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CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIOTICOS
“Efecto de algunos agentes químicos permeabilizantes (AQP’s) sobre la liberación de betacianinas producidas por cultivos en suspensión de betabel (Beta vulgaris L. var. Crosby Egyptian)”
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN
DESARROLLO DE PRODUCTOS BIOTICOS
P R E S E N T A :
BIOL. GUADALUPE SALCEDO MORALES.
YAUTEPEC, MORELOS MARZO DEL 2004
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
El presente trabajo fue realizado bajo la dirección del Dr. Antonio Ruperto
Jiménez Aparicio en el Departamento de Biotecnología del Centro de Desarrollo
de Productos Bióticos del IPN. Se contó con el financiamiento de la Coordinación
General de Posgrado e Investigación del Instituto Politécnico Nacional a través del
Proyecto 20030340 “ Utilización de agentes químicos permeabilizadores (AQP’s)
como estrategia para promover la liberación de colorantes naturales producidos
por cultivo de células vegetales” y del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACyT) mediante el proyecto 39562 “Estudio por análisis de imágenes y
fractales de la mecanoquímica de la pared celular de cultivos en suspensión
sometidos a permeabilización con agentes químicos”.
AGRADECIMIENTOS
A mi director de tesis el Dr. Antonio Jiménez Aparicio por el apoyo y dirección de este trabajo y por la confianza que siempre me ha brindado. Al jurado y comité revisor de tesis (Dr. Miguel A. Velázquez del Valle, Dr. Enrique Galindo Fentanes, Dr. Mario Rodríguez Monroy, Dra. Martha Lucia Arenas Ocampo, M. en C. Gabriela Tejo Tapia y Dr. Antonio Jiménez Aparicio) por su apoyo y consejos para el desarrollo de este trabajo. Agradezco al Dr. Enrique Galindo Fentanes por sus atinados consejos y el tiempo dedicado para mejorar este trabajo de tesis. Mis mejores agradecimientos a la M. en C. Gabriela Trejo Tapia por su apoyo siempre incondicional y la disposición que siempre tuvo para escucharme y asesorarme. A mis compañeros de trabajo (Blanca, Toñita, Sandra, Gloria, José Luis, Minerva, Lety Bravo, Sarita y Faustina) les agradezco su apoyo y amistad. A mis compañeras de maestría: Emigdia, Luz, Blanca Elisa por los momentos vividos durante el desarrollo de nuestros estudios.
DEDICATORIAS
A mis padres “Agustina y Amalio” por el gran amor, apoyo y comprensión que desde pequeña me han brindado y por ser un gran ejemplo de fortaleza y
honestidad.
A mis queridos hijos: “Misael y Andrea” por ser uno de los motivos mas importantes en mi vida y por que gracias a ellos he aprendido que lo mas
importante es la vida y la salud que Dios nos ha dado.
A mi esposo y compañero Fernando que siempre me apoya y me escucha ¡gracias por tu amor, comprensión y por compartir muchos momentos conmigo!
A mis hermanos: Chuy, Virgilio (qed) que desde donde quiera que estés, sé que me seguirás apoyando, Mercedes, Angel, Fidel, Guille, Goyo y Adolfo que
nunca se olvidan de mi. ¡mil gracias por su cariño y amistad! A mis cuñadas y cuñados (Tony, Rosa, Chuy, José, Adrián y Julio) por que en
algún momento me han escuchado y aconsejado. ¡Gracias por su amistad y comprensión!.
A todos mis sobrinos: César, Uriel, Adriana, Israel, Erick, Yosahandi, Omar, Toñito, Ariel, Oliver, Kendy, Angel, Diana y a la pequeña Ximena ¡Gracias por
su cariño y por ser mis sobrinos!
En especial a mi “hija” Itzel que siempre me ha brindado su amor, amistad y confianza... “GRACIAS” .
INDICE 1 2 2.1 2.2 2.3 2.7
INDICE DE CUADROS INDICE DE FIGURAS SIMBOLOGIA RESUMEN ABSTRACT
INTRODUCCION ANTECEDENTES
Aspectos biológicos y fisicoquímicos de la producción por cultivo de
células vegetales
Permeabilización celular
Los detergentes como agentes químicos permeabilizantes
Permeabilización de células vegetales para la obtención de
betalaínas
Páginas
i
ii
iii
vii
ix
1
3
6
9
13
3 JUSTIFICACION 18
4 5 5.1. 5.2. 6
HIPOTESIS OBJETIVOS Objetivo general Objetivos Particulares MATERIALES Y METODOS
18
19
19
19
6.1 6.1.1 6.1.2. 6.1.3. 6.1.4. 6.1.5. 6.2.
Materiales
Línea celular
Medio de cultivo
Condiciones de cultivo
Material y equipo de laboratorio
Sustancias químicas
Métodos
20
20
20
20
21
21
21
i
6.2.1. 6.2.2. 6.2.3 6.2.4 6.3
Preparación del medio de cultivo
Extracción de las betalaínas de los cultivos celulares
Cuantificación espectrofotométrica de las betacianinas
Observaciones al microscopio
Desarrollo metodológico
21
22
22
23
23
6.3.1 Estrategia general 23
6.3.2 6.3.3. 6.3.4 7. 7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 8. 9. 10.
Pruebas preliminares para la selección del agente químico
permeabilizante (AQP) en sistema estático (tubos de ensaye)
Pruebas de liberación de betacianinas para la selección de la
concentración del AQP (en un sistema agitado)
Recrecimiento de los cultivos en medio líquido (matraces)
RESULTADOS Y DISCUSION Selección del AQP
Selección de la concentración del Tritón X-100 y tiempo de contacto
en un sistema agitado.
Ensayos de de recrecimiento en matraces agitados
Consideraciones finales
CONCLUSIONES PERSPECTIVAS DEL TRABAJO BIBLIOGRAFIA
25
25
26
28
34
41
48
54
55
56
ii
INDICE DE CUADROS 1
Características de algunos detergentes no iónicos
Páginas
12
2 Estrategias utilizadas para promover la liberación de betalaínas en
cultivos celulares de B. vulgaris
14
iii
INDICE DE FIGURAS 1
Mecanismo propuesto para la síntesis y almacenamiento de
betalaínas en el interior de la células.
Páginas
4
2 Representación esquemática de la interacción de los detergentes con
las membranas celulares.
11
3 Estructura química del detergente “Tritón X-100” . 13
4 Estructura química del detergente “Tween’s” . 13
5 Estrategia general de trabajo. 24
6 Ensayos preliminares para la selección del agente químico
permeabilizante.
26
7 Liberación de betacianinas de cultivos celulares de Beta vulgaris
sometidas al proceso de permeabilización utilizando cuatro
detergentes a una concentración de 0.9 mM durante 24 h de contacto
28
8 Fotomicrografias (campo claro) de células de B. vulgaris sometidas a
permeabilización con Tritón X-100 a una concentración de 0.9 mM
durante 24 h.
31
9 Fotomicrografias (campo claro) de agregados celulares de B. vulgaris
sometidos a permeabilización con Tween 40, a una concentración
de 0.9 mM durante 24 h.
32
10 Efecto de la concentración de Tritón X-100 en la permeabilización
de cultivos celulares de B. vulgaris a un tiempo de contacto de 50
min.
35
11 Fotomicrografias de células de B. vulgaris permeabilizadas con tres
concentraciones de Tritón X-100.
37
12 Fotomicrografias de células de B. vulgaris permeabilizadas con 0.7
mM de Tritón X-100 a dos tiempos de contacto: (A) 10 min y (B) 15
min.
41
iv
13 Cinéticas de (A) crecimiento celular y (B) producción de betacianinas
de células de B. vulgaris L. permeabilizadas con Tritón X-100 a una
concentración de 0.7 mM y 2 tiempos de contacto.
42
14 Proceso de permeabilización con Tritón X-100 comparado con el
proceso por lotes para la producción de betacianinas por cultivo de
células de B. vulgaris en suspensión.
50
v
SIMBOLOGIA
Abs = Absorbancia
AQP´s = Agentes químicos permeabilizantes.
( B)f = Biomasa final.
[BC]f = Betacianinas finales.
[BC]e = Betacianinas excretadas.
[BC]s = Betacianinas sintetizadas.
CCM = Concentración crítica micelar.
d = Días.
DNI = detergente no iónico.
FDA =Diacetato de flurosceína.
FRP = Fenotipo rojo púrpura.
g = Gramos.
g/l = Gramos /litro.
gpf/l = Gramos de peso fresco/litro.
h = Hora.
kV = Kilo Volts.
mA = Miliampers.
min = Minutos
mg/l = Miligramos/litro.
mgBC/l = Miligramos de Betacianinas /litro.
ms = Milisegundos.
mHz = MegaHertz.
mM = Milimoles.
nM = Nanomoles.
ns = Nanosegundos.
s = Segundos.
td = Tiempo de duplicación celular.
µ = Velocidad específica de crecimiento .
vi
Resumen.
El cultivo de células vegetales es una opción interesante para producir metabolitos
secundarios, tales como las betalainas, pigmentos naturales ampliamente
utilizados en alimentos, así como en fármacos y en algunos cosméticos. No
obstante, al igual que otros metabolitos secundarios, las betalainas son productos
intracelulares que se almacenan en las vacuolas de las células vegetales. Esta
característica hace necesario el rompimiento celular para lograr la liberación de las
betalaínas. Recientemente, el uso de agentes químicos para la permeabilización
de la membrana celular, es una técnica que permite la recuperación de productos
almacenados intracelularmente, con un mínimo de daño en la viabilidad celular.
Los detergentes no-iónicos (DNI) se utilizan comúnmente para modificar la
estructura de algunas membranas, así como para recuperar proteínas y otros
productos intracelulares. El objetivo de este trabajo fue el determinar el efecto de
diferentes DNI en la recuperación de las betalainas producidas por cultivos en
suspensión de betabel (Beta vulgaris L.). La estrategia general consistió en probar
diferentes DNI como son Tween’s-® (20, 40 y 80) y el Triton X-100-® para lograr la
excreción de las betalainas almacenadas. A continuación se planteó establecer la
concentración y el tiempo de contacto con las células utilizando el DNI
seleccionado. Se tomaron imágenes fotomicrográficas para establecer la
concentración y el tiempo de contacto, así como para evaluar el posible daño
celular provocado por el DNI. Asimismo, se hicieron pruebas de recrecimiento,
para comparar el cultivo sometido a permeabilización con un cultivo control. Se
determinó tanto el crecimiento celular como la producción de betalainas. De los
perfiles cinéticos se evaluaron las velocidades específicas de crecimiento y de
producción de betalainas. Los principales resultados mostraron que el Triton X-
100-® permitió la permeabilización celular, mientras que los Tween’s-® solo
promovieron una baja recuperación de betalainas. Las imágenes mostraron que
con una concentración de 0.009 mM del Triton X-100-® no se producía liberación
de betalainas, mientras que con una concentración 0.9 mM se observaba la
liberación total del pigmento del interior de las células. De aquí que se haya
vii
seleccionado la concentración de 0.070 mM y un tiempo de contacto de 10
minutos. En las pruebas de recrecimiento, el comportamiento cinético del cultivo
control presentó una fase de crecimiento logarítmico con una µ = 0.147 d-1 entre
los días 4 y 7, seguido de un período característico de desaceleración hasta el
final de la cinética. Por otra parte, las células permeabilizadas presentaron dos
fases de crecimiento: una lenta desde el día 0 hasta el 11 con una µ= 0.061 d-1
seguida de un segundo período de mayor velocidad, con una µ = 0.121 d-1 desde
el día 11 hasta el día 18. Este periodo mostró niveles de crecimiento celular
similares al cultivo control. Este comportamiento podría ser resultado de un
proceso de reparación celular después del posible daño causado por el Triton X-
100-®. El proceso global de permeabilización permitió un incremento del 36 % en
el total de las betalainas recuperadas dado que fue posible, cuando menos una
vez, el recrecimiento celular. Se concluye que la permeabilización de los cultivos
en suspensión de betabel (Beta vulgaris L.) con el Triton X-100-® no dañó
severamente las células y se incrementó el período productivo del cultivo. Sin
embargo, es necesario realizar mayores estudios con el objeto de entender los
diferentes mecanismos involucrados en los procesos de permeabilización celular.
viii
Abstract Plant cell culture is an interesting option to produce secondary metabolites, such
as betalains, natural pigments widely used in foods and even in some drugs and
cosmetics. Nevertheless, as other secondary metabolites, betalains are
intracellular products stored in the vacuoles of the plant cells. This characteristic
makes necessary the cell breakage to release the intracellular metabolites.
Recently, the use of chemical agents to permeabilized the cell membrane is an
alternative which allows the recovery of the intracellular stored products with a
minimal lost of cell viability (integrity). The non-ionic detergents (NID) are
commonly used to modify the structure of certain membranes as well as to recover
proteins and others intracellular products. The aim of this work was to determine
the effect of different NID in the release of betalains produced by red-beet (Beta
vulgaris L.) suspension cultures. The general strategy included treatments with
Tween’s-® (20, 40 and 80) and Triton X-100-® NID to promote the excretion of
stored betalains. After that, an experiment was performed to select the
concentration and contact time with the cells, using the selected NID. Microscopic
images of the permeabilized cells were al so taken to select the best concentration
and contact time of the NID as well as to determine the possible cellular damage.
Also, re-growth treatments were performed, to compare the permeabilized cells
with a non-permeabilized control culture. The following parameters were
determined: cell growth and betalain production. From the kinetic profiles, the
specific velocity of cell growth as well as the specific velocity of pigment production
were evaluated. The main results showed that only Triton X-100-® allowed the cell
permeabilization while Tween’s-® promoted a low release of betalains. The during
15 minutes was not sufficient to allow the permeabilization; in contrast, a serious
cellular damage was observed when a concentration of 0.9 mM as used. From
these results, a concentration of 0.07 mM of Triton X-100-® and contact time of 10
minutes were proposed. Using these conditions, the kinetic behavior of the control
culture showed an exponential cellular growth phase with a µ = 0.147 d-1 between
day 4 th and 7 th, followed by a characteristic period of desacceleration towards
the end of the culture. At the other hand, the permeabilized cells exhibited two
ix
x
different cellular growth periods: a slow one from day 0 to day 11 th with a µ=
0.061 d-1, followed by second, faster period with a µ = 0.121 d-1 from day 11 th to
day 18 th. This last period reached similar levels of cellular growth than the control
culture. This behavior could be the result of the cellular reparation process after the
possible damage caused by the Triton X-100-®. The overall permeabilization
process allowed an increase of 36 % in the betalain production with respect to the
control culture. This was possible because the re-growth of the permeabilized cells,
at least twice. We conclude that the permeabilization of red-beet (Beta vulgaris L.)
suspension cultures with Triton X-100-® did not injure drastically the cells and
increased the productive period of the culture. Nevertheless, more studies must be
carried out to understand the different biochemical mechanisms involved in the
cellular permeabilization process.
1. INTRODUCCION.
El cultivo de células vegetales es un conjunto de herramientas con la que
se pueden producir metabolitos secundarios de importancia comercial como
fármacos, fungicidas, fragancias, saborizantes y colorantes (Stafford, 1991;
Havkinfrebkel y col, 1997). Un ejemplo de ello son las betalaínas, pigmentos
nitrogenados que comprenden a las betaxantinas que proporcionan una coloración
amarilla y a las betacianinas que dan color rojo a las plantas. Estos compuestos
tienen un limitada distribución biológica en plantas del orden de las Caryophilalles
y ciertos hongos de los géneros Amanita, Hygrophoruse higrocybe (Strack y col,
1993).
Las betalaínas son compuestos importantes en la industria de los
alimentos, donde son usados como colorantes naturales solubles en agua para
impartir color en productos procesados tales como bebidas carbonatadas, lácteos,
cárnicos y confites. Por otro lado, la industria farmacéutica los utiliza en la
manufactura de tabletas, grageas y bases para jarabes (Delgado Vargas y col,
2000).
En general, son escasos los procesos desarrollados a nivel biorreactor
para la producción de metabolitos secundarios por cultivo de células (Rodríguez y
Galindo, 1999). El crecimiento lento de las células vegetales in vitro y las bajas
concentraciones en que estos metabolitos se sintetizan, son factores limitantes
1
para la utilización de esta tecnología en la producción de colorantes de interés a
nivel comercial. Un factor negativo adicional lo constituye el almacenamiento
intracelular de estas sustancias, lo cual es frecuente en el metabolismo de las
células vegetales. Este factor parece ser el impedimento más importante para
hacer más eficientes los procesos de producción (Zhang y col, 2002).
Como consecuencia de esta problemática, en la bibliografía disponible se
han planteado, estrategias dirigidas principalmente a mejorar los procesos de
biosíntesis y de producción. Algunos ejemplos de éstas son las siguientes: el
manejo de los nutrimentos en el medio de cultivo (Trejo y col, 1999), la selección
de líneas altamente productoras (Dicosmo y Misawa, 1995) y la utilización
exógena de reguladores de crecimiento (Dicosmo y Misawa, 1995). De igual
manera es posible que los sistemas de producción se logren hacer más eficientes
con el desarrollo de diversas tecnologías, como por ejemplo la inmovilización de
células en soportes inertes (Knorr y Berlin, 1987; Dicosmo y Misawa, 1995) y la
extracción de metabolitos mediante sistemas de dos fases (Jiménez y col., 1995).
Merecen un especial señalamiento los estudios encaminados a establecer y
optimar las condiciones de cultivo y producción en biorreactores (Rodríguez y
Galindo, 1999).
Una estrategia adicional poco estudiada, pero que puede representar un
enfoque diferente a los planteados en líneas anteriores, se refiere a la liberación
de los productos celulares almacenados, utilizando procedimientos fisicoquímicos
2
que incluyen la electroporación, sonicación y la permeabilización de las
membranas celulares con agentes químicos, entre otros (Brodelius y Pedersen,
1988).
Con base en lo antes mencionado, en este trabajo se presentan los
resultados correspondientes al proceso de permeabilización de cultivos celulares
de B. vulgaris L., utilizando para ello diferentes agentes químicos permeabilizantes
(AQP’s), particularmente detergentes no iónicos, con el objeto de promover la
liberación de betacianinas.
2. ANTECEDENTES.
2.1. ASPECTOS BIOLÓGICOS Y FISICOQUÍMICOS DE LA PRODUCCIÓN DE
BETALAÍNAS POR CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES.
En la biosíntesis de metabolitos secundarios, como lo son las betalainas,
ocurren una serie de procesos biológicos y fisicoquímicos muy complejos y que
tienen que ver con aspectos bioquímicos, fisiológicos y de fenómenos de
transporte que dan como resultado diferentes niveles de diferenciación celular, la
compartamentalización, translocación, almacenamiento e incluso, procesos de
redireccionamiento del flujo metabólico (Verpoorte y col., 2002; Zhang y col., 2002;
Strack y col., 2003). De manera general, en las células vegetales cultivadas in
vitro, frecuentemente los metabolitos secundarios son sintetizados en el
citoplasma o en algún organelo específico; sin embargo, otra posibilidad es que
los precursores estén ubicados en el citoplasma y sean trasladados hacia algún
3
organelo en particular para que se lleve a cabo la síntesis del metabolito (Zhang y
col, 2002). Parece ser que tal es el caso de las betalaínas de B. vulgaris,
pigmentos constituidos por las betaxantinas (color amarillo) y las betacianinas
(color rojo).
La figura 1 muestra, de manera esquemática, el mecanismo probable de
síntesis y acumulación de las betalaínas. Al respecto, Schliemann y col. (1999),
sugieren que la biosíntesis de las betaxantinas involucra el transporte del ácido
betalámico (precursor de la vía biosintética) del citosol hacia el interior de la
vacuola, en donde bajo condiciones ácidas y a través de reacciones que aún son
desconocidas, se condense con diferentes aminoácidos o aminas para dar lugar a
los pigmentos amarillos (Stintzing y Schieber, 2001).
Medio extracelular: pH 4.5-6
MEMBRANA PLASMATICA +
CITOSOL (pH 7-7.5)
+ (S) CicloDOPA
Betanidina
Betanidina
(S)-Acido betalámico
VACUOLA pH 3-6 Betanina
H+ +Aminoácidos
y aminas Betaxantinas
H+ (S)-Acido Betalámico
4
Figura 1. Mecanismo propuesto para la síntesis y almacenamiento de betalaínas en el interior de la célula. (Adaptado de: Schliemann y col, 1999; Stintzing y Schieber, 2001 y
Strack y col, 2003).
Por otro lado, la síntesis de la betanidina (pigmento mayoritario del grupo de
las betacianinas) se realiza en el citoplasma, donde el pH es de 7 – 7.5 (Strack y
col., 2003). Por su naturaleza fuertemente hidrofílica es transportada a la vacuola,
(pH 3 – 6), donde se ionizan de manera parcial, lo que impide que puedan difundir
fuera de la vacuola, permitiendo, por lo tanto, su acumulación y almacenamiento
(Mukundan, 1998; Stintzing y Schieber, 2001). Al ser una molécula protonada, la
betanidina puede interactuar con otras moléculas contenidas en la vacuola, como
por ejemplo con la glucosa y a través de reacciones de glicosilación (con
glicosiltransferasas), formar otras betacianinas, en este caso la betanina.
Los mecanismos de translocación y compartamentalización al sitio de
almacenamiento (vacuola) involucran también los procesos inversos, es decir, la
excreción. Se sabe que el volumen vacuolar representa un límite de tipo físico
para la acumulación de compuestos. Sin embargo, el aumento en la concentración
de determinados compuestos también juega un papel muy importante debido a
éstos pueden llegar a ser tóxicos para la propia célula (Cormier y col., 1992; Wu y
Lin, 2003).
Para impedir que los metabolitos se sigan acumulando, en la célula operan
mecanismos tales como: a) la interrupción de los procesos de biosíntesis debido a
que la concentración del producto puede ser tal que inhibirá ciertas enzimas clave
de la vía metabólica y b) procesos de tipo catabólico, donde las betalaínas son
degradadas enzimáticamente hasta o y p-fenoles, ciclo-DOPA o-quinona y ciclo-
DOPA o-glicósido (Böhm y Rink, 1988; Strack y col., 2003). Algunas de estas
5
sustancias pueden ser re-incorporadas en la biosíntesis como el caso de ciclo-
DOPA o-glicósido, o bien ser excretadas por las células como productos de
deterioro, como por ejemplo los o y p-difenoles (Böhm y Rink, 1988; Zhang y col.,
2002).
2.2. PERMEABILIZACIÓN CELULAR.
Como se señaló en líneas anteriores, las bases para el establecimiento
exitoso de un bioproceso para la producción de metabolitos secundarios, están
determinadas por tres capacidades de la célula: de síntesis, de almacenamiento y
de desintoxicación. En función de ello, se han planteado diversas estrategias
dirigidas principalmente a mejorar los procesos de biosíntesis y de producción. No
obstante, los diversos factores biofisicoquímicos involucrados en el transporte,
almacenamiento y catabolismo de los metabolitos secundarios, son aspectos aún
poco estudiados (Zhang y col, 2002).
El interés de utilizar un proceso que promueva la liberación de los
metabolitos del interior de la vacuola hacia el exterior, es reutilizar la misma
biomasa en un nuevo cultivo (Thimmaraju y col, 2003). De igual forma, la
liberación de los metabolitos secundarios intracelulares al medio de cultivo durante
el proceso, puede facilitar tanto la recuperación y purificación del producto, como
el aprovechar y favorecer la biosíntesis en las células, dando como resultado un
incremento en la producción del bioproceso (Zhang y col, 2002).
6
Una estrategia que representa un enfoque diferente a los procesos
tradicionales de extracción, se refiere a la liberación de los productos celulares
almacenados, utilizando procedimientos fisicoquímicos que incluyen la
electroporación, ultrasonicación y la permeabilización de las membranas celulares
con sustancias químicas, entre otros (Brodelius y Pedersen, 1993; Dörnemburg y
Knorr, 1992; 1995).
La electroporación normalmente involucra intensidades de corriente altas
por períodos de tiempo cortos del orden de ns a ms (pulsos). Mientras que la
electropermeación utiliza bajas intensidades eléctricas, por ejemplo de 1 a 5 mA
aplicados por varias horas (Yang y col., 2003). Un ejemplo de la aplicación de esta
técnica mediante pulsos eléctricos, ha sido la reportada por Brodelius y Pedersen
(1992) para alcaloides producidos por Thalictrum rugosum (5 kV cm-1 ) y para
Chenopodium rubrum (5 kV cm-1 ).
La ultrasonicación es una técnica que se basa en la aplicación de ondas
electromagnéticas completas del tipo de microondas, las cuales producen una
serie de cavitaciones entre el medio de cultivo y el gas disuelto en éste; formando
así un poro temporal en las membranas de las células. Esta técnica depende de
varios factores, entre los que se incluye la frecuencia, la potencia y el tiempo de
aplicación (Hunter y Kilby, 1988). Con esta técnica se ha logrado recuperar
saponinas en cultivos celulares de Panax ginseng y la shikonina en Lithospermum
erythrorhizon (Wu y Lin, 2002).
7
Por la naturaleza de este trabajo, se abordarán algunos aspectos que se
consideran importantes referentes a la permeabilización celular utilizando para ello
sustancias químicas conocidas con el término de “agentes químicos
permeabilizantes” AQP’s (Dörnemburg y Knorr, 1993). Algunos ejemplos de éstos
son el dimetil sulfóxido (DMSO), disolventes, quitosano, surfactantes, detergentes
y el polietilenglicol, entre otros.
La adición de este tipo de sustancias aparentemente promueve la formación
de “microporos” o “microcanales”, por los cuales los metabolitos almacenados
intracelularmente son excretados o liberados al medio de cultivo, posiblemente a
través de procesos difusivos (Brodelius, 1988; Gowrishankar y col., 1998). La
formación de estos conductos son temporales e idealmente, no deberían dañar la
estructura de las membranas celulares, por lo que las células se conservarán
viables para continuar realizando los procesos metabólicos conducentes a
crecimiento y biosíntesis (Thimmaraju y col., 2003).
Algunos ejemplos de permeabilización utilizando AQP’s se tienen con el
trabajo de Lerner y col (1978) quienes usando tolueno (0.5 a 0.7 nM) y Triton X-
100 (0.1%) describieron la formación de poros en raíces vegetales de Atriplex
nummularia donde evaluaron el radio de dichos poros. Asimismo, aplicando dimetil
sulfóxido (DMSO) en concentraciones de hasta 0.5 % (v/v), Park y Martínez (1992)
pudieron permeabilizar células de Catharanthus roseus. Los resultados
mostraron la liberación de un 50 % del total de alcaloides intracelulares
8
Sin embargo, son frecuentes los reportes en los que se señala que,
después de ser sometidas a un proceso de permeabilización con AQP’s, las
células pueden no permanecer viables (Felix, 1982; Dörnemburg y Knorr, 1997)
debido al daño ocasionado en la estructura nativa de la membrana.
Por otra parte, los mecanismos por los que se forman este tipo de
conductos parecen ser bastante complejos y para explicarlos se han propuesto
diversos modelos en la literatura (Gowrishankar y col., 1998; Wu y Lin, 2002), los
cuales se relacionan con el contenido y proporción de fosfolípidos y proteínas, la
naturaleza polar y no-polar de los componentes de la membrana y las diferencias
existentes en cuanto al tipo de organelo, la especie vegetal y el estado fisiológico
de las células.
2.3 LOS DETERGENTES COMO AGENTES QUÍMICOS PERMEABILIZANTES.
Los detergentes se han utilizado para la liberación de metabolitos en
cultivos microbianos, debido a sus propiedades hidrofílicas-hidrofóbicas (Miozzari
y col, 1978), para realizar estudios estructurales de membranas celulares
(Lichtenberg y col, 2000), para la incorporación de macromoléculas en el
citoplasma (Meiners y col., 1991; Le Maire y col., 2000) y en procesos de
permeabilización celular (Le Maire y col., 2000; Schreier y col., 2000).
9
La figura 2 muestra un esquema de la probable interacción de los
detergentes con la membrana celular. Se distinguen cuatro etapas importantes:
• La región A, en donde a bajas concentraciones del detergente, éste comienza
a interactuar con los fosfolípidos; pero aún es mayor el número de regiones no
ocupadas por las moléculas del detergente.
• En la región B, se observa que conforme se incrementa la concentración del
detergente, una mayor cantidad de moléculas se están insertando e
interactuando con los fosfolípidos, comenzando a saturar las posibles regiones
de unión (punto de la concentración de saturación, CSat).
• La región C se caracteriza porque ocurre una concentración crítica de
saturación (CCS) de todas las regiones probables de interacción, pero sin que
ocurra la solubilización de las moléculas de proteínas.
• En la región D, ése frágil equilibrio se desplaza hacia la formación de micelas
debido a que la concentración de detergente enlazado es tal, que solubiliza a
los fosfolípidos e interactúa con las porciones hidrofóbicas de las proteínas,
reemplazando a los lípidos que están unidos a dichas proteínas.
Es precisamente en D, donde la membrana pierde su estructura nativa y
adquiere la nueva estructura micelar (Goñi y Alonso, 2000; Le Maire y col., 2000).
10
Figura 2. Representación esquemática de la interacción de los detergentes con las membranas celulares: (CSat) Concentración de saturación, (CSC) Concentración de
saturación crítica y (CCM) concentración crítica micelar. (Adaptado de: Le Maire y col., 2000).
Es importante señalar que, dado que el proceso de permeabilización
involucra la formación de microcanales idealmente reversibles y temporales como
resultado de la interacción con el detergente, la concentración de éste deberá
estar por abajo del punto de saturación (CSat), lo cual permitiría idealmente
mantener la viabilidad celular (Almgren, 2000; Schreier y col., 2000).
Existen tres tipos de detergentes: iónicos, catiónicos y no-iónicos. La
diferencia entre ellos se establece en función a su carga iónica neta. Los 3 tipos
de detergentes han sido reportados tanto para estudios de solubilización de
11
membranas (Almgren, 2000; Goñi y Alonso, 2000), como para la permeabilización
en células bacterianas (Felix, 1982) y vegetales (Wang y col, 2001).
En el cuadro 1 se presentan algunos ejemplos de detergentes utilizados
para la permeabilización de membranas; las estructuras químicas
correspondientes se muestran en las figuras 3 y 4.
Cuadro 1. Características de algunos detergentes no-iónicos.
DETERGENTE
PESO
MOLECULAR (Da)
CONCENTRACIÓN DE
PERMEABLIZACIÓN (mM)
Tween 20®
(monolaureato de sorbitan)
346.47
0.06
Tween 40® (monopalmitato de sorbitan)
402.58
-
Tween 80® (monoleato de sorbitan)
Tritón X-100®
(polioxietileno isoctifenil)
428.62
647
0.027
0.23
Fuente: www.anatrace.com/literature/cat9900/catalog.pdf;2002.
La selección del tipo de AQP’s depende de varios factores como pueden
ser su peso molecular, sus características estructurales (lineal o ramificada) y la
afinidad por los diversos fosfolípidos constituyentes de la membrana celular
(Lichtenberg y col, 2000).
12
Figura 4. Estructura química de los detergentes Tween´s®.
Figura 3. Estructura química del detergente Tritón X-100®.
2.4. PERMEABILIZACIÓN DE CÉLULAS VEGETALES PARA LA OBTENCIÓN DE
BETALAÍNAS.
En el caso específico de la obtención de betalaínas por el cultivo de
células, se han aplicado diferentes estrategias de permeabilización, con el objeto
de promover la excreción de los pigmentos; el cuadro 2 muestra un resumen de
estos trabajos.
13
Cuadro 2. Estrategias utilizadas para promover la liberación de betalaínas (BL) en cultivos celulares de B. vulgaris L.
Sistema Estrategia Bl (%) Desventaja Referencia
Raíces Permeabilización 70 _____ Thimmaraju y col,
transformadas con Tritón X-100 2003.
de B. vulgaris.
Células de Electro- 10 _____ Yang y Bayraktar, B. vulgaris y permeabilización 2003. C. roseus. Raíces Disminución 50 Pérdida Mukundan y col,
transformadas del pH de la viabilidad 1998.
de B. vulgaris
Células de Incremento ligero 15 Pérdida de la Dilorio y col,
B. vulgaris en la temperatura viabilidad 1993.
Células de Ultrasonicación 5-10 _____ Kilby y Hunter,
B.vulgaris 1990.
Células de Permeabilización 50 Pérdida de la Brodelius,
Ch. rubrum con Tritón X-100 viabilidad 1988.
Células de Permeabilización 62 Pérdida de la Knorr y Berlin
Ch. rubrum con DMSO y quitosano viabilidad 1987.
Utilizando la ultrasonicación como método de permeabilización, Kilby y
Hunter (1990) lograron la excreción al medio de cultivo de las betalainas
producidas por cultivos celulares de B. vulgaris (cv. Suttons Bolthardy). Aplicaron
para ello, ondas ultrasónicas en una frecuencia de 1.02 Mhz a una potencia de 3
watts cm-2 y por pulsos de 10 a 60 s.
14
Encontraron que solo los pulsos de 30 a 60 s producían la liberación de
los pigmentos entre un 5 y 10 %. Mediante este procedimiento no se observó daño
de la viabilidad o daños importantes en la estructura celular, no obstante de utilizar
incluso varios ciclos de ultrasonicación y recuperación de betalainas.
Recientemente, Yang y col., (2003) reportaron la electropermeación de
cultivos celulares de C. roseus y B. vulgaris (cv Red ball), utilizando intensidades
de corriente 0 a 5 mA, con un potencial eléctrico de 0 a 40 V y tiempos de
exposición de hasta 18 h. Observaron la liberación de casi el 60 % de los
alcaloides en C. roseus, mientras que para B. vulgaris después de 6 h, la
respuesta representó solo un pequeño incremento en la liberación de betalainas
(reportada como absorbancia a 537 nm). Las ventajas de este proceso fueron
referidas preferentemente hacia la conservación de la viabilidad y a la
recuperación de los metabolitos dado su carácter iónico, más que a la cantidad
liberada.
En ambos casos parece ser que tanto los pulsos ultrasónicos de bajo
voltaje, como la corriente eléctrica de baja intensidad y voltaje favorecieron la
formación de poros que se abren y cierran, como resultado de la rotación de las
moléculas lipídicas que conforman las membranas celulares (Gowrishankar y col.,
1998; Wu y Lin, 2002; Yang y col., 2003).
Con relación a la utilización de AQP’s, en un primer reporte, Knorr y Berlin
(1987) utilizaron diferentes concentraciones y combinaciones de quitosano y
15
DMSO para permeabilizar células de Chenopodium rubrum productoras de
betacianinas (cuadro 2). Encontraron que los mayores niveles de pigmento
liberado (61.7 %) se obtuvieron con el 11 % (v/v) de DMSO en el medio de cultivo
y un tiempo de contacto de 2 h. Tiempos de contacto mayores, provocaron una
disminución drástica en la cantidad de pigmento liberado, debido al efecto
altamente deteriorativo del DMSO en las betalainas. No hubo respuesta a la
permeabilización celular cuando se utilizó quitosano en concentraciones del 1 %
(p/v), incluso después de 192 h de contacto.
Por otra parte, Brodelius (1988) reportó el uso de Tritón X-100 para la
permeabilización de tres líneas celulares: Catharanthus roseus (productora de
alcaloides), Thalictrum rugosum (productora de berberina) y Chenopodium rubrum
(productora de betanina). En este reporte, en cuanto a la pérdida de viabilidad, T.
rugosum y C. rubrum resultaron ser mas sensibles al tratamiento con Tritón X-100
al 0.02 %, mientras que células de C. roseus pudieron recrecer después del
tratamiento con el agente permeabilizante, liberando el 50 % de los alcaloides; no
obstante, la cinética presentó una fase lag de mayor duración. Las diferencias en
cuanto a la sensibilidad de estas líneas celulares son atribuidas tanto a la
morfología celular, como al daño producido a nivel de membranas celulares.
Mukundan y col., (1998) sometieron cultivos de raíces transformadas de B.
vulgaris a diferentes valores de pH (en un intervalo de 2 a 7) y una disminución de
los fosfatos del medio de cultivo. Encontraron que entre un pH de 3 - 7, no había
liberación de betalaínas después de 24 h y que cuando éste se disminuía a 2.5 se
16
lograba una excreción mínima después de 6 h; limitando la fuente de fosfatos a un
30 % de la concentración original. No obstante, cuando las raíces fueron
colocadas en un pH de 2 por 10 min se recuperó aproximadamente un 36.8 % del
total de las betalaínas contenidas en las células, bajo la misma limitación de
fosfatos. Este comportamiento fue atribuido a la lisis parcial de células “frágiles”
que fueron más susceptibles a la acción combinada de la disminución del pH y de
la fuente de fosfatos. Resultados similares fueron obtenidos por Kino-Oka y col.,
(1992) en cultivos que sufrieron limitaciones severas de oxígeno.
En otro reporte reciente, utilizando también raíces transformadas de B.
vulgaris (Thimmaraju y col, 2003), fue realizada la permeabilización celular con
Tritón X-100 a una concentración de 0.2 % (p/v) en condiciones estáticas y de
agitación durante 24 h. Estos autores observaron que durante la permeabilización
se lograba después de 2 h de contacto con el detergente y que a las 4 h, se
alcanzaba la mayor liberación de las betalainas (80 % en el sistema estático y 70
% en el sistema agitado). Después de ese tiempo, en ambos sistemas, la
liberación del pigmento se mantenía casi constante e incluso, disminuía
significativamente.
El comportamiento anterior fue atribuido por un lado a la disolución de la
bicapa de fosfolípidos de las membranas celulares, permitiendo así la rápida
excreción de los pigmentos y por el otro a la degradación de las betalainas. No
obstante, la alta concentración del detergente (0.2 % p/v) no permitió que el cultivo
conservara su viabilidad.
17
JUSTIFICACION. 3.
Uno de los problemas que se presenta en la producción de las betalaínas
por cultivo de células vegetales de B. vulgaris en matraces (Rodríguez y col.,
1994; Trejo y col., 1999), en biorreactores tipo tanque agitado (Jiménez y col,
1996; Rodríguez y Galindo, 1999) y tipo air-lift (Juárez y col., 2002) se refiere a la
acumulación de los metabolitos secundarios en el interior de las vacuolas, lo que
pudiera ocasionar inhibición de la biosíntesis y degradación de los propios
pigmentos (Wu y Lin, 2003).
Por lo anterior, se considera importante encontrar algún agente químico que
modifique la permeabilidad celular (Ramachandra y Ravishankar, 2002);
favoreciendo así la liberación de betacianinas en los cultivos en suspensión de B.
vulgaris.
4. HIPOTESIS.
La aplicación controlada de AQPs favorecerá la liberación de las
betacianinas producidas por cultivos celulares es suspensión de B. vulgaris L, sin
afectar la capacidad de crecimiento celular y la síntesis del pigmento.
18
5. OBJETIVOS.
5.1. OBJETIVO GENERAL:
Evaluar el efecto de diversos detergentes no-iónicos en la liberación
de betacianinas y en la capacidad de mantener la viabilidad en cultivos en
suspensión de betabel (B. vulgaris L.).
5.2. OBJETIVOS PARTICULARES:
a) Seleccionar un detergente no-iónico con base en la respuesta a la
liberación de betacianinas .
b) Establecer las condiciones de permeabilización del detergente
seleccionado, tales como concentración y tiempo de contacto.
c) Evaluar el efecto del detergente seleccionado en la liberación de
betacianinas y la capacidad de recrecimiento de los cultivos.
19
6. MATERIALES Y METODOS.
6.1. MATERIALES.
6.1.1 Línea celular.
Se utilizaron células en suspensión provenientes de la línea celular fenotipo
FRP (rojo púrpura) Beta vulgaris, variedad “Crosby Egiptian” crecidas en matraces
de 500 ml de acuerdo a la metodología reportada por Ontiveros (1994).
6.1.2. Medio de cultivo.
Las células de B. vulgaris se cultivaron en el medio basal B5 formulado por
Gamborg y col (1968) de la marca SIGMA (St. Louis, MO. USA), adicionando con
los reguladores de crecimiento [ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y cinetina] y
ajuste del pH.
6.1.3. Condiciones de cultivo.
Los cultivos se incubaron a 25oC, bajo condiciones de fotoperiodo (16 h
luz), intensidad luminosa (36 µmol m-2 s-1) y agitación orbital (100 min-1)
constantes.
20
6.1.4 Material y equipo de laboratorio.
Se empleó material común de laboratorio incluyendo:
Balanza analítica (OHAUS GA 200D)
Bomba de vacío (Cole –Parmer 7049-50)
Campana de flujo laminar (Alder).
Espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-160)
Parrillas de calentamiento y agitación (Thermolyne)
6.1.5. Sustancias químicas.
Todos los reactivos utilizados incluyendo los detergentes fueron grado
analítico de las marcas SIGMA.
6.2 MÉTODOS. 6.2.1. Preparación del medio de cultivo.
Para preparar un litro del medio de cultivo se pesaron 3.2 g del medio B5 y
se le adicionaron 20 g de sacarosa, 0.02 mg de ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D) y 0.1 mg de cinetina; se ajustó a un pH de 5.5 con soluciones de hidróxido
de sodio (NaOH) y ácido clorhídrico (HCl) 1N según fuera el caso, antes de
diluirlo a su volumen final. Finalmente se esterilizó en autoclave a 121oC y
1.033 Kg cm-2 de presión durante 20 minutos.
21
6.2.2 Extracción de las betacianinas de los cultivos celulares.
Se utilizó el método adaptado por Jiménez y col (1997), en las células son
maceradas y se les adiciona agua o mezclas conocidas de metanol – agua en una
relación peso – volumen de 1:10 (células/solución extractora); posteriormente se
eliminan los restos celulares por filtración (papel Whatman No.1) y centrifugación
(2500 x g, 15 min). Finalmente, al sobrenadante se les determina la concentración
de pigmentos por el método descrito en el siguiente inciso.
6.2.3 Cuantificación espectrofotométrica de las betacianinas.
Al sobrenadante obtenido anteriormente, se le determina la absorbancia a
540 nm de longitud de onda en el espectrofotómetro. A partir de este valor y el
coeficiente de extinción molar se evaluó la concentración de pigmento (mgBC/l);
(Saguy y col. 1978; Schwartz y col. 1981; Piatelli, 1981). Las concentraciones de
betacianina se calcularon por medio de la relación propuesta por Nilsson (1970) y
modificada por Cai y col (1998), de acuerdo a:
X = 1.095 (Abs540 - Abs 600) nm.........................................................................(1)
X = Concentración de betacianinas.
Coeficiente de extinción molar para betacianinas: 1120 (1cm, 1 %).
Este procedimiento se siguió para 1 gpf de células, el cual se utilizó como
referencia del 100% de concentración de betacianinas.
22
6.2.4 Observaciones al microscopio.
Se realizaron observaciones al microscopio colocando 200 µl del cultivo en
un portaobjetos excavado. Las imágenes fueron adquiridas con el objetivo 4X en
campo claro.
6.3. DESARROLLO METODOLÓGICO.
6.3.1. Estrategia general.
La estrategia general para el desarrollo de este trabajo se muestra en la
figura 5. Primeramente se plantea el uso de distintos detergentes no iónicos
cultivos para la permeabilización de las células en suspensión de B. vulgaris
provenientes de inoculos crecidos en matraces de 500 ml, con el objeto de
seleccionar aquél que presentase una respuesta favorable a la permeabilización.
Los detergentes ensayados fueron: Tween 20®, Tween 40®, Tween 80® y Tritón
X-100®.
Después de la selección del detergente se propuso establecer la
concentración y tiempo de contacto y finalmente hacer las pruebas de
recrecimiento celular con las condiciones de permeabilización establecidas.
23
Evaluación de cuatro detergentes (Tritón X-100, Tween’s 20, 40 y 80)
Figura 5. Estrategia general de trabajo.
Cuantificación del peso fresco (g/l) Cuantificación de la concentración de
betacianinas (mg BC l-1)
Cinética de recrecimiento de los cultivos permeabilizados
Selección del tiempo de lavado de las células
Ensayos (lavado) para desechar el detergente contenido en el medio de cultivo
(10, 15 min)
Ensayos de recrecimiento en medio B5 líquido
Detergente seleccionado
Determinación de las betacianinas liberadas
Selección del tiempo de contacto ( 0, 15, 20, 35, 50 y 24 h)
Selección de la concentración del detergente: 0.009, 0.09,
0.23, 0.51, 0.7, 0.78 y 0.9 mM
Cultivos en suspensión de Beta vulgaris
24
6.3.2 Pruebas preliminares para la selección del agente químico
permeabilizante (AQP) en un sistema estático (tubos de ensaye)
Las pruebas preliminares se realizaron con el objeto de evaluar la
respuesta a la posible liberación de las betalaínas utilizando los cuatro AQP’s
señalados anteriormente y con ello seleccionar aquella sustancia que
eventualmente pudiera promover la excreción de los pigmentos. Para ello se
siguió la metodología referida en la figura 6.
Se utilizaron 3 g de células que fueron colocadas en tubos de ensaye de
50 ml con 30 ml de medio B5 líquido y los detergentes en una concentración 0.9
mM. Los tubos se agitaron en un vortex y se dejaron incubar durante 24 h a una
temperatura de 25oC± 2oC. La variable de respuesta evaluada fue la concentración
de betacianinas liberadas al medio de cultivo. Se realizaron cinco repeticiones
para cada uno de los diferentes ensayos.
6.3.3. Pruebas de liberación de betacianinas para la selección de la
concentración del AQP (en un sistema agitado).
Para esta fase se utilizó el detergente seleccionado de acuerdo a los
resultados de la sección 6.3.2. Se utilizaron concentraciones de 0.009, 0.09, 0.23,
0.51, 0.7, 0.78 y 0.9 mM, así como diferentes tiempos de contacto (0, 15, 20, 35 y
50 minutos).
25
Filtrar en una malla 250 µm
Cultivos en suspensión de B. vulgaris
Determinar la concentración de betalaínas liberadas al medio de cultivo
Dejar incubar por 24 hrs.
Aplicar una concentración de 0.9 mM de cada uno de los detergentes.
Colocar 3 g de células (pf) en tubos de ensaye de 50 ml con 30 ml de medio B5.
Figura 6. Ensayos preliminares para la selección del detergente (AQP).
Estas pruebas se realizaron en matraces de 50 ml conteniendo 10 ml de
medio B5 y 1 g de células (pf). Las condiciones de incubación de los cultivos
fueron: temperatura de 25oC± 2oC y agitación 100 rpm. De igual forma, la variable
de respuesta fue la cantidad de betacianinas liberadas al medio de cultivo.
6.3.4. Recrecimiento de los cultivos en medio líquido (matraces).
Este experimento consistió en dar el tratamiento permeabilizante a las
células de B. vulgaris con la concentración y tiempo de contacto seleccionado en
los ensayos anteriores. Posteriormente, las células permeabilizadas fueron
inoculadas en matraces de 50 ml con 10 ml de medio B5 y se dejaron incubando
26
durante 22 días con tiempos de cosecha de: 0, 4, 7, 11, 15, 18 y 22 días. Durante
la cinética, las variables de respuesta a evaluar fueron: concentración de
betacianinas (mgBC/l) y peso fresco (g/l). La cinética se hizo por quintuplicado.
Con estos datos se calcularon los siguientes parámetros: a) la velocidad
específica de producción de betalaínas (ϕ), producto de la pendiente obtenida en
el trazo cinético del cambio de la concentración de pigmentos con respecto al
tiempo; y b) la velocidad específica de crecimiento (µ) con las siguientes
relaciones (Brown, 1990): :
• Tiempo de duplicación celular tdc= ln 2/ m (2)
• Velocidad específica de crecimiento (µ) a partir de tdc con: µ= 1/tdc. (3)
Donde:
tdc= Tiempo de duplicación celular
m= pendiente de la recta
27
7. RESULTADOS Y DISCUSION.
7.1. SELECCIÓN DEL AQP.
En la figura 7 se presentan los resultados correspondientes a la liberación
de betacianinas cuando se utilizaron diferentes AQP’s.
Betacianinas liberadas(mg BC/l)
Control: 1180 mgBC/l 1200
1000
800
600
400
200
0
Agentes permeabilizantes (AQP's) Tween 80 Tween 40 Tween 20 Tritón X-100
Figura 7 . Liberación de betacianinas de cultivos celulares de Beta vulgaris sometidas al proceso de permeabilización utilizando cuatro detergentes a una concentración de 0.9 mM durante 24 h de contacto. (Promedio de tres repeticiones; las barras señalan la
magnitud de la desviación estándar).
Para este ensayo, la concentración de betacianinas en la muestra control
fue de 1180 mgBC/l. Como es posible observar en la gráfica de referencia, se
encontró que después de 24 h la mayor cantidad de pigmentos liberados al medio
de cultivo (900 mgBC/l), se obtuvo al utilizar el Tritón X-100®. De manera
contrastante, en aquellas muestras a las que se les aplicaron los diferentes
28
detergentes Tween’s®, la cantidad liberada al medio de cultivo fue sensiblemente
menor, obteniéndose valores entre 55 y 110 mgBC/l.
Es de hacer notar dos aspectos importantes de este ensayo: a) se
utilizaron concentraciones de los AQP’s mayores a las reportadas en la literatura
(para otro tipo de sistemas celulares), lo que suponía poder asegurar la
permeabilización celular, b) Los sistemas celulares permanecieron en reposo
durante las 24 h de contacto con los AQP’s lo que eventualmente estaría
asegurando la liberación total de las betacianinas.
Dado que se partió de concentraciones de detergente utilizadas
normalmente en procesos con células animales, las cuales crecen en forma
aislada (Le Maiere y col., 2000) y no en agregados formados por un número
importante de células; es por lo tanto muy probable que, para el caso de los
cultivos de B. vulgaris L. utilizados en este trabajo, las células que estén
localizadas hacia el interior de los agregados, no tengan la posibilidad de estar
expuestas al AQP, no obstante de estar en concentraciones incluso superiores a
las reportadas en la literatura para permeabilización de membranas (www.
anatrace. com/literature/ cat9900/ catalog. pdf; 2002).
Con base en ello, se infiere que esta característica dependerá entonces
de la homogeneidad en cuanto al tamaño de agregados en las muestras
sometidas al proceso de permeabilización.
29
Thimmaraju (2003) reporta la liberación de betalaínas en un 70 % en
presencia de Tritón X-100 (0.2 %) para raíces transformadas de B. vulgaris en
un tiempo de 2 h. Caso contrario a lo observado en este trabajo con cultivos en
suspensión donde la liberación del metabolito es casi inmediata.
Este mismo autor también reporta tiempos de degradación de las betalaínas
(después de haberse liberado) entre 4 a 8 h, para un sistema estático, y en un
menor tiempo, cuando usa un sistema con agitación. Estos resultados podrían
sugerir que el no someter a agitación las suspensiones celulares durante el
proceso de permeabilización, podría favorecer un menor daño mecánico.
En el caso del presente trabajo, sólo el Triton X-100® tuvo una respuesta
favorable a la permeabilización, aunque solo alrededor del 76 % de betacianinas
se liberaron. En este caso es muy probable que, debido a que el sistema
permaneció en reposo durante las 24 h, se haya presentado una degradación de
las betalaínas con lo cual se obtuvieron valores menores a lo esperado, de
acuerdo con lo evaluado para el control.
Otro factor importante en el proceso de permeabilización es el tamaño de
los agregados celulares. En general, las células vegetales tienen una tendencia
marcada a formar agregados macroscópicos: Esta característica por una parte
parece ser un requisito para la síntesis de metabolitos secundarios como lo
reportan para otras líneas celulares (Pépin y col., 1999; Miyanga y col., 2000);
30
mientras que por la otra, puede ser una limitante para el transporte de nutrientes y
reguladores de crecimiento (Topete y col., 1991; Wang y col., 2001).
En el caso de este trabajo, la línea de B. vulgaris L. utilizada presenta
variaciones importantes (Trejo y col., 2003) razón por la cual, se homogeneizó el
tamaño de los agregados, haciéndolos pasar a través de una malla de 250 µm,
porque es en ese tamaño donde se encuentra la mayor proporción de agregados.
No obstante de haber realizado una homogeneización del tamaño de
agregados celulares, es posible suponer que la formación de nuevos agregados o
el incremento en el tamaño de los ya existentes, también sea un factor limitante
para el transporte del AQP hacia las células que se encuentran contenidas en el
interior de estos agregados. Este aspecto pudo ser corroborado con las
observaciones realizadas en el microscopio; la figura 8 representa un ejemplo de
esto.
50 µm100 µm
A B
Figura 8. Foto micrografías (campo claro) de células de B. vulgaris sometidas a
permeabilización con Tritón X-100® a una concentración 0.9 mM durante 24 h: (A) Agregados celulares sin permeabilizar (testigo,4X), (B) Agregados después del proceso de
permeabilización (4X).
31
La figura 8A corresponde a una imagen de células que no han sido
sometidas a la permeabilización, donde prácticamente la totalidad está
pigmentada; mientras que en la figura 8B es posible observar tanto la presencia de
células en agregados que ya no contenían pigmento (células incoloras); así como
células ligeramente pigmentadas, hacia el centro o interior del agregado.
Por otra parte, como se señaló anteriormente, los valores de betacianinas
liberadas por los detergentes Tween’s®, fueron muy bajos (figura 7), posiblemente
como resultado de las concentraciones utilizadas de estos agentes
permeabilizantes, de acuerdo a lo reportado en la literatura ( www. anatrace.
com/literature/cat9900/catalog.pdf; 2002). Este hecho, paralelamente al problema
referido en cuanto al tamaño de agregados y adicionalmente a la estructura de la
molécula de los detergentes Tween’s, podría estar sugiriendo la no incorporación
de esto detergentes en la membrana plasmática de B. vulgaris. De igual manera,
como un ejemplo de esto, en la figura 9 se muestra una fotomicrografía de células
de B. vulgaris después de haber estado en contacto con el Tween-40® durante 24
h en el sistema sin agitación.
Figura 9. Fotosometidos a perme
micrografía (campo claro, 10X) de agregados celulares de B. vulgaris abilización con Tween 40®, a una concentración de 0.9 mM durante 24 h.
100 µM
32
Como se puede observar, prácticamente el total de las células
permanecieron pigmentadas. A este respecto, Gontier y col. (2002) reportaron el
uso del Tween-20® en concentraciones de 1, 2, 3 y 5 % (p/v), equivalentes a
8.9, 17.8, 26.7 y 44.6 mM, respectivamente, para permeabilizar células de raíz de
Datura innoxia Mill, obteniendo entre 10 y 80 mg/l de alcaloides liberados al medio
de cultivo, de acuerdo a la concentración del detergente.
En ese trabajo se señala que las altas concentraciones de detergente para
lograr la permeabilización podría ser resultado de las características estructurales
de las células de dicha especie. Un comportamiento análogo lo reportan
Thimmaraju y col. (2003), para raíces transformadas de B. vulgaris,
permeabilizadas con Tritón X-100® a 1.8 mM; obteniendo una recuperación del 70
% de las betalaínas.
De acuerdo a lo señalado por Le Maire. (2000) y Schreier y col. (2000), el
proceso de permeabilización se basa en diversos factores entre los que se pueden
citar principalmente las características fisicoquímicas de los AQP’s, la capacidad
de penetrar la membrana plasmática de las celulas por el AQP, resultado de la
interacción hidrofóbica - hidrofílica entre las moléculas del detergente y los
fosfolípidos de la membrana, el número de regiones de la membrana plasmática
que dichos detergentes pudiesen ocupar y la composición de la membrana en
cuanto a fosfolípidos y proteínas, los cuales cambian para las diferentes especies
vegetales (Meiners y col., 1987).
33
Por ejemplo, si el número de regiones ocupadas por el detergente es baja,
sí hay un impedimento estérico debido al tamaño y/o composición de la molécula
del detergente, o bien si la interacción hidrofílica – hidrofóbica no es suficiente, el
proceso de formación de los “microcanales” o “microporos” podría no estarse
dando como se reporta para células animales (Le Maire, 2000). En los trabajos
referidos por Gontier y col., (2002) y por Thimmaraju y col., (2003), las células que
utilizaron fueron obtenidas de raíz de especies vegetales distintas.
Por tal motivo, las estructuras de la pared y membranas son distintas a las
de células meristemáticas de los cultivos en suspensión (Verpoorte y col., 2002)
tales como las de B. vulgaris utilizadas en este trabajo y por lo tanto es muy
probable que el proceso de permeabilización, consecuentemente también sea
diferente. Con base en el conjunto de estos resultados, se seleccionó al Tritón X-
100® para continuar con los siguientes ensayos.
7.2. Selección de la concentración del Tritón X-100® y tiempo de contacto,
en un sistema agitado.
La siguiente etapa del trabajo consistió en establecer tanto el tiempo de
contacto, como la concentración del Tritón X-100®, más adecuados con lo que
además de promover la excreción del pigmento, se estaría tratando de conservar
la capacidad de recrecimiento de las células de B. vulgaris. Para ello, se
propusieron diferentes concentraciones del detergente, teniendo como límite
superior el de 0.9 mM, así como concentraciones de uno (0.09 mM) y dos órdenes
34
(0.009 mM) de magnitud inferiores; asimismo, se probaron simultáneamente
concentraciones intermedias dentro del intervalo de magnitud establecido. La
cinética de liberación del pigmento se siguió durante 50 minutos, teniendo un
cultivo control con un contenido inicial de 1478 mg BC/l. Los resultados se
muestran en la figura 10.
Betacianinas liberadas (mg BC/l)
Concentración de Tritón X-100® (mM)
0.009 0.09 0.23
0.51
0.7
0.78 0.9
1600
1200
800
400
0 10 20 30 40 50 0
Tiempo de permeabilización (min)
Figura 10. Efecto de la concentración del Tritón X-100® en la permeabilización de cultivos celulares de B. vulgaris, a un tiempo de contacto de 50 min. (Promedio de tres
repeticiones. Las barras indican la magnitud de la desviación estándar).
Como se puede observar, para las concentraciones de 0.7 a 0.9 mM, se
encontró que entre los 15 y 20 min se llegaba a la cantidad máxima de
betacianinas liberadas al medio de cultivo; un mayor tiempo de contacto no
35
promovió una mayor excreción, por lo que la liberación del metabolito se estabiliza
a partir de los 20 min. Cabe señalar que por la respuesta tan inmediata (en cuanto
a la liberación del metabolito) observada con este sistema, no fue posible
experimentar con tiempos de contacto menores; por lo que posiblemente, el punto
máximo en cuanto a la liberación de las betacianinas pudiera estar dada antes de
los 15 minutos.
Las cantidades liberadas con respecto al control fueron 100 % para 0.9
mM, 90 % (1152 mgBC/l) para 0.78 mM y 59 % (870 mgBC/l) para 0.70 mM.
Concentraciones de 0.51 mM o menores, tuvieron como resultado una muy baja
excreción de betacianinas, en niveles que estuvieron de 3.3 hasta 20 %, incluso
después de los 50 min de contacto. Es probable que a estas concentraciones, la
cantidad de detergente no esté interactuando totalmente con las moléculas de
fosfolípidos (Le Maire, 2000), en aquellos agregados formados por un número
considerable de células.
Es decir, aquellas células que particularmente se encuentran localizadas
hacia el interior de dichos agregados, probablemente ni siquiera estén en contacto
con el AQP. En este sentido, ha sido reportado que el proceso de
permeabilización se establece con un balance entre la concentración del AQP y
las características biológicas y fisicoquímicas de las membranas celulares
(Dörnenburg y Knorr, 1997; Schreier y col., 2000); adicionalmente, como se señaló
anteriormente, se deberá tomar en cuenta la facilidad que tengan los diversos
tipos de AQP para difundir a través de agregados celulares (Wang y col., 2001).
36
En síntesis, cuando hay un exceso de AQP se estarían induciendo
modificaciones estructurales importantes en la membrana llegando incluso a
cambios conformacionales irreversibles (micelización); por otra parte, si no se
establece la concentración de AQP para que se dé, la interacción hidrofílica –
hidrofóbica, no habrá la formación de los “microcanales” como se ha informado
para otras especies vegetales y animales (Parr y col., 1986; Dörnemburg y Knoor,
1992; Almgren, 2000).
En la figura 11 se presentan a manera de comparación las
fotomicrografías correspondientes a la permeabilización, utilizando el Tritón X-
100® a concentraciones crecientes en un orden de magnitud. Como es posible
observar, las concentraciones de 0.009 y 0.9 mM corresponden a los extremos en
donde, en un caso prácticamente no hubo permeabilización (0.009 mM) y en el
otro (0.9 mM), aparentemente casi el total de las células se encuentran sin
pigmento; las células sometidas al 0.09 mM presentan una permeabilización
parcial.
A 50 µmB C
Figura 11. Fotomicrografías (campo claro, 4X) de células de B. vulgaris
permeabilizadas con tres concentraciones de Tritón X-100®: (A) 0.009 mM, (B) 0.09 mM y (C) 0.9 mM
37
Cabe señalar que con la concentración mas alta de 0.9 mM, se obtuvieron
valores espectrofotométricos de betacianinas mayores a los observados con el
testigo. Al respecto, es probable que la concentración de detergente utilizada esté
liberando adicionalmente otras sustancias celulares; por ejemplo, algunos
polifenoles que estarían absorbiendo a una longitud cercana a los 540 nm (Kujala
y col., 2001), modificando así las lecturas de absorbancia utilizadas para el cálculo
de las betacianinas, de acuerdo al método espectrofotométrico reportado por
Nilsson (1970).
En este sentido como se señaló anteriormente, concentraciones elevadas
del agente químico utilizado en el proceso de permeabilización puede conducir a
una desnaturalización de la estructura nativa de las membranas celulares y por lo
tanto la salida de otras sustancias como polifenoles. (Le Maire, 2000).
Un efecto similar fue observado por Thimmaraju y col. (2003) para células
de raíces transformadas de B. vulgaris después de 2 h de contacto con Tritón X-
100® a una concentración 1.8 mM. Estos autores atribuyen el incremento en la
concentración de pigmentos liberados por encima del testigo, precisamente a la
solubilización de la bicapa de fosfolípidos de las membranas celulares.
Con base en lo antes descrito, se estaría pensando que los ensayos de
recrecimiento celular se realizarían con la concentración de 0.9 mM, debido a que
a esa concentración se estaría logrando la excreción de la mayor cantidad de
betacianinas. No obstante, Miranda (2003) en su trabajo referente al daño y
38
viabilidad de células de B. vulgaris y C. robusta, reportó que cuando se presentó
un área teñida con diacetato de fluoresceina (FDA) menor al 50 %, los cultivos no
crecieron y sugiere que es importante contar con un cultivo que presente un área
teñida con FDA del 60-70 %.
Adicionalmente, en un trabajo reciente, Cuevas (2003), utilizó las mismas
condiciones mostradas en la figura 11, así como la técnica desarrollada por
Miranda (2003) y encontró que la viabilidad de las células permeabilizadas
disminuyó drásticamente (hasta el 30 %), con tiempos de contacto de 15 min y
concentraciones de 0.9 mM de Tritón X-100®, no así cuando utilizó 0.7 mM (en
cuyo caso la viabilidad se mantuvo en el 70 %). Por otra parte, tiempos mayores
de contacto, a pesar de no promover una mayor excreción (figura 11), dieron como
resultado una pérdida importante de la viabilidad celular, incluso llegando a tener
valores menores del 5 %.
En su conjunto, estos resultados sugirieron que el contacto con el AQP,
por tiempos mayores, estaba teniendo un efecto letal para la célula, posiblemente
debido a una desnaturalización irreversible de las membranas celulares, como lo
informaron Dörnemburg y Knorr (1992), Park y Martínez (1992) y Bassetti y col
(1995) para otras líneas de células vegetales. De hecho, Brodelius (1988), reportó
que la disminución en la viabilidad de cultivos tratados con agentes
permeabilizantes fue producto de la destrucción de la compartamentalización
celular, liberación de componentes tóxicos y enzimas hidrolíticas, tales como
39
proteasas que actúan a nivel de proteínas constitutivas de la membrana
plasmática.
Diversos autores (Lerner y col., 1977; Parr y col., 1986; Brodelius, 1988;
Almgren, 2000) coinciden en que, bajo ciertas condiciones de permeabilización, la
capacidad de sobrevivencia de los cultivos está relacionada con diversos factores,
tales como las características fisicoquímicas de los AQP’s, de los propios
metabolitos y de la fisiología celular, particularmente en cuanto a la cantidad de
“microporos” formados, su temporalidad y reversibilidad. En conjunto, estos
factores también estarían influyendo indirectamente en la cantidad de producto
liberado.
Con base en lo anterior y con el objeto de evitar este posible efecto
deteriorativo y/o letal de las células, para las pruebas de recrecimiento se
seleccionó la concentración de 0.7 mM del Tritón X-100® y se propuso utilizar dos
tiempos de contacto: 10 y 15 min, en los cuales las células liberan entre el 40 y 60
% de las betacianinas, respectivamente (conforme a los resultados mostrados en
la figura 11). Aunado a ello, se estaría en posibilidad de mantener la viabilidad
entre 60 y 70 % de acuerdo, tanto a los valores obtenidos con FDA por Cuevas,
(2003), como lo reportado por Miranda (2003), lo que permitiría un eventual
recrecimiento de las células.
En la figura 12 se muestran fotomicrografías de células permeabilizadas
con 0.7 mM de Tritón X-100® a los 10 y 15 min de contacto. Como es posible
40
observar, las células permeabilizadas durante 10 min (figura 12A) tienen un mayor
contenido aparente de pigmento con relación a las que tuvieron un tiempo de
contacto de 15 min (figura 12B).
100 µm B A
Figura 12. Fotomicrografías (campo claro, 4X) de células de B. vulgaris permeabilizadas con 0.7 mM de Tritón X-100® a dos tiempos de contacto: (A) 10
min y (B) 15 min.
7.3. ENSAYOS DE RECRECIMIENTO EN MATRACES AGITADOS.
La figura 13 muestra la cinética del crecimiento celular y producción de
betacianinas para muestras permeabilizadas y sin permeabilizar. Con relación al
crecimiento celular, se puede observar que en las tres muestras, los perfiles de
crecimiento fueron distintos (figura 13A).
Primeramente, en el testigo no se presentó una fase lag y la etapa de
mayor crecimiento fue del día 4 al 11 con una velocidad específica de crecimiento
(µ) de 0.147 d-1 y una productividad de 26 gpf l-1·d-1. Mientras, en la muestra
permeabilizada durante 10 min se observaron 2 fases de crecimiento: una del día
41
0 al 11 con una µ= 0.061 d –1 y otra del día 11 al 18 con una µ= 0.120 d–1; la
productividad, en cuanto a biomasa del cultivo fue de 18 gpf l-1·d-1. Finalmente, en
contraste con las otras dos muestras, en las células permeabilizadas durante 15
min no hubo crecimiento.
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
T estigo10 m in15 m in
Biomasa (gpf l-1)
A
0
1000
2000
3000
4000
5000
0 5 10 15 20 25
Testigo10 min15 min
Betacianinas (mg BC l-1)
B
Tiempo (d)
Figura 13. Cinéticas de: (A) crecimiento celular y (B) Producción de betacianinas de células de B. vulgaris L permeabilizadas con Tritón X-100® a una concentración de 0.7
mM y 2 tiempos de contacto.(Promedio de cinco repeticiones. Las barras indican la magnitud de la desviación estándar)
El crecimiento que presentó la muestra testigo concuerda, tanto en las
concentraciones de biomasa, como en el perfil de crecimiento con lo reportado por
42
diversos autores (Rodríguez y col., 1994; Rodríguez y Galindo, 1999; Trejo-Tapia
y col., 2001; Martínez, 2003).
Por otra parte, los resultados del lento crecimiento observado en las
muestras tratadas con Tritón por 10 min, presentado al inicio de la cinética
sugieren por un lado, que probablemente solo una fracción de la población celular
fue resistente a las condiciones usadas en el tratamiento. Este resultado coincide
con lo reporta Brodelius (1988) para Chenopodium rubrum (productora de
betaninas) y otras dos especies celulares Catharantus rubrum y Thalictrum
rugosum siendo estas dos ultimas especies mas resistentes al tratamiento con el
detergente. Por otra parte, existe la posibilidad de que se haya presentado un
proceso de reparación en el que una cantidad importante del flujo metabólico y por
ende del aporte energético de la célula, estaría dirigido de manera preferencial a
realizar procesos vitales como lo reportan Sakuta y Komamine (1987); Zhang y col
(2002) para otras especies vegetales.
Al respecto, en la literatura consultada se señala que dependiendo del
tiempo de tratamiento con el AQP, la apertura de los “microporos” en el proceso
de permeabilización, puede incluir también un desprendimiento limitado y parcial
de proteínas periféricas y lipopolisacáridos constitutivos de las membranas,
estructuras químicas con las cuales mantiene su integridad, viabilidad y capacidad
de seguir creciendo y que además tienen cierto efecto protector de la
desnaturalización por detergentes (Felix, 1982; Brodelius, 1988; Almgren, 2000).
En el proceso de reparación, las proteínas que conforman las membranas se
43
sintetizan en los ribosomas y son transportadas a vesículas que se forman en el
aparato de Golgi, sustituyendo o reparando las proteínas faltantes de la membrana
(Felix, 1982; Bassham y Raikhel, 1996).
Por otro lado, el cultivo celular es una mezcla compleja formada por una
población heterogénea que estaría involucrando la conjugación dinámica de: a)
células muertas (Miranda, 2003) y b) células que fueron capaces de resistir el
proceso de permeabilización de acuerdo a las evidencias experimentales
encontradas en el presente trabajo así como células que probablemente estén en
un proceso de reparación, por lo que el resultado de todo ello sería el lento
crecimiento celular observado. Un comportamiento análogo fue reportado para A.
tricolor por Knorr y Teutonico (1987) y en C. blumei por Park y Martínez (1992)
utilizando quitosano y DMSO como AQP’s, respectivamente.
Posterior al proceso de reparación, las células tendrían la capacidad de
crecer nuevamente y de acuerdo a lo señalado por diversos autores (Dörnemburg
y Knorr, 1995; Bassham y Raikhel, 1996; Zhang y col., 2002) el flujo metabólico y
por ende el gasto energético se redireccionaría tanto a los procesos de citocinesis
o división, así como de expansión celular, aumentando en número y tamaño la
población de células en el cultivo. De esta manera es posible explicar el cambio en
el valor de la pendiente y por ende un incremento en el valor de µ del día 11 al 18
en la cinética de la figura 13A, llegando a presentar valores de biomasa cercanos
a un 90 % con relación al cultivo testigo.
44
Finalmente, en las muestras permeabilizadas durante 15 min, el Tritón X-
100® aparentemente tuvo un efecto letal en las células, dado que no crecieron
durante 15 días. Cabe señalar que durante los primeros tres días, si bien las
células no crecieron, tampoco habían manifestado una pérdida de peso, lo cual se
evidenció a partir del día 7.
No obstante, la cinética se continuó hasta el día 15 con el objeto de esperar
una posible recuperación, lo cual no ocurrió; de hecho posterior al día 3, se
comenzó a observar oxidación y/o necrosis lo que probablemente sea producto
tanto del deterioro producido por el proceso de permeabilización, como al estrés
producido cuando se les adicionó el medio de cultivo fresco B5 (Parr y col., 1986;
Almgren, 2000).
Por otra parte, con relación a la producción de betacianinas, en la figura
13B se presentan las cinéticas que se obtuvieron para las células sometidas al
proceso de permeabilización. En el testigo se observó, un valor máximo a los once
días. Este resultado es similar a lo ya reportado en trabajos previos (Rodríguez y
Galindo, 1999; Trejo-Tapia y col., 2001; Miranda 2003); la productividad alcanzada
por el cultivo fue de 354 mg BC l-1·d-1 con una velocidad específica de producción
(ϕ) de 241 d-1.
La muestra permeabilizada durante 10 min presentó diferencias
importantes con el testigo, evidenciándose un desfasamiento en el tiempo para
45
alcanzar la máxima concentración en la muestra permeabilizada. Mientras que en
el testigo, dicho valor se obtuvo a los 11 días y luego permaneció constante, en la
muestra permeabilizada por 10 min este valor se obtuvo hasta el día 18. Sin
embargo, se debe resaltar el hecho de que la concentración máxima alcanzada
fue un 93 % del testigo y que ϕ de 248 d-1 fue similar al testigo aunque la
productividad fue de 200 mg BC l-1d-1, valor 42 % menor al testigo.
Como se ha señalado, este desfasamiento sugiere nuevamente suponer
que el flujo metabólico estuvo dirigido al proceso de reparación celular y no a la
división, expansión y metabolismo secundario (Dörnemburg y Knorr, 1995;
Bassham y Raikhel, 1996; Zhang y col., 2002).
Por tal motivo, el contenido de betacianinas que se tiene al inicio y hasta el
día 11 se refiere al que quedó sin ser excretado después del proceso de
permeabilización, o bien en aquellas células del interior de los agregados que no
tuvieron contacto con el Tritón X-100®; no es sino hasta después del día 11
cuando se evidencia un incremento en la cantidad de betacianinas, hecho que
sugiere que la célula comenzó a sintetizarlas nuevamente, es decir cuando los
eventos referentes al proceso de reparación aparentemente se han concluido ya
que coincide con el inicio del crecimiento celular acelerado, como se señaló en
párrafos anteriores.
46
Se especula que la reactivación de la vía de biosíntesis podría ser el
resultado de que algunos metabolitos secundarios pueden ser reconvertidos e
incorporados nuevamente en la ruta metabólica en eventos post-biosintéticos
(Zhang y col, 2002). Se sabe que uno de estos procesos involucra las reacciones
de condensación entre ácido betalámico con ciclo-DOPA (Schliemann y col, 1999),
con lo que es posible obtener la formación de la betanidina. Cabe señalar que este
pigmento es la principal betacianina (Martínez, 2003) de los cultivos celulares de
B. vulgaris utilizados en este trabajo.
De igual manera es importante tener en consideración que moléculas
pequeñas tales como algunos iones que son cofactores de algunas enzimas de la
vía de biosíntesis (Trejo-Tapia y col, 2001) así como intermediarios de la ruta
biosintética, por ejemplo algunos aminas o aminoácidos, pudieron ser liberados
de los compartimentos donde se encuentran almacenados, quedando accesibles
para incorporarse a la ruta metabólica (Böhm y Rink, 1988; Strack y col, 2003). En
este sentido, se ha reportado en la literatura la presencia en el citoplasma de
ciertas cantidades de aminoácidos y aminas que intervienen en la ruta de
biosíntesis de betalaínas (Stintzing y Schieber, 2001; Strack y col., 2003).
Con relación a aquellas células sometidas a 15 min de permeabilización, se
encontró que no hubo biosíntesis de pigmentos. De hecho, como se señaló
anteriormente, las células se observaron oxidadas o necróticas producto de la
degradación de las betacianinas a o y p-difenoles principalmente (Kujala y col.,
2001).
47
7.4. CONSIDERACIONES FINALES.
Los resultados encontrados en este trabajo sugieren que la
permeabilización de células de B. vulgaris utilizando Tritón X-100® es un proceso
complejo en el que se involucran diversos aspectos fisicoquímicos, bioquímicos y
fisiológicos coincidiendo con lo reportado por diversos autores (Parr y col., 1986;
Dörnemburg y Knorr, 1995; Gontier y col., 2002.
Al respecto, es importante conocer la edad del cultivo, el tamaño de los
agregados, las características hidrofílicas e hidrofóbicas del AQP y la facilidad que
tiene éste para que difunda a través de los agregados, la afinidad de las
membranas celulares por el agente permeabilizante, así como las vías de
biosíntesis y compartamentalización de los metabolitos secundarios de interés,
entre otros.
No obstante, la permeabilización continua siendo una alternativa
biotecnológica para promover la excreción de los metabolitos de interés
producidos por el cultivo de células vegetales (Ramachandra y Ravishankar, 2002;
Wu y Lin, 2003; Yang y col., 2003).
Por otro lado, los resultados de este trabajo demostraron que al agregar el
AQP, es posible lograr la liberación prácticamente inmediata (10 min) del 67.5 %
de BC respecto a la concentración inicial y adicionalmente se estableció la
48
posibilidad de que los cultivos ya permeabilizados, se recuperen del estrés y
recrezcan, llegando a producir cantidades de biomasa y de pigmentos
equivalentes a los que produjo el cultivo testigo; esta característica ya ha sido
reportada por otros autores (Brodelius, 1988).
Con el objetivo de mostrar la probable ventaja que representa entonces el
proceso de permeabilización se realizó un balance de masas el cual se representa
en la figura 14. En este esquema se comparan ambos sistemas: el proceso sin
permeabilización (sp) y el proceso sometido a permeabilización (cp).
a) Proceso sp. De manera resumida el proceso sp, consistió en suspender las
células (con 6 días de crecimiento) en medio líquido y posteriormente dejarlas
crecer; de acuerdo a los resultados de las cinéticas de crecimiento y producción
(figura 13AB) a los 15 días se obtiene tanto el máximo crecimiento celular, como la
mayor cantidad de BC, es decir a los 21 días acumulados (6 días del inóculo +
15días para llegar a su máxima producción y crecimiento).
Por lo tanto, se tendría una cantidad de pigmentos sintetizados [BC]s
correspondiente al nivel máximo de la cinética de la figura 13B. De tal manera que
[BC]s será igual a 38.7 mg; por lo tanto, la productividad es de 1.84 mg d-1.
Si de manera ideal este proceso permanece constante para cada ciclo de
producción, la cantidad acumulada de BC se puede representar por:
49
sBCtBCn
i∑
=
=1
][][ ........(4)
donde n representa el número de ciclos que se llevan a cabo; es decir, que
en dos ciclos se obtendrán 77.4 mg de BC, en tres 116. 1 y así sucesivamente; sin
embargo, la productividad permanecerá constante (es decir, 38.7 / 21 días = 1.84
mg BC d-1; 77.4/42 = 1.84 etc).
PERMEABILIZACION (Liberación de 13.5 mg BC)
BASE DE CALCULO: 10 ml
(condiciones iniciales 1 g pf y 20 mg de BC)
0
6
21
24
Biomasa: 3.3 gpf
Betacianinas: 35 mg
Biomasa: 3.65 gpf
Betacianinas: 38.70 mg (C)
PROCESO SP
PROCESO CP
TIEMPO (días)
Figura 14. Proceso de permeabilización con Tritón X-100 comparado con el
proceso por lotes para la producción de betacianinas por cultivo de células de B.vulgaris en suspensión (cálculos en base a un volumen de 10 ml).
50
b) Proceso cp. Debido a que se necesitaba una cantidad de masa celular
grande para realizar las pruebas de recrecimiento con sus respectivas
repeticiones, se trabajo inicialmente con un volumen de 400 ml de medio líquido
B5 conteniendo 40 g pf de células. Posteriormente, para la etapa de recrecimiento
el volumen de trabajo fue de 10 ml. Por lo tanto, para realizar el balance de masa
correspondiente, se planteó en una base de cálculo de 10 ml conteniendo 1 g pf
de biomasa y 20 mg de betacianinas (figura 13A).
Al agregar el AQP, las células liberaron una cantidad de BC y
posteriormente continuaron su crecimiento celular y biosíntesis de BC . Como se
mostró en la figura 13B, a los 24 días (6 días correspondientes al inoculo + 18 días
de la cinética), se llegó a la máxima producción de BC (35 mg), por lo que la
cantidad de BC totales sintetizadas será la siguiente:
[BC]s = [BC]e - [BC]f………(5)
Es decir 13.5 + 35 = 48.5 mg de BC. Por lo tanto, la productividad en este
caso es de 2.02 mg d-1, siendo casi un 10% mayor que en el proceso sp; este
valor demuestra de manera muy somera, la ventaja de esta alternativa.
De igual manera, una desventaja adicional de sp se refiere a la necesidad
de realizar la extracción del metabolito al final de cada lote de proceso, para lo que
es necesario realizar una lisis celular y la posterior recuperación del metabolito, no
51
así en cp, en donde se podría establecer varios ciclos de permeabilización –
crecimiento y producción.
Asimismo también es importante recordar que el almacenamiento
intracelular de los metabolitos secundarios que se está llevando a cabo en sp,
viene a ser una probable limitante para que se produzca una cantidad mayor de
BC, debido a dos factores principales: a) Por un lado los productos acumulados,
resultado de la biosíntesis, pueden ocasionar una inhibición de las enzimas
involucradas en la vía metabólica en cultivos de células vegetales, tal y como lo
reportan Wu y Lin, (2003) y b) el espacio disponible para almacenar estos
compuestos, está limitado por el tamaño de la vacuola lo que representa un
impedimento físico para incrementar la cantidad de metabolitos acumulados
(Zhang y col, 2002).
Para el caso de la biomasa, el balance se realizó siguiendo el mismo
procedimiento que el utilizado para BC. Los resultados mostraron que en sp, la
cantidad de biomasa producida [B]f corresponde a 3.65 gpf con una productividad
de 0.17 gpf d-1 mientras que en cp, la cantidad total de biomasa fue de 3.3 gpf,
con una productividad de 0.13 gpf d-1.
Como es posible observar, la productividad de cp fue menor a sp, en un
23.5 %; esta disminución se puede atribuir al posible daño celular causado por la
adición del AQP y además, como resultado de la permeabilización, existe un
periodo considerable (alrededor de 7 días, como se muestra en la figura 13 A) en
52
el que aparentemente las células no crecen debido a que están sometidas a un
proceso de reparación, como lo señala Felix, (1982).
Sin embargo, paralelamente estos resultados están demostrando que la
diferencia en la cantidad de biomasa no está afectando la capacidad de
crecimiento del cultivo ni la capacidad de biosíntesis de las BC.
53
8. CONCLUSIONES.
- De los cuatro detergentes propuestos para permeabilizar las células de B.
vulgaris, se seleccionó al Tritón X-100 con base en la respuesta favorable que
presentó a la liberación de betacianinas.
- Para la línea celular de B. vulgaris L. utilizada en este trabajo, se estableció que
las condiciones de permeabilización bajo las cuales las células siguen creciendo
son con una concentración 0.70 mM de Tritón X-100 y un tiempo de contacto de
10 minutos.
-No obstante que el proceso de permeabilización posiblemente implica un daño
celular, la línea de B. vulgaris L. utilizada en este trabajo, pudo ser recrecida un
ciclo más, en suspensión en matraces con medio de cultivo B5.
-En las pruebas de recrecimiento se obtuvieron niveles en crecimiento y
producción de betacianinas similares al testigo.
54
9. PERSPECTIVAS DEL TRABAJO.
• Estudiar la posibilidad de establecer un proceso donde las células puedan
ser permeabilizadas en forma continua, permitiendo la re-utilización del
mismo cultivo.
• Evaluar el efecto que tiene la adición del detergente en otras etapas del
crecimiento celular tanto en el crecimiento celular y en la producción del
pigmento, con el objeto de comparar el proceso con aquel donde el Tritón
X-100 se agrega en las primeras etapas del cultivo.
• Evaluar el daño estructural causado por el proceso de permeabilización y
correlacionarlo con la muerte celular.
• Evaluar la posible capacidad de reparación celular, con base en la
presencia de algunas enzimas características de dicho proceso.
55
10. BIBLIOGRAFIA.
Almgren, M. (2000). Mixed micelles and other structures in the solubilization of
bilayer lipid membranes by surfactants. Biochimica of Biophysica Acta 1508.146-163.
Bassham, D.C. and Raikhel, N.V. (1996). Transport proteins in the plasma
membrane and the secretory system. Trends in Plant Science. 1(1):15-20. Bassetti, L., Hgendoom M. and Tramper J. (1995). Surfactant-induced non lethal
release of anthaquinones from suspension cultures of Morinda citrifolia. Journal of Biotechnology. 39:149-155.
Böhm, H. and Rink. (1988). Betalains. In: “Cell culture and somatic cell genetics of
plants”. (Ed) I. K. Vasil. y F. Constabel. Academic Press. New York. 5: 449-463.
Brodelius, P.E., Funk, Ch. and Shillito, R. D. (1988). Permeabilization of cultivated
plant cells by electroporation for release of intracellularly stored secondary products. Plant Cell Reports. 7:186-188.
Brodelius, P. (1988). Permeabilization of plant cells for release of intracellularly
stored products: viability studies. Applied Microbiology and Biotechnology. 27:561-566.
Brodelius, P.E. and Pedersen, H. (1993). Increasing secondary metabolite
production in plant-cell culture by redirecting transport. Trends Biotecchnology 11:30-36.
Brown, J. T. (1990). The initiation and maintenance of callus cultures. In: Plant cell
and tissue culture. (Ed). J. W. Pollar and J. M. Walker. Humana Press. 6:57-63.
Cai, Y., Sun, M., Wu, H., Huang, R. and Corke, H. (1998) Characterization and
quantification of betacyanin pigments from diverse Amaranthus Species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49(6): 2063-2070
Catalogo de detergentes.(2002). Anatrace. com/ literature/ cat9900/ catalog.pdf Cormier, F., Bao Do, Ch. and Moresoli, Ch. (1992). Anthocyanin release from
grape (Vitis vinifera L.) cell suspension. Biotechnology Letters. 14(11):1029-1034.
56
Cuevas, C. J. (2003). “Estudio de la permeabilización con Tritón X-100 de células de Beta vulgaris mediante análisis digital de imágenes”. Tesis de Licenciatura. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología. México, D.F.
Delgado-Vargas, F. Jiménez-Aparicio, AR. and Paredes-López, O (2000) Natural
pigments : carotenoids, anthocyanins and betalains-characteristics, biosynthesis, processing and stability. CRC Critical Review in Food Science and Nutrition. 40(3):173-289.
Dicosmo, F. and Misawa, M. (1995). Plant Cell and Tissue Culture: alternatives for
metabolite production. Biotechnology Advances.13:425-463. Dörnenburg, H. and Knorr, D. (1992). Release of intracellularly stored
anthraquinones by enzymatic permeabilization of viable plant cells. Process Biochemistry. 27:161-166.
Dörnenburg, H. and Knorr, D. (1995). Strategies for the impromevement of
secondary metabolite production in plant cell cultures. Enzyme and Microbial Technology. 17:674-684.
Dörnenburg, H. and Knorr, D. (1997). Challenges and opportunities for metabolite
production from plant cell and tissue cultures. Food Technology. 51(11):47-54.
Felix, H. (1982). Permeabilized cells. Analytical Biochemistry. 120:211-234. Gamborg, O.L., Miller, R.A. and Ojima, K. (1968). Nutrient requeriment of
suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research. 50:151-158.
Goñi, F. and Alonso, A. (2000). Spectroscopic techniques in the study of
membrane solubilization, reconstitution and permeabilization by detergents. Biochimica et Biophysica Acta 1508. 51-68.
Gontier, E., Clément, A., Trant, T. Gravot, Liévre, A., Guckert, A. and Bourgaud, F.
(2002). Hydroponic combined with natural or forced root permeabilization: a promising technique for plant secondary metabolite production. Plant Science. 163: 723-732.
Gowrishankar, T.R. and lee, R.C. (1998). Characterization of cell membrane
electroporation. www.fp.mcs. anl.gov/ccst/research/reports-pr1998/comp_ bio/electroporation
Havkinfrenkel, D., Dorn, R. and Leustek, T. (1997). Plant tissue culture for
production of secondary metabolites. Food Technology. 51(119):56-61.
57
Jiménez A. A .(1995) Producción de colorantes de interés alimentario por cultivo de células vegetales: Las betalaínas del betabel (Beta vulgaris L.) como caso de estudio. Tesis de Doctor en Ciencias. Especialidad en Alimentos. ENCB-IPN. México. pp 1-243.
Jiménez, A. A., Gutierréz L.G. and Rodríguez M.M. (1996). Caracterización
reológica del cultivo de células de betabel (Beta vulgaris L.) productoras de betalaínas en un bioreactor tipo tanque agitado. En: Propiedades físicas de los alimentos. Tomo 1. (Ed.) M. Hubinger, F.X. Murr, J.M. Aguilera. España. pp.105-1112.
Jiménez, A.A., Del Villar M.A.A., Dávila, O.G. and Rodríguez M.M. (1997).
Estabilidad fisicoquímica de la betanina producida por cultivo de células de betabel (Beta vulgaris L.). Acta Mexicana de Ciencia y Tecnología. 12(42):67-80.
Juárez-Sánchez, M., Jiménez-Aparicio, A., Gutiérrez-López, G., Trejo-Tapia, G.
and Rodríguez-Monroy, M. (2002). Broth rheology of Beta vulgaris cultures growing in air lift bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 12:37-41.
Kilby, N.J. and Hunter, C.S.(1990). Repeated harvest of vacuole-locatedsecondary
product from in vitro grown plant cells using 1.02 MHz ultrasound. Applied Microbiology Biotechnology 33:448-451.
Kino-Oka, M., Mine, K., Taya, M., Tone, S. and Ichi, T. (1994). Production and
release of anthraquinone pigments by hairy roots of madder (rubia tinctorium L.) under improved culture conditions. Journal of fermentation and Bioengineering. 77(19):103.106.
Knorr, D. and Berlin, J. (1987). Effects of immobilization and permeabilization
procedures on growth of Chenopodium rubrum cells and amarantin concentration. Journal of Food Science. 52(5):1397-1400.
Knorr, D. y Teutonico, A. (1985). Chitosan inmobilization and permeabilization of
Amaranthus tricolor cells. Journal of Agricultural Food Chemistry.34:96-97 Kujala, T. Loponen, J. and Pihlaja, K. (2001). Betalains and phenolics in red
beetroot (Beta vulgaris) peel extracs:extraction and characterization. Zeitschrift Fur Naturforsch. 56c: 343-348.
Le Maire, M., Champeil P., and Moller, J.V. (2000). Interaction of membrane
proteins and lipids with solubilizing detergents Biochimica Acta 1508. 86-111.
Lerner, H., Ben-Bassat, D., Reinhold L. and Poljakoff-Mayber. (1978). Induction of “pore” formation in plant cell membranes by toluene. Plant Physiology. 61:213-217.
58
Lichtenberg, D., Opatowski, E. and Kozlov, M. (2000). Phase boundaries in mixtures of membrane-forming amplhiphiles and micelle-forming amphiphiles. Biochemica et Biophysica Acta 1508:1-19.
Martínez, B. (2003). Identificación de las betalaínas producidas por cultivo de
células de Beta vulgaris L. var. “Crosby Egyptian” en diferentes sistemas (callo y suspensión celular). Tesis de Maestria. Centro de Desarrollo de Productos Bióticos /IPN. Yautepec, Mor.
Meiners, S., Gharyal, P.K. and Schindler, M. (1991). Permeabilization of the
plasmalemma and wall of soybean root cells to macromolecules. Planta. 184:443-447.
Miozzari, G.F., Niederberger, P. and Hütter, R. (1978). Permeabilization of
microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry.90:220-223. Miranda, H. L. (2003). Análisis de imágenes para la medición de viabilidad y
morfología de cultivos de B. vulgaris y Chinchona robusta. Tesis de Maestria. Centro de Desarrollo de Productos Bióticos /IPN. Yautepec, Mor.
Miyanga, K., Seki, M. and Furusaki, S. (2000). Analysis of pigment accumulation
heterogeneity in plant cell population by image-processing system. Biotechnology and Bioengineering. 67(4):493-497.
Mukundan U., Bhide V., Singh G., and Curtis W.R. (1998). pH-mediated release of
betalains from transformed root cultures of Beta vulgaris L. Applied Microbiology Biotechnology. 50:241-245.
Nilsson, T. 1970. Studies into pigments in beet root. Lantbrukshog. Skolans
Annalers.36:179-190. Ontiveros, J. A. (1994). Aislamiento de líneas celulares de Beta vulgaris
productoras de betalaínas. Tesis de Licenciatura. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México. México.
Park, Ch-H. and Martinez, C. (1992). Enhanced release of rosmarinic acid from
Coleus blumei permeabilized by dimethyl sulfoxide (DMSO) while preserving cell viability and growth. Biotechnology and Bioengineering. 40:459-464.
Parr, A. J., Robins, R.J., Rhodes, M. J. C. (1986). Product release from plant cells
grown in culture. In: Secondary metabolism in plant. Ed: Morris, P., Scragg, A.H., Stafford, S., and Foulier, M.W. Cambridge Univ. Press, UK. 173-197.
Pépin, M.F., Smith, A.L. and Reid, J. F. (1999). Application of imaging tools to plant
cell culture: relationship between plant cell aggregation and flavonoid production. In vitro Cell. Dev. Biology Plant. 35:290-295.
59
Piatelli, M. (1981). The betalains. Structure biosynthesis and chemical taxonomy. In “Biochemistry of plants: a comprenhesive treatise”. (Ed) E.E. Conn. Academic Press. New York. EUA. 7:557-575.
Ramachandra, R. S. and Ravishankar, G.A. (2002). Plant cell cultures: Chemical
factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20:101-153. Rodríguez M.M., Jiménez A.A., Dávila O.G. and Sepúlveda J.G. (1994). Effect of
carbon source on cell growth and betalain production in cell suspension culture of Beta vulgaris. Biotechnology Letters.16(8):853-858.
Rodríguez M.M. and Galindo E. (1999). Broth rheology, growth and metabolite
production of Beta vulgaris suspension culture: a comparative study between cultures grown in shake flasks and in a stirred tank. Enzyme and Microbial Technology. 24:687-693.
Saguy, I., Kopelman, I. J. and Mizrahi, S. (1978). Computer-aided determination of
beet pigments. Journal of Food Science. 43:124-127. Sakuta, M. and Komamine, A. (1987). Cell growth and acumulation of secondary
metabolites. In: "Cell culture and somatic cell genetics of plants". (Ed.) Asil, I.K. and Constabel, F. Academic Press. Tokio, Japan. 4:97-114.
Schreier S., Malheiros S.V.P., and De Paula E. (2000). Surface active drugs : self-
association and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological aspects. Biochimica et Biophysica Acta 1508. 210-234.
Schliemann, W., Kobayashi, N. and Strack, D. (1999). The decisive step in
betaxanthin biosynthesis is a spontaneous reaction. Plant Physiology. 119: 1217-1232.
Schwartz, S.J., Hildenbrand, B. E. and Von Elbe, J.H. (1981). Comparison of
spectrophotometric and HPLC methods to quantify betacianins. Journal of Food Science. 46:296-297.
Stafford, A. (1991). The manufacture of food ingredients using plant cell and tissue
cultures. Trends Food Sci. Technol. 2.116-122. Stintzing, F., and Schieber, A. (2001). Phytochemical and nutritional significance of
cactus pear. European Food Research Technology. 212: 396-407. Strack, D., Steglich, W. and Wray, V. (1993). Betalains. Methods in Plant
Biochemistry. Vol. 8. Ed. Academic Press. EUA. P:421-450. Strack, D., Vogt, T. and Schliemann, W. (2003). Recent advances in betalain
research. Phytochemistry. 62: 247-269.
60
61
Thimmaraju, R., Bhagyalaksmi, N., Narayan, M.S. and Ravishankar (2003). Food-
Grade chemical and biological agents permeabilized red beet hary roots, assisting the release of betalains. Biotechnology. Progress. 19. 1274-1282.
Topete, M., Torres, L. G., Ramírez, Ma. E., Herrera, M. and Galindo, E. (1991):
Avances en los sistemas de cultivo masivo de Células vegetales. Ciencia y Desarrollo. XVII. (99):73-85.
Trejo, T., Jiménez, A., Rodríguez, M., Sepúlveda, G., Salcedo, G., Martínez, B.,
Gutierrez, G., and De Jesús, A. (1999). Influence of medium constituents on growth and betalain production in cell suspension cultures of Beta vulgaris. Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology. 7(2):1-11.
Trejo-Tapia, G., Jiménez-Aparicio, A., Rodríguez-Monroy, M., De Jesús-Sanchez,
A. y Gutierrez-Lopez, G. (2001). Influence of cobalt and other microelements on the production of betalains and the growth of suspension cultures of Beta vulgaris L. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 67:19-23.
Verpoorte, R., Contin, A., Memelink, J. (2002). Biotechnology for the production of
plant secondary metabolites. Phytochemistry. 1:13-25. Wang, H., Komolpis, K. and Kaufman, B. (2001). Permeabilization of metabolites
from biologically viable soybeans (Glycine max). Biotechnology Progress. 17:424-430.
Wu, L. and Lin, L. (2002). Elicitor-like effects of low-energy ultrasound on plant
(Panax ginseng) cells: induction of plant defense responses and secondary metabolite production. Applied Microbiology Biotechnology 59:51-57.
Wu, J. and Lin, L. (2003). Enhancement of taxol production and release in Taxus
chinensis cell cultures by ultrasound, methyl jasmonate and in situ solvent extraction. Applied Microbiology and Biotechnology. DOI 10.1007/s00253-003-1275-x.
Yang, R.Y.K., Bayraktar, O. and Pu. H.T. (2003). Plant–cell bioreactors with
simultaneous electropermeabilization and electrophoresis. Journal of Biotechnology. 100:13-22.
Zhang, W., Curtin, Ch. and Franco, Ch. (2002). Towards manipulation of post-
biosynthetic events in secondary metabolism of plant cell cultures. Enzyme and Microbial Technology. 30:688-696.
