Interpretácia výsledkov analýzy krvných buniek rutinnou prietokovou cytometriou

Marián Bobovčák (bobovcak@npolianka.sk)Klinické laboratórium VÚPCH-VVZ a.s., Nová Polianka - Vysoké Tatry

Seminár Poprad – jún 2013

Aplikačné oblasti Prietokovej cytometrie (FC) v klinickej diagnostike

ČO JE MOŽNÉ MERAŤ – FC:Bunky, častice (1-100 um)fluorescsenčné značenie (fluorochróm)meranie jednotlivej častice- protilátky (značenie)- farbiváMolekuly -povrchové-intracelulárne-subcelulárne štruktúry-solubilnéAnalýza časticových populácií-povrchová a IC expresia-kvantifikáciafunkčné prejavy-metabolizmus, chemizmus-aktivácia, proliferácia, apoptóza-vitalita-kolokalizácia molekúl-prenos signálov... -humorálne faktory....kombinácia parametrov !Vzorky-periférna krv , izolované bunky,-tkanivové kultúry, BAL, punktáty, -kostná dreň, CSF, moč, -L. uzliny, solídne tkanivá.... -atď

- Hematológia (onkológia, anémie, -pénie ...)

- Imunológia a alergológia (fenotypizácia a funkcia imunocytov)

- Transplantológia, bunková terapia - Infektológia a interná medicína - DNA analýza – solídne nádory- Genetika a reprodukčná medicína- Mikrobiológia- klinický výskum

Interpretácia:- analýza dát cytometrickým softwarom- interpretácia klinicko diagnostická

Základné časti prietokového cytometra

1-3 SS – bočný rozptyl

FW – priamy rozptyl

Fluorescencie5-8 (36)

Základné parametre merané v klinickej prietokovej cytometrii.

Bunka FW – priamy rozptyl svetla= cca VEĽKOSŤ bunky Ly<Mo<Gra

SS – bočný rozptyl svetla= GRANULARITA bunky Ly<Mo<Gra

FL1 FL2 FL3 ... atď

Povrchové molekuly

Monochromatické svetlo, laser

FL1

FL2

Cytogramy

+ +

+ -- -

- +

CD3

HLA DR

1 10 100 1000

1000

100

10

LymfoFL2

FL3Aj negatívna expresia = významný znak ! Intenzita expresie= počet molekúl

Intenzita

Monoklonálne protilátky značené fluorescenčne

Monocyty

Granulocyty

RT-SSC RT-SSC

CD3+ T-Lymfocyty

CD3+ 8+ 4- CD3+ 8+ 4+

CD3+ 8- 4+CD3+ 8- 4-

CD3+ 4+Lymfo-Helpery

FW

SS

Ly

Mo Gra

Multiparametrová analýza periférnej krvi – cytometrická analýza tzv. „gating“trojfarebná kombinácia protilátok antiCD4-FITC, antiCD8-PE, antiCD3-PE-Cyanin5.

Lymfocyty

Granularita

Veľ

kosť

Aby sme mohli výsledky analýzy krvi interpretovať -základné imunocyty - bunky imunitného systému – funkcia - vzťahy

Vrodená imunita

Monocyty -Makrofágy

Dendritické b.

NK bunky

Most Vrodené - Získané

Získaná imunita

Neutrofily, Eo

Fagocytóza, Komplementzabíjanie mikróbov

chemokíny, lyzozým,metabolické vzplanutie

Defragmentácia rozloženie

makromolekúl: tvorba antigénov

Cytokíny

Protilátky, opsonizácia

Prezentácia antigénu

NKT bunky

Blymfocyty

Tlymfocyty

Plazmocyty

Th, Tc, Treg...etclymfocyty

Imunitná odpoveď v periférnej krvi neprebieha !V periférnej krvi - odraz niekde prebiehajúcej lokálnej odpovede (krivé zrkadlo)

Normálna IO prebieha lokálne:-v sekundárnych lymfatických orgánoch – slezina, LU

(miesto kooperácie imunocytov)- v slizniciach - GALT, BALT, - v tkanivách

Vzorky na analýzu:BALVýpotkysynoviálna tekutina CSFPunktáty LU

GALTPayerove plakyApendixsubmukóza

Slezina

LU

Waldeyer kruh• tonsily• adenoidné tk.

BALT

Primárne lymfoidné orgány

Sekundárne:• Lymfatické uzliny• slezina

Lymfatické tkanivá v slizniciach (MALT)

Genitálny trakt

Týmus

Kostná dreň

CD systém Cluster of DifferentiationHLDA - leukocyty 8. workshop zaradené do

HCDM - Human Cell Differentiation Molecules – HDCM 9 Barcelona cez 360 molekúl www.hcdm.org

Prítomnosť leukocytov v periférnej krvi zdravých – líniové markery

Myelomonocytárny rad Lymfoidný rad - lymfocyty

Pluripotentná kmeňová bunkaKostná dreň

Lymf. uzlina

Tkanivo

Progenitory

Periférnakrv

NeuCD16+

BazoCD203c+

EoCD16-

MonocytyCD14+

ErytrocytyTrombocyty

Dendritické bunky

Makrofág-Akt. MF

AktiváciaCD16+

HLA DR+

granulocyty

Tr.B

zrelá BCD19+

Plazmocyt

T CD3+ =

T helper CD3+4+

subpopulácie, naivné, efektory, pamäťové, aktivované

CTL CD3+8+

T Reg...

NK CD3- CD16+-56+-

NKT CD3+

CD34+

Pan Leu CD45+

Čo hľadáme vo výsledku FC pri fenotypizácii leukocytov.

Deficit určitej subpopulácie leukocytov, ktorá je normálne prítomná(vyšetrujeme pokiaľ možno mimo akútneho ochorenia a opakovane – aj pol roka)1. primárny (najčastejšie kombinovaný, CVID) 2. sekundárny získaný a/alebo spojený s akútnym či chronickým ochorením.- deficit početný - chýbanie, redukcia počtu subpopulácie- deficit molekuly, receptora, funkčný deficit....

Prebytok určitej subpopulácie (relatívny, absolútny)- významný - klonalita, nezvyčajné znaky- prítomnosť aktivovaných buniek - zvýšenie expresie molekuly (akt. znaku CD16, CD25, HLADR)

(mono-makrofágy, aktivované T)

V periférnej krvi - odraz (krivé zrkadlo) prebiehajúcej lokálnej odpovede- veľmi zriedka proliferujúce bunky (mimo onkologických ochorení)

- možno nájsť aktivované bunky - žiadne, málo, buniek typu CD34+, dendritické bunky, plazmocyty

Nezvyčajný obraz analýzy (vzhľad populácie, nezvyčajné znaky napr. leukémie, proliferujúce bunky, apoptóza...)

Čo hľadáme vo výsledku FC pri fenotypizácii leukocytov.

Početné zastúpenie populácií: lymfocyty Th,Tc, B, NK, NKT (cca100%)- relatívne zastúpenie % populácie v rámci lymfocytov, - regulačné pomery,ak nejde o primárny deficit populácie, alterácie sa objavujú pri perzistujúcich infekciách, ochoreniach s imunopatogenetickým pozadím. IRI= T-CD4/T-CD8 (1-2,5)IRI: zníženie HIV (abs), Herpes vírusy, CMV, EBV,VZV (rel, nárast CD8)

Zníženie T a B, nie NK – Influenza (abs) Bakteriálne infekcie vnútorné (SPA, klebsiela, ) nárast CD4(rel)TBC, intracelulárne infekcie,granulomatózy, zníženie T CD4 (rel), zvýšenie NKTBakteriálne superficiálne infekcie len malé zmeny v T populáciách

- absolútne počty (aj keď je populácie relatívne málo (deficit) – abs. počet postačuje)

V každej krvi - zdravého jedinca sa nachádzajú subpopulácie subpopulácií !(napr. CD3 - naivné, pamäťové bunky, špecifické a nešpecifické efektory T, NK, funkčne odlišné populácie) špecifický klon predstavuje 1-10-tky buniek / ul krvi

Špecifické celulárne deficiencie je často ťažké odlíšiť od efektu infekčných agensna IS , zmeny v populáciách môžu pretrvávať mesiace (herpetické vírusy)

Zmeny v subpopuláciách sprevádzajú infekcie, vakcináciu, terapiu – nie sú diagnostické!Nie je vždy možné určiť či zmeny v populáciách = imunodeficiencia / imunitná odpoveď

Aké protilátky (základné líniové znaky) vybrať pre rutinný protokol FC

CD45: pan Leu marker – na rozlíšenie non Leu buniek a debris

Anti: CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD 16 (56), HLA-DRNajlepšie v rámci 1skúmavky – teoreticky 2n populácií (n=počet znakov)

CD3+(CD19-CD16-) : všetky populácie T lymfocytov a NKT bunky (16+56)CD3+4+8-(16-) : T helperické ly. (bunka reguluje IO, HIV) , NKT (16+56)CD3+4-8+(16-) : T cytotoxické ly. (nádory, autotolerancia), NKT (16+56) CD3+4+8+(16-): T nezrelé ly. (malé deti, posun z LO)CD3+ 4-8-(16-) : T d. neg ly. (TCR gama/delta a iné, napr intracel. parazity, TBC)CD3+DR+ : Aktivované T lymfocyty (efektorové bunky)

CD19+ DR+ (CD3-4-8-16- ) : všetky populácie B lymfocytov (tvorba protilátok)

CD16+56+(CD3- 8+dim 80% ) : NK bunky (vírusy, nádory, im. dohľad)

CD3+ CD16+-56+- CD8+ - CD4+-) : NKT bunky funkcia NK, funkcia T - IFNg

Lymfocyty

Aké protilátky (základné líniové znaky) vybrať pre rutinný protokol FC Anti: CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD 16 (56), HLA-DR

Monocyty CD14+ a Granulocyty CD16+-nie len lymfocytom je potrebné venovať pozornosť pri rutinnej analýze !

Monocyty 45+14+ >SS ako Ly, CD4 dimm, HLADR, CD16+ aktivované makrofágy

Granulocyty >SS ako Mono, > FS, 45+14± , CD16+ Neutrofily CD16- Eozinofily

Granulo

Aké protilátky (základné líniové znaky) vybrať pre rutinný protokol FC

Monocyty a Granulocyty potrebné venovať pozornosť pri rutinnej analýze !

CD16 CD16

SSSS

Aktivované Mono CD16+

Monocyty

Lymfocyty

Neutrofily CD16+

Eozinofily CD16-

Rutinný protokol fenotypizácie periférnej krvi (CD4, 19/CD8,16/CD3/CD45)

Leukocyty

Debris

LyMo Gra Neutrofily

Eozinofily

Th, NKT

Tc, NKT

B

Th, NKT

Tc, NKT

NK

NK

BCD3+4+8+

CD3+4-8-

CD3+4-8+

CD3+4+8-

Gate z CD3 buniek

CD4

SS

CD16

SS

CD4CD19

CD3

CD8CD16

CD4

CD8CD3

CD45

Rutinný protokol fenotypizácie periférnej krvi -pokračovanie

Aktivovanémonocyty CD16+

Všetky T bunkyvčítane NKT

CD16

CD3 FS

SS

Koľko je NKT buniek v zdravej periférnej krvi (CD16+56 /CD45/ CD3/CD4)

Th,NKT

Tc,NKT

NK NKT

TB

NK, B

Populácia NKT buniek v zdravej periférnej krvi - subpopulácie

NKT (subtypy) : cca 5% z Lymfo, zvýšené napr. TBC, ADCC cytotoxická odpoveď podobne ako NK, Ne, Mf, Eo (CD16)TCR -aktivácia na glyko/lipidy- prezentoavné cez CD1d (baktérie TBC, kvasinky), silná produkcia IFN gama, IL4 ....

CD16

CD3

CD8

CD4 CD4

CD8

Kazuistika

Pacientka 33 r. v poslednom roku opakovane liečená pre obojstranné otitídy,Prijatá do VUPCH pod obrazom atypickej pneumónie s interlobárnou reakciou a subfebrilitami, Gastritída.Laboratórne. : mierna anémia HG, Ery, Tr-pénia Fe norm. CRP 300 postupne klesá , FW1- 60, mierna leukopénia (3,7), Leu diff posun ku GRA 70% ( mierna lymfopénia 22%). Anti TB ,T-SPOTTB negat, diméry negat. Odobraná mikrobiológia a inf. serológia. Prietoková cytometriaIg(G/A/M) opakovane na hranici detekcie

= indikované vyšetrenie subpopulácií B lymfocytov

Kazuistika - rutinná fenotypizácia leukocytov

BAktivované

MonoNKTh Tc

Kazuistika – subpopulácie B lymfocytov

Kazuistika – subpopulácie B lymfocytov

CD 27

Naivné B lymf: 60,5%

B lymf. marginal zóny: 15,3%

Zdravý dárca

Izotypovo prepnuté pamäťové B lymf.: 21,3%

IgDZáver: pravdepodobný CVID

porucha expresie CD40L?prípadne iný genetický defekt

Odoslanie na imunologické konzíliumna navrhutie iv IgG suplementácie

Pacient:

Príklad HIV + pacientPacient – HIV+ hepatopatia, oportúnne infekcie TBC, kandidóza, anémia

Th 4,2% (19) Tc 51,1% (231)

452 517 6876

Príklad - Deficit CD16 na neutrofiloch (výskum Eo symbicort AB)

CD16 (NK, Mf, Ne) la FcRIII pre IgG – efektorové funkcie, fagocytóza opsoniz.častíc a IK, ADCC. Deficiencia je pravdepodobne kompenzovaná CD34, CD64 – bez dopadu na IO.Alely NA1, NA2, NA null – v kavkazkej populácii gén frekvencia 0,0274 (NAIN neonatal alloimunne neutropenia)

Pri absencii molekuly nutné použiť rôzne klony protilátok – genetické testy, RT PCR atď.

Ly akt.MoNeu CD16+

Eo CD16-

Normálny nález

Ly akt.Mo

Gra CD16-

Príklad akútne vírusové ochorenie (influenza)

Príklad Bronchiálna Astma exacerbácia - Eozinofily

Eozinofily

Neočakávané nálezy - príklad B-CLL

B

CD19

CD5

CD34

1000

100

10

1 10 100 10001 10 100 1000

CD19

CD5 CD14

HLA DRLymfo Ly-Mo

LEU

CD34 hematopoeticképrekurzory 0.1-0.5 %

Leukémie CD5, CD19, HLA DR,CD 13,14 screening (CD19+5+ Autoimunita)

1.5%

Neočakávané nálezy – onko hematológia - klonalita

1000

100

10

CD56+ 43%

CD38+ 95 %

CD19 vs CD20

FS vs SS

Lymfocyty

Plazmocyty

Plazmatické bunky fenotyp: CD45dim(100% ),CD38+(95% ), CD56+(43%), CD16-, CD19-,CD20-,HLADR-,CD3-,CD14-,kappa+, paraproteín, proliferácia

Neočakávané nálezy – pleurálny punktát aj periférna krv

Hematológia - počítanie RTC, eozinofilov a bazofilov

ErytrocytyRetikulocyty

Leukocyty

TrombocytyCD203c PE

SS

FL1

FL2

RNA+ThiazolOr- FL1

AutofluorescenciaEozinofily

Retikulárne Trombocyty

RTC + maturačný index

CD3

HLA DR MoCD4

CD25 CD45RA

CD4

CD69

Lymfo Lymfo

CD16

Leu CD45RA

Lymfo

CD45RO

CD4+LymfoCD14 Mono

CD3+DR+ Aktivov.T lymfo 8-15% 85-255b/ul

CD25+ Ly,Mo ( IL2R,)Včasná aktivácia

CD45RA+4+ naive,virgin32-49% 173-620 b/ul

CD69 Ly,Mo - de novoVčasná aktivácia (AIM)

CD14+16+ Aktiv.Mono -MF>15% v subklinickom štádiu

CD45RO+RA- memoryprimované Ag

BAL – flow cytometry

FW

SS

FW

SSLy

Mo Gra

Perif.Krv

BAL

CD45

CD3 CD4

CD3

Celulárny profil v BAL - a diagnóza

LymfocytózaLymfocytárna alveolitis

Sarkoidóza EAA

BeryliózaTBC , HIV , Virová BP

Polieková AlveolitisAlveolárna proteinóza

KolagenózyPneumokoniózy

Bronchiolitis obliteransLymfangiosis Ca

Neutrofília

Idiopat.pľ.fibrózaPneumónie-infekt

ARDSKolagenózy

Wegener.GranulomatózaPneumokonióza

Eozinofília

Eozinifilná pneumóniaChurg-Strauss-Syn.

Hyper Eoz.Syn.Alerg. BP aspergilóza

Idiopat.pľ.fibrózaLieky

Asthma bronchiale

Normálny nález / 80-90%AM /fajčiari/vylučuje:

Aktívnu Sarkoidózu Aktívnu EAA

BeryliózuEozinifilná pneumóniaAlveolárna proteinózaAlveolárna hemorágia

CD4/CD8zvýšenýzníženýnormálny (2,4 ±1,4)

Azbest

Ďakujem za pozornosť a trpezlivosť

Krajšie ako hory,sú hory, v ktorých som ešte nebol.