Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Como a Filogenia pode nos ajudar!!!!

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mailto:[email protected]


Considerações importantes

Regiões amplificadas sãs as regiões adequadas á pergunda em questão?

O PCR esta adequado para a realização de uma reação de sequenciamento?

Qualidade da sequência genômica

- Ambiguidades (polimorfismos)

- “N” nas sequências

Qualidade do alinhamento

- “gaps”no alinhamento

Melhor trabalhar com nucleotideos ou aminoácidos (a região é codificante?)?

Análise filogenética

- Método

- modelo

Que sequencias controle usar nas análises !!!!!


Sempre teremos uma árvore filogenética

Mas o resultado é consistente?????


objetivos


Verificar a transmissão do HIV por transfusão

de sangue utilizando análise filogenética de

sequencias de DNA do HIV do doador e

receptor de sangue de um banco de sangue

brasileiro

Material & Métodos


O que levou a estes estudo!!!

Em 2009 surgiu a suspeita que uma paciente que havia recebido

componentes de sangue numa cirurgia de retirada de cisto de

ovário, tivesse recebido algum desses componentes

contaminados com HIV

A suspeita surgiu quando a paciente reportou, aproximadamente

uma semana após a cirurgia, febre, linfoadenopatias e

alterações hematológicas

Nesta ocasião iniciou-se então a investigação retrospectiva do

doador e do seu parceiro...

Material & Métodos


Material & Métodos


Testes realizados

- EIA = enzima imunoensaio

- WB = wetern Blot

- CHHia =Quimioluminescência (prisma)

- RT PCR = Real time PCR

Nested PCR

- envelope = ED5/ED12 e ED31/ED33

- polimerase = DP10/MMRT6 e DP16/MMRT5

Reação de sequenciamento

Análises filogenéticas

- Distância (Mega4)/ tamura Nei / 1000 réplicas de bootstrap

- ML(PHY ML)/ Kimura / 1000 réplicas de bootstrap

Resultados


Resultados


conclusão


Foi observada alta similaridade entre as sequencias

genomicas do doador e receptor

(Menos de 1% de divergência entre as sequencia

nucleotideas)

Foi observada maior similaridade entre as

sequencias do região pol quando comparado com as

sequencias do envelope.


objetivos


Avaliar a transmissão do HIV entre casais

numa: coorte de casais HIV positivos

(concordantes), residentes em Dakar no

Senegal


Material & Métodos

De maio de 2005 até fevereiro de 2009,

pacientes das consultas do ambulatório de

HIV do Centro Hospitalar Universitário Fann,

em Dakar no Senegal foram convidados a

participar do estudo com o seu Parceiro


Material & Métodos


Resultados


Resultados 34 casais – as sequencias agruparam com bootstrap

acima de 80% e distância abaixo do cut off (0,04)

Estas sequências foram consideradas geneticamente relacionadas

6 casais – as sequencias agruparam mas com bootstrap abaixo de 80% e distância abaixo ou acima do cut off

Estas sequências foram consideradas geneticamente indeterminadas

6 casais – as sequências não agruparam e a distância acima do cut off

Estas sequências foram consideradas geneticamente indeterminadas


Resultados


Resultados


conclusão

A maioria dos casais (concordantes) HIV positivos em

Dakar no Senegal mostrou sequencias

geneticamente relacionadas

Dados epidemiológicos indicam o marido como o

provável caso indice, estes dados enfatizam o risco

de mulheres casadas em contrair HIV como resultado

de relações sexuais ocasionais de seus maridos

Compreender as origens e dinâmicas da infecção HIV-

1 em casais na África será crucial para o

planejamento futuro e sucesso de programas de

prevenção do HIV


objetivos


Acompanhar o padrão de evolução de HIV-1 na

Ásia durante o período de 17 anos

A actividade biológica e patogenicidade de um dos

mais prevalentes subtipos do HIV (subtipo B) na Ásia

foi determinada com base nas sequências de HIV-1 do

período de 1990 -2007 disponíveis no banco de dados de Los

Alamos


Material & Métodos

Os data sets foram divididos em 4 grupos

Grupo I: 1990 – 1994Grupo II: 1995 – 1999Gupo III: 2000 – 2004Grupo IV: 2005 – 2007

Foram realizados dois tipos de análises da proteina do envelope e da alça V3 das sequencias retiradas do banco de Los Alamos


Material & Métodos

Análises filogenéticas baseadas na proteína do envelope

Predição de sitios de glicosilação na proteína do envelope

Alinhamento do dominio V3

Análise do “Motif” GPGX

Determinação de regiões conservadas da região V3


Resultados


Resultados

Os clusters B, C, D e E apresentaram divergência e taxas de mutação altas

Os clusters A e F exibem forte seleção e permanecem menos divergentes durante estes período

Foi observado um aumento de heterogeneidade nas sequencias de envelope na população infectada durante este periodo


Resultados


Resultados


Resultados


Resultados

60% dos sitios da V3

permanecem conservados


conclusão

A patogenicidade e infectividade do subtipo B do

HIV-1 está aumentada e mostrou uma rápida

evolução e um mecanismo de modulação

Os dados analisados também fornecem

informações úteis sobre a vigilância da infecção do

HIV-1 na Ásia e destaca o padrão evolutivo de

populações de vírus que possam estar sob pressões

variadas de seleção durante os diferentes períodos

de tempo



objetivos

Analisar as relações filogenéticas de diferentes regiões do genoma do VHC de amostras de casais portadores crônicos

Comparar as sequências genômicas dos casais

portadores de VHC com sequências de portadores crônicos, não relacionados, atendidos no mesmo ambulatório

Avaliar o grau de similaridade entre as sequências

genômicas do VHC dos casais e dos portadores não relacionados


Material & Métodos


Amostra(Soro)

Extração RNA-VHC(QIAamp)

Síntese de cDNAcom Random Primers

1º e 2º PCR

NS5B NS3 1ª estratégia

NS3 2ª estratégia

Neg

Pos

Pos Neg

Excluídos desta análiseReação de sequenciamento

Amostra(Soro)

Extração RNA-VHC(QIAamp)

Síntese de cDNAcom Random Primers

1º e 2º PCR

NS5B NS3 1ª estratégia

NS3 2ª estratégia

Neg

Pos

Pos Neg

Excluídos desta análiseExcluído das análises de NS3



Gel de sequenciamento

Purificação após reação de sequenciamento

Seqüências da região NS5B e NS3

Validação das seqüênciasMontagem da seqüência consenso

(Phred-Phrap- Consed)

Alinhamento das seqüências de cada regiãocom seqüências do GenBank e seqüências controle

(Clustal X)


Gel de sequenciamento

Purificação após reação de sequenciamento

Seqüências da região NS5B e NS3

Validação das seqüênciasMontagem da seqüência consenso

(Phred-Phrap- Consed)

Alinhamento das seqüências de cada regiãocom seqüências do GenBank e seqüências controle

(Clustal X)

Genotipagem e Subtipagem Análise do Sinal Filogenético

Construção das topologias das árvores filogenéticas das diferentes regiões com os diferentes métodos e modelos

Alinhamento das seqüências da região NS5Bcom seqüências do GenBank e seqüências controle

Alinhamento das seqüências da região NS3com seqüências do GenBank e seqüências controle

Alinhamento das seqüências da região NS3/NS5Bcom seqüências do GenBank e seqüências controle

Genotipagem e Subtipagem Análise do Sinal Filogenético

Construção das topologias das árvores filogenéticas das diferentes regiões com os diferentes métodos e modelos

Alinhamento das seqüências da região NS5Bcom seqüências do GenBank e seqüências controle

Alinhamento das seqüências da região NS3com seqüências do GenBank e seqüências controle

Alinhamento das seqüências da região NS3/NS5Bcom seqüências do GenBank e seqüências controle

Material & Métodos


Casal Sexo Genótipo Nascimento Uso Dogas Inj. Tranfusão /ano Promiscuidade** Risco Prof. Tatoo Acupuntura

1 F 3 28/8/1963 Sim Não Não Não Não Não

M 3 4/1/1960 Não Não Não Não Não Sim

2 F 3 30/7/1971 Não Não Não Não Não Não

M 3 22/11/1952 Sim Não Não Não Sim Não

3 F 1 6/7/1942 Não Sim/1975 Não Não Não Sim

M 1 S/Inf* Não Não Não Não Não Sim


M 1 4/6/1955 Sim Não Sim Não Não Não


M 1 29/5/1945 Não Não Não Sim Não Não

6 F 1 19/6/1957 Não Sim/1984 Não Não Não Sim

M 1 13/2/1949 Não Não Não Não Não Sim

7 F 3 5/8/1962 Não Não Não Sim Sim Não

M 3 29/12/1963 Não Não Não Sim Não Não

8 F 1 S/Inf* Não Não Não Não Sim Não

M 1 S/Inf* Sim Não Não Não Sim Não

9 F 1 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*

M 1 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*

S/Inf* = Sem informação

** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses

Tabela 1 - Características dos pacientes (casais) selecionados (dados obtidos de prontuário)

Material & Métodos


Controle Nº Sexo Genótipo Nascimento Uso Dogas Inj. Tranfusão /ano Promiscuidade Risco Prof. Tatoo Acupuntura

6947 M 1 1981 Não Sim/1981 Não Não Sim Não

6681 F 1 1962 Não Não Não Não Não Não


6625 M 1 1957 Não Não Não Não Não Não

7152 M 1 1951 Sim Não Sim Sim Sim Não

10248 F 1 1963 Não Sim/1986 Não Não Não Sim

8217 M 1 1966 Não Sim/várias Não Sim Não Não


7017 M 1 1954 Não Sim/1978 Não Não Não Não

9089 M 1 1967 Sim Não Sim Não Sim Sim

8399 F 1 1963 Não Sim/1988 Não Não Não Não

10402 F 1 1941 Não Sim/1975 Sim Não Não Não


10355 M 1 1956 Não Não Sim Não Sim Não



7918 F 1 1940 Não Não Não Sim Não Não

7910 M 1 1972 Não Não Não Sim Não Não

6887 F 1 1931 Não Sim/1983 Não Não Não Não7733 M 1 1952 Não Sim/1974 Não Não Não Não

10187 M 1 1955 Não Sim/1976 Sim Não Não Não


10323 M 1 S/Inf* Sim Não Não Não Não Não


5772 M 1 1949 Não Não Sim Não Não Não


10371 M 1 1943 Não Sim/1966 Não Sim Não Não

7692 M 1 1975 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*

Material & Métodos



Tabela 2 – Características pacientes controle (dados obtidos de prontuário)


Material & Métodos

Tabela 2 - Características dos pacientes controle (dados obtidos de prontuário) (continuação)

10180 M 3 1943 Sim Sim/1980 Não Não Não Não

7647 M 3 1939 Não Sim/1978 Sim Não Não Não







7244 M 3 1964 Não Sim/1990 Não Não Sim Não



10749 F 3 1939 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*

10698 M 3 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*

10173 F 3 1960 Não Não Não Não Sim Não

Tatoo AcupunturaControle Nº Sexo Genótipo Nascimento Uso Dogas Inj. Tranfusão /ano Promiscuidade Risco Prof.




Resultados


Resultados

NS5B 199nt(77 seq)

NS5B 344nt(77 seq)

NS3 619nt(72 seq)

NS3/NS5B960nt

(72 seq)

A B

C D

Análise do sinál filogenético


Resultados

Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos casais

Região NS5B entre 78,2% e 99,1% (média de 95,45%)

Região NS3 entre 94,7% e 99,2% (média de 97,24%)

Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos controles locais e sequências do Genbank

Região NS5B entre 53,9% e 98% (média de 72,9%)

Região NS3 entre 61% e 98,2% (média de 74,8%)

Variabilidade nucleotidica


A

BA

B

C

NS3/NS5BMV TBR

TrN+I+G(Bootstrap=1000 réplicas) C

ResultadosAnálise filigenética das regiões NS3/NS5B


A

BMV TBRNS3/NS5B

TrN+I+G(Bootstrap = réplicas)

A

B

C

C

ResultadosAnálise filigenética das regiões NS3/NS5B

(Com controles)


A

B

MVNS5B

TBRTrNef+I+G

(Bootstrap = 1000 réplicas)

A

B

C

C

ResultadosAnálise filigenética da regiãoNS5B

(Com controles)


Similaridade Bootstrap*** Distância MV Similaridade Bootstrap*** Distância MV Bootstrap*** Distância MV

CF01 97,4% ** MO MO 96,4% ** ? ? ** MO MO

CF02 97,4% ** ? MO 99,2% ** ? ? ** MO MO

CF03 97,1% ** ? ? 94,7% ** ? ? 99 MO MO

CF04 97,7% 98 MO MO NR NR NR NR NR NR NR

CF05 96,8% ** ? ? 96,6% ** ? ? ** ? MO

CF06 97,7% 72 ? MO 97,0% 100 MO MO 100 MO MO

CF07 97,7% 73 MO MO 97,4% ** MO MO 81 MO MO

CF08 99,1% 92 MO MO 99,0% 94 MO MO 100 MO MO

CF09 78,2% ** ? ? NR NR NR NR NR NR NR

MO = Mesma origem (ramo monofilético) (vermelho com Bootstrap acima de 70)

NR = Não Realizado

*** = Valores acima de 70

NS3/NS5b

** = Sem bootstrap significativo (<70)

? = Não apresentam ramo monofilético

MV = Máxima Verossimilhança

Análises sem controles

Familiares NS5b NS3

Resumo das análises das árvores filogenéticas (sem controle)

Resultados


Resumo das análises das árvores filogenéticas (com controle)

Resultados

Similaridade Bootstrap*** Distância MV Similaridade Bootstrap*** Distância MV Bootstrap*** Distância MV

CF01 97,4% ** MO MO 96,4% ** ? MO ** ? MO

CF02 97,4% ** ? MO 99,2% 79 ? MO ** ? MO

CF03 97,1% ** ? ? 94,7% 88 MO MO 94 MO MO

CF04 97,7% 89 MO MO NR NR NR NR NR NR NR

CF05 96,8% ** ? ? 96,6% ** ? ? ** ? MO

CF06 97,7% ** ? MO 97,0% 99 MO MO 99 MO MO

CF07 97,7% ** MO MO 97,4% ** MO MO 73 MO MO

CF08 99,1% 92 MO MO 99,0% 91 MO MO 98 MO MO

CF09 78,2% ** ? ? NR NR NR NR NR NR NR

MO = Mesma origem (ramo monofilético) (vermelho com Bootstrap acima de 70)

*** = Valores acima de 70** = Sem bootstrap significativo (<70)

Análises com controles

Familiares NS5b NS3 NS3/NS5b

MV = Máxima Verossimilhança

? = Não apresentam ramo monofilético NR = Não Realizado


conclusão

A escolha da região genômica e do método de análise

filogenética a ser utilizado são importantes para a

precisão dos resultados

Os dados de prontuário juntamente com as análises

moleculares indicam que a origem dos vírus dos

casais 8, 7, 6, 3 e 4 seja a mesma, dando suporte à

hipótese de transmissão intrafamiliar


conclusão

A inclusão dos controles nas análises mostrou-se

relevante para a confirmação dos resultados

Dados como similaridade de sequências não são

suficientes para inferir mesma fonte de transmissão


Obrigada

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Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho