BiotecnologaDefinicinHistoriaProcesos en la biotecnologa alimentariaEtapas en el desarrollo de la biotecnologaAplicaciones de la biotecnologaAreas biotecnolgicas importantesProcesos biotecnolgicos por fermentacinProduccin de aminocidos, biopolmeros, compuestos aromticos y colorantesHidrlisis para la obtencin de glucosa y fructosa

BiotecnologaUso integrado de la bioqumica, microbiologa y de las ingenieras gentica, bioqumica y de procesos para fabricar productos a partir de microorganismos, cultivos celulares y partes derivadas de ellos (Knorr, 1987).La biotecnologa alimentaria puede definirse como el uso de las tecnologas biolgicas para la produccin, transformacin o conservacin de alimentos, o bien para la produccin de materias primas, aditivos y coadyuvantes empleados en la industria alimentaria (Garca Garibay y col., 1993).Ha permitido el desarrollo de procesos con base en las siguientes aplicaciones:1. Los mecanismos de control de la expresin y regulacin gentica en microorganismos y en clulas utilizadas.

2. Las leyes de la bioqumica y la fisicoqumica que regulan el comportamiento de stos entes biolgicos y de sus molculas.3. La fisicoqumica y los fenmenos de transporte involucrados en las operaciones de propagacin, recuperacin y utilizacin de los organismos o partes de ellos.

MicrobiologaBioqumicaIngenieraBiologamolecularBiotecnologa Universo de la Biotecnologa

Es una de las ms antiguas industrias. La panificacin, produccin de vino y cerveza se remontan al ao 2400 a.c., en India (los Vedas) con un producto similar al yogurt, y en los grabados de una tumba Egipcia describiendo la panificacin y fermentacin alcohlica.Posteriormente los estudios de Luis Pasteur ayudaron a comprender los mecanismos de la fermentacin en la produccin de cerveza, vino, vinagre, etc.Posteriormente se us la papana para la produccin de la cerveza siendo tal vez la primera patente con enzimas exgenas.A principios del siglo pasado (XX) empezaron a prepararse una gran cantidad de productos por fermentacin, tales como la biomasa de microorganismos como alimento, el cido ctrico, y la invertasa de levadura para la hidrlisis del azcar.Muchos alimentos y bebidas comunes se basan en fermentacin natural (queso y yoghurt), o en el uso de enzimas (jarabes fructosados, aspartamo).

El mayor impacto de la biotec. de alim. es la elaboracin de materias primas y aditivos alimentarios: edulcorantes no calricos, jarabes fructosados, aminocidos, vitaminas, etc.En cuanto a las aplicaciones analticas destacan las enzimas para la determinacin especfica de algunos componentes, microorganismos para la evaluacin de la calidad nutricional de alimentos. Tambin se han desarrollado sondas de DNA de anticuerpos para la determinacin rpida de patgenos (Salmonella, Listeria) adulteraciones de protena de origen animal por una de origen vegetal.El mayor beneficio se ha dado en el sector farmacutico y de salud, ya que son productos de alto valor agregado que pagan el costo de la investigacin rpidamente.Los antibiticos produjeron avances en en la tecnologa de fermentaciones, microbiologa industrial, mutaciones no especficas, control de expresin gentica.En los 70s y 80s la tecnologa del DNA recombinante se ha usado para producir protenas de inters farmacutico: insulina, hormona del crecimiento, interfern, activador del plasmingeno.La industria de los alimentos se encuentra muy departamentalizada y no tiene estructura de grupo, adems el consumo de alimentos es masivo, con bajo valor agregado.

Procesos de fermentacin en alimentosNaturales o espontneos (cultivos mixtos) : ensilado, cacao, caf, pozol Inoculados: vino, yogurt, tempeh (Rhizopus oligosporus)2. Procesos de fermentacin en medios de cultivoProduccin de biomasa: protena unicelular, levadura de pan, o de cervecera3. Procesos enzimticosElaboracin de materias primas: jarabes fructosados, cido asprticoProcesos de transformacin: malteado, coagulacin de lecheAditivos

Procesos Involucrados en la Biotecnologa Alimentaria

Cultivo de clulas vegetales:Elaboracin de materias primas: colorantesMicropropagacin Perodos de Desarrollo de la BiotecnologaPrimera Generacin: Etapa emprica o pre-Pasteur, donde se elaboran vinagre, bebidas alcohlicas, productos lcteos, alimentos fermentados tradicionales. No se tiene registro histrico.Biotecnologa Industrial: A partir de la segunda mitad del siglo XIX. Se divide en 2 etapas: I) Segunda generacin o era de Pasteur: Entre 1865-1940; desarrollo inicial de la microbiologa y la bioqumica. II) Tercera generacin: Era de los antibiticos, entre 1940-1975, surge la ingeniera bioqumicaCuarta Generacin o nueva Biotecnologa: En la segunda mitad de la dcada de los setenta, con la Ing. Gentica, cultivo de tejidos, anticuerpos monoclonales.

Biotecnologa no-convencional: Procesos de fcil implementacin, de pequea o mediana escala, tendientes a resolver problemas de ndole energtico o ecolgico.

AnticuerposIgG: 75% del total de IgAb: Protenas en forma de Y, localizadas en el suero sanguneo, producidas en respuesta a un antgeno especfico (MW~ 150 kDa)Inmunidad humoral: IgG (Ab), IgM, IgE (alergia), IgD, IgA (secreciones como saliva, calostro, lgrimas)

(Fluorocromo)Sistema biotina-avidina, que puede ser usado eficientemente en inmunofluorescencia indirecta (IF), Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) y radio- inmunoensayos (RIA).Fluorforo: digoxigenina

ELISA competitiva para la deteccin de Salmonella. Al aumentar la densidad de Salmonella, menos Ab estar disponible para enlazarse al Ag recubriendo los pozos. Esto conduce a menos enlace del Ab de deteccin a los Abs de los pozos y menor nmero de producto final (103-105 cel/mL).

ELISA tipo sndwich para la deteccin de una toxina. Un au-mento en el nmero de molculas de toxina conducir a un aumento en la formacin de producto final coloreado.

Procedimiento usado para aislar clulas de hibridoma produciendo anticuerpos monoclonales. PEG= polietiln glicol; HAT= hipoxantn aminopterina timidina.

Aplicaciones diagnsticas relevantes al procesamiento y produccin de alimentosCitometra de FlujoPartculas biolgicas de inters se colocan en suspensin. Se aade un color fluorescente a la suspensin la cual se hace fluir en un tubo que pasa por una fuente de luz, usualmente un rayo lser, una partcula a la vez. La de la luz se elige para que el colorante ligado a las partculas deseadas fluoresca. Una computadora cuenta y/o analiza las clulas o partculas que pasan por el rayo lser y fluorescen, las cuales pueden separarse de las dems y recogerse en recipientes separados. Algunas carctersticas de las partculas como tamao y forma no requieren usar colorantes, porque tienen una dispersin de luz tpica al pasar por el rayo lser.

IMPACTO DEL DESARROLLO BIOTECNOLGICO EN EL PROCESO DE DOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS:

QuesoCerveza

Primera Uso emprico de BAL Uso emprico de levadurasgeneracin Uso emprico de quimosina Uso emprico de malteado

Segunda Aislamiento y uso de BAL Uso de cultivos puros de lev.generacin Extraccin, purific. y carac- Naturaleza enzimtica del terizacin de la quimosina malteado Uso de papana para la clarificacin en fro

QuesoCerveza

Tercera Propagacin masiva de Mejor control de la fermentacinGenerac. BAL Seleccin de cultivos Fermentacin continua para lcticos mejorados. producir cerveza. Sustitucin de quimo- Prod. y uso de amilasas microbianas sina por proteasas mi- para sacarificacin y de -glucanasas crobianas producidas termotolerantes. en gran escala Uso de enzimas (glucosidasas amilasas) para la produccin de cervezas ligeras Cuarta ADN recombinante para Ing. Gentica para obtener levadurasGenerac. producir quimosina y amilolticas y prod. de -acetolactato mejoramiento de BAL descarboxilasa para [diacetilo]

Uso industrial de enzimas: Quimosina (Renina) La quimosina bovina causa un rompimiento especfico de la kappa-casena, que estabiliza las micelas de casena. Reconoce la secuencia de His98 a Lys111 y rompe el enlace peptdico entre Fen105 y Met106 de la cadena de kappa-casena.Es una proteasa producida en el cuarto estmago de la ternera, como un precursor (pre-pro-quimosina). 169 Despus de una serie de protelisis, la quimosina madura tiene un PM de 35.6 kDa, y se clasifica como una proteasa asprtica o carboxil proteasa.Tambin ataca enlaces Phe-Val, Glu-Ala, Leu-Tyr, Tyr-Leu, Leu-Val, Phe-Tyr pH ptimo de 3.5, aunque mxima estabilidad a pH 5.Experimenta autlisis a pH 3.5 y se desnaturaliza a pH>6.

Las proteasas de Mucor miehei, M. pusillus y Endothia parasitica, tienen similar estructura y especificidad. No obstante, estas proteasas no son adecuadas para quesos madurados puesto que tienen un rango diferente de actividades no especficas que la quimosina y no producen los sabores correctos en maduracin prolongada. Las fuentes microbianas son ms baratas y tienen ms estabilidad en su disponibilidad. Adems, los vegetarianos encuentran el uso de la renina bovina inaceptable. Uso industrial de enzimas: Quimosina (Renina)

Uso industrial de enzimas: Quimosina recombinanteOtra alternativa es clonar el gene bovino en una cepa productora adecuada y producir la enzima por fermentacin. Los huspedes posibles para su produccin son:Escherichia coli. Es el organismo ms frecuentemente usado en clonacin de genes. Desafortunadamente, las protenas recombinantes son frecuentemente sintetizadas intracelularmente como cuerpos de inclusin, lo cual incrementa considerablemente el costo del proceso. Adems, E. coli no es generalmente reconocida como segura para el consumo humano. Bacillus sp. Es no patognico y se usan industrialmente para producir amilasas. B. licheniformis produce la quimosina, pero las secuencias seal no permitieron la secrecin de la enzima al medio de cultivo.

Lactococcus lactis. Se usa en cultivos iniciadores, pero los niveles de produccin encontrados han sido muy bajos. Saccharomyces cerevisiae. Se han tenido dificultades para obtener altos niveles de secrecin en esta levadura. Kluyveromyces lactis. Se usa para producir -galactosidasa, y sus propiedades de fermentacin son bien conocidas. La quimosina pudo producirse en este husped y se han obtenido buenos niveles de secrecin al medio de cultivo. El gen de quimosina se insert en el cromosoma de K. lactis y la levadura se crece por fermentacin en lote alimentado. Despus de la fermentacin, la levadura se destruye aadiendo cido benzoico y la quimosina se separa por filtracion.Uso industrial de enzimas: Quimosina recombinante

Proceso de fermentacin en cervecera

Tipos de Malta

Proceso de fabricacin de cerveza Gushing: Espuma fuera de la botella. Ocurre cuando existen muchasmicroburbujas y liberacin excesiva e incrontrolada de CO2 Skunking: Cerveza daada por luz (UV), por enlazamiento de iso- humulonas con S (se pueden detectar partes por trilln).DMS: (CH3)2S, proviene de SmetilMetionina, umbral:10-150 ppb

Tipos de CervezaLos egipcios y mesopotmicos tenan en la cerveza un alimento imprescindible.Se producan hasta ocho tipos diferentes de cerveza que en Egipto era un monopolio econmico en manos del faranLos avances en la tecnologa cervecera se afianzan en Baviera, alrededor del ao 1400, al descubrirse las ventajas de la fermentacin, no en superficie sino en la profundidad de la cuba

Lager: Elaborada con cepas que crecen en el fondo del tanque: S. cerevisiae. Fermentacin a 6-12C, por 8-14 d, despus se almacena por mximo 3 semanas a -1C, antes de embotellar.

Es la que ms se produce en Alemania, E.U., Mxico, etc. Las lagers de E.U. tienden a tener poco lpulo comparado con las europeas, y no son amargas. Con 40-90 kcal/100 ml y

Tipos de cervezaAle: Se hacen con cepas de superficie que crecen uniformemente en todo el mosto, son S. cerevisiae o S. carlsbergensis. Crecen a 14-23C por 5-7 d. Es casi exclusiva de Inglaterra, y su periodo de aejamiento es de solo 1-3 d. Tiene sabores ms complejos que las lager por la T de fermentacin (sabor afrutado por steres, etc.). Las ales fuertes tienen >5% de alcohol, stout, porter, pale ale, bitter, con colores de amarillo a negro y sabores de ligeros a muy profundos y complejosCervezas secas y ligeras. Pueden hacerse de ales o lagers, aunque se usan ms comnmente las lagers. La ligera tiene sabor ms simple por menores niveles de carbohidratos no fermentescibles, obtenindose menos alcohol, y por tanto menos caloras (15-30 kcal/100 ml). Las cervezas secas tienen el mismo alcohol que las convencionales, pero con diferente calidad sensorial con menos sensacin de llenado. Sin alcohol:

Lpulo (Humulus lupulus)Confiere a la cerveza su sabor amargo caractersticoEste fenmeno se debe a la isomerizacin de sus resinasSus componentes amargos son la humulona, lupulona y sus compuestos de transicin, pero tambin tiene aceites esenciales (humuleno, farneseno) y taninos.Son las flores de la planta femenina del lpuloSe usa entre 0.4 y 4 g/LEs mejor usar extracto y resinas preisomerizadasAdems, el lpulo tiene otras funcionesProps. antimicrobianas contra Gram(+)Mayor cuerpo de la cerveza

Haze forming materialsYeastSpoilage organismsOxalic acidCell wallpolysaccharides fromBarleyStarchProteins andpolyphenols

Fermentacin primariaLa fermentacin es una parte crucial en el proceso de fabricacin de cervezaEl proceso de gliclisis y fermentacin fue elucidado primeramente en S. cerevisiaeDespus de la coccin se elimina el lpulo, se enfra el mosto y se transfiere al biorreactor.Se agregan ~0.5 L de una suspensin de levadura por 100 L de mosto para disminuir la fase lag.La fermentacin es un proceso anaerbico para generar energa a travs de la reduccin de aceptores electrnicos orgnicos como la G3P o acetaldehdo.Altas conc. de glucosa y otros carbohidratos evitan la respiracin de S. cerevisiae, alterando la estructura mitocondrial, ocasionando que la fermentacin sea la ruta predominante de obtencin de energa, an cuando exista abundante oxgeno, este fenmeno se denomina efecto Crabtree.

Glucosa (180 g) 2 EtOH (92 g) + CO2 (88) Alcohol deshidrogenasa (Zn)Piruvato descarboxilasa(Mg2+)

Fermentacin secundariaCuando todos los CHO fermentescibles se han convertido en EtOH, la cerveza se transfiere a otro tanque, se enfra y se almacena, an con la presencia de las levaduras.El aejamiento vara de varios das a meses, donde la levadura es capaz de ejercer un metabolismo limitado.Se dan otros cambios debido a reacciones qumicas que mejoran el sabor de la cerveza (steres: etil-, isoamil-, feniletil-; alcoholes, cidos etil octanoato y etil caprilato, dicetonas vecinales, comps. de azufre [DMSO, (CH3)2S, DMS], acetaldehdo, c. grasos de cadena corta)Cambio ms importante: reduccin en niveles de diacetilo (fuerte sabor a mantequilla) indeseable en cerveza. El diacetilo se forma a partir de -acetolactato (intermediario en la biosntesis de varios aminocidos) a travs de un proceso no enzimtico.El diacetilo se convierte lentamente a acetona por la levadura. Las cerveceras modernas carbonatan la cerveza antes de envasar (4-5 g CO2 /L). Se agrega glucosa para producir CO2 en el producto final.

[diacetilo]

N: ayuda a espumar,por polipptidos amfipticos (10-50 ppm), suprime carcter amargo.O2: envejecimiento, turbidezEtOH: puede inhibir espumado

A favor En contraPolipptidos Lpidos Iso -cidos DetergentesMe2+ EtanolN2Aspectos de la espuma de cerveza

Formacin (nucleacin, moldeado) Estabilidad (retencin de cabeza) Lacing (pegado, adhesin) Textura, blancura, etcProtenas responsables del espumadoHiptesis del polipptido discretoHip. De los polipptidos amfipticos generalizados

Mejoras biotecnolgicas de la cerveza: Represin catablicaLa glucosa es la mejor fuente de carbono para las levaduras porque puede pasar directamente a la ruta fermentativaLa glucosa es preferencialmente fermentada por las levaduras y se usan otros carbohidratos cuando se termina la glucosa, siendo entonces sujetos a represin catablica (RC)Esto resulta en una disminucin indeseable en la velocidad de produccin de etanol que a lo largo de un ao provoca prdidas significativas en la produccin de la cerveceraEn levadura, la RC tambin se ha llamado sealizacin de la glucosa. Cuando se termina la glucosa, se inactivan los genes necesarios para su utilizacin y se activan aquellos involucrados en la entrada y uso de otros azcares, como maltosa, ocurriendo un cambio diuxico.

Represin catablica en levadurasEn levaduras los niveles de adenosn monofosfato cclico (cAMP), aumentan cuando la glucosa est presente; esto bloquea la transcripcin de genes que codifican para protenas involucradas en la toma y uso de maltosa y otros azcares, aunque el mecanismo de esta regulacin no est claro todava. Como los mecanismos de la RC en levadura no estn claros no se pueden alterar los genes para modificar la RC. Se ha intentado eliminar la RC en algunas cepas de levadura de cervecera exponindolas a un mutgeno (sustancia que causa cambios aleatorios en la secuencia del DNA), y luego a 2-desoxiglucosa, un anlogo de glucosa, que no puede usarse como fuente de C (y energa) por las levaduras

Represin catablica en levadurasClulas con RC normal de las cepas silvestres no pueden usar fuentes alternativas de C debido al efecto inhibitorio de la 2-desoxiglucosa.Uno de los muchos mutantes puede desarrollar una RC alterada, por mutacin de un gen responsable de codificar una protena reguladora clave en la expresin gentica.Tal mutante podra ser capaz de usar otros carbohidratos, a pesar de la presencia de 2-desoxiglucosa.Esta estrategia se ha usado exitosamente para producir levaduras mutantes que pueden usar glucosa, maltosa y maltotriosa simultneamente, evitando la fase lag que normalmente ocurre a medida que declinan los niveles de glucosa.Recientemente los genes mig1 y mig2 se han descubierto como los responsables de la represin catablica

Uso de una estrategia de mutagnesis para aislar cepas de levadura con RC alterada

Mejoras en los procesos industrialesS. cerevisiae utilizada en la industria cervecera flocula al presentarse una falta de nitrgeno, oxgeno o carbono. La floculacin est controlada por una proteina de pared celular con su N-terminal hacia el medio y esta se une a glucoprotenas (manosa)Introduccin de -glucanasa para facilitar el filtrado de la cerveza (-glucanos son muy viscosos)Disminucin del tiempo de fermentacin por delecin de mecanismo de control de expresin de invertasa y maltasa (mig1, mig2), a causa de un incremento en el consumo de maltosa y un decremento en el tiempo de adaptacin cuando se agota la glucosa.

Biotecnologa: Cinco reas tecnolgicas principalesDNA recombinante (rDNA). Insercin de DNA a un nuevo sistema, donde se clona y se expresa.

Tecnologa enzimtica. Se usa la capacidad cataltica de las enzimas en solucin o inmovilizadas.

Cultivo de tejidos de plantas. Cultivo in vitro de clulas de plantas para obtener sustancias o biotransformaciones requeridas.

Tcnicas de clulas fusionadas. Fusin de dos clulas diferentes, produciendo hbridos con caractersticas de ambos padres.Ingeniera del procesamiento y tecnologa de fermentaciones.

Usos de la Biotecnologa en el procesamiento de alimentos

Diseo de microorganismos que transformen biomasa no comestible en alimento para consumo humano o alimentacin animal.Uso de sistemas biolgicos para ayudar al procesamiento de alimentos ya sea actuando directamente sobre el alimento o suministrando materiales que puedan aadirse al alimento (aditivos)Procesos innovadores en la tecnologa de alimentos: eliminacin de cido ercico del aceite de canola. www.alltech.com/es

Categora de ProcesosProduccin de clulas microbianas: levadura, vacunas, insecticidas microbianos.Produccin de metabolitos: alcohol, cidos orgnicos, antibiticos, aminocidos, vitaminas y enzimas.Bioconversin de sustratos, no utilizados para crecimiento: hormonas esteroides: Progesterona 11-hidroxiprogesterona por Rhizopus nigricans, luego por sntesis qumica: cortisona y otros tres esteroides (800 tons/ao).Bioconversin de sustratos, usados para crecimiento pero con objeto principal de cambiar su estado fsico: aguas residuales Alimentos fermentados: yoghurt, queso, ensilado, salami, etc.Cultivo de clulas de plantas y animales usando tcnicas microbiolgicas. a) Clulas animales. Anticuerpos monoclonales b) Clulas de plantas

Procesos BiotecnolgicosSeleccin del organismoGentica Aplicada(mutacin, recombinacin, manipulacin de genes)Biorreactor(Clulas microbianas, de plantas o animales; enzimas)CalorEliminacin de gasesEsterilizacinProcesos de recuperacin(rompimiento de pared celular, separacin S-L, concentracin, cromatografa, cristalizacin)Producto final(enzimas, antibiticos, aminocidos)Elim. deslidosElim.biomasa

Transformacin Gentica de Cultivos

Usos Potenciales de Plantas Transgnicas de Relevancia para Consumidores y la Industria de Alimentos.

Cultivos recombinantes liberados en EUA entre 1994 y 2000(lino)

http://whybiotech.com/mexico.asp?id=2701; Council for Biotechnology Information, (2004)"Plant Biotechnology: Current and Potential Impact for Improving Pest Management in U.S. Agriculture, An Analysis of 40 Case Studies," National Center for Food and Agricultural Policy, June 2002, .Rendimiento del algodn Bt en MxicoCutivos de OGM como canola, maz, algodn y soya representarion ms del 99% de cultivos de OGM a nivel mundial en 2001. En 2001 en EUA nicamente stos 4 cultivos ms papaya y calabacita transgnicos produjeron un extra de 4 millardos de lb de alimento y fibra, y aumentaron el ingreso de granjas en $1.5 millardos y redujeron el uso de plaguicidas en 46 millones de lb.

Factores que conducen a la hostilidad del consumidor hacia alimentos conteniendo plantas transgnicasDaar el ambiente?Es seguro para comer?Cmo me beneficia?La nueva tecnologaes riesgosaPreocupa-ciones del consumi- dorRechazo del consumidorde alimentos conteniendo plantas transgnicas

Compuestos indeseables en cultivos comestibles, naturaleza qumica y presencia o ausencia de lneas transgnicas con niveles reducidos de cada compuesto

Procesos biotecnolgicos por fermentacin Leches fermentadasGrupo I. Lactococcus y leuconostoc. Acidez baja moderada: Jocoque, buttermilkGrupo II. Lactobacillus. Acidez moderada/alta: Leche blgara, yakult, leche acidfila- Grupo III. Lactobacillus, Streptococcus. Acidez moderada/ alta. Yoghurt, Bioghurt, BranoGrupo IV. Bacterias lcticas y levaduras. Acidez y alcohol: Kefir, Koumis, BlgarosSueroProduccin de cidos orgnicos (propinico, actico, lctico), etanol, -galactosidasaMedio de cultivo: Protena unicelular (Kluyveromyces marxianus)Levadura para panificacin (S. cerevisiae), despus de hacer disponible los azcares (hidrlisis de lactosa)Bebidas (Rivella, Gefilus)

Composicin del suero lcteoDubach, 1988. Base hmedaDBO: 30-50 g/L

Grfico3

0.93

0.048

0.007

0.008

0.007

Grasa 0.80%

Proteina 0.70%

Lactosa 4.80%

Hoja1

Agua93%

Lactosa4.80%

Proteina0.70%

Grasa0.80%

Minerales0.70%

Hoja1

0

0

0

0

0

Lactosa 4.80%

Proteina 0.70%

Grasa 0.80%

Hoja2

Hoja3

Produccin mundial de suero lcteoFAO, 2001

Grfico1

0.0666681263

0.1136313877

0.0266672505

0.2063318299

0.0081008889

0.100264921

0.042770504

0.0570127425

0.043810483

0.0189057232

0.0121294391

Estados Unidos, 20.63%

Mxico 0.81%

Irlanda 1.21%

Asia 4.38%

Sudamerica 5.70%

Grfico2

0.0666681263

0.1136313877

0.0266672505

0.2063318299

0.0081008889

0.100264921

0.042770504

0.0570127425

0.043810483

0.0189057232

0.0121294391

Estados Unidos, 20.63%

Mxico 0.81%

Irlanda 1.21%

Asia 4.38%

Sudamerica 5.70%

Grfico3

0.0666681263

0.1136313877

0.0266672505

0.2063318299

0.0081008889

0.100264921

0.042770504

0.0570127425

0.043810483

0.0189057232

0.0121294391

Alemania10.03%

Mxico0.81%

Francia 11.36%

Italia 6.67%

Canad 2.67%

Nueva zelanda,1.89%

Irlanda1.21%

Sudamrica, 5.70%

Polonia4.28%

Hoja1

PaisMts%

africa91348

norteamerica22304incluye mexico y EU

sudamerica5208

asia4002

europa53413

mundial91348Italia60906.66681262866.67%

francia1038011.363138766Francia1038011.36313876611.36%Mxico740

canada24362.6667250515Canad24362.66672505152.67%

estados unidos1884820.6331829925Estados unidos1884820.633182992520.63%

argentina37704.1270744844Mxico7400.81008889080.81%

mexico7400.8100888908Alemania915910.026492096210.03%

egipto15051.6475456496Polonia39074.27705040074.28%

dinamarca19942.1828611464Sudamrica52085.70127424795.70%

alemania915910.0264920962Asia40024.38104829884.38%

islandia11081.2129439068Nueva zelanda17271.89057231691.89%

Netherlands47685.2195997723Irlanda11081.21294390681.21%

polonia39074.2770504007

Russian Fed18362.009896221

Switzerland14761.6157989228

australia21932.4007093751

Hoja2

Hoja3

Usos del suero lcteoCmara de productos alimenticios elaborados con leche, 1985Produccin de 1.15 millones de tons (1984), y 85% ms para 1995.Productos lcteos (WPC, WPI) Hidrolizados proteicosPanaderaConfiteraAc. LcticoEnzimas: inulinasa, lactasa a partir de K. lactis, o pectinasa y lactasa.Alimentacin humana Jarabes de suero Protena unicelular (C. utilis, K. marxianus)

Grfico3

1.3

0.13

Utilizacion del suero

Suero lacteo utilizado

suero no aprovechado 90%

Suero aprovechado 10%

Grfico1

32

1.3

56.5

E. U Mxico varios

produccion mundial de suero lacteo

Hoja1

32estados Unidos, Mxico, varios1.3Utilizacion del suero

1.30.13?

56.5

Hoja1

0

0

0

Produccion mundial de suero lacteo

Mexico1, 1%

Estados Unidos, 36%

Italia, francia, alemania, etc, 63%

Hoja2

0

0

Utilizacion del suero

Suero lacteo utilizado

Suero aprovechado 10%

suero no aprovechado 90%

Hoja3

Programas de investigacin sobre propiedades nutracuticas de productos lcteosInhibidores de la enzima convertidora de angiotensina-I (ACE)((Dism. la presin arterial)Glicomacropptido (64 aa)Prebiticos, probiticos y simbiticos-lactoglobulina como acarreador y fijador de retinol Pptidos bioactivos liberados de las estructuras nativas de la casena (casomorfinas, fosfopptidos)Protenas biolgicamente activas (lactoferrina y sus pptidos)

Productos fermentados de leche como alimentos funcionalesProbiticosMicroorganismos benficosPrebiticosIncrementan el crecimiento de probiticosSimbiticosprobiticos y prebiticos juntos

Hidrolizados de protena de leche Farmacutico dietas de formulacin definida, nutricin enteral, nutricin parenteral Alimentos infantiles hipoalergnicos, no alergnicos, bajo peso al nacer, fenilcetonuria Fortificacin Nutricional - calcio bebidas enriquecidas, bebidas isotnicas para atletas.

Pptidos derivados de la leche bovina con propiedades inmunoregulatorias Adapted from Gill & Rutherfurd, 1998

Algunos nutracuticos podran ser ms adecuadamente clasificados como frmacosVaca Hiper-inmunizada Tratamiento trmicoInmunizacinBacteriaVaca TransgnicaIngenera gentica Inmunoglobulinas basadas en Leche y calostro (MCBIs) Componentes antibacteriales no especficosTratamiento de enfermedades digestivas.ManufacturaPosible actividadanticariognica

Anti-allergy properties of fermented foods: an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria? M. L. Cross, L. M. Stevenson and H. S. Gill Milk and Health Research Centre, Institute of Food, Nutrition and Human Health, Massey University, Palmerston North, New ZealandInternational Immunopharmacology Volume 1, Issue 5, May 2001, Pages 891-901

AbstractClinical reports have suggested that dietary consumption of fermented foods, such as yogurt, can alleviate some of the symptoms of atopy and might also reduce the development of allergies, possibly via a mechanism of immune regulation. Controlled studies have indicated that consumption of fermented milk cultures containing lactic acid bacteria (LAB) can enhance production of Type I and Type II interferons at the systemic level. In animal models, LAB have been shown to promote interferon expression, and to reduce allergen-stimulated production of IL-4 and IL-5 in some cases. Recent results have shown that LAB are potent inducers of pro-interferon monokines (IL-12 and IL-18), and that cytokine secretion is stimulated by the interaction of Gram-positive cell wall components with surface receptors of mononuclear phagocytes, via NF-B and STAT signalling pathways. However, it is clear that the extent and quality of LAB-induced immunoregulation is strain-dependent. This review discusses the clinical and laboratory evidence for anti-allergy properties of fermented foods, and proposes a model for the mechanism by which some well-defined strains of immunoregulatory LAB might down-regulate a Th2 allergic phenotype.

PM= 14.2 kDa y es muy parecida a la protena humana. 74% de sus aminocidos son idnticos, y un 6% extra tiene un alto grado de similitud qumca. La alfa-LA bovina consiste de 123 aas y cerca del 10% de la protena bovina est glicosilada. Tiene 4 enlaces disulfuro, Cys6-Cys120, Cys28-Cys111, Cys61-Cys77, and Cys73-Cys91. Dos puentes (Cys6-Cys120) y (Cys28-Cys111) estn en el dominio-a, el tercero (Cys61-Cys77) est en el dominio-b. El cuarto (Cys73-Cys91) conecta la hlice-C del dominio-a con una hlice-310 en el dominio-b. No tiene tiol libre y es una metaloprotena que enlaza Ca, en donde el Ca estabiliza la estructura.-lactalbumina Bovina

Embutidos fermentados Los microorganismos reducen la humedad, contribuyen a la estabilidad y proporcionan sabores y aromas caractersticos.M.O.: BAL, Corynebacterium sp., Debaromyces sp., Penicillium expansum, P. nalgioviensis. Pueden ser secos y semisecos, de carne (principalmente cerdo) picada que por accin microbiana llegan a un pH 5.3, y eliminada 25-50% de humedad (secos) 15% (semisecos). - Ahumados/curados (semisecos): Thuringer (alemn). 18-48 h de maduracin a 35-40C, coccin a 105C; 50% humedadSecos. Salami (italianos). 18-48 h de maduracin a 28-32C; 30-69 d de secado a 10-22C; 35-40% humedadAhumados. Boloa (embutido de Lbano, Penn.). Slo de res. 10 d en salmuera a 4C, uso de KNO3; ahumado a 68C por 4-8 d. 50% humedad.

Clasificacin de bebidas alcohlicas segn el sustrato de donde proceden

SustratoNo destiladas(3.5-14% alcohol)Destiladas(35-55% alcohol)Fortificada(~20% alcohol)FRUTASUvaVino, champaa,vino espumosoBrandy, coac, armaac, pisco grappaJerez, oporto, vermouth, moscatel, madeiraManzanaSidra, sidra espumosaCalvadosPeraPerryCerezaKirschOtrasVinos de frutas: capuln, ciruela, gua-yaba, pitahaya, etc.

Clasificacin de bebidas alcohlicas (Cont.)

SustratoNo destiladasDestiladasCerealesCebadaCervezaWhiskyMazTesginoBourbon, whisky de maz de TennesseeVarios(incluyendo papa)Vodka, ginebra, akvavitArrozCerveza africanaCaaMelazas jugoRon, aguardiente, cachaza, pinga, charandaAgavesPulque (A. atrovirens)Tequila (A. tequilana Weber), mezcal (A. angustifolia)MielVino de miel

Qu es el mezcal?NOM-070-SCFI-1994 Bebidas alcohlicas Es aquel producto que se obtiene de la destilacin y rectificacin de mostos preparados directa y originalmente con los azcares de las cabezas maduras de los Agaves, previamente hidrolizadas o cocidas y sometidas a fermentacin alcohlica con levaduras, cultivadas o no. El Mezcal 100% agave puede ser joven, reposado o aejo y susceptible de ser abocado.Este debe ser producido en la Regin del Mezcal en Mxico. Durango, Zacatecas, San Luis Potos, Guerrero y Oaxaca.

Materia prima utilizada para produccin de Mezcal en MxicoOtras especies del genero agave excepto A. tequilana.Agave salmianaAgave angustifolia hawAgave potatorumAgave scabraAgave weberiSLPZACOAXGUEOAXGUESON

DURZACGUE

Mezcal5. Destilacin y Almacenamiento4. Fermentacin3. Molienda2. Coccin 1. JimaProceso de elaboracin del Mezcal

Alimentos y bebidas fermentados tradicionalesAlimentos fermentados por hongos. Productos de origen indonesio como el tempeh (soya fermentada por Rhizopus oligosporus) , y oncom (cacahuate fermentado por neurospora sp.).Alimentos fermentados por bacterias. Generalmente BAL, gnero Bacillus. - Verduras fermentadas. Col (sauerkraut), rbano, pepinos, etc., fermentados en salmuera - Pescados fermentados. Salsas y pastas de pescado usadas como condimento en el sureste asitico. Kecap de Indonesia, patis de Filipinas. - Granos fermentados. Fermentacin por B. subtilis de soya para producir natto (producto viscoso de olor y sabor penetrante) en Japn. - Productos de maz. En frica se fermenta una masa de maz dando el kenkey. La fermentacin dura 3 d y se ha identificado a Corynebacterium sp., Aerobacter cloacae y Lb. plantarum

Alimentos y bebidas fermentados tradicionales - Productos de arroz. El idli es un pan hind a base de arroz y frijol negro. Se produce cido y gas por fermentacin natural con L. mesenteroides y S. faecalis. - Productos de yuca. El gari es yuca fermentada por 3-4 d, se fre y se mezcla con agua, azcar, especiasAlimentos fermentados por mezcla de hongos y levaduras el ragi de origen chino se usa como inculo en varias fermentaciones asiticas. Se hace fermentando harina de arroz y Mucor, Rhizopus, Candida y Saccharomyces le confieren sabor dulce, un poco cido y alcohlicoAlimentos fermentados por hongos, seguido de una mezcla de bacterias y levaduras Se usa como inculo el tane koji que es un polvo verde-amarillento conteniendo esporas de A. oryzae y A. soyae, para la primera fermentacin de la salsa de soya. La segunda fermentacin se hace con bacterias y levaduras. Otro producto similar es el miso y sake

Algunos alimentos mexicanos fermentados

NombreDescripcinEstados donde se consumeAlimentos de mazAtoleBebida no embriagante (BNE) preparada con masa de maz, de tortillas y mazorcasSLP, Ver, Hgo, Pue, Gro, DF,Tlax, Mich, Jal, Oax.Atole agrioBNE de masa de maz negro y fermentado por 4-5 dSLP, Ver, Hgo, Pue, Gro, DF,Tlax, Mich, Jal, Oax.CharaguaBE a base pulque con almbar, chi-le ancho y hojas de maz tostado. Se calienta y luego se fermenta.SLP, Ver, Hgo, Pue, Gro, DF,Tlax, Mich, Jal, Oax.PozolBNE cida. Masa de maz nixtama-lizado fermentada envuelta en hojas de pltano; diluido con aguaTab, Chis, Yuc, Oax, Ver, Gro, QR.

Algunos alimentos mexicanos fermentados (Cont.)

NombreDescripcinEstados donde se consumeAlimentos de frutasColoncheBebida dulce, gaseosa, ligero olor butirceo, y bajo contenido alcohlico. Fermentacin de jugo de tunas Chih, Son, SLP, Zac, DgoTepacheBebida dulce refrescante. Se obtiene de la fermentacin de jugo y pulpa de pia, naranja, guayaba, arrallanes De consumo general en el pasChichaBebida alcohlica elaborada de pia, agua de cebada y masa de maz prieto. Se fermenta por 4 d y se aade dulce, clavo y canelaTejuinoBebida alcohlica obtenida por infusin del jugo de tunas con cscara de frutos de timbre(4-8cm) (Acacia augustissima)

Mtodos para el estudio de comunidades microbianas en alimentos fermentadosDenaturing gradient gel electrophoresis (Urea 6M, Formamida)Temperature Gradient Gel Electrophoresis

ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) consiste en amplificar el gen 16S rRNA seguido de una separacin de digeridos con diferentes enzimas de restriccin. Estos patrones de restriccin combinados resultan en perfiles ARDRA que permiten diferenciar entre la mayora de las especies. Por ej. los patrones de restriccin obtenidos con respectivamente CfoI, AluI, MboI, RsaI y MspI numerados respectivamente 1,1,1, 2 and 3 rinden en combinacin el perfil ARDRA 11123 que es caracterstico de A. baumannii. El proceso completo de extraccin de DNA (a partir de un cultivo puro), amplificacin del 16S rDNA, restriccin, digestin y electroforesis en agarosa toma un da (hasta 30 cepas).

Figure 1. Patrones de restriccin obtenido despus de digestion con enzimas de restriccin CfoI, AluI, MboI, RsaI and MspI para 16S rDNA amplificado de diferentes especies de Acinetobacter.

Perfiles ARDRA de cepas de Acinetobacter previamente identificadas a especies genmicas por el uso de hibridacin DNA-DNA. Los patrones se muestran en la Fig. anterior.

Genomic speciesPattern with enzymeStrainsReference strainCfoIAluIMboIRsaIMspI(N)1 (A. calcoaceticus) 221137ATCC 23055T321131RUH 5832 (A. baumannii)1112327ATCC 179041112133ATCC 19606T11121+34LMD 82.54

AFLPI paso: digerir DNA genmico con una enzima de restriccin que corte frecuentemente (MseI, 4 pb secuencia de reconocimiento) y otra que corte menos fecuentemente (EcoRI, 6 pb secuencia de reconocimiento). Los fragmentos resultantes se ligan a molculas adaptadoreas extremo- especficas. Se realiza una amplificacin preselectiva por PCR usando primers complementarios a c/u de los adaptadores, excepto por la presencia de una base adicional en el extremo 3, seleccionada por el usuario. Ocurre amplificacin de solo 1/16 de los fragmentos de EcoRI-MseI. En un segundo PCR "selectivo", se usan los productos del primer PCR como plantillas, conteniendo los primers dos bases adicionales, seleccionadas por el usuario. Los primers para los adaptadores especficos de EcoRI estn etiquetados por fluorescencia o radioactividad. El perfil electrofortico revela un patrn (huella digital) de fragmentos representando cerca de 1/4000 de los fragmentos de EcoRI-MseI.

Primer preselectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCg Adaptador -------------------------------| Primer selectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCgtc Adaptador --------------------------------|

AFLPComparado con RAPD, se requieren menos primers para realizar escrutinios de todos los sitios posibles. El procedimiento de AFLP tpicamente detecta ms polimorfismos por reaccin que los anlisis por RFLP o RAPD. El anlisis AFLP es especialmente til para el escrutinio de individuos que se retrocruzan (backcross). AFLP's, pueden ser marcadores codominantes, como los RFLP's. La codominancia resulta cuando el polimorfismo se debe a secuencias dentro de la regin ampliada. Pero debido al No. de bandas observadas al mismo tiempo, se requiere evidencia adicional para determinar que un grupo de bandas resulta de diferentes alelos en el mismo locus.Si el polimorfismo se debe a la presencia/ausencia de un sitio de unin al primer, la relacin es dominancia. El alelo que no tiene unin al primer no ser detectado como una banda.

RAPDLa complejidad del DNA nuclear eucaritico es suficientemente alta para que aleatoriamente existan pares de sitios complementarios a octa- o decanucletidos de una tira en la orientacin correcta y relativamente cercanos unos de otros para que puedan ser amplificados por PCR. Con algunos decanucletidos escogidos al azar no se amplifica secuencia alguna. Con otros, productos de la misma longitud se generan a partir de DNAs de diferentes individuos. Con algunos otros, se dan patrones de bandeo (ver figura) diferentes para cada individuo de una poblacin.La bandas variables son comnente llamadas DNA polimrfico amplificado al azar (RAPD). Tres de las bandas de la figura son bandas RAPD. RAPDs exhiben polimorfismo y pueden usarse como marcadores genticos RAPDs son dominantes en el sentido de que la presencia de una banda RAPD no distingue entre estados hetero- y homozigotos.

Tecnologa EnzimticaEl mercado mundial para las enzimas de inters industrial se ha estimado en US $ 625 millones (1989) y $ 2 millardos (2004), siendo Novozymes (55%) y Danisco (30%, Dinamarca) los principales productores, con un ritmo de crecimiento de 2-3% anual.En Mxico el mercado estimado es de US $17 millones.En 1985 se produjeron 80 000 tons de productos enzimticos, equivalentes a 4 000 tons de protena activa.La mayora de las enzimas producidas encuentran aplicacin en la industria de los alimentos: la industria alimentaria ocupa el 62 % (con la tercera parte usada en panificacin), la textil el 5 % y la industria de los detergentes el 33 %. En la industria alimentaria las enzimas se utilizan principalmente para el procesamiento del almidn, en seguida para la elaboracin de quesos, jugos, repostera, jarabes fructosados.

Distribucin del mercado mundial de las enzimasRao y col., 1998

Selected Industrial Enzyme CompaniesAB Enzyme www.abenzymes.comBio-Cat www.bio-cat.comDanisco Dinamarca www.danisco.comDiversa Corp. www.diversa.comDSM Food Specialties USA www.dsm.comEnzyme Development Corp. www.enzymedevelopment.comGenencor Internationala www.genencor.comNational Enzyme Co. www.nationalenzymecompany.comNovozymesb www.novozymes.com

a Second largest manufacturerb First largest manufacturer

Enzimas en la industriaKaneka ha encontrado una formiato deshidrogenasa robusta para el reciclaje de cofactores en procesos de oxidacin-reduccin. Dowpharma ha usado su tecnologa de expresin Pfenex para producir grandes cantidades de enzimas.

Uso Industrial de enzimas: PanificacinEn panificacin, las amilasas, celulasas y proteasas ayudan a procesar el pan y la masa para mejorar las calidades de: textura, volumen, estabilidad y estructura de la miga. La harina de trigo contiene

Uso Industrial de enzimas: PanificacinLa harina de trigo contiene tambin ~ 2.5-3% de pentosanos, tal como arabinoxilanos que representan cerca de un cuarto de la absorcin de agua de la masa. Los pentosanos insolubles deprimen el volumen de la hogaza y hace una estructura de la miga mas abierta. Existe actualmente mucho inters en usar xilanasa en panificacin para reducir el contenido de pentosano insoluble.Las proteasas (de A. oryzae) se aaden a menudo para relajar la masa, resultando en mayor mobilidad y extensibilidad. Esto es probablemente debido a efectos en las fracciones de gluten o gliadina de las protenas. Una acccin excesiva de las proteasas causa pegajosidad en la masa.

Uso Industrial de Enzimes: PanificacinOtra adicin comn a los sistemas de masa es la lipoxigenasa.Esta enzima oxida los cidos grasos cis, cis-polienoicos a hydroper-xidos, oxidando conjuntamente los grupos -SH de las protenas a grupos -S-S-, aumentando la resistencia de la fraccin del gluten en las protenas de la masa. Tambin acta sta enzima como blanqueador ya que decolora los carotenoides de la harina. La enzima es usualmente aadida en forma de harina de soya desgrasada. Soybean lipoxygenase

Uso Industrial de enzimas: Lipasas en la Industria Lctea Se usan principalment en la IL para la mejora del sabor y en la maduracin de quesos. Los cidos grasos libres dan el sabor y aroma caracterstricos de los quesos: liberacin de cidos grasos de cadena corta (C4 y C6) dando sabores fuertes y c. grasos de cadena media (C12 y C14) dan origen a sabores a jabn. Los c. grasos pueden ser biotransformados por la poblacin microbiana del queso, conduciendo a la formacin de compuestos de sabor como acetoacetato, beta-ceto cidos, metil cetonas, steres y lactonas. Tradicionalmente lipasas animales se han usado en los quesos, con cada especie resultando en un perfil de sabor caracterstico. Recientemente, se han introducido lipasas microbianas de Mucor miehei, Aspergillus niger, y A. oryzae.Queso Lipasa

Romano cabrito/cordero pre- gstricoFeta Mucor miehei

Mozzzarella Ternera/cabrito pre- gstricoParmesano Provolone Cheddar A. nigerManchego A. oryzaeAzul

Uso Industrial de enzimes: variosLas pectinases ayudan a romper las paredes ceulares de las plantas, permitiendo ms eficiente extraccin de jugos para bebidas de fruta y vino, y mejorar el proceso de clarificacin.Una gran variedad de enzimas especializadas se han usado para diferentes productos. P. ej. pueden usarse proteasas especficas para hidrolizar compuestos alergnicos en soya o leche, permitindoles un uso seguro como aditivos alimentarios.Las enzimas son tambin valiosas en la produccin de sabores y fragancias para mejorar la calidad de los alimentos.

Enzimas y microorganismos con potencial en la industria de alimentos

Termolisina(B. thermoproteolyticus)Sntesis de aspartamoPululanasa cida(B. acidopullulyticus)Sacarificacin de almidnFructosil transferasa(B. subtilis)Nuevos disacridos -amilasa cida(B. stearothermophilus)Produccin de jarabes de maltosaLigninasas(Arthrobacter sp.)Degradacin de cscara de cacahuateVarias(Irpex lacteus, Formitopsis pincola)Generacin de aroma en quesos

Produccin industrial de aminocidosLa produccin microbiolgica de aminocidos se basa en la conversin de diferentes fuentes de carbono, tales como melaza, glucosa, hidrolizados de almidn, azcar, etc. Pero no en todos los casos se usa la fermentacin comercialmente. Mtodo EjemploFermentacin (glucosa/melazas) Acido L-glutmico, L-lisinaEnzimtico (preparacin de Ac. L-asprtico de ac. fumricoprecursores) L-alanina de c. L-asprticoSntesis qumica DL-metioninaExtraccin L-cistena de pelo humano y de equino

Aplicacin de tcnicas modernas de biotecnologa para la produccin de aminocidos MetodologaAminocidoCultivo continuoL-lisinaCultivo continuo en cepa transformadaL-triptofanogenticamenteIngeniera genticaL-treonina, L-fenilalaninaClulas inmovilizadas/sistema continuoL-serinaNueva cepa, sustrato barato,L-fenilalaninaingeniera gentica

Se han usado tcnicas de ADN recombinante eficientemente en Brevibacterium flavum (Lys) y Corynebacterium glutamicum (Glu), con el fin de tener cepas mutantes, con caractersticas regulatorias deseadas e hiperproductoras de aminocidos.

Aminocidos usados en la industria alimentariaValor de mercado estimado (2004): $ US 3.5 billones; Ajinomoto (30%), ADM y BASF. 52% alimentos, 30% alim. animal, 18% especialidades qumicas y farmacuticas).

AminocidoProd. mundial/ ao (tons)1984UsosUtilidadL-Glu (GMS)~1 milln (2004)VariosReforzar sabor, ablandador de carneL-Asp y Ala5,000 (Q)Jugo de frutasEnriquecer el saborGli6,000 (sntesis qumica, Q)Alim. EndulzadosNutricin humanaMejorar sabor, punto de inicio en sntesis orgnicaL-Cys700 (Extraccin)Pan, jugos de frutasMejorar la calidad; AntioxidanteL-Try + L-His400Varios, leche en polvoAntioxidante, aditivo nutritivoL-Lys70,000Pan (Japn), Alim. animal Aditivo nutritivoL-MetDL-Met150 enzimtica120,000 (Q)Prods. de soya; Alim. animal.Aditivo nutritivo, uso en hepatitis (teraputico)

Producccin de aminocidos por enzimas inmovilizadasAcetil D,L-aminocido L-aminocido AminoacilasaRacemizacinDL-R-CHCOOH + H2O NHCORL-R-CHCOOH + RCOOH + NH2 D-R-CHCOOH NHCORAcil-D-aminocido Tanabe (Japn) en 1969 desarroll un proceso continuo utilizando aminoacilasa de A. oryzae inmovilizada en DEAE-Sephadex. Con reactores de 1 m3 se obtienen 200-250 kg de aa/da. Se producen por este mtodo L-Ala, L-Met, L-Phen, L-Trp, L-Val (520 ton/mes).

Aumento de la productividad de AminocidosLa fig. siguiente muestra las rutas bioqumicas y los mecanismos regulatorios de metabolitos producidos por m.o. y mtodos de promocin de sobreproduccin de los metabolitosPara tener una sobreproduccin, el aa debe excretarse de la clula, la cual deber seleccionarse de entre otras con cambios en sus mecanismos de controlPara el cido glutmico (GLU), la velocidad de crecimiento de las bacterias (Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum), aumenta por la adicin de biotina al medio. Pero esto reduce la permeabilidad de la membrana para GLU disminuyendo su sntesis y acumulacin.La adicin de penicilina c. grasos saturados (C16, C18) al cultivo restaura la permeabilidad de la membrana, resultando altos rendimientos y acumulacin de GLU

Mtodos tpicos para promover la sobreproduccin de metabolitosPuntos de ControlAceleracin Desregulacin limitacinSmbolosS: SustratoA y B: Interme- diarioC: SubproductoP: ProductoE: Enzima

ProduccinInhibicin represin Funcin1: Activacin crecimiento celular2: Aceleracin de la exc. de producto3: Elim. de la inhib por retroaliment. y represin 4: Enriquecimiento de la activ. enzim.5: Reduc. de la ac. enz. que conduce a subproductos

AspartatoGlucosaAspartil fosfatoAspartato cinasaAspartato semi-aldehidoMutante no tiene homoserina deshidrogenasaHomoserinaMetioninaTreoninaDihidropicolinatoDiaminopimelatoLisinaRuta y control de la produccin de Lis en mutantes auxotrficos de C. glutamicumPenicillin yields raised from 0.15 to 7 g/L by spontaneous or induced mutations auxtrofo cuando slo es capaz de proliferar en un medio de cultivo si a ste se ha aadido alguna sustancia especfica, que el tipo silvestre, llamado prottrofo no requiere, porque es capaz de sintetizarla.Oxaloacetato

Aminocidos producidos por cepas mutantesLa produccin de L-LIS se obtiene de cepas productoras de L-GLU donde la primera enzima de la ruta biosinttica (Aspartato cinasa; AC) se regula por unos cuantos metabolitos tales como TRE y LIS a travs de una inhibicin por retroalimentacin concertada (el efecto de los moduladores es ms que aditivo). Se han obtenido mutantes regulatorios de C. glutamicum donde la AC es resistente a la inhibicin por LIS, y la enzima homoserina deshidrogenasa se ha eliminado genticamente, por lo cual no se produce TRE ni MET. Suministrando bajos niveles de TRE se han producido industrialmente 170 g/L de LIS y 0.54 mol LIS/mol glucosaProduccin anual de LYS: 300,000 tons ($ US 600 millones)

Principales polisacridos microbianos de inters comercialDextrnsacarasa

PolisacridoFuenteComposicinXantanaXanthomonas campestrisUnidad estructural: glucosa, manosa, c. glucurnico (2:2:1), PM~2x106 Da. Se produce a pH>5.0, 28C, en quimiostato con conds. limitadas de NDextranaLeuconostoc mesenteroidesGlucosa con enlace -1-6, ramific. 1-3, 1-4 (5%). nSacarosa nfructosa+dextrana PM:0.5-1x106 Da. Alginato Azotobacter vinelandiPseudomonas aeruginosacido gulurnico y manurnico conectados por enlaces -1-4 y -1-4. Sustituyentes acetil. 50-100,000 residuos.CurdlanoAlcaligenes faecalisGlucano con enlaces -1-3

Xanthomonas campestris inoculum (

Flow diagram of the production process of microbial alginate

Principales aplicaciones de los alginatos

rea de aplicacinFuncinEjemplosIndustria de bebidas y alimentosEstabilizanteEspesanteGelificanteEstabilizacin de espumasSuspensin de frutas, espesante de salsasReconstitucin de alimentosIndustria farmacuticaEstabilizanteGelificanteEmulsiones para cosmticosImpresiones dentales, fibras y pelculas, cubiertas para tabletas.Otros usosEspesanteTintas para impresin, inmovili-zacin de clulas y enzimas

Biopolmeros producidos por microorganimos con potencial aplicacin industrial BiopolmeroCaractersticasCelulosa bacterianaPelcula extracelular compuesta de (Acetobacter xylinum) microfibras de celulosaGelanaPolmero extracelular compuesto de glucosa y (Pseudomona elodea) rahmnosa. Geles termoreversibles. Producido por Kelco (EUA)PS-10 (Kelco, EUA)Polmeros de glucosa, manosa, fructosa, c. (Erwinia tahitica) glucurnico. Sustitutos de hidroxi-etilcelulosa en pinturasEmulsanaLipopolisacrido que funciona como (Acinetobacter emulsificante calcoaceticus)

Compuestos Aromticos y SaboresLa legislacin trata de limitar el uso de sabores y aromas artificiales en alimentos y bebidas.Aumento en el rechazo del pblico de alimentos (ingredientes) qumica o sintticamente producidos.Sabores naturales encuentran uso ms amplio en alimentos; de plantas (a menudo en cantidades pequeas o en forma enlazada), o de origen microbiano.Sabores microbianos puede venir de biosntesis (sntesis de novo, de clulas en crecimiento o de su metabolismo secundario; bajos rendimientos) o de biotransformaciones (modificaciones especficas o interconversiones de estructuras qumicas; mayores rendimientos y mas econmicas).Los microorganismos o enzimas pueden producir ya sea sistemas de sabores complejos multicomponentes o compuestos individuales de sabor. El etil-butilato microbiano (sabor a frutas): $ 180/kg, sinttico: $ 4/kg (Hercules, Inc.)

Compuestos aromticos producidos por microorganismos

MicroorganismoAromaCompuestosCeratocystis moniliformisAfrutado: pltano, durazno, pera, rosa3-metil butiril acetato, - y -decalactona, geraniol, citronelol, nerol, linalol, geranil acetato Mycoacia udaAfrutado: almendras, pastop-metilacetofenona, p-tolil-1-etanolPenicillium decumbensPino, rosa, manzana, hongo3-octenona, 1-octen-3-ol, -feniletanol, nerodiolSporobolomyces odorusDuraznoTrametes odorataAfrutado: miel, rosa, ansMetil fenil acetato, gera-niol, nerol, citronelolTrichoderma virideCoco6-pentil-2-pirona

VanillinPrincipal flavor component of vanilla, which is widely used in flavor formulations. US $ 2,500/kg flavor solids.Extracted form pulped wood (vines), and also via microbial biotransformation (also considered natural)Produced from eugenol or isoeugenol by Serratia, Klebsiella or Enterobacer, with a yield of 3.8 g/L.Can also be obtained form callus cells of Vanilla fragrans or V. phaeantha. Higher yields may be obtained by immobilized culture systems with continuous removal of flavor components; passing them through activated charcoal and eluting with 50% ethanol.-lactone-lactone-ionone (off flavor in oxi-dized freeze-dried carrots)CHO

Flavor enhancers: production of 5 nucleotides by enzymatic hydrolysis of RNAYeast (C. utilis, S. cerevisiae)Extraction by hot alkaline saline (5-20% NaCl, 8 h, 100C)Precipitation by HCl or ethanoldryRNA (70-90 % purity)Exonuclease P1 (Penicillium citrinum) orStreptomyces aureus mutant [5 nucleotidase & phosphatase (-)]pH 5, 4 h, 65C5GMP/5AMP/5CMP/5 UMP mixtureRemove CMP/UMP by adsorption on activated charcoalElute adsorbed AMP/GMP with methanol/ammonia5AMP/5GMP mixture- Deamination of AMP by adenyl deaminase (A. oryzae)IMP/GMP mixture-purification by anion exchange chromatograpy5 IMP + 5 GMP (1.5-3 %)

NUCLEOTIDES

Monosodium Glutamate (MSG)Fermentation of glucose and sucrose as carbon and energy sources by C. glutamicum.C. glutamicum accumulates -ketoglutaric acid (AGA) because it is uncapable of performing a complete TCA cycle.AGA is directed towards the production of glutamic acidBiotin limiting conditions leads to more production of GLU Limiting biotin reduces phospholipid synthesis and membrane permeability, but it is restored by adding 0.65 mL/mL of oleic acid (18:1).Using Brevibacterium divaricatum, 50-60% of the C source is converted to GLU, at pH 7.8, 38C, in a fed batch process, after 30-35 h, with a yield of 100 g/L.

Sntesis de Aminocidos y ciclo de Krebs

Flavor enhancers5 GMP + 5 IMP: their maximum influence in savory flavor is on fish and vegetable proteins. Less effect on meats, cereals, milk, eggs.MSG: Most profound influence on: meat, followed by fish, vegetables, cereals, egg, milk.UMAMI compounds have a most pronounced effect on chicken, and weaker enhancement on beef, turkey and porkSavory ingredients market: $ US 1 billion/year. HVP, Autolyzed yeast extract, soya bean sauce, MSG, I+G.

Clasificacin de los colorantes I. Naturales 1.- Orgnicosa) Vegetales: Antocianinas, betalanas, carotenoides, flavonoides, clorofila, otrosb) Animales: Acido carmnico (de grana cochinilla), cido kermsico (obtenido de las hembras fecundadas de los insectos Kermes ilicis L. y Kermes vermilio Planchn, parsitos de la encina (Quercus ilex L.) y de la coscoja (Quercus coccifera L.), respectivamente), otros 2.- Inorgnicosa) Minerales: Azul ultravioleta, dixido de titanio, negro carbnII. Sintticos 1.- Orgnicos: Azoicos, antraquinonas, difenilmetano, otros

Pigmentos alimenticios de origen naturalComponente FuenteTetrapyrroles ClorofilasVegetales verdes, de hoja Grupos HemoCarnesCarotenoides CarotenoZanahorias (-caroteno), tomates (licopeno), XantofilasChiles del gnero Capsicum (capsantina), salmon (astaxantina), zempaschitl (lutena)Benzopiranos AntocianinasUvas (enocianina), bayas, manzanas Flavonas y flavanonasNueces, piel de cebolla, tBetalanas BetacianinaBetabel BetaxantinasBetabelPigmentos derivados de Procesos CarameloMiel, jarabes, refresco de cola, licores MelanoidesJarabes

Produccin de monascina por diferentes tcnicas Cepa Condiciones de cultivoCultivo SumergidoMonascus ankaPolvo de arroz 3%; MgSO47H2O 0.1%, KNO3 0.15%, KH2PO4 0.25%, 96 h a 30CM. kaolinus S-11Idem, 72 h a 35CM. anka V-204Polvo de arroz 5%, Glutamato monosdico 0.15%, MgSO4 7H2O 0.1%, KH2PO4 0.25%, 144 h a 30CCultivo slidoM. ankaPolvo de arroz 168 h, 30-40CM. ankaHarina de pan, 192 h, 32CM. kaoliang R 10847Harina de Mantou 144 h, 32C

Historia de los procesos de hidrlisis para la obtencin de glucosa

EpocaMateria prima(almidn 30-45% materia seca)Hasta 1950sAcidificacin (HCl, pH 1.5). Hidrlisis (T=150C).ED= funcin del tiempo de hidrlisis. Con 45 min: ED =90 con 86% glucosaHasta 1960sAcidificacin (HCl, pH 1.5). Hidrlisis (5-10 T=150C; ED= 12-20). Reaccin con amiloglucosidasa (pH=4-4.5, T=60C, 48-100 h. J. gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa)Entre 1960s y 70sLicuefaccin con -amilasa (pH5.5-7.0, T=70-90C), ED=20-30. Sacarificacin con amiloglucosidasa (pH=4-4.5; T=60C, 48-100 h). J. de gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa.Despus de 70sLicuefaccin -amilasa termorresistente (6 a 105C, 2 h a 95C), ED=8-12. Sacarificacin con amiloglucosidasa (pH=4-4.5; T=60C, 48-100 h). J de gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa)

AlmidnH2OEnzimas (10%)CaCl2Bomba de desplaza-miento positivoEnzima (90%)atmsferaCocedor jet(140C, 30 s)Vapor90-95C, 2 hED = 8-15Sistema de licuefaccin con -amilasatermorresistente

Process flowchartfor dextrose productionGlucoamilasa de A. niger o Rhizopus. El proceso puede ser por lotes o continuo.El rendimiento de glucosa de una suspensin de almidn (32-35 % p/p ) es 95-96%.El rendimiento puede aumentarse por sacarificacin a 10-12 % (p/p) de slidos y usando pululanasa, resultando en aumentos del 0.5-1%En 1998: dextrosa anhidra $ 1.12/kg; dextrosa monohidrato $ 0.51/kg; jarabe de maz $ 0.21 /kg(50-55% solids)

Jarabe de maz de alta fructosa (HFCS)La conversin enzimtica de glucosa a fructosa se report en 1957 y fue patentada en 1960 por la compaa CPC (USA)Un desarrollo Japons usando GI de Streptomyces logr la primera produccin comercial de HFCS en 1967 en USA (por lotes).Los problemas que evitaban su competencia con sacarosa y azcar invertido incluyeron - Alto costo de la enzima - Formacin de productos coloreados - Produccin de azcar no metabolizable (D-psicosa) - Inhibicin enzimtica por minerales (Ca2+)La GI inmovilizada re-utilizable permiti una produccin continua en 1972Este fue el primer uso a escala industrial de enzimas inmovilizadas, cuyas caractersticas son (40-50 %w/w) :- Reduccin significativa de costos de produccin- Costos competitivos con la produccin de sacarosa

(30-40% dry solid; pH 6-6.5)-amylaseCa2+ (100-200 ppm)DE=94-98; 31% TS60C, pH 7.0, de-aerationMg2+activatorSeparation C treatment(87% glucose, 5% F)70-85% TSResina fuertemente cida cationica, Ca2+, retrasa fructosa y no retiene DP>3-4

US HFCS producers

HFCSLa produccin anual global de HFCS es 10 millones de tons, en base seca (1999).Para esto se utilizan 1500 tons de GI inmovilizada (GII; 1999)Los mayores productores de GII son Genencor (Danisco) y Novo.La GII de Genencor se produce por adsorcin de la enzima purificada en resinas de intercambio inico, reticulada con polietilnimina y glutaraldehdo, y granulada por extrusin.La productividad es de 12-15 tons de HFCS (bs)/kg GII, con t=1900-3600 h.La GII de Novo (Sweetzyme T) se prepara por reticulacin de clulas de Streptomyces murinus con glutaraldehdo, seguido de extrusinSe usa en biorreactores de 1.5 m(d)x5 m(h) a 60-65C, pH 7.5-8.5 (1 h reaccin; 0.5 tons/da) para producir jarabe con 42% de fructosa, que por fraccionamiento se convierte a 55% de fructosa.

Catalizadores formulados con Glucosa Isomerasa*IGIU: Cantidad de enzima que produce un mol de fructosa por minuto&Tiempo de vida media, bajo condiciones ptimas de reaccin.

CompaaActividad(IGIU/g)*Catalizadort1/2 & (hrs)Miles (Taka- sweet)171Clulas de Flavobacterium aborescens, extruidas y reticuladas1800Gist-Brocades675(MGIU/L)Enzima de Streptomyces missouriensis en gelatina reticulada con glutaraldehdo1500CPC Int. Inc.1487Enzima en DEAE-celulosaNovo A/S200Clulas de B. coagulans entrecruzadas1500Finnsugar (Spezyme, IGI)Enzima de Streptomyces Rubiginosus en DEAE celulosa y poliestireno con TiO21200

cido CtricoSu produccin rebasa las 3x105 tons/aoPfizer tiene la mayor planta con capacidad mayor a 8x104 tons/ao70% es consumido por industria de alimentos y bebidas, donde representa el 55-65% del total de acidulantes18% se dirige a industria farmacuticaSe produce por Aspergillus y Penicillium, aunque tambin levaduras y bacterias pueden acumular c. ctrico a partir de glucosa en un menor tiempo de fermentacin.Su produccin requiere de una operacin defectuosa del CAT y su transporte fuera de la clula.

Degradacin de glucosa a cido ctrico a travs de gliclisis y ciclo de los cidos tricarboxlicos

Produccin de cido ctrico (AC)Todas las reacciones del CAT excepto la condensacin del AC ctrico son reversibles.Se bloquea la transformacin del AC reduciendo a un mnimo la presencia de iones fierro (cofactor de aconitasa)Se interrumpe entonces la formacin de los dems intermediarios esenciales en biosntesis, por lo cual se requieren reacciones adicionales llamadas anaplerticas de reabastecimiento que regeneren los intermediarios del CAT, aprovechando la reversibilidad del cicloTres reacciones anaplerticas pueden ocurrir

Reacciones Anaplerticas del ciclo de Krebs (CAT)

La nica reaccin anaplertica comprobada en A. niger es la carboxilacin del piruvato, permitiendo la fijacin del CO2 removido de piruvato durante su descarboxilacin a acetil-CoAA partir de glucosa se han tenido rendimientos de 70-90% (w/w), con el mximo terico de 112%.La participacin del ciclo del glioxilato durante la fermentacin ctrica de A. niger es controvertida y solo se ha comprobado en levaduras.Para evitar esta reaccin: Oxalacetato oxalacetato hidrolasa oxalato + acetato Se conduce la reaccin a pH 3.5, al cual sta enzima no actaLos altos niveles de AC inhiben la fosfofructocinasa, la cual se protege en presencia de iones NH4+ a concentraciones superiores a las fisiolgicas

La deficiencia de Mn2+ permite la acumulacin de iones NH4+, modificndose la sntesis normal de lpidosLa consecuencia de esto es la presencia de membranas celulares defectuosas con mayor permeabilidad al AC, as como un mayor flujo de C hacia el AC como resultado de la disminucin de lpidos en los componentes celularesCuando se usan levaduras para producir AC, la fermentacin es independiente de Mn2+, requieren de un pH menos cido (4.5-6.5), requieren de tiamina y se acumula AC en condiciones de limitacin de NAspectos NutricionalesLa produccin de AC est relacionada inversamente con el crecimiento celularLos carbohidratos deben ser simples : melaza (14-240 g/L); N: sales de amonio (0.1-0.4 g/L); 0.1-0.2% de fosfato, Fe2+ y Mn2+ en bajos niveles, por lo que se debe remover el Fe de las melazas (EDTA, polietilenamina).Aspectos FisicoqumicosTemperatura de 25-30C, ya que a T mayor se acumula c. oxlicopH inicial 3.5-4.5, pero se mantiene en 2 durante la etapa productiva

Cintica de la fermentacin para producir cido ctrico por A. niger.La fermentacin es sumergida, aerbica en grandes biorreac-tores de acero inox. en un medio deficiente en hierro.

Diagrama simplificado del proceso de produccin de cido ctrico por cultivo sumergido a partir de melazas4

Microorganismos usados para elaborar productos valiosos en la industria de alimentos

Gene encoding protein of interestSequence encoding6 His in frame with cloned ORFClone producing His-tagged proteinNi AffinityColumnTagging Proteins for Affinity Purification

Affinity ChromatographyNi ColumnCrudeExtractEluent-Competes forNi MatrixPureProteinClone producingHis-tagged proteinof Interest

PAGE Results of a Protein Purification

Separacin de DNA por Electroforesis en GelPropsitosHerramienta analtica- Identifcar o conocer algo acerca de un fragmento particular de DNA: tamao, topologa, patrn de restriccin, pureza, concentracin Herramienta Preparativa - Separar un fragmento de inters de una mezcla compleja de fragmentos de DNA.

Gel Electrophoresis

El Gel Tamiza las Molculas -Pequeas Molculas Migran ms Rpido+-TiempoDNA de Alto PM, incremento en la friccinDNA de bajo PM, disminucin en la friccin

Electroforesis en GelMolculas cargadas se movern en un campo elctricoSe usa una matriz de gel para tamizar las molculasAgarosa floja; amplio rango de separacin Acrilamida ms apretada; estrecho rango de separacinEl movimiento a travs del gel depende de la carga y forma NO de la masaPara que el movimiento sea proporcional a la masa (PM) la molcula debe tener un relacin carga/masa constante.

Electroforesis en GelEl DNA tiene 2 cargas negativas (fosfato disteres) por par de bases Todas las molculas lineales de doble tira del DNA tienen (esencialmente) la misma formaPor tanto el movimiento es proporcional a la longitud (MW)Distancia 1 / log (MW)

Gel Electrophoresis

Bromuro de EtidioColorante para visualizar DNAAbsorbe a ~520nmFluoresce a 605nm(Fluoresce naranja bajo luz UV)Fluorescencuia se incrementa por enlace al DNA

Bromuro de Etidio Intercalado en la hlice del DNA

Anlisis de Restriccin

Informacin de Electroforesis en GelTamaoDistancia migrada es inversamente proporcional al logPM (o log(# pb).Cantidad - Enlace del etidio es directamente proporcional a la MASA del DNA

1011 Molecules x 10 Kb= 1012 Kb= ~100 ng2x1011 Molecules x 5 Kb= 1012 Kb= ~100 ng1012 Molecules x 1 Kb= 1012 Kb= ~100 ngQuantitation of DNA by Ethidium Bromide StainingMarker DNA -Known sizeand quantity

Clicker QuestionYou have purified your favorite plasmid from a strain of E. coli. You run an agarose gel with a standard of known concentration to quantitate the DNA. But what about protein contamination? Does the presence of contaminating protein interfere with this procedure?YesNo

La Densidad de la Matriz Define la Resolucin del Gel Porcentaje de Agarose

Resolucin de molculas muy grandes de DNA porElectroforesis en Gel de Campo Pulsante180 KiloBP90 KiloBP45 KiloBPEl campo elctrico se reorienta constantemente mientras se corre el gel. Consecuentemente, las molculas de DNA tienen que reorientarse. Pequeos fragmentos se reorientan ms fcilmente.

Transferir DNAa membraneAadir fragmento de DNAetiquetado e hibridizarSouthern BlotInventado por E. SouthernOxford University

Strain 1EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIProbexxStrain 2sonda etiquetada se hibrida a la secuencia complementaria

Premio Nobel Qumica 2006Roger D. Kornberg, a structural biologist at Stanford University, has been awarded the 2006 Nobel Prize in Chemistry for his studies on the molecular basis of eukaryotic transcription, the process by which the genetic code of DNA is converted into messenger RNA for later translation into proteins.Kornberg has used the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model eukaryotic organism. He developed an in vitro yeast transcription system that contained highly purified RNA polymerase II and five helper proteins known as general transcription factors. However, the system did not respond to the addition of other transcription factors known to activate specific genes in cells. This observation led Kornberg to discover a protein complex known as Mediator, which serves to transfer signals from gene-specific transcription factors to RNA polymerase II and the general transcription factors.

Mighty Machine In this ribbon structure of part of the yeast RNA polymerase II complex, the clamp protein (yellow) closes on the DNA (blue and green) and growing RNA transcript (red). The bridge helix is shown in green and the complex's active site magnesium ion is shown in pink.In 2001, Kornberg and his colleagues published high-resolution X-ray crystal structures of a 10-subunit yeast RNA polymerase and of a complex consisting of RNA polymerase, template DNA, and product RNA (Science 2001, 292, 1863 and 1876). These structures showed that the two largest subunits of RNA polymerase lie in the center on either side of a nucleic acid-binding cleft, with the smaller subunits on the outside. The cleft is bridged by an -helix that acts like a ratchet to move the growing RNA transcript out of the active site during RNA synthesis.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)Es un mtodo para la amplificacin rpida de DNA in vitro que produce grandes cantidades de genes especficos para clonar, secuenciar o para propsitos de mutagnesisSe requiere conocer una parte de la secuencia nucleotdica del gen que se desee amplificar, stos son los iniciadores, a partir de los cuales se sintetiza la hebra complementaria por la DNA polimerasa (Thermus aquaticus [Taq] polimerasa)1. Dos oligonucletidos (degenerados o no) iniciadores en los extremos del DNA blanco se fabrican en un aparato de sntesis de oligonucletidos y se aaden en mucho exceso al DNA blanco desnaturalizado por calor 2. Cuando se enfra la mezcla, se asegura que el exceso de iniciadores (primers), relativos al DNA blanco, se hibridicen a las hebras separadas con los iniciadores y no entre ellas (alineamiento)

La DNA polimerasa extiende los iniciadores usando las hebras blanco como plantilla Despus de un tiempo adecuado de incubacin, la mezcla se vuelve a calentar para separar las tiras, y se contina con este ciclo unas 20-30 veces (calentamiento, alineacin, extensin)Los productos de extensin de un iniciador, pueden servir como plantilla para otro iniciador en el siguiente cicloCada ciclo ( aprox. 5 min) involucra: 1. Desnaturalizacin por calor 93C, 5 min (despus de 1er ciclo: 1 min) 2. Enfriamiento para alineamiento de iniciadores 45C, 1 min 3. Extensin de iniciadores 70C, 1 min. Despus del ltimo ciclo se deja 10 min para finalizar las extensionesEn cada ciclo se duplica el contenido del DNA blanco original, obtenindose en 20-30 ciclos aumentos en 106-109 de la secuencia blanco

PCR para amplificar secuencias de DNA. (a) calentamiento del DNA blanco y exceso de dos iniciadores, uno complementario de una tira y el otro de la tira complementaria, ms DNA polimerasa. (b) alineamiento y extensin, originndose dos tiras hijas. (c) nuevo ciclo. (d) 2a copia de DNA. (f) Efecto de 20 ciclos PCR en un DNA blanco conteniendo 10 copias inicialmente (la grfica es semilog)

La Taq polimerasa no tiene funcin correctora, por lo cual comete errores en la extensinCuando la exactitud es crucial, puede usarse la DNA polimerasa del arqueano Pyrococcus furiosus (Top=100C; Pfu), ya que tiene actividad correctora La amplificacin in vivo tomara varios das, por lo cual los termocicladores son muy tiles.La DNA polimerasa termoestable se ha clonado en E. coli y se produce en grandes cantidadesEl PCR es muy til en la clonacin de DNA porque si se conoce la secuencia en sus extremos puede amplificarse antes de clonarComo herramienta para la secuenciacin de DNA, el PCR produce grandes cantidades de DNA que pueden usarse como plantillas

El PCR puede producir grandes cantidades de DNA mutadoUsando oligonucletidos con algunas bases que no se hibridizarn como iniciadores, pueden introducirse mutaciones. Los mutantes puede entonces amplificarse por PCREl DNA mutado puede usarse para transformar clulas, formando derivados mutantesEl PCR puede usarse para estudios comparativos evolucionarios, amplificando genes de diferentes fuentes, donde el DNA ya se ha clonado y secuenciado, usando iniciadores que no sean perfectamente complementarios, pero que sean regiones altamente conservadas Con los iniciadores adecuados, puede identificarse una sola clula bacteriana, en presencia de otras, en una muestraPuede usarse para identificacin de individuos (huellas dactilares de DNA)

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