problemas que podem dificultar o
estabelecimento inicial do cultivo in vitro. A liberação de compostos ocorre devido ao
dano causado nas células durante a excisão dos explantes. Algumas enzimas oxidam os
fenóis formando quinonas (LERCH, 1981). As quinonas são responsáveis pela
coloração marrom nas culturas, além de causarem a inibição do crescimento e morte dos
explantes em grande número de espécies (MONACO et al., 1977).
Outra importante característica dos compostos fenólicos é a sua capacidade de
formar complexos quelatos com metais. Eles também são facilmente oxidados e assim
formam polímeros (agregados escuros). O escurecimento de um corte ou uma planta
morta é causado por essa reação (OZYGIT et al., 2007).
GRATTAPLIA & MACHADO (1998) recomendam para controlar a oxidação
as seguintes medidas: lavagem do material antes da desinfestação em água corrente,
auxiliando na lixiviação de compostos fenólicos; utilização de antioxidantes: ácido
15
ascórbico, polivinilpirrolidona (PVP), carvão ativado e incubação inicial dos explantes
no escuro.
Segundo DAVIES (1972) a atividade de enzimas no que diz respeito à
biossíntese e oxidação de fenóis é aumentada pela luz. Dessa forma, o escurecimento
dos tecidos poderá ser reduzido e até mesmo impedido, caso os explantes sejam
cultivados no escuro por até 14 dias (MONACO et al., 1977). A diminuição da
luminosidade na câmara de fluxo laminar, durante a excisão dos explantes e a
manutenção da cultura no escuro no início o cultivo também é benéfica para reduzir a
oxidação (MARKS & SIMPSON, 1990).
Segundo MARKS & SIMPSON (1990) a oxidação fenólica tem sido controlada
em diferentes espécies lenhosas pela redução da intensidade luminosa, e segundo
CALDAS et al. (1998) pela diminuição na concentração de sais no meio de cultura e
notadamente pela adição de antioxidantes ao meio.
A oxidação do explante é considerada um dos aspectos mais sérios relacionados
com a cultura de tecidos de palmeiras. O escurecimento tem sido atribuído à liberação e
a oxidação de compostos fenólicos que inibem o crescimento do explante (MELO et al.,
2001).
ASHBURNER et al. (1993) controlaram a oxidação por fenóis da cultura in vitro
de embriões de coco (Cocos nucifera L), efetuando a suplementação com carvão
ativado a 0,2% no meio. O carvão ativado age promovendo a adsorção dos exudatos
liberados pelo explante, os quais provocam a oxidação; além de possuir as propriedades
de adsorver e reduzir a disponibilidade de auxina exógena no meio de cultura e induzir
o processo de rizogênese (GEORGE, 1996).
Em palmáceas o problema de oxidação é freqüentemente causado pela liberação
e oxidação de compostos fenólicos, e para minimizar esse problema é comum utilizar
ácido ascórbico, carvão ativado e PVP (TISSERAT, 1987).
O PVP reage com os compostos oxidantes e os ácidos cítrico e ascórbico reagem
com os metais presentes no meio de cultura, evitando que os mesmos fiquem
disponíveis para se oxidarem (GEORGE, 1996). A poliamina PVP possui a capacidade
de adsorver os compostos fenólicos evitando que estes oxidem e polimerizem
(GUERRA & NODARI, 2006).
Em leguminosas, os taninos são os polifenóis de maior importância. Eles
possuem a propriedade de formar complexos coloridos com sais de ferro, compostos
insolúveis com sais de chumbo e de sofrer substituição eletrofílica aromática de
16
acoplamento com sais de diazônio e aldeídos. Os taninos presentes nas leguminosas
consistem de uma série de fenóis poliméricos que estão envolvidos no baixo
aproveitamento de nutrientes do feijão (BRESSANI, 1993). Estes compostos possuem
propriedades antimicrobianas, indicando uma possível função como mecanismo de
defesa da planta (SCALBERT, 1991).
Feijões comuns e outras leguminosas contêm quantidades variáveis de
compostos fenólicos, encontrados principalmente na casca das sementes, entretanto,
com quantidades baixas ou insignificantes nos cotilédones. O nível desses taninos está
associado com a cor da semente. Em feijões brancos o teor médio de compostos
fenólicos é de 2,3 mg/g, enquanto nas sementes marrons é de 7,8 mg/g, nas pretas é de
6,6 mg/g e nas vermelhas cerca de 12,6 mg/g (BRESSANI, 1993).
Em protocolos de cultura de tecidos de palmeiras o carvão ativado é que
promoveu os melhores resultados; por isso, passou a ser incluído como procedimento
padrão em diferentes concentrações de até 2% (TISSERAT, 1987).
MELO et al. (2001) estudaram o efeito de diferentes antioxidantes na oxidação,
germinação e desenvolvimento das plântulas no cultivo in vitro de embriões zigóticos
da guarirobeira. O ácido ascórbico, na concentração de 0,6 µM, foi o antioxidante mais
eficiente no controle da oxidação e também o que proporcionou a maior porcentagem de
embriões zigóticos. O ácido ascórbico é considerado antioxidante biológico, estando
presente em altas concentrações em muitos compartimentos celulares, como o estroma
dos cloroplastos (LARSON, 1988).
FLORES et al. (1998) estudaram o efeito da imersão dos explantes de espinheira
santa (Maytenus ilicifolia Mart.) em solução líquida de ácido ascórbico em cinco
concentrações por 30 minutos. As concentrações foram: 0,05%; 0,1%; 0,2%; 0,3% e
0,5%. Esses autores verificaram que efeito altamente significativo das concentrações de
ácido ascórbico quanto à porcentagem de oxidação e regeneração dos explantes. Os
melhores resultados foram obtidos na solução a 0,05% de ácido ascórbico, havendo
crescente porcentagem de explantes regenerativos (86,9%) e baixo índice de oxidação
(1,5%). Na concentração de 0,2% nenhum explante oxidou, entretanto houve resultados
inferiores da regeneração dos explantes quando comparados a 0,05%.
Segundo MONACO et al. (1977) a imersão dos tecidos em meio líquido,
diminui o dano nas células e reduzem a exposição do tecido ao oxigênio, reduzindo a
oxidação.
17
BROOME & ZIMMERMAN (1978) verificaram que agentes redutores como o
ácido ascórbico, ácido cítrico e a cisteína foram prejudiciais no desenvolvimento de
explantes de amora preta. BIASI et al., (1994) trabalhando com micropropagação em
abacateiro, verificaram que concentrações mais reduzidas (0,06µM e 0,12µM ) de ácido
ascórbico e de ácido cítrico reduzem a oxidação nos explantes.
Estudo da aplicação de agentes antioxidantes no cultivo in vitro de feijão foram
realizados por MOHAMED et al. (1993) e ARELLANO & FUENTES (2008).
MOHAMED et al. (1993) adicionaram em meio de manutenção de calos
0,42µM e 0,84 µM de ácido ascórbico. Esses autores constataram que a adição de ácido
ascórbico ao meio aumentou o tempo de manutenção dos calos para até seis semanas de
cultivo.
ARELLANO & FUENTES (2008) acrescentaram ao meio de indução de calos
1,4 µM de PVP-360 k e observaram que se o PVP não fosse adicionado aos meios os
explantes rapidamente ficariam escuros e perderiam a capacidade de regenerar. Esses
autores concluíram que o uso do PVP foi um dos fatores de sucesso na obtenção de
calos morfogenéticos.
2.3.3 A importância da organogênese in vitro para a produção de plantas
transgênicas em feijão (P. vulgaris L.)
O uso da cultura de células e engenharia genética é visto como uma forma de
aumentar a produtividade nas leguminosas (HILDEBRANDT et al. 1986). Porém
muitos autores provaram que tais espécies são recalcitrante para a regeneração in vitro e
constantemente protocolos para a regeneração e transformação das mesmas são
estudados (HINCHEE et al. 1988). Além da importância na transformação genética de
plantas a regeneração in vitro também é importante para a recuperação de valiosos
germoplasma com baixo potencial de germinação.
A taxa de transformação e regeneração de P. vulgaris é extremamente baixa e as
plantas são assim consideradas recalcitrantes. Muitos estudos relataram a transformação
genética de feijão a partir de diferentes explantes (GENGA et al., 1990; McCLEAN et
al., 1991; FRANKLIN et al., 1993; LEWIS & BLISS, 1994). Porém ainda assim a falta
de um sistema reproduzível é a maior dificuldade encontrada na transformação genética
da espécie.
A produção de plantas transgênicas de Phaseolus exige encontrar células que são
competentes tanto para transformação como para regeneração. No entanto a habilidade
18
para a cultura de plantas in vitro freqüentemente depende na escolha de genótipos
satisfatórios, estado fisiológico da planta doadora, o explante, o meio de cultura e a
interação entre eles (HENRY et al., 1994).
PUONTI-KAERLAS (1993), NAGL et al., (1997) e ZHANG-ZHANG et al.
(1997) descrevem como principais fatores limitantes à transformação de feijão:
genótipo, idade, tipo, fonte primária do explante, condições de pré-cultivo, a
Agrobacterium, as condições de co-cultivo, o sistema de seleção, as condições de
regeneração in vitro e os métodos qualitativos e quantitativos para análises do material
transgênico.
Segundo NAGL et al. (1997) há evidências que somente certos explantes são
hábeis para a transformação ou regeneração, e a regeneração de novo pode não ser um
pré-requisito para a produção de plantas transgênicas.
O meio de indução de brotos é importante no processo de regeneração porque é
nesse meio que um grande número de gemas adicionais e brotos são formados via
organogênese, no qual foi também observado por FRANKLIN et al. (1991) em
explantes de P. vulgaris com três dias de cultivo.
A necessidade de um protocolo que resulte em diferenciação eficiente,
desenvolvimento de brotos e regeneração de plantas completas é essencial para a
transformação genética de plantas. A transferência de genes homólogos, heterólogos e
homeólogos estão se tornando uma comum ferramenta em programas de melhoramento
genético. Esse processo, junto com o melhoramento tradicional de plantas, pode acelerar
o desenvolvimento de novos cultivares com características específicas como resistência
a seca, adaptação a solos ácidos, melhor arquitetura de planta, vida longa de prateleira e
qualidades nutricionais.
Os primeiros trabalhos para produzir plantas transgênicas de feijão falharam
devido ao conhecimento deficiente de seqüências de DNA e sistema de regeneração.
McCLEAN et al. (1991) conseguiram introduzir genes em feijão utilizando o sistema de
Agrobacterium, mas eles foram incapazes de regenerar plantas transgênicas.
SMITH et al. (1992), baseando-se no número de eixos embrionários
bombardeados, obtiveram uma freqüência em torno de 0,9% de transformação.
RUSSEL et al. (1993) obtiveram plantas transformadas de feijão através do uso do
dispositivo acelerador de partículas eletricamente carregadas, porém a freqüência de
plantas transformadas obtidas por esses autores foi 0,3%, muito inferior ao citado
acima. ARAGÃO et al. (1996), bombardeando eixos embrionários e posteriormente
19
induzindo a multiplicação de brotos, obtiveram uma freqüência de transformação de
0,9%.
Fatores biológicos, como a morfologia do ápice dos brotos e a capacidade de se
obter uma multiplicação de brotos homogênea e reprodutível, são críticos para se obter
plantas transgênicas de feijão (ARAGÃO & RECH, 1997). As células localizadas na
zona central da região meristemática foram indicadas como o centro das atividades
morfológicas e histológicas no ápice dos brotos (MEDFORD, 1992; HARA, 1995).
Muitos estudos mostram que as diferenciações de novos brotos em embriões de feijão
cultivados em citocininas aparecem em camadas periféricas do anel meristemático
(McCLEAN & GRAFTON, 1989; FRANKLIN et al., 1991; MALIK & SAXENA,
1992). Baseado nesses conceitos, cultivos com a não exposição da região do meristema
apical não são capazes de originar plantas transgênicas. A remoção, necessária nesse
caso, dos primórdios foliares não é um procedimento prático (ARAGÃO & RECH,
1997)
ARAGÃO et al. (1998) obteve plantas transgênicas de feijão resistente ao vírus
o mosaico dourado, através do bombardeamento dos embriões imaturos. Apesar de
muitos estudos tentarem realizar a transformação genética por meio da Agrobacterium,
obstáculos que variam desde a susceptibilidade á bactéria a um eficiente sistema de
regeneração dos materiais transformados, levaram à preferência por trabalhar com
transformação via bombardeamento de embriões em feijão.
2.4 Regeneração de plantas haplóides por meio da androgênese in vitro em feijão
(P. vulgaris L.)
A androgênese é o fenômeno no qual um grão de pólen é capaz de alterar a sua
rota de desenvolvimento e originar um esporófito haplóide. Este processo ontogênico
alternativo ainda é pouco conhecido, apesar de sua potencialidade tanto para estudos
básicos como àqueles aplicados para o melhoramento de plantas (KALTCHUK-
SANTOS & BODANESE-ZANETTINI, 2002).
Uma planta haplóide tem somente metade de seu patrimônio genético sendo,
portanto estéril. A duplicação de seu número cromossômico de maneira espontânea, ou
induzida pela aplicação de colchicina, recupera a condição diplóide e restaura a
fertilidade. Esta planta, chamada duplo haplóide será totalmente homozigota, uma vez
que cada cromossomo terá a sua cópia exata (MORAES-FERNANDES, 1990).
20
Desde a primeira descrição de embriogênese de pólen de Datura innoxia por
GUHA & MARHESHWARI (1964; 1966) a cultura de anteras ou micrósporos isolados
têm sido importantes ferramentas para a produção de duplos – haplóides homozigotos
em muitas espécies agronomicamente importantes (JAIN et al., 1996).
Até agora a cultura de anteras tem sido utilizada principalmente em programas
de melhoramento genético, porém recentes avanços em culturas embriogênicas de
micrósporos isolados em Brassica (PECHAN & KELLER, 1988; TAKAHATA e
KELLER, 1991), Nicotiana (BENITO - MORENO et al.,1988; KYO & HARADA,
1986), Hordeum (HOEKSTRA et al., 1993) e Triticum (TOURAEV et al. 1996b) tem
feito da cultura de micrósporo uma forma real de se produzir duplos – haplóides.
A formação do grão de pólen compreende a microsporogênese e a
microgametogênese. O processo da microsporogênese inicia-se com a meiose e finaliza-
se com a formação de um micrósporo haplóide polarizado (TOURAEV et al., 1997).
Quando o micrósporo atinge esse estádio de desenvolvimento, ele pode seguir dois
caminhos de desenvolvimento, um seria a sua rota normal, ou seja, a gametofítica ou
alternativamente poderia seguir uma rota androgenética, ou esporofítica, e isso
dependerá das condições ambientais.
A embriogênese de micrósporo também é um bom sistema para mapeamento
genético (GRANER 1996), transformação genética (JÄHNE et al., 1994; STÖGER et
al., 1995) assim como para seleção de características recessivas e dominantes
(POLSONI et al., 1988; SWANSON, 1989). A possibilidade de uso da haploidia para
estudos básicos e aplicados de genética e biologia floral vem a bastante tempo
despertando o interesse na obtenção de plantas haplóides (KALTCHUK-SANTOS &
BODANESE-ZANETTINI, 2002).
Apesar da técnica da cultura de anteras ser mais simples a cultura de
micrósporos apresenta muitas vantagens sobre ela. Primeiramente a formação de calos e
embriões que freqüentemente formam nos tecidos somáticos das anteras são anulados.
Além de que permite um direto acesso aos micrósporos o qual acelera a otimização das
condições de cultura. Estudos comparativos em Brassica napus e Hordeum vulgare
confirmaram que a cultura de micrósporos pode ser de cinco a dez vezes mais eficiente
que a cultura de anteras para a produção de embriões (SIEBEL & PAULS, 1989;
HOEKSTRA et al., 1992). Atualmente, a cultura de anteras, através do processo de
androgênese, tem sido a técnica mais empregada para a produção de haplóides
(KALTCHUK-SANTOS & BODANESE-ZANETTINI, 2002).
21
A homozigose alcançada mediante a haploidização torna a cultura de anteras
uma interessante ferramenta para o melhoramento vegetal. No sistema convencional de
melhoramento de autógamas, onde o método de cruzamentos é usado, são necessários
de sete a oito ciclos de autofecundação para estabilizar o genótipo pela fixação de genes
em homozigose. Além de ser um processo demorado e trabalhoso, a eficiência da
seleção nas primeiras gerações de autofecundação é muito baixa, devida principalmente
à ocorrência de alelos dominantes em heterozigose. Ao eliminar o mascaramento
causado pela heterozigose, a produção de duplo-haplóide traz outra vantagem, que é a
de ampliar a eficiência de seleção, tanto para caracteres qualitativos como quantitativos,
facilitando, portanto, a identificação e genótipos superiores (MORAES-FERNANDES,
1990; KALTCHUK-SANTOS & BODANESE-ZANETTINI, 2002).
Segundo opinião de MORAES-FERNANDES (1990, 1999), para os programas
de melhoramento vegetal de países como o Brasil, a haploidização apresenta
perspectivas de ganhos genéticos e econômicos superiores aos dos países
desenvolvidos. Isso porque, em relação à boa parte das culturas economicamente
importantes, os tetos de rendimento nacionais ainda são baixos. Portanto os ganhos
domésticos com o uso da haploidização poderão ser proporcionalmente maiores.
A técnica de cultura de anteras vem sendo usada rotineiramente em programas
de melhoramento de várias famílias importantes como os cereais, as crucíferas e as
solanáceas (MORAES- FERNANDES et al., 1999). Um exemplo dessa tecnologia é a
cultivar BRS- 43 de trigo que foi produzida pela Embrapa (CAETANO & MORAES-
FERNANDES, 1992).
HODDON & NORTHCOTE (1976a,b) foram os primeiros a relatar a formação
de calos via cultura de anteras de P. vulgaris, usando grãos de pólen mono e
binucleados. No entanto esses autores não obtiveram regeneração desses calos
cultivados em diferentes tipos de fitorreguladores.
PETERS et al. (1997) criaram um sistema para a indução de calos haplóides de
feijão, cultivando as anteras em meio suplementado com 2,4-D levando à
desdiferenciação das células das anteras. Temperaturas superiores a 30º C inibiram o
crescimento dos calos, Análises citológicas desses calos revelaram a ocorrência de calos
haplóides, diplóides e baixa freqüência (3%) de poliplóides.
de OLIVEIRA et al. (1994) estudaram a influência de auxinas e citocininas na
resposta in vitro de anteras maduras de um cultivar de feijão francês. Tais autores
relataram uma alta freqüência de formação de calos quando auxinas (2,4 – D ou NAA)
22
foram usadas em baixas concentrações, tais autores também relataram que altas
concentrações de citocininas promoveram a rizogênese.
Não existe ainda, disponível na literatura, nenhum protocolo para a produção de
plantas haplóides em feijão. Nem mesmo a partir de cultura de anteras. MUÑOZ &
BAUDOIN (2002) em estudos sobre a cultura de anteras de P. vulgaris e Phaseolus
coccineus L. obteve apenas calos haplóides a partir dos quais não conseguiu regenerar
plantas.
A cultura de anteras é tecnicamente simples e é ainda, utilizada em muitos
laboratórios comerciais para a produção de duplos-haplóides, mas recentemente, o uso
da cultura de micrósporos isolados surgiu como uma alternativa. A cultura de
micrósporos oferece a vantagem de que os tecidos da parede da antera esporofítica não
interferem no processo, e o desenvolvimento do embrião pode assim se dar diretamente
(TOURAEV et al., 1997).
A cultura de micrósporos isolados apresenta certas vantagens em relação à
cultura de anteras intactas (PETROVA et al., 1993): a manipulação de células isoladas é
mais apropriada para estudos biotecnológicos que o uso de anteras completas, por
impedir que ocorra alguma interferência da parede da antera. Finalmente os embriões
obtidos após a cultura de micrósporos são certamente haplóides, ao contrário da cultura
de anteras no qual eles podem ser obtidos de tecidos somáticos diplóides.
2.4.1 Desenvolvimento in vitro do micrósporo
O papel do gametófito masculino é a produção de gametas masculinos e a dupla
fertilização, no entanto alguns desses micrósporos presentes na cultura de anteras in
vitro são capazes de abandonar sua programação original de desenvolvimento e seguir
um novo programa de desenvolvimento esporofítico envolvendo contínuas divisões que
levam à produção de embriões haplóides ou calos (BARNABÁS et al., 2001).
Segundo SANGWAN & CAMEFORT (1982) o micrósporo jovem, após sua
liberação da tétrade, possui um grande núcleo central, citoplasma rico em ribossomos e
com numerosos pequenos vacúolos. Ao logo do tempo ocorre a coalescência desses
vacúolos resultando na formação de um único vacúolo grande e centralizado e
conseqüentemente o núcleo se desloca para junto da parede do micrósporo (SAX &
EDMONDS, 1933 citado por KALTCHUK-SANTOS & BODANESE-ZANETTINI,
2002).
23
Com o deslocamento do núcleo para a periferia da célula ocorre a primeira
divisão mitótica. Essa polarização do núcleo resulta em assimetria do fuso mitótico e
conseqüentemente distribuição desigual do citoplasma nas células filhas, originando
assim uma célula vegetativa e outra generativa. Sendo assim essas duas células são
estruturais e funcionalmente diferentes, mesmo possuindo o mesmo material genético.
A segunda mitose do pólen envolve somente a célula generativa, enquanto a
vegetativa permanece quiescente. Essa divisão origina duas células alongadas e em
forma de meia – lua, chamadas de células espermáticas. Assim o gametófito maduro é
constituído de três células: a vegetativa e as duas gaméticas.
Segundo o modelo determinístico de dois pontos, proposto por GRANDO &
MORAES-FERNADES (1997), haveria dois momentos no qual o micrósporo poderia
ter sua via ontogenética normal alterada, levando à aquisição do potencial
androgenético. O primeiro ponto de alteração seria no início da meiose e o segundo
durante o estádio mononucleado do pólen. Há evidências de que a eliminação das
moléculas carreadoras de informações esporofíticas (mRNA, ribossomos e proteínas)
deve ocorrer nestas duas etapas e qualquer anormalidade que impeça a correta
eliminação destas moléculas acarretará a reativação do processo embriogênico.
As análises citológicas da segmentação inicial de micrósporos oriundos da
cultura de anteras em varias espécies, realizadas por SUNDERLAND & DUNWELL
(1974), mostram a existência de quatro rotas de androgênese in vitro:
Rota I – o micrósporo segue seu curso normal, passando pela divisão assimétrica
e a diferenciação celular, para formar uma célula generativa e uma vegetativa. Mas
somente a célula generativa continua dividindo e estará envolvida na embriogênese.
Rota II – nesta rota, assim como na I, a primeira divisão mitótica e a
diferenciação celular são normais. A célula generativa não é funcional e degenera-se
rapidamente, ou após uma ou duas divisões. Apenas a célula vegetativa participa na
formação do embrião.
Rota III – a primeira divisão é assimétrica e as células, vegetativa e generativa,
continuam a dividir-se e participam no desenvolvimento do embrião androgenético.
Rota IV – o micrósporo sofre uma divisão simétrica cujas duas células – filhas
idênticas com características do tipo vegetativo contribuem para o desenvolvimento do
esporófito haplóide.
Independente do padrão inicial de segmentação, o pólen sofre divisões tornando-
se multicelular, e este tecido pode tomar duas possíveis direções: (I) formar um embrião
24
globular que passa pelos estádios normais da embriogênese pós – globular; (II)
proliferar e formar um calo que mais tarde se diferencia em plântulas, via embriogênese
ou organogênese (BHOJWANI & RAZDAN, 1983).
Segundo PENG et al. (1997) em cultura de anteras de aspargo a formação de
calos, embriões e plântulas haplóides têm como pré-requisito a ocorrência de divisão
simétrica. Grãos de pólen cuja primeira mitose tenha sido do tipo assimétrica não
sofrem divisões adicionais e, portanto, não tomam a via esporofítica. Vários outros
estudos (FAN et al., 1988; ZAKI & DICKINSON, 1900, 1991, 1995) defendem a
hipótese de que da simetria a mitose do pólen é um ponto chave para que ocorra o
desvio do programa gametofítico.
A mudança na ontogenia normal de um micrósporo para uma via esporofítica
requer alterações profundas na morfogênese celular (IQBAL et al., 1994). Os
microtúbulos que determinam a localização das organelas, incluindo o núcleo, estão
necessariamente envolvidos em tais mudanças morfogenéticas. Assim, a reorganização
dos microtúbulos é vista como uma condição necessária na alteração do padrão de
desenvolvimento.
O pólen binucleado simétrico é formado após uma divisão equacional, cujo
resultado são duas células idênticas do tipo vegetativas. Sua origem deve-se,
basicamente, a não formação do vacúolo ou modificação no eixo de divisão da célula.
Presume-se que o potencial androgenético deste tipo de pólen deva-se à manutenção de
determinantes esporofíticos (mRNA e ribossomos) em seu citoplasma. Desta forma, o
pólen resultante de divisão simétrica poderia ser definido como uma estrutura
embriogênica induzida (ZHAO et al., 1996).
2.4.2 Fatores externos que induzem o micrósporo a entrarem na via esporofítica
Pouco se sabe sobre os mecanismos de redirecionamento da ontogenia do
gametófito masculino no sentido de formar uma célula embriogênica (GARRIDO et al.,
1993), mas, os estudos têm mostrado que este redirecionamento necessita de um
estímulo – sinal.
Segundo REYNOLDS (1997) a aplicação de fatores externos torna o micrósporo
competente para a androgênese. O estresse parece ser o sinal para iniciar o processo
androgenético, uma vez que proteínas de estresse são detectadas durante a indução da
embriogênese haplóide. Tais proteínas seriam responsáveis pela reprogramação da
célula e pela proteção à condição estressante (KIVIHARJU & PEHU, 1998).
25
Fatores estressantes aplicados in vivo e in vitro têm sido identificados como
capazes de disparar o processo esporofítico (IMMONEM & ROBISON, 2000;
SMYKAL & PECHAN, 2000). Entre eles podem ser listados, choque térmico (calor ou
frio), agentes anti-mitóticos (colchicina), carência de nitrogênio, carência de
carboidratos, incubação em solução de manitol.
O uso de fatores de estresse na indução da androgênese não é um fato recente.
NITSCH & NOREEL (1973) aplicaram pré-tratamento de frio em botões florais de
Datura innoxia e constataram um aumento na freqüência de pólens com dois núcleos
idênticos, bem como no número de embriões formados.
O tratamento das anteras a baixas temperaturas, antes ou no início da cultura in
vitro, tem como conseqüências, para o grão de pólen, a dissolução dos microtúbulos e
alterações na distribuição do citoplasma e na divisão celular (RASHID, 1983). Portanto
é provável que o pré-tratamento de frio exerça seu efeito através de uma interferência
precoce no estabelecimento da polaridade, resultando em modificação na organização
do fuso, com a formação de pólens binucleados simétricos (MAHESHWARI et al.,
1980; RASHID, 1983).
Além do uso dos tratamentos de frio, a indução de mitose simétrica no
micrósporo pode ser alcançada através do uso de colchicina. A colchicina é uma droga
que se liga a heterodímeros inibindo a adição de dímeros aos microtúbulos, resultando
na sua despolimerização e, impedindo assim, a progressão no desenvolvimento do pólen
(ZHAO et al., 1996).
BONET & OLMEDILLA (2000) estudando o desenvolvimento in vitro de
micrósporos de trigo observaram que ao contrário do desenvolvimento gametofítico a
primeira divisão androgenética é simétrica, com a formação de dois núcleos idênticos.
Segundo esses autores a primeira divisão simétrica ocorreu três dias após
submeter esses micrósporos a um meio rico. Após oito dias já se pode observar grãos de
pólen polinucleados com até dez núcleos. Esses pólens polinucleados não mostraram
visíveis diferenças em tamanho quando comparados com micrósporos não induzidos. A
parede do pólen se rompeu somente quando o número de células dentro do pólen
polinucleado chegou de 10 a 15 aproximadamente.
Micrósporos capazes de se adaptar ao estresse ambiental das condições in vitro e
a sobreviverem nos primeiros três dias de cultura são também capazes de seguir um
caminho de desenvolvimento esporofítico. A comparação de divisão simétrica e
assimétrica dos micrósporos e a freqüência de formação de embriões ou calos indicaram
26
que o desenvolvimento embriogênico dos micrósporos ocorreu após divisões simétricas,
enquanto que calos foram formados pela adicional divisão de células vegetativas
resultado da divisão assimétrica de micrósporos (BARNABÁS et al., 1988).
Estudos sobre o efeito do agente anti-mitótico colchicina na cultura de anteras e
de micrósporos de Brassica napus mostrou que esta substância age como um promotor
da androgênese, tratamentos com colchicina resultaram em aumento significativo do
número de divisões simétricas, bem como, no número de embriões formados (ZAKI &
DICKINSON, 1990, 1991, 1995). Resultados semelhantes foram também obtidos por
IQBAL et al. (1994) e ZHAO et al. (1996) em Brassica, e por SZAKÁCS &
BARNABÁS (1995) em trigo.
Os resultados obtidos nesses estudos apontam a colchicina como um promotor
da androgênese através da reorganização do citoesqueleto. Entretanto ZAKI &
DICKINSON (1995) argumentaram que, embora esta droga tenha potencialidade para
induzir mitose simétrica, a sua capacidade em aumentar paralelamente a embriogênese
ainda não estava claramente comprovada. De acordo com TOURAEV et al. (1996a), a
simetria não é uma condição essencial para aquisição da capacidade embriogênica.
Estresses do tipo de choque de calor (BINAROVA et al., 1997) e carência de
sacarose (ZÁRSKY et al., 1995) na indução da androgênese demonstraram a presença
de proteínas de choque térmico (HSPs). Foi verificada uma alta correlação entre a
indução do desenvolvimento embriogênico e a presença de proteínas de choque térmico
da classe da HSP70 (CORDEWENER et al., 1995).
O uso combinado dos fatores choque de calor e carência de sacarose tem levado
a acréscimos significativos na indução de embriogênese do pólen, tanto em tabaco como
em trigo (TOURAEV et al., 1996 a,b). Contudo em triticale IMMONEN & ROBISON
(2000) testaram diferentes fatores de estresse e verificaram que, embora estes tenham
sido capazes de melhorar a resposta androgenética, não foram capazes de induzir a
androgênese nos genótipos mais recalcitrantes.
O interesse no uso do sistema de duplo-haplóides androgenéticos na obtenção de
linhagens puras pode ser justificado por benefícios tais como a redução de tempo e de
custos, a maior variância genética, a melhor eficiência na seleção e, ainda como teste
para identificar cruzamentos promissores (MORAES- FERNANDES et al., 1999).
Porém as dificuldades na indução da androgênese em algumas espécies como as
leguminosas, por exemplo, têm limitado sua aplicação nos modernos programas de
melhoramento (KALTCHUK-SANTOS & BODANESE-ZANETTINI, 2002).
27
Tem sido verificado que o estádio de desenvolvimento do micrósporo tem um
papel crucial na eficiência da indução haplóide. Tudo indica que, em determinados
períodos, o micrósporo apresenta-se mais suscetível a alterações em sua via
ontogenética e, assim, competente para a androgênese. Em geral este período é anterior
à primeira mitose e está relacionado com uma eliminação inadequada de determinantes
esporofíticos (KALTCHUK-SANTOS & BODANESE-ZANETTINI, 2002).
2.4.3 Relação entre estádio de desenvolvimento de micrósporos e tamanho do botão
floral
Muitos autores, na tentativa de monitorar o processo de divisão meiótica,
tentaram associar o tamanho do botão floral com as diferentes fases meióticas ou
estádios de desenvolvimento do grão de pólen (WILLCOX et al., 1990; LAUXEN et al.,
1995; SILVA et al., 1995; ANDRADE et al., 1996;). Esse tipo de informação é
importante para o sucesso de pesquisas que envolvem a técnica e cultura de anteras, em
que um dos pontos de entrave é o estádio da microgametogênese, uma vez, para a
maioria das espécies, é necessária a manipulação da célula gamética uninucleada
(ZHANG & LESPINASSE, 1992).
Numerosos fatores influenciam o processo de androgênese in vitro e a sua
eficiência, tal como o estádio fisiológico da planta doadora das anteras (WANG &
CHEN, 1980; OUYANG et al., 1987), o estádio de desenvolvimento do micrósporo
(OUYANG et al., 1973; HE & OUYANG, 1984), as condições de cultura in vitro (JING
et al., 1982) e o genótipo usado no processo (BULLOCK et al., 1982).
LAUXEN et al. (1995) relacionaram os estádios da microsporogênese a quatro
intervalos preestabelecidos de comprimento de botão floral, em três cultivares
brasileiras de soja (Glycine max (L.) Merrill), e constataram falta de sincronismo entre
as anteras de um mesmo botão quando a meiose I e II. ANDRADE et al., (1996)
analisaram citologicamente quatro cultivares de café (Coffea arábica L.), e em todos os
genótipos houve associação entre o tamanho de botões florais e anteras apenas nos
estádios de desenvolvimento de micrósporos.
A relação entre tamanho de botão floral e o estádio de desenvolvimento do grão
de pólen tem sido buscada em várias espécies, principalmente como subsídio para
estudos envolvendo microsporogênese e cultura de anteras (WILLCOX et al., 1990).
Segundo SOUZA et al. (2002) análises citológicas realizadas em botões florais de
maracujazeiro – amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.), tanto o tamanho do
28
botão quanto das anteras não devem ser usados como parâmetros indicativos para fases
meióticas durante a microsporogênese. Nesse estudo os valores de comprimento de
botão floral e de anteras encontrados em uma fase meiótica sobrepõem-se à outra fase,
não sendo possível identificar com precisão a que intervalo pertence cada fase, ao
contrário dos estádios da microgametogênese, micrósporo e grão de pólen.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Regeneração via organogênese direta e proliferação de gemas axilares de feijão
(P.vulgaris L.)
A seguir serão detalhados os experimentos para o estudo da regeneração de
plantas de P. vulgaris L. por meio da organogênese in vitro e desenvolvimento de
plantas a partir da proliferação de gemas axilares. Esses experimentos foram baseados
no protocolo proposto por CRUZ DE CARVALHO et al. (2000), e a partir desse
método foram feitas modificações buscando adaptá-lo para as condições do presente
estudo, conforme andamento dos experimentos. Todos os experimentos foram
realizados no laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, do Centro de Pesquisa e
Desenvolvimento de Recursos Genéticos Vegetais, do Instituto Agronômico, sediado na
cidade de Campinas, São Paulo.
3.1.1 Material Vegetal e estabelecimento in vitro das sementes de feijão (P.vulgaris
L.)
O material vegetal deste estudo foi o cultivar: IAC – Alvorada, que é originário
do cruzamento realizado entre os genótipos: {(IAC- Carioca Pyatã . A686) x [(IAC –
Maravilha . G2338) . (IAC- Maravilha. And277)]} x L317-1. O IAC- Alvorada, tipo
grão carioca, apresenta porte de planta semi-ereto (tipo III), com resistência moderada à
antracnose, alto peso de mil sementes (275 g) e alta qualidade. Essa qualidade deve-se à
resistência ao escurecimento e ao tamanho do grão (peneira 13 e 14). O teor de proteína
médio é de 22%. O padrão de produtividade média desse cultivar é de 2500 kg/ha.
A germinação in vitro foi realizada em tubos de ensaio de 20 cm de altura e 2,4
cm de diâmetro de boca, tampados com papel alumínio ou filme de plástico de PVC.
Sementes do cultivar IAC- Alvorada sofreram descontaminação superficial com
água e detergente e em seguida álcool 70% por 40 segundos. Em câmara de fluxo
29
laminar foram submersas em solução de hipoclorito de cálcio (2%) por 20 minutos sob
agitação constante, seguida por um rápido enxágüe em solução de ácido clorídrico
(0,001N) e sucessivas lavagens com água destilada autoclavada por 30 minutos. Os
tubos de ensaio receberam 20 mL de meio de germinação que constou do ½ MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962,) com as vitaminas do meio B5 (GAMBORG et al.,
1968), suplementado ou não com 6-BA, no qual serão descritos no detalhamento de
cada experimento. Após inoculação das sementes o material foi mantido em sala de
crescimento com condições de luz, fotoperíodo de 16/8 (luz/escuro) e temperatura, 28 ±
2ºC controladas. O período de germinação variou conforme o experimento, pois foi
dependente do desenvolvimento das plântulas. Assim quando emitiram o primeiro par
de folhas eram consideradas ideais para o uso.
3.1.2 Efeito de explantes da região nodal entre os cotilédones e folhas primárias e
região nodal das folhas primárias de feijão (P.vulgaris L.)
Segundo CRUZ DE CARVALHO et al. (2000) a região de explante mais
responsiva para a regeneração via organogênese direta em feijão é o epicótilo,
principalmente a região nodal das folhas primárias, onde afirmaram que obtiveram uma
alta capacidade de regeneração (FIGURA 1).
Figura 1 – Representação da plântula de feijão (P. vulgaris L.) e partes utilizadas como
explantes neste estudo.
30
As sementes foram germinadas conforme item 3.1.2 por sete dias sem 6-BA. Os
diferentes tratamentos constaram das diferentes regiões do explante, sendo assim: ‘A’
região nodal das folhas primárias; ‘B’ – região proximal das folhas primárias; C- região
intermediária entre os cotilédones e folhas primárias e ‘D’- região distal das folhas
primárias. Sendo ‘B’, ‘C’ e ‘D’ pertencentes à região nodal entre os cotilédones e folhas
primárias. Os explantes foram dissecados conforme a técnica denominada de tTCL
(transverse thin cell layer, CRUZ DE CARVALHO et al., 2000). A região A sofreu
corte das gemas visíveis (MOHAMED et al., 1992a), sem auxílio de microscópio
esteroscópico. O meio de indução constou do meio MS com as vitaminas do meio B5
acrescido de 10 µM de 6-BA. Os frascos receberam 10 tTCL’s de 0,3 e 0,5 mm de
espessura. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com nove
repetições. Após montagem do experimento, o material foi mantido em sala de
crescimento com condições de luz, fotoperíodo de 16/8 (luz/escuro) e temperatura, 28 ±
2ºC controladas. Foi avaliado após sete dias o número de regenerações por frasco, e a
partir dele calculou-se o percentual de regeneração, obtido pela razão entre o número de
regenerados pelo número de explantes viáveis por frasco para cada uma das repetições,
obtendo-se ao final uma média de porcentagem de regeneração por tratamento. Os
materiais regenerados foram passados para meio MS com vitaminas do meio B5 livre de
hormônios.
3.1.3 Efeito do ácido ascórbico na organogênese in vitro de feijão (P.vulgaris L.)
Nesse experimento foi testado o uso de ácido ascórbico em três concentrações
0,06 µM, 0,14 µM e 0,3µM (PHYTO TECHNOLOGY LABORATORIES, 2007). O
experimento foi realizado em placas de Petri médias (diâmetro 6 cm e altura 1,4 cm),
contendo variado número de explantes. Os tratamentos de ácido ascórbico foram
utilizados no meio de indução MS com vitaminas do meio B5 e 10 µM de 6-BA. O
delineamento foi de blocos casualizados, divididos no tempo, com duas repetições.
As sementes foram germinadas conforme item 3.1.2, sem adição de 6-BA. O
bloco 1 foi montado com plântulas germinadas com 17 dias e o bloco 2 com 15 dias de
germinação. Os explantes foram divididos em dois tipos: ‘A’- região nodal das folhas
primárias e ‘B’- região proximal das folhas primárias (FIGURA 1). Os tratamentos de
ácido ascórbico foram: 0,06µM, 0,14 µM e 0,3µM em um esquema fatorial 2x2 com
cinco placas (unidades de observação) para cada combinação por bloco. As soluções de
31
ácido ascórbico foram filtroesterilizadas, uma vez que o ácido ascórbico não pode ser
autoclavado juntamente com o meio.
Cada placa continha a região do explante de uma plântula na forma de tTCL’s.
Após montagem do experimento, o material foi mantido em sala de crescimento com
condições de luz, fotoperíodo de 16/8 (luz/escuro) e temperatura, 28 ± 2ºC controladas.
Nesse experimento foi avaliado o grau de oxidação das placas, após sete e 15 dias de
cultivo, atribuindo-se notas de 0 a 100 %, conforme o grau de oxidação, sendo 0% sem
oxidação e 100% totalmente oxidado. Ao final, considerando a ultima avaliação, foi
obtida uma média por combinação das cinco placas e realizada análise dos resultados.
3.1.4 Efeito do uso do 6-BA e do TDZ em meio de indução na organogênese in vitro
de feijão (P.vulgaris L.)
Foi proposto nesse experimento testar o efeito do 6-BA e do TDZ na
organogênese in vitro de explantes da região nodal das folhas primárias de plântulas de
feijão. Os experimentos foram constituídos de quatro tratamentos onde, todos receberam
o mesmo meio básico (MS mais as vitaminas do B5). O T1 foi o controle, livre de
reguladores de crescimento, o T2 foi acrescido de 10µM de 6-BA, o T3 foi acrescido de
15 µM de 6-BA e o T4 acrescido de 10µM de TDZ. As sementes foram germinadas
conforme item 3.1.2 por 11, 10, sete e 14 dias para cada bloco respectivamente. O
delineamento experimental foi de blocos casualizados, divididos no tempo, com quatro
repetições, com pelo menos cinco frascos (unidades de observação) por bloco e cada
frasco continha dez tTCL’s. O número de unidades de observação não foi padronizado
pois era dependente do número de plântulas que emitiram o primeiro par de folhas.
Assim o bloco um foi montado com plântulas de 11 dias, o bloco dois com dez dias, o
bloco três com sete dias e o bloco quatro com 14 dias de germinação. Os explantes
foram retirados da região nodal do primeiro par de folhas (região ‘A’ FIGURA 1), com
corte das gemas axilares pré - existentes visíveis. Após montagem do experimento, o
material foi mantido em sala de crescimento com condições de luz, fotoperíodo de 16/8
(luz/escuro) e temperatura, 28 ± 2ºC controladas. Foi avaliado número de plantas
regeneradas em relação ao número de explantes viáveis, a cada sete dias num total de
três avaliações. A partir da avaliação final, obteve-se a freqüência média de regeneração
pela média das unidades de observação, para cada bloco e posteriormente foi realizada
análise dos resultados.
32
3.1.5 Efeito do uso do 6-BA e do TDZ na proliferação de gemas axilares de feijão
(P.vulgaris L.)
Baseando-se nos resultados com relação à região do explantes e efeito das
citocininas 6-BA e TDZ no meio de indução, foi realizado esse experimento utilizando
somente a região nodal das folhas primárias (região ‘A’ FIGURA 1) sem a retirada das
gemas pré-existentes, uma vez que CRUZ DE CARVALHO et al. (2000) não relatam
tal procedimento. A germinação das sementes foi realizada conforme item 3.2.1 e foi
dividida em dois tratamentos de germinação in vitro com e sem 6-BA (5µM). O período
de germinação foi de 14 dias para o bloco 1, 15 dias para o bloco 2 e 18 dias para o
bloco 3.
O meio de indução também foi dividido em dois tratamentos: T1 - meio MS com
vitaminas do meio B5, acrescido de 10 µM de 6-BA e T2: meio MS com vitaminas do
meio B5, acrescido de 10 µM de TDZ. Sendo assim o experimento foi realizado em
esquema fatorial 2x2, e o delineamento experimental foi de blocos casualizados,
divididos no tempo, com três repetições. O número de frascos (unidades de observação)
por bloco variou de seis a dez. Cada frasco continha a região nodal das folhas primárias
(região ‘A’ FIGURA 1) de uma plântula na forma de tTCL’s. Após a montagem do
experimento, o material foi mantido em sala de crescimento com condições de luz,
fotoperíodo de 16/8 (luz/escuro) e temperatura, 28 ± 2ºC controladas. Foi avaliado o
número de plantas desenvolvidas a cada sete dias, totalizando três avaliações. A partir
da ultima avaliação, obteve-se a freqüência média de plantas desenvolvidas pela média
das unidades de observação, para cada combinação e posteriormente foi realizada
análise dos resultados.
3.1.6 Proliferação de gemas axilares a partir de ápices meristemáticos de caules de
feijão (P.vulgaris L.) in vitro
Foi realizando um estudo comparando dois meios na proliferação de gemas
axilares, a partir de ápices meristemáticos de caules, e alongamento de brotos. Para tal
estudo foram utilizados ápices de plântulas germinadas in vitro conforme descrito o
item 3.2.1, com adição de 5 µM de 6-BA por 17 dias.
Os meios consistiram de T1: meio MS com as vitaminas do meio B5 acrescido de
1 µM de 6-BA, 3µM de GA3 e 10 µM de AgNO3 (CRUZ DE CARVALHO et al.,
2000) e T2: meio MS com as vitaminas do meio B5 acrescido de 3µM de GA3. O
delineamento foi inteiramente casualizado com quatro repetições (frascos) por
33
tratamento. Cada frasco continha quatro ápices (explante) de plântulas de feijão. Após
montagem do experimento o material foi mantido em sala de crescimento com
condições de luz, fotoperíodo de 16/8 (luz/escuro) e temperatura, 28 ± 2ºC controladas.
Foi avaliado o número de brotos formados por explantes, e a formação de raiz
durante três semanas, avaliando a cada sete dias. A partir da ultima avaliação obteve-se
uma média do número de brotos formados em cada tratamento pelas suas repetições.
Para a formação de raiz obteve-se a freqüência média de formação de raiz por
tratamento, obtida pela relação entre o número de explantes que formaram raiz pelo
total inoculado viável em cada tratamento, pelas suas repetições. Posteriormente foi
realizada análise dos resultados.
3.1.7 Aclimatação de plantas
Anteriormente à aclimatação as plantas passaram por um período in vitro em
meio MS com as vitaminas do meio B5 livre de hormônio afim de que elas
desenvolvessem tanto parte aérea como raízes. As plantas que apresentavam parte aérea,
com ramos e folhas verdes, e sistema radicular bem desenvolvido foram aclimatadas em
copos plásticos de 200 mL, com vermiculita autoclavada, molhada com uma solução de
meio MS/4 para suprir as necessidades nutricionais das mesmas. Essas plantas foram
armazenadas em condições de laboratório, com umidade do ar (aproximadamente 80%)
e temperatura controlada (25ºC) em bandeja contendo água, até se adaptarem a essas
condições ex vitro. Após esse período as plantas foram passadas para vasos com terra e
colocadas em condições de casa de vegetação.
3.1.8 Análise estatística
As análises estatísticas, ANOVA e teste de Tukey de cada experimento foram
realizadas por meio do programa SISVAR (software livre, cedido pela UFLA) Os
gráficos foram realizados no programa Excel.
3.2 Regeneração de plantas haplóides por meio da Androgênese em feijão
(P.vulgaris L.)
A seguir serão descritos os procedimentos adotados para estudos da androgênese
em feijão. Todos os experimentos foram realizados nos laboratórios de Cultura de
Tecidos Vegetais e de Citogenética, do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de
Recursos Genéticos Vegetais, do Instituto Agronômico, sediado na cidade de Campinas,
São Paulo.
34
3.2.1 Cultura de anteras em feijão (P.vulgaris L.)
Inflorescências do cultivar IAC- Alvorada, após o período de choque térmico de
0, 48 e 72 horas, foram esterilizadas superficialmente. Primeiramente foram lavadas em
água corrente com algumas gotas de detergente e na seqüência permaneceram em álcool
70% por 40 segundos. Em câmara de fluxo laminar asséptico as inflorescências foram
submersas em solução de hipoclorito de cálcio (1,5%) por dez minutos sob agitação
seguida de um rápido enxágüe em solução de ácido clorídrico (0,001N) e sucessivas
lavagens por água destilada autoclavada durante 10 minutos
Os botões, classificados em pequenos (2,0 a 3,5 mm) médios (3,6 a 6,0 mm) e
grandes (6,1 a 8,5 mm), foram dissecados sob microscópio esteroscópico e as anteras
foram inoculadas em meio de cultura, na seguinte conformidade: 40 anteras para cada
placa de Petri média (diâmetro de 9,5 cm e altura de 2,0 cm), contendo 20 mL de meio.
As placas de Petri foram colocadas em sala de crescimento em temperatura de
aproximadamente 26º C no escuro.
Foram testados diferentes meios de cultura. Os meios de cultura para indução de
calos constou do MS contendo cinetina (18µM) + 2,4-D (18µM) (MUÑOZ &
BAUDOIN, 2002) ou 6-BA (17,4µM) + 2,4-D (18µM) com as vitaminas do meio N6
(CHU, 1975). Calos obtidos do meio de indução foram passados para meio de
crescimento de calo constituído de MS com vitaminas de MOURAD-AGHA &
DEXHEIMER (1979) e posteriormente esse calos foram passados para meio de
regeneração MS com vitaminas do meio B5 e 10 µM.L-1 de 6-BA.
Avaliou-se o número de anteras que produziram calos, ao mesmo tempo em que
se procurou observar de que tecidos ou células esses calos foram originados. O
delineamento experimental foi inteiramente casualizados com no mínimo três
repetições.
3.2.2. Cultura de micrósporos isolados em feijão (P.vulgaris L.)
3.2.2.1 Relação entre tamanho de botão floral e estádio de desenvolvimento do
micrósporo
Foram realizados estudos para a averiguação da existência de uma possível
relação entre o tamanho dos botões florais e o estádio de desenvolvimento dos
micrósporos, especificamente, a fase mononuclear de interesse na androgênese. Para tal,
35
botões florais, coletados de plantas cultivadas em casa-de-vegetação, de tamanhos
inferiores a 1 mm até 8,5mm foram coletados e então dissecados sob microscópio
esteroscópico. Foram analisados cinco botões de cada tamanho. As anteras foram
retiradas e colocadas em meio CPW-13 (FREARSON et al., 1973). A seguir, as mesmas
foram transferidas para uma lâmina com uma gota do mesmo meio, maceradas com
cuidado para liberação dos micrósporos íntegros e cobertas com uma lamínula. Algumas
lâminas foram preparadas com o corante carmim acético 1,2% (MEDINA &
CONAGIN, 1964) e comparadas com aquelas preparadas apenas com o meio CPW-13
para verificar qual deles propiciava melhor contraste entre o núcleo e o citoplasma. As
observações quanto ao número de núcleos nos micrósporos foram feitas utilizando-se
um microscópio óptico Jenaval-Zeiss. O método de preparo das lâminas com carmim
acético foi semelhante ao do CPW-13. Alguns micrósporos foram selecionados e
fotomicrografados em fotomicroscópio Vanox-Olympus, com filme colorido ASA 400
Kodak Ultra.
3.2.2.2 Efeito de choque térmico sob os micrósporos
Botões florais do cultivar de feijão IAC – Alvorada, de tamanhos entre 2,5 a 3,5
mm, coletados de plantas cultivadas em casa-de-vegetação, foram divididos em dois
tratamentos: T1: 20 botões utilizados como testemunha, ou seja, não receberam choque
de frio (8 ± 1ºC – em geladeira) sendo dissecados imediatamente após a coleta e T2: 20
botões armazenados em geladeira, em um Becker contendo algodão umedecido com
água destilada, por seis dias, período de choque de frio (8 ± 1ºC - em geladeira). Após
os seis dias de choque de frio foi realizado o procedimento para a liberação dos
micrósporos.
Para a liberação dos micrósporos, primeiramente os botões florais foram
dissecadas em microscópio estereoscópico para a retirada das anteras em meio CPW-13.
Assim, os micrósporos foram liberados das anteras pela maceração das mesmas em
meio CPW-13, passagem por peneira de 58 micrômetros e observação em microscópio
de luz invertida. Foram analisados 20 campos aleatórios, contando-se o número de
micrósporos de cada tamanho de forma presente.
36
3.2.2.3 Experimentos de isolamento e cultivo de micrósporos
A seguir (TABELA 1) estão descritos o número de experimentos com
micrósporos realizados e algumas especificações. Porém cada experimento será
detalhado abaixo.
Tabela 1 – Experimentos de cultura de micrósporos isolados do cultivar de feijão (P.
vulgaris L) IAC-Alvorada e suas especificações.
Os experimentos de cultivo de micrósporos isolados foram baseados em
MATOS (2006), trabalho esse desenvolvido dentro do laboratório de Cultura de Tecidos
Vegetais do IAC. Esse trabalho serviu de base, uma vez que se trata do cultivo e
regeneração de plantas a partir de protoplastos de Passiflora spp, e podem-se cultivar
micrósporos utilizando-se procedimentos semelhantes.
Experimento 1:
Material Vegetal: para esse estudo foram utilizados 80 botões de 3,0 a 3,5 mm de
comprimento, do cultivar IAC- Alvorada, cultivado em casa-de-vegetação. O material
foi colhido no dia do isolamento e não sofreu choque térmico de frio.
Retirada das Anteras: os botões florais foram lavados rapidamente com água e
detergente e posteriormente foram colocados em álcool 70% por 40 segundos. Todas as
etapas a seguir foram realizadas sob condições assépticas, ou seja, em câmara de fluxo
laminar asséptica e material autoclavado. Os botões florais foram esterilizados com
solução de hipoclorito de cálcio 1,5 % por quatro minutos, em seguida sofreram
enxágüe em solução de ácido clorídrico (0,001N) autoclavada. Posteriormente sofreram
Experimento Época de colheita das
anteras
Período de choque térmico
Forma de plaqueamento
Meio utilizado
pra indução 1 Outono 0 dia Líquido K8P
2
Outono
9 dias
Gotas de agarose 0,6%
K8P
3
Outono
6 dias
Gotas de agarose
0,6%
K8P/K8
4, 5, 6
Outono(4) /
Inverno (5 e 6)
10, 6 e 13 dias
Gotas de agarose
0,6%
K8
37
sucessivas lavagens de dez minutos com água destilada autoclavada. Após a
esterilização os 80 botões foram dissecados com auxílio de microscópio estereoscópico
e as anteras foram retiradas e colocadas imediatamente em meio CPW-13.
Esmagamento das anteras: As anteras foram colocadas em peneira de 58 micrômetros,
com auxílio de pipeta Pasteur e foram maceradas em meio CPW-13 com um bastão de
vidro de ponta achatada para que os micrósporos fossem liberados. Como os
micrósporos são menores que 58 micrômetros, esses passaram pela peneira utilizada e o
que ficou retido na peneira era descarte, como por exemplo, restos de anteras ou outros
materiais.
Filtragem em Peneira de 30 micrômetros: após passarem pela peneira de 58
micrômetros, adicionou-se CPW-13 à placa contendo micrósporos e esses foram
filtrados na peneira de 30 micrômetros, objetivando reter os micrósporos vivos na
peneira e descartar partículas menores que isso, como por exemplo, micrósporos
inviáveis. Após a filtragem o material que passou na peneira foi descartado e os
micrósporos foram ressuspendidos em meio CPW-13 com auxílio de uma pipeta
Pasteur. Os micrósporos em suspensão no meio CPW-13 foram coletados e colocados
em tubos para centrífuga. Posteriormente foram armazenados em caixa de isopor com
gelo e levados a geladeira por aproximadamente duas horas (8 ± 1ºC) em meio CPW-13
antes da centrifugação.
Centrifugação: A centrifugação foi realizada por cinco minutos a 1200 rpm em
centrífuga modelo Baby I 206B, marca Fanem. A seguir descartou-se o sobrenadante e
o pellet foi ressuspendido em um mL de meio K8P (KAO & MICHAYLUK, 1977).
Após a homogeneização retirou-se uma alíquota para contagem de micrósporos em
câmara de Newbawer.
Diluição: foi obtida uma solução de micrósporos com uma população de 9 x 104 /mL a
qual foi diluída para aproximadamente 2,3 x 104 /mL, acrescentando-se 2mL de K8P,
totalizando então ao final da diluição uma solução de 3mL de K8P 1 x com
micrósporos. Esses 3 mL foram divididos em duas placas de Petri pequenas (diâmetro 6
cm e altura de 1,4 cm), contendo 1,5 mL em cada uma. Nesse caso foi utilizado meio
líquido sem Agar e as placas foram mantidas no escuro. Os micrósporos plaqueados
foram observados diariamente em microscópio de luz invertida, anotando-se o estádio
de desenvolvimento dos micrósporos, o número de micrósporos inviáveis ou rompidos,
a presença ou não de divisões. A documentação também se deu por meio de fotografias
digitais. A cada três ou quatro dias as culturas receberam troca de meio velho por meio
38
novo, onde de cada placa foi retirado 1mL de K8P da placa e adicionado 1mL de K8P
1x novo.
Experimento 2:
Material Vegetal: para esse estudo foram utilizados 76 botões de 3,0 a 3,5 mm de
comprimento, do cultivar IAC- Alvorada, cultivado em casa-de-vegetação, colhidos e
colocados em geladeira, estando no momento da instalação do experimento com nove
dias de choque térmico de frio (8 ± 2°C).
Os procedimentos de retirada e esmagamento das anteras, filtragem em peneira
de 30 micrômetros e centrifugação foram feitos como descrito no “experimento 1”.
Diluição: foi obtida uma solução de micrósporos com uma população de 8,5 x 104 /mL
a qual foi diluída para aproximadamente 2,1 x 104 /mL, acrescentando-se 0,5 mL de
K8P 1 x e 1,5 mL de agarose 1,2% (1:1 de agarose 2,4 % e meio K8 2x),, no final
obteve-se 3 mL de K8P 1x com agarose 0,6%. Esses 3 mL foram divididos em gotas de
agarose em cinco placas de Petri médias contendo 9,6 mL de meio K8P em cada una e
as placas foram mantidas no escuro. Os micrósporos plaqueados foram observados
diariamente em microscópio de luz invertida, anotando-se o estádio de desenvolvimento
dos micrósporos, o número de micrósporos inviáveis ou rompidos, a presença ou não de
divisões. A documentação também se deu por meio de fotografias digitais. As trocas de
meio se deram a cada três ou quatro dias, onde cada placa grande recebeu a troca de 3,2
mL de meio K8P da placa por 3,2 mL de meio K8P 1x novo.
Experimento 3:
Material Vegetal: para esse estudo foram utilizados 80 botões de 3,0 a 3,5 mm de
comprimento do cultivar IAC- Alvorada, cultivado em casa-de-vegetação, colhidos e
colocados em geladeira, estando no momento da instalação do experimento com seis
dias de choque térmico de frio (8 ± 1ºC).
Os procedimentos de retirada e esmagamento das anteras, filtragem em peneira
de 30 micrômetros e centrifugação foram feitos como descrito no “experimento 1”.
Exceto para após a centrifugação onde o pellet foi ressuspendido em dois tubos de
ensaio e cada um recebeu 1mL de meio K8 (KAO & MICHAYLUK, 1977) 1x e K8P
1x.
Diluição: foram obtidas duas soluções de micrósporos com uma população de 9,25 x
104 /mL a qual foi diluída aproximadamente 1,15 x 104 /mL, acrescentando-se 1 mL de
39
K8P 1 x ou K8 1x e 2mL de agarose 1,2% , (1:1 de agarose 2,4 % e meio K8 2x), ao
final obteve-se 4 mL de meio com agarose 0,6%. O tratamento um constou de meio
K8P 1 x e o tratamento dois de meio K8 1x. Os 4 mL de cada tratamento foram
divididos em gotas de agarose, onde o T1 foi composto de cinco placa de Petri ,quatro
médias e uma pequena, e o T2 de quatro placas de Petri, três médias e uma pequena. As
placas de Petri médias receberam 9,6 mL de meio K8P ou K8 1x e as pequenas 3,0 de
K8P ou K8 1x. As placas foram mantidas no escuro. Os micrósporos plaqueados foram
observados diariamente em microscópio de luz invertida, anotando-se o estádio de
desenvolvimento dos micrósporos, o número de micrósporos inviáveis ou rompidos, a
presença ou não de divisões. A documentação também se deu por meio de fotografias
digitais.
As trocas de meio se deram a cada três ou quatro dias, onde cada placa média
recebeu a troca de 3,2 mL de meio K8P ou K8 velho por meio K8 1x novo e as placas
pequenas 1 mL de meio K8P e K8 velho por meio K8 1x novo.
Experimento 4
Material Vegetal: para esse estudo foram utilizados 70 botões de 3,0 a 3,5 mm de
comprimento, do cultivar IAC- Alvorada, cultivado em casa-de-vegetação, colhidos e
colocados em geladeira, estando no momento da instalação do experimento com dez
dias de choque térmico de frio (8 ± 1ºC).
Os procedimentos de retirada e esmagamento das anteras, filtragem em peneira
de 30 micrômetros e centrifugação foram feitos como descrito no “experimento 1”.
Exceto para após a centrifugação onde o pellet foi ressuspendido em meio K8 1x.
Diluição: foi obtida uma solução de micrósporos com uma população de 8,1x 105 /mL a
qual foi diluída para aproximadamente 2,0 x 104/mL, acrescentando-se 2 mL de K8 1 x
e 3 mL de agarose 1,2% , (1:1 de agarose 2,4 % e meio K8 2x), ao final obteve-se 6
mL de meio com agarose 0,6%. Essa solução foi distribuída em 14 placas de Petri
pequenas em forma de gotas de agarose ou camada de agarose. Em cada placa as gotas
foram cobertas com 3 mL de meio K8 1x e foram mantidas no escuro. Os micrósporos
plaqueados foram observados diariamente em microscópio de luz invertida, anotando-se
o estádio de desenvolvimento dos micrósporos, o número de micrósporos inviáveis ou
rompidos, a presença ou não de divisões. A documentação também se deu por meio de
fotografias digitais.
40
As trocas de meio se deram a cada três ou quatro dias, onde cada placa recebeu a
troca de 1mL de meio K8 1x da placa por 1 mL de meio K8 1x fresco.
Experimento 5
Material Vegetal: para esse estudo foram utilizados 45 botões pequenos de 3,0 a 3,5
mm de comprimento, do cultivar IAC- Alvorada, cultivado em casa-de-vegetação,
colhidos e colocados em geladeira, estando no momento da instalação do experimento
com seis dias de choque térmico de frio (8 ± 2ºC).
Os procedimentos de retirada e esmagamento das anteras, filtragem em peneira
de 30 micrômetros e centrifugação foram feitos como descrito no “experimento 1”.
Exceto para após a centrifugação onde o pellet foi ressuspendido em meio K8 1x.
Diluição: foi obtida uma solução de micrósporos com uma população de 3,18 x 105 /mL
a qual solução foi diluída para aproximadamente 4,0 x 104 /mL, acrescentando-se 1 mL
de meio K8 1x e 2 mL de agarose 1,2% (1:1 de agarose 2,4 % e meio K8 2x), ao final
obteve-se 4 mL de meio com agarose 0,6%. A solução foi plaqueada na forma de gotas
de agarose em quatro placas de Petri pequenas, em cada placa as gotas foram cobertas
com 3 mL de meio K8 1x. Os micrósporos plaqueados foram observados diariamente
em microscópio de luz invertida, anotando-se o estádio de desenvolvimento dos
micrósporos, o número de micrósporos inviáveis ou rompidos, a presença ou não de
divisões. A documentação também se deu por meio de fotografias digitais.
As trocas de meio se deram a cada três ou quatro dias, onde as placas 1 e 3
receberam a troca de 1mL de meio K8 1x da placa pela mistura gradativa (3:1; 2:1; 1:1;
1:2 e 0:1) de meio K8 1x com K8 sem 2,4-D 1x e as placas 2 e 4 de meio K8 1x e K8
sem hormônio 1x.
Experimento 6
Material Vegetal: para esse estudo foram utilizados 50 botões de 3 a 3,5 mm de
comprimento do cultivar IAC- Alvorada, cultivado em casa de vegetação, colhidos e
colocados em geladeira, estando no momento da instalação do experimento com 13 dias
de choque térmico de frio (8 ± 1ºC).
Os procedimentos de retirada e esmagamento das anteras, filtragem em peneira
de 30 micrômetros e centrifugação foram feitos como descrito no “experimento 1”.
Exceto para após a centrifugação onde o pellet foi ressuspendido em meio K8 1x.
41
Diluição: foi obtida uma solução de micrósporos com uma população de 4,5 x 105 /mL
a qual foi diluída para aproximadamente 11,2 x 104 /mL, acrescentando-se 500 µL de
K8 1x e 1,5 mL de agarose 1,2% (1:1 de agarose 2,4 % e meio K8 2x), ao final obteve-
se 3 mL de meio com agarose 0,6%. Os 3 mL foram divididos em gotas de agarose em
seis placas de Petri pequenas, em cada placa as gotas foram cobertas com 3 mL de meio
K8 1x As placas foram mantidas no escuro. Os micrósporos plaqueados foram
observados diariamente em microscópio de luz invertida, anotando-se o estádio de
desenvolvimento dos micrósporos, o número de micrósporos inviáveis ou rompidos, a
presença ou não de divisões. A documentação também se deu por meio de fotografias
digitais.
As trocas de meio se deram a cada três ou quatro dias, onde as placas 1, 3 e 5
receberam a troca de 1mL de meio K8 1x da placa pela mistura gradativa (3:1; 2:1; 1:1;
1:2 e 0:1) de meio K8 1x com K8 sem 2,4-D 1x e as placas 2,4 e 6 a mistura de meio K8
1x e K8 sem hormônio 1x.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Regeneração via organogênese direta e proliferação de gemas axilares de feijão
A seguir serão descritos e discutidos os resultados dos experimentos de
organogênese direta e desenvolvimento de plantas a partir da proliferação de gemas
axilares de feijão, conforme descritos no material e métodos.
4.1.2 Efeito de explantes da região nodal entre os cotilédones e folhas primárias e
região nodal das folhas primárias
Segundo CRUZ DE CARVALHO et al. (2000) a região mais responsiva para a
regeneração direta em feijão é o epicótilo. Analisando a metodologia deste trabalho
notou-se que a região utilizada tratava-se especificamente da região nodal das folhas
primárias (região ‘A’ FIGUA 1).
Um experimento foi realizado utilizando essa região (‘A’ FIGUA 1) e também a
região nodal entre os cotilédones e o primeiro par de folhas, dividido em três partes
iguais (B, C e D; FIGURA 1).
Como se pode observar (FIGURA 2) explantes da região nodal das folhas
primárias de plântulas de feijão, do cultivar IAC-Alvorada, apresentaram diferença
42
significativa na regeneração in vitro (51%) quando comparadas com explantes da região
nodal entre os cotilédones e folhas primárias. Apesar de ser realizado o corte de gemas
pré-existentes nessa região não foi utilizado microscópio esteroscópico, o que pode ter
favorecido a permanência de gemas axilares não visíveis a olho nu.
Figura 2 - Freqüência média relativa de regeneração do cultivar de feijão (P. vulgaris
L.) IAC – Alvorada em função de diferentes regiões do explante. * Tratamentos seguidos de letras diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.
CRUZ DE CARVALHO et al. (2000) não mencionam no trabalho se foi
realizada a retirada das gemas axilares, uma vez que essa região apresenta uma grande
quantidade dessas gemas.
A partir desses dados se pode deduzir que os resultados de CRUZ DE
CARVALHO et al. (2000), chamado de um sistema eficiente e reprodutível de
regeneração via organogênese direta, pode na verdade tratar-se de um processo de
desenvolvimento de plantas a partir da proliferação de gemas axilares, o que
descaracteriza a organogênese direta. Segundo PHILLIPS & HUBSTENBERGER
(1995) a regeneração direta, ou adventícia, de plantas na cultura de tecidos pode ser
obtida pela cultura de seções de tecidos sem a presença de um meristema pré-formado.
4.1.3 Efeito do ácido ascórbico na organogênese in vitro de feijão
Como se pode observar (FIGURA 3) o teste F não foi significativo para a essa
característica, indicando que não houve diferenças entre os tratamentos de ácido
ascórbico para o presente experimento. Sendo assim o uso do ácido ascórbico não foi
43
eficiente no controle da oxidação dos explantes de feijão para as três doses estudadas
para as condições deste experimento. MOHAMED et al. (1993) utilizando 0,42 µM e
0,84 µM de ácido ascórbico verificaram um efeito positivo de aumento do tempo de
sobrevivência de calos para seis semanas. A não eficiência das doses estudadas pode ter
sido devido a serem menores quando comparadas ao trabalho de MOHAMED et al.
(1993).
Também não foi verificada regeneração de plantas a partir dos explantes
utilizados, à região nodal das folhas primárias com retirada das gemas visíveis (‘A’
FIGURA 1) e a região proximal das folhas primárias (‘B’ FIGURA 1).
Figura 3 – Porcentagem média de oxidação entre as diferentes concentrações de ácido ascórbico sobre os explantes do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada.
Para a região do explante o teste F foi significativo, indicando que houve
diferenças na porcentagem média de oxidação conforme a região utilizada como
explante. Como se pode observar (FIGURA 4) a região proximal das folhas primárias
(‘B’ FIGURA 1) apresentou uma maior porcentagem média de oxidação (94,25%) em
relação à região nodal das folhas primárias (‘A’ FIGURA 1) (81,4%).
CV: 13,94
a
a
44
Figura 4 – Porcentagem média de oxidação entre as diferentes regiões do explante do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada. * Tratamentos seguidos de letras diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.
Para o desdobramento da variável tratamento de ácido ascórbico (0,06 µM; 0,14
µM. e 0,3µM) dentro de cada nível de explante (‘A’ - região nodal das folhas primárias
e ‘B’ - região distal das folhas primárias, FIGURA 1) o teste F não foi significativo.
Para o desdobramento da variável região do explante (‘A’ - região nodal das
folhas primárias e ‘B’ - região distal das folhas primárias, FIGURA 1) dentro de cada
nível de tratamento de ácido ascórbico (0,06 µM; 0,14 µM. e 0,3µM) o teste F foi
significativo para a relação entre a região do explante e as doses de 0,14 e 0,3 µM de
ácido ascórbico. Como se pode observar (TABELA 2) a região nodal das folhas
primárias (‘A’ FIGURA 1) apresentou uma média de porcentagem de oxidação de 80 e
83,33% para as concentrações de ácido ascórbico de 0,14 e 0,3 µM respectivamente.
Essas diferiram das observadas para a região distal das folhas primárias (‘B’ FIGUA 1)
com médias de 96,67% e 95% para as concentrações de 0,14 e 0,3 µM de ácido
ascórbico respectivamente. Para esse experimento foi observada uma única regeneração
no tratamento de 0,14 µM.
b
45
Tabela 2 – Interação entre a região do explante do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada e a concentração de ácido ascórbico na porcentagem média de oxidação desses explantes.
% Média de oxidação por concentração de ácido ascórbico Região do
Explante 0,06 µM 0,14 µM 0,3 µM
Região nodal das folhas primárias
80,70a
80,00a
83,33a
Região proximal
das folhas primárias
91,11a
96,67b
95,00b
* Tratamentos seguidos de letras diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.
4.1.4 Efeito do uso do 6-BA e do TDZ na indução da organogênese in vitro de feijão
(P.vulgaris L.)
Utilizando-se a região nodal das folhas primárias (‘A’ FIGURA 1) com corte das
gemas axilares visíveis, avaliou-se a eficiência de duas concentrações de 6-BA e de uma
de TDZ na indução à organogênese in vitro em feijão. A Figura 5 apresenta os
resultados de regeneração e formação de calos para os quatro tratamentos avaliados:
Controle - sem hormônios; 10µM de 6-BA; 15µM de 6-BA; 10µM TDZ. Observou-se o
desenvolvimento de plantas em todos os tratamentos, embora em baixa freqüência, com
exceção no tratamento com 15µM de 6-BA que não apresentou regenerações. Conforme
se pode verificar (FIGURA 5) nenhum dos tratamentos apresentou diferenças
significativas. Os valores observados nos tratamentos de 10 µM de 6-BA (22%) e TDZ
(20%) foram muito próximos, indicando que esses dois hormônios apresentaram
respostas semelhantes.
Não foi verificado efeito de bloco nesse experimento, indicando que as plântulas
com diferentes dias de germinação (11, 10, sete e 14 dias para cada bloco
respectivamente) não interferiram no resultado do experimento.
46
Figura 5 - Freqüência média relativa de regeneração do cultivar de feijão (P. vulgaris
L.) IAC – Alvorada, sob diferentes concentrações hormonais: 0, 10 µM de 6-BA,15 µM de 6-BA e 10 µM de TDZ, para explantes da região nodal das folhas primárias sem as gemas axilares. * Tratamentos seguidos de letras diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.
4.1.5 Efeito do uso do 6-BA e do TDZ na proliferação de gemas axilares de feijão
(P.vulgaris L.)
Baseando-se nos resultados do experimento 4.1.4 e da região do explante 4.1.2
foi realizado um estudo com a região nodal das folhas primárias (‘A’ FIGURA 1) sem a
retirada das gemas pré-existentes. As plântulas usadas nesse experimento foram
germinadas em dois diferentes meios, um sem hormônio e outro com 5 µM de 6-BA.
Foram utilizados dois diferentes meios de indução, um com de 10 µM de 6-BA e outro
com10 µM de TDZ.
Como se pode observar (FIGURA 6) explantes de plântulas germinadas com 5
µM de 6-BA forneceram maior porcentagem (9,6%) de plantas desenvolvidas em
relação ao meio sem hormônio (4,5%). Apesar dessa diferença os tratamentos de
germinação não diferiram entre si segundo o teste F.
Para os meios de indução também não houve diferença estatística segundo o
teste F. A freqüência média de desenvolvimento de plantas foi de aproximadamente
5,9% para o meio suplementado com 10 µM de 6-BA e de 8,5% para o meio
suplementado com 10 µM de TDZ.
CV: 321,56
47
Figura 6 - Freqüência média relativa de desenvolvimento de plantas do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada para os diferentes tratamentos de germinação e meios de indução para explantes da região nodal das folhas primárias sem corte das gemas axilares.
Para o desdobramento da variável germinação (com ou sem 5 µM de 6-BA)
dentro de cada nível de meio de indução (10 µM de 6-BA e 10 µM de TDZ), o teste F
foi significativo para a relação das diferentes germinações com o meio de indução
acrescido de 10 µM de TDZ. Sendo assim como se pode observar (TABELA 3) para o
meio de germinação que não recebeu 5µM de 6-BA a freqüência média de plantas
obtidas foi de 1,88% enquanto que para o meio de germinação suplementado com 5µM
de 6-BA a freqüência média de plantas obtidas foi de 9,55% para explantes cultivados
em meio de indução acrescido de 10 µM de TDZ.
A freqüência média de desenvolvimento de plantas observada (TABELA 3) para
o meio de germinação acrescido de 5µM de 6-BA e meio de indução acrescido de 10
µM de 6-BA foi de 9,69%, valor esse muito próximo a freqüência média observada para
o mesmo tratamento de germinação e com 10 µM TDZ no meio de indução.
Tabela 3 – Interação entre o meio de germinação e o meio de indução na freqüência média relativa de desenvolvimento de plantas do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada, para explantes da região nodal das folhas primárias sem corte das gemas axilares.
* Tratamentos seguidos de letras diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.
Meio de indução Meio de Germinação MS + B5 + 10 µM 6-BA MS + B5 + 10 µM TDZ
½MS + B5 7,43a 1,88a ½MS + B5 + 10 µM 6-BA
9,68a
9,55b
48
Pode-se destacar com relação a isso que para explantes tratados com 5 µM 6-BA
na germinação os dois diferentes meios de indução apresentaram praticamente o mesmo
valor de freqüência de desenvolvimento de plantas o que não foi observado para o
tratamento sem 6-BA.
Com base em tais resultados presume-se que a utilização de 10 µM 6-BA ou 10
µM TDZ no meio de indução foi semelhante para a multiplicação de gemas, pois não
houve diferença estatística entre os dois tratamentos.
Apesar do TDZ ter apresentado, nesse caso, mesma eficácia que o 6-BA no
desenvolvimento de plantas a partir de gemas pré-existentes, pode-se observar a
formação e um maior crescimento de calos nos explantes que receberam este tratamento
(FIGURA 7d). Também foi observada uma alta quantidade de nódulos verdes nesses
calos (FIGURA 7a a 7c) após 21 dias de cultivo no mesmo meio. Após 30 dias de
cultivo, observou-se nesses calos regenerações possivelmente provenientes das gemas
axilares multiplicadas nesses explantes (FIGURA 7e e 7f). No meio suplementado com
10 µM 6-BA também foram observados calos com nódulos, mas esses eram em menor
quantidade daqueles cultivados em 10 µM TDZ.
A Figura 8 mostra os calos provenientes de meio suplementado com 10 µM 6-
BA e seus brotos.
Figura 7 – (a, b e c) Explantes de tTCL’s da região nodal das folhas primárias do cultivar de feijão (P. vulgaris L. ) IAC – Alvorada em meio contendo 10 µM de TDZ apresentando grande número de nódulos verdes; (d) calos nesse meio com maior crescimento e (e e f) brotações provenientes de gemas axilares multiplicadas.
49
Figura 8 – Explantes de tTCL’s provenientes da região nodal das folhas primárias do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada em meio contendo 10 µM de 6-BA apresentando calos com nódulos e regenerações.
Não foi verificado efeito de bloco neste experimento, o que indica que a seleção
visual das plântulas que apresentavam diferentes dias de germinação, 14, 15 e 18 para
cada bloco respectivamente, foi uniforme e não interferiu na proliferação de gemas
axilares.
4.2 Proliferação de gemas axilares a partir de ápices meristemáticos de caules de
feijão (P.vulgaris L.) in vitro
Este experimento foi realizado para obter um meio eficiente na proliferação de
gemas axilares a partir de ápices meristemáticos de caules, contínua multiplicação e
alongamento dos brotos obtidos. Como observado (FIGURA 9) o meio contendo 1µM
de 6-BA, 3 µM de GA3 e 10 µM de AgNO3, proposto por CRUZ DE CARVALHO et al.
(2000) propiciou maior número de brotos gerados, sendo essa diferença superior a 50%
do observado no meio contendo somente 3 µM de GA3.
Foi observado que ápices cultivados em meio contendo somente 3 µM de GA3
apresentaram uma média de 3,4 brotos por explante além terem plantas alongadas finas.
Os ápices cultivados em meio com 1µM de 6-BA, 3 µM de GA3 e 10µM de AgNO3
apresentaram uma média de 8,6 brotos por explante e um homogêneo desenvolvimento
de plantas (FIGURA 9). A presença da citocinina 6-BA e do AgNO3 pareceram
importantes nesse caso no processo.
50
Figura 9 – Número médio de formação de brotos provenientes de ápices de plântulas do cultivar de feijão IAC-Alvorada cultivados em dois diferentes meios. * Tratamentos seguidos de letras diferentes diferem entre si pelo teste te Tukey a 5%.
Figura 10 - (a- 4 frascos da esquerda e b) Ápices do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC – Alvorada, cultivados em meio MS + B5 + 3 µM de GA3,1 µM de 6-BA, 10 µM de AgNO3; ( a- 4 frascos da direita e c) ápices do mesmo cultivar cultivados em meio MS + B5 + 3 µM de GA3.
Meio Meio MS +B5 +3µM
GA3, 1µM 6-BA , 10 µM de
AgNO3
Meio MS +B5 +3µM GA3
a
b
CV: 24,02
51
MOHAMED et al. (1992b) observaram que para desenvolvimento das brotações
obtidas utilizando no alongamento de parte aérea um meio secundário acrescido de 2
µM 6-BA e 4 µM GA3 obtiveram um crescimento uniforme de parte aérea, porém não
houve formação de raízes. Com essa combinação de 6-BA e GA3 foi observado um
rápido alongamento em duas semanas, porém os brotos apresentaram área foliar
reduzida e quando permaneceram mais que uma semana nesse meio, as plantas
tornaram-se alongadas, finas e com folhas amareladas. No presente trabalho, essas
características foram observadas para o meio contendo somente GA3.
Para a formação de raiz também houve diferença significativa entre os dois
meios utilizados. As plantas em meio contendo 1µM de 6-BA, 3 µM de GA3 e 10µM de
AgNO3 apresentaram menor percentual de formação de raízes, em torno de 6,3%,
enquanto que plantas cultivadas em meio contendo somente 3 µM de GA3 apresentaram
cerca de 68% de formação de raiz (FIGURA 11).
Após três semanas de cultivo nesses meios essas plantas foram passadas para
meio MS mais as vitaminas do meio B5, livre de hormônios. As plantas que estavam em
meio contendo 1µM de 6-BA, 3 µM de GA3 e 10µM de AgNO3 apresentaram rápido
enraizamento e produção de ramos e folhas. As plantas desenvolvidas em meio
contendo somente 3 µM de GA3 eram finas, sem grande produção de ramos folhas.
Figura 11 – Freqüência média de formação de raízes em brotos provenientes ápices de plântulas do cultivar de feijão IAC-Alvorada cultivados em dois diferentes meios. * Tratamentos seguidos de letras diferentes diferem entre si pelo teste te Tukey a 5%.
A auxina, hormônio fundamental na formação do sistema radicular, é produzida
nos meristemas apicais das plantas. Assim para que uma planta obtida in vitro
a
b
CV: 24,02
52
desenvolva seu sistema radicular de forma a permitir a sua readaptação as condições ex
vitro, é necessário que a parte aérea presente seja suficiente a ponto de suprir as
necessidades de auxina requeridas para a formação de raízes.
4.3 Androgênese
4.3.1 Cultura de anteras de feijão (P. vulgaris L.).
Foi verificado efeito do meio MS acrescido dos hormônios 6-BA ou cinetina e
2,4-D, com as vitaminas do N6, na formação de calos para botões florais e anteras em
todos os tamanhos estudados. Anteras e botões florais colocados em meio de indução
formaram calos (FIGURA 12a) os quais foram transferidos para meio de crescimento de
calos, e em seqüência para o meio de regeneração, porém nenhum calo formado
apresentou regeneração. Verificou-se também que o tecido que estava se multiplicando
nesse caso não era proveniente de micrósporo, mas sim das células do filete e/ou
conetivo, ou seja, um tecido somático (FIGURA 12b). Por esse motivo não se avaliou a
diferença entre os diferentes tratamentos de estádio de desenvolvimento de anteras e
meios de indução. Assim resolveu-se cultivar micrósporos isolados, uma técnica mais
trabalhosa, porém mais vantajosa, pois evitaria a interferência de tecidos somáticos no
processo.
Figura 12 - (a) Calo formado da cultura de antera do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada. (b) Células do filete e/ou conetivo da antera dividindo e dando origem a calo, do mesmo cultivar.
53
4.3.2 Cultura de micrósporos isolados de feijão (P. vulgaris L.)
4.3.2.1 Estudo da relação entre tamanho de botão floral e estádio de
desenvolvimento de micrósporos.
Observou-se inicialmente que tanto o uso do meio CPW-13 como o do corante
carmim acético, no preparo das lâminas de botões florais de feijão, propiciou bom
contraste entre o núcleo e o citoplasma (FIGURA 13a e b).
Figura 13 - Fotomicrografias de micrósporos de Phaseolus vulgaris L. IAC - Alvorada: (a) partir de botão floral com 3,5mm de comprimento e preparado em CPW-13; e (b) botão floral com 5 mm de comprimento e preparado com carmim acético 1,2%. Aumento das fotos: X900.
Estudos efetuados em algumas plantas, como por exemplo, maracujá-amarelo
(Passiflora edulis forma flavicarpa) por SOUZA et al. (2002) e em tomate (Solanum
lycopersicum) por SEGUI-SIMARRO & NUEZ (2005), por exemplo, comprovaram a
existência de uma associação entre o tamanho do botão floral e o estádio de micrósporo
e de grão de pólen. Em Phaseolus vulgaris L., IAC-Alvorada, os estudos realizados
mostraram que há chance de se encontrar micrósporos mononucleados em botões florais
medindo de 2,5 a 4,5 mm de comprimento (TABELA 4), porém se somente estes forem
coletados de inflorescências jovens. Entretanto como a flor de feijão nunca se encontra
isolada, mas sim agrupada na forma de inflorescência tipo racemo axilar, se na mesma
inflorescência houver desde gemas florais até botões na antese e também vagens, as
chances de se obter um botão, embora de pequeno tamanho, e na fase de micrósporo
mononucleado é praticamente nula. Nesse caso tanto os botões pequenos como os
grandes já estão em fase de grãos de pólen, devido provavelmente a uma aparente
sincronia
54
Tabela 4 - Relação entre tamanho dos botões florais e fases da meiose em Phaseolus vulgaris L. IAC – Alvorada.
Tamanho do botão
em mm Fase da meiose
< 1,0 paquíteno a diacinese
1,0 metáfase I; metáfase II; tétrade
1,5 metáfase I ; metáfase II; tétrade
1,8 metáfase II; tétrade
2,0 Tétrade
2,5 Tétrade; micrósporos mononucleados
3,0 micrósporos mononucleados
3,5 micrósporos mononucleados
4,0 micrósporos mononucleados
4,5 micrósporos mononucleados; micrósporos binucleados
5,0 micrósporos mononucleados
6,0 micrósporos mononucleados
7,0 micrósporos mononucleados; micrósporos binucleados
8,0 micrósporos mononucleados; micrósporos binucleados
8,5 micrósporos mononucleados; micrósporos binucleados
Estas informações são fundamentais para o sucesso das pesquisas que envolvem
a técnica e cultura de anteras in vitro, pois um dos pontos de entrave é o estádio da
microgametogênese, isto é, a presença de micrósporos mononucleados que são
fundamentais para o sucesso da androgênese (ZHANG & LESPINASSE, 1992).
Baseado nestas informações optou-se no presente estudo pela utilização de
botões de tamanho entre 2,5 e 3,5 mm coletados a partir de ramos jovens onde o estádio
de desenvolvimento dos botões é uniforme.
4.3.2.2 Efeito de choque térmico sob os micrósporos
O desvio do desenvolvimento gametofítico para esporofítico em cultura de
micrósporos ocorre pela aplicação de vários pré-tratamentos tanto in vivo como in vitro,
que agem como gatilhos para a indução dessas vias esporofíticas (TOURAEV et al.,
1997). Entre esses pré-tratamentos podemos listar choque térmico (calor ou frio),
agentes anti-mitóticos (colchicina), carência de nitrogênio, carência de carboidratos,
55
incubação em solução de manitol e indução hormonal. Neste estudo foi escolhido o
choque de frio (8 ± 1ºC) a zero e seis dias. Foram observados micrósporos grandes
redondos, grades triangulares, grandes inviáveis, pequenos redondos, pequenos
triangulares e pequenos inviáveis.
Como se pode observar (FIGURA 14) micrósporos da testemunha apresentaram
maior freqüência de micrósporos pequenos triangulares sem reestruturação do
citoplasma (FIGURA 16a), considerados não induzidos em relação a seis dias de
choque de frio (8 ± 1ºC). Porém, observa-se também um aumento considerável de 11,8
para 18%, de micrósporos grandes redondos (mononucleados) e com mudanças
estruturais (FIGURA 15), de zero para seis dias de choque térmico, dado importante,
pois estes micrósporos são considerados ideais à indução e induzidos respectivamente,
segundo a literatura ( FIGURA 16b). HÖFER et al. (1999) encontraram micrósporos
com características peculiares, onde após sofrerem choque de falta de suprimentos,
essas células não apresentaram grãos de reserva, mas sim aumentaram de tamanho e
apresentavam muitos vacúolos. Para TOURAEV et al., (1997) micrósporos isolados
após o pré-tratamento intumescem e seus citoplasmas sofrem uma reorganização
estrutural onde o núcleo se move para o centro da célula e linhas citoplasmáticas são
formadas circundando o mesmo, as quais passam através do vacúolo e conectam o
citoplasma perinuclear com o citoplasma subcortical. Micrósporos com essa
conformação também são chamados de ‘tipo estrela’ (SHARIATPANAHI et al., 2006).
Figura 14 – Freqüência de diferentes tipos de micrósporos da testemunha, cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada.
56
Figura 15 – Freqüência de diferentes tipos de micrósporos do cultivar de feijão (P.
vulgaris L.) IAC- Alvorada com seis dias de choque de frio (8 ± 1ºC).
Figura 16 – (a) Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada: os quais não sofreram reestruturação organizacional do citoplasma após choque de frio, (b) e com reestruturação organizacional do citoplasma após o choque de frio (8 ± 1ºC). 4.3.2.3 Experimentos de isolamento e cultivo de micrósporos
A Tabela 5 apresenta um resumo dos experimentos incluindo aqueles na qual
foram observadas mudanças estruturais característica de divisões celulares.
57
Tabela 5 – Experimentos de cultura de micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris
L.), IAC- Alvorada incluindo as suas especificações e indicação os que apresentaram mudança estrutural semelhante a divisão celular.
Experimento 1
Um dia após o isolamento de micrósporos esses se encontravam viáveis e sem
nenhuma contaminação nas placas. A cultura apresentava micrósporos em diferentes
estádios de desenvolvimento, desde micrósporos inviáveis, com aparência de rompidos
(FIGURA 17) até estádios mononucleados. Também foram observados grãos de pólen
que já apresentavam forma triangular com três saliências bem visíveis, possivelmente os
seus poros (FIGURA 18).
Figura 17 – Micrósporo do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada inviável
Experimento Época de colheita das
anteras
Período de choque térmico
Forma de plaqueamanto
Meio utilizado
pra indução
Mudança estrutural
semelhante a divisão celular
1 Outono 0 dia Líquido K8P Sim
2
Outono
9 dias
Gotas de agarose 0,6%
K8P
Sim
3
Outono
6 dias
Gotas de
agarose 0,6%
K8P/K8
Não
4, 5, 6
Outono(4) / Inverno (5 e
6)
10, 6 e 13
dias
Gotas de
agarose 0,6%
K8
Sim (5)
Não (4 e 6)
58
Figura 18 – (a) Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada, na forma de grão de pólen, (b) e em estádio mononucleado.
Após quatro dias de cultura, observando-se as placas com cultura de micrósporos
e verificou-se que na Placa 1 os micrósporos estavam agrupados, formando
visivelmente “grumos”. Na placa 2 os micrósporos estavam dispersos. Assim, foi
adicionado 1 mL de meio K8P 1x em cada placa para suprir as necessidades de
nutrientes e vitaminas.
A constante troca de meio é de extrema importância, visto que nessa etapa uma
grande quantidade de micrósporos vivos, que se encontram na cultura de células,
consome de forma rápida os nutrientes e vitaminas presentes no meio. Diferentes
aditivos de meio como a água de coco fornecem essenciais nutrientes na cultura de
tecidos e parecem ter um efeito positivo na divisão inicial dos micrósporos e
subseqüente formação de embriões (NEUENSCHWANDER & BAUMANN, 1995). O
fornecimento de um meio enriquecido é necessário para que as células sejam capazes de
crescer, mesmo em baixa densidade populacional, pois esse meio irá lhe fornecer
apropriados metabólitos intermediários (KAO & MICHAYLUK, 1975).
Essa troca de meio também é indicada para a redução da pressão osmótica do
meio devendo assim proceder com a troca gradativa por um meio com menor pressão
osmótica. Segundo MATOS (2006) a troca deve ocorrer a cada três ou no máximo
quatro dias, pois caso contrário, tanto os protoplastos quanto as células que já haviam
59
entrado em divisão morreriam. Esse procedimento proporcionou uma eficiência de
plaqueamento alta em experimentos preliminares, quais sejam: de 45,8% para P. edulis,
36,8% para P. alata, e de 24,5 % para P. nítida (PASSOS & BERNACI, 2005). Dessa
forma optou-se neste trabalho por realizar a troca de meio a cada três ou quatro dias.
Um dia após adicionar 1mL de meio nas placas, na placa um foi observado que
os micrósporos estava dispersos e menos agrupados que o dia anterior. Na placa 2
observou-se maior quantidade de micrósporos inviáveis em relação a placa 1.
Com seis e sete dias de cultivo foram verificadas mudanças estruturais nos
micrósporos, em ambas as placas (1 e 2) que podem ser comparadas com divisões
celulares. Nas figuras 19a a 19c estão apresentadas algumas dessas possíveis divisões.
Figura 19 – (a) Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada, em possíveis divisões na placa 1, após seis dias de cultivo, (b e c) placa 2 após sete dias de cultivo.
Nesse caso, os botões florais não sofreram nenhum tipo de pré-tratamento antes
do isolamento dos micrósporos. A forma de indução à divisão foi somente o meio K8P,
que contém a auxina 2,4-D a qual é utilizada justamente para induzir a célula a entrar
em processo de divisão. Após sete dias de cultivo foi verificada contaminação dessas
placas as quais foram descartadas.
Experimento 2
Um dia após o isolamento dos micrósporos, os mesmos estavam viáveis e sem
contaminação. A quantidade de micrósporos rompidos era muito baixa e a cultura
apresentava micrósporos em diferentes estádios de desenvolvimento, desde
mononucleados até grãos de pólen.
60
Aos quatro dias de cultivo as placas de número 1, 3 e 5 foram descartadas devido
a contaminação bacteriana. As placas de número 2 e 4 não apresentavam contaminação
aparente, havendo poucos micrósporos inviáveis e rompidos.
No quinto dia de cultivo a placa 2 também apresentou contaminação, porém foi
mantida para observação dos micrósporos. A placa 4 foi mantida e recebeu troca de
meio nesse mesmo dia; assim foram retirados 3,2 mL de meio K8P e acrescentado 3,2
mL de K8 1x.
Algumas observações foram feitas nessas duas placas, como mudanças
estruturais dos micrósporos, após cinco dias de cultivo. Porém não há como afirmar
certamente se essas mudanças estruturais são ou não as primeiras divisões celulares dos
micrósporos para posterior entrada em rota esporofítica. Como podemos observar
(FIGURA 20), houve uma mudança estrutural nesse micrósporo. A seta indica possível
formação de lamela média, o que é comum nessa fase da cultura, visto que segundo
BONET e OLMEDILLA (2000) os micrósporos primeiramente sofrem divisões
internas, tornando-se multicelulares, para posterior quebra da exina e divisão externa.
Figura 20 – Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada, isolados em meio K8P, solidificado com agarose 0,6%, onde a seta indica uma possível formação de lamela média oriunda de divisão interna do micrósporo.
Experimento 3
Das cinco placas inoculadas somente as placas K8-1, K8 -2 e K8P-1 não
apresentaram contaminação. Dessas, somente uma placa não contaminou (K8-2), Em
experimentos posteriores foi adotado o uso da placa de Petri pequena, pois é mais fácil
de controlar o desenvolvimento dos micrósporos, porém, o índice de contaminação é
maior. Segundo MATOS (2006), a contaminação acontece principalmente devido a alta
61
temperatura verificada no nível das placas incubadas o que provoca a evaporação do
meio de cultura e condensação na tampa da placa, o qual escorre pelas laterais para fora,
propiciando assim o desenvolvimento de fungos e bactérias. Dessa forma, o uso de
placas médias evita a contaminação, pois a quantidade de meio por volume de placa é
menor que na placa pequena, o que acaba contribuindo para evitar a contaminação.
Em todos os tratamentos não foram observadas mudanças estruturais nos
micrósporos que indicam divisão celular. Nas placas K8-1 e K8-2, foram observadas
mudanças estruturais que podem indicar uma ruptura e liberação do citoplasma,
provavelmente causada pela maceração das anteras (FIGURA 21a e b).
Figura 21 - Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada, inviáveis, em meio K8 1x.
Nas culturas de micrósporos em meio K8P foram observados micrósporos
induzidos “tipo estrela” (SHARIATPANAHI et al., 2006), que segundo TOURAEV et
al., (1997) após o pré-tratamento intumescem e seus citoplasmas sofrem uma
reorganização estrutural. Nesta estrutura o núcleo se move para o centro da célula e
linhas citoplasmáticas são formadas circundando o mesmo, as quais passam através do
vacúolo e conectam o citoplasma perinuclear com o citoplasma subcortical (FIGURA
22). Nesse caso o pré-tratamento foi de choque de frio (8 ± 2ºC) por nove dias.
62
Figura 22 – Micrósporo do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada, “tipo estrela” em meio K8P 1x.
Experimento 4
Das 14 placas inoculadas somente as placas 2, 4 e 5 contaminaram. Nas placas 2
e 5 não foram observadas mudanças estruturais nos seus micrósporos que fossem
comparadas a divisões celulares, mas sim mudanças que caracterizam ruptura de
micrósporo, provavelmente ocasionada pela maceração dos mesmos, como observado
no experimento anterior (FIGURA 21a e b).
Na placa 4 também com aproximadamente seis dias de cultivo foram observadas
mudanças estruturais. Como observado (FIGURA 23) o micrósporo aparentemente pode
ter aumentado de tamanho e formado muitos vacúolos, o que também foi observado por
HÖFER et al. (1999) ou ainda pode ter sofrido entrada de água na célula e alterando sua
forma. O uso do meio K8, utilizado nesse experimento, na qual apresenta uma menor
pressão osmótica em relação ao meio K8P, pode ter favorecido a entrada de água no
micrósporo, buscando dessa forma equilibrar a pressão dentro e fora da célula. Somente
com as observações a nível estrutural não se pode afirmar se ocorreu indução para
entrada em divisão o micrósporo, ou entrada de água na célula devido ao uso do meio
K8. Para se afirmar com certeza que se tratava de divisões internas seria necessário o
uso de técnicas complementares que vêem a confirmar esse processo, como por
exemplo, calcofluor ou ainda esperar cerca de 30 dias de cultivo, como observado por
MATOS (2006) na cultura de protoplastos de maracujá, a formação de microcalos
provenientes dos protoplastos em divisão.
63
Figura 23 – Micrósporos do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada, cultivado em meio K8 1x e gotas de agarose, após seis dias de cultivo apresentando mudanças estruturais que podem indicar múltiplos vacúolos na célula ou entrada de água na célula.
Após esses seis dias não foi verificada evolução nessa mudança de estrutura que
levasse ao rompimento de exina e entrada do micrósporo na rota esporofítica.
Se os micrósporos iniciaram uma divisão celular e não deram continuidade ao
processo entrando em embriogênese somática ou formação de calos, pode estar
associado ao excesso de 2,4 –D no meio de cultivo. Esse hormônio tem o papel de
induzir as células a entrarem em divisão, ou seja, é necessário apenas como fator inicial,
não sendo necessário seu uso ao longo do cultivo para não prejudicarem o processo. A
alta dose de 2,4- D, assim como outros fatores estressantes aplicados na célula induzem
a produção de proteínas que segundo KIVIHARJU & PEHU, 1998 seriam responsáveis
pela reprogramação da célula e pela proteção à condição estressante.
Segundo MATOS (2006) em cultura de protoplastos de maracujá foi observada a
formação de bolhas ao redor dos mesmos (budding), que segundo essa autora podem ter
sido ocasionadas pelo excesso da exposição dos protoplastos ao 2,4-D, considerada uma
auxina que pode ser tóxica. Assim com a retirada dessa auxina do segundo meio de
cultura foi verificada redução na formação de budding.
A partir desses resultados foram realizados cultivos em K8 1x modificado sem
2,4 –D, buscando reduzir a concentração desse hormônio ao meio gradativamente. Após
64
dez dias as placas foram descartadas com contaminação bacteriana o que não permitiu
acompanhar o desenvolvimento desses micrósporos.
Experimento 5
O experimento cinco foi dividido em dois tratamentos de troca de meio, onde o
meio fresco a ser adicionado à cultura foi misturado de duas formas: T1, (placas 1 e 3)
que constou de diluição gradativa de meio K8 1x normal com K8 1xsem 2,4-D e o T2
(placas 2 e 4) que constou de diluição gradativa entre os meios K8 1x normal e K8 1x
sem hormônio.
Após dois dias de cultivo a placa 4 apresentou um micrósporo com mudanças
estruturais características de um micrósporo multicelular com quatro divisões bem
distintas apontadas pelas setas (FIGURA 24). Essa mudança estrutural possivelmente
está mais associadas ao período de choque térmico de seis dias (8 ± 1ºC), do que ao
meio de cultivo. Esse micrósporo podem ter sofrido indução durante o período de
choque e com a presença de meio rico em nutrientes e vitaminas ter dado continuidade
rapidamente ao processo de uma possível divisão celular.
Figura 24 - Micrósporo do cultivar de feijão (P. vulgaris L.) IAC- Alvorada, cultivado em meio K8 1x e gotas de agarose (placa 4), após dois dias de cultivo com mudança estrutural semelhante a um micrósporo multicelular.
Ao longo de 12 dias de cultivo a placas 2, que recebeu na troca de meio a
mistura de K8 normal com K8 sem hormônio não apresentaram mudanças estruturais
65
características de divisão celular. Da mesma forma aconteceu com as placas 1 e 3 que
receberam na troca de meio a mistura de K8 normal com K8 sem 2,4-D. Em ambas as
placas foram somente observadas mudanças estruturais desuniformes que caracterizam
micrósporos inviáveis possivelmente pela maceração das anteras como já descrito e
mostrado anteriormente.
Experimento 6
Assim como no experimento cinco este experimento foi dividido em dois
tratamentos de troca de meio, onde o meio fresco a ser adicionado à cultura foi
misturado de duas formas: T1 (placas 1, 3 e 5) que constou de diluição gradativa de
meio K8 normal com K8 sem 2,4-D e o T2 (placas 2, 4 e 6) que constou de diluição
gradativa entre os meios K8 normal e K8 sem hormônio.
No dia do isolamento dos micrósporos foram observadas mudanças estruturais
em todas as placas características de micrósporos inviáveis. Provavelmente devido ao
processo de maceração das anteras como já mencionado acima em outros experimentos.
Após seis dias de cultivo foram observadas ainda, esses mesmos danos nos
micrósporos e não houve observação de mudanças estruturais que caracterizem divisão
celular.
4.2.2.4 Considerações gerais sobre os experimentos de cultivos de micrósporos
isolados
Como se pode observar nos experimentos 1, 2, e 5 foram verificadas mudanças
na estruturais nos micrósporos que se assemelham a divisão celular (FIGURAS 19, 20 e
24). Não se pode afirmar qual desses meios foi melhor nesse processo uma vez que os
fatores que o influenciaram não foram os mesmos para todos os experimentos, como por
exemplo, o número de dias de choque térmico de frio, a época de colheita dos
micrósporos e o estádio de desenvolvimento das plantas.
Nos demais experimentos 3, 4 e 6 não é correto afirmar que não ocorreram
nessas células mudanças bioquímicas e estruturais que estejam ligadas às alterações que
levam a passagem da rota gametofítica para esporofítica, porém não foram observadas
mudanças estruturais que pudessem caracterizar uma divisão celular. Como citado por
BARNABÁS et al. (1988) estudando a técnica em trigo, micrósporos capazes de se
adaptar ao estresse ambiental das condições in vitro e sobrevivem nos primeiros três
66
dias de cultivo são também capazes de seguir um caminho de desenvolvimento
esporofítico.
Para estudos futuros, onde é interessante se conhecer qual tratamento de choque
de frio ou meio mais eficiente na divisão de micrósporos, seria interessante estudar
conjuntamente esses diferentes fatores a fim de poder realizar comparações entre eles.
No presente trabalho foram feitas somente observações ao nível de morfologia
dos micrósporos e não ao nível bioquímico, o que poderia ter facilitado, por exemplo, a
identificação de proteínas envolvidas no processo de divisão celular. Uma técnica que
pode ser utilizada neste trabalho é a do calcofluor para a detecção de formação de
parede celular. Assim, trabalhos futuros, buscando repetir os presentes experimentos
deverão ser realizados e posteriormente incluir técnicas que permitam afirmar
precisamente os processos que ali estarão ocorrendo.
4.4 Considerações Finais
4.4.1. Organogênese in vitro em feijão
A idéia inicial do presente trabalho foi de otimizar o método proposto por CRUZ
DE CARVALHO (2000), adaptando alguns parâmetros conforme necessário. No
decorrer do trabalho, o insucesso obtido durante a realização dos experimentos levou a
uma análise detalhada deste método. Nessa etapa verificaram-se alguns detalhes que
provavelmente foram pontos críticos para não se conseguir reproduzir a técnica. Para a
região do explante em experimentos preliminares foi utilizada a região nodal entre os
cotilédones e primeiro par de folhas.
Epicótilos de plantas germinadas por 14 dias são alongados (cerca de 10 cm) e
provavelmente apresentam balanço hormonal diferente ao longo do seu comprimento, o
qual é um ponto importante a considerar na regeneração de plantas, o estádio fisiológico
do explante. CRUZ DE CARVALHO et al. (2000) mencionam a região utilizada como
epicótilo, porém alisando a figura, no artigo científico, que demonstra a região usada,
verificou-se tratar especificamente da região nodal das folhas primárias.
Ao utilizar essa região em experimentos do presente estudo, a partir de plântulas
germinadas por sete dias na presença de luz, uma alta freqüência de regeneração (em
torno de 51%) foi obtida. Apesar de ter sido realizado o corte das gemas axilares
visíveis do explante, trata-se de uma região com muitas gemas dormentes o que de
alguma forma pode ter favorecido tal experimento. Com base nisso, não se pode afirmar
67
que os resultados desse experimento são regeneração via organogênese direta ou
multiplicação de plantas proliferação gemas axilares.
Outro problema observado em nossos experimentos foi a rápida oxidação dos
explantes, onde em apenas um dia de cultivo, já apresentavam escurecimento. Como
citado anteriormente, o feijão naturalmente apresenta grande quantidade de polifenóis e
isso favorece a rápida oxidação dos explantes. Mesmo utilizando alguns antioxidantes
não foi verificada resposta positiva. Foi verificado que independente da presença de
antioxidantes, explantes foram capazes de regenerar e nesses explantes a oxidação não
aconteceu rapidamente. A presença de células competentes no explante pode estar
relacionada a esse processo. Conforme observado, explantes que apresentavam células
competentes e regeneraram não oxidaram rapidamente como aqueles que não
apresentaram essa característica e que oxidaram em até um dia de cultivo.
Com base nessas informações, para experimentos futuros, verifica-se a
necessidade de um estudo detalhado de tempo de germinação e tamanho de plântulas
ideais à regeneração in vitro. Essa informação será importante uma vez que definido o
estádio de desenvolvimento que propicie explantes com células competentes, facilita o
estudo de outros fatores que podem melhorar a regeneração in vitro de feijão.
Para que as técnicas biotecnológicas estudadas nesse trabalho, sejam empregadas
com êxito ao programa de melhoramento de feijão do IAC, é necessário que haja
prosseguimento nessa linha de pesquisa, a partir desses primeiros resultados obtidos.
Um protocolo otimizado de regeneração in vitro será necessário para que outras técnicas
como, fusão de protoplastos, transformação genética e androgênese possam ser
aplicadas como ferramenta ao programa de melhoramento de feijão do IAC.
4.4.2 Androgênese em feijão
Os resultados obtidos com este trabalho inicial de cultivo de micrósporos
isolados foram de grande validade, uma vez que não há na literatura trabalhos deste
porte na cultura do feijão.
Estudos básicos como conhecimento da relação de tamanho de botão floral e de
desenvolvimento de micrósporos, assim como do fator de indução que altera a estrutura
morfológica do micrósporo são fundamentais para pesquisas em uma nova espécie.
Para se obter sucesso na técnica de cultivo de micrósporos dentro do programa
de melhoramento genético de feijão do IAC precisa haver persistência e dedicação, uma
vez que o estudo dessa técnica abre uma nova linha de pesquisa no grupo.
68
Estudos mais avançados juntamente com a técnica de cultura de micrósporos
vêm sendo aplicados em diferentes culturas como, por exemplo, o trigo por diferentes
grupos de pesquisa no mundo e são trabalhos que já vêem em andamento a mais de 15
anos. Assim, é importante salientar que, tratando-se de um trabalho precursor da técnica
dentro do programa de melhoramento de feijão do IAC, muitas barreiras ainda deverão
ser transpostas para se conseguir novas descobertas e se atingir o objetivo de poder
utilizar a androgênese como ferramenta do de melhoramento de feijão.
5 CONCLUSÕES
5.1 Organogênese in vitro em feijão
a) A região nodal das folhas primárias apresentaram células competentes à regeneração
in vitro;
b) O ácido ascórbico foi mais eficiente no controle da oxidação nas concentrações de
0,14 µM e 0,3 µM para explanes da região nodal das folhas primárias;
c) O meio de germinação contendo 5 µM de 6-BA foi mais eficiente no proliferação de
gemas em meio de indução acrescido com 10 µM de TDZ e
d) O meio de proliferação de gemas contendo 1 µM de 6-BA, 3 µM de GA3 e 10 µM
AgNO3 propiciou maior número de brotos (8,3) por ápice meristemático de caule
em relação ao meio contendo somente 3 µM de GA3 (3,4).
5.2 Androgênese em feijão
a) A cultura de anteras não foi eficiente, no presente estudo, para estudos de
androgênese em feijão, uma vez que foi verificada interferência de tecidos
somáticos;
b) Botões florais de tamanho entre 2,5 e 4,5 mm apresentam micrósporos
mononucleados;
c) O período de seis dias de choque térmico de frio a (8 ± 2ºC) propiciou aumento de
6,2% de micrósporos induzidos em relação a testemunha.
69
d) A cultura de micrósporos isolados na forma líquida e gotas de agarose (0,6%) em
meio K8-P e em meio K8 na forma de gotas de agarose (0,6%) proporcionaram
modificações estruturais nos micrósporos que se assemelharam a divisões celulares.
6 REFERÊNCIAS
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