Isolasi Dan Inokulasi

1Isolasi dan inokulasi mikroorganisme

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar belakang

Seiring denagn kemajuan bidang teknlogi, maka

pengembanagn mikroorganisme telah lama di gunakan

untuk menghasilkan produk-produk seperti bahan pangan

industri, pertanian dan obat-obatan .

Isolasi adalah cara untuk memisahkan

mikroorganisme tertentu dari lingkungan sehingga

diperoleh biakan yang sifatnya murni. Tujuan isolasi adalah

untuk memperlihatkan keanekaragaman mikroorganisme

dalam lingkungan di sekitar kita. Proses pemindahan

mikroba dari medium lama ke medium baru harus

dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus

diusahakan agar semua alat-alat yang berhubungan

dengan medium dan pekerjaan inokulasi (penanaman) itu

benar-benar steril, hal ini untuk menghindari kontaminasi

dengan mikroorganisme yang tidak diinginkan.

Inokulasi Penanaman bakteri atau biasa disebut juga

inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari

medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat

ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan

Rezky Nahdiati R. Rina Andriani S.farm, Apt.O1A114039


penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan

agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan

medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari

terjadinya kontaminasi.

Dalam mengisolasi suatu mikroorganisme, dilakukan

dengan cara yang aseptis untuk menghindari terjadinya

kontaminasi dengan mikroorganisme lain.

B. Maksud dan tujuan percobaan

a. Maksud percobaan

Maksud percobaan ini adalah untuk mengidentifikasi

mikrrorganisme/bakteri tertentu melalui proses isolasi

dan inokulasi.

b. Tujuan percobaan

Tujuan percobaan ini adalah agar

mahasiswa/mahasiswi (praktikan) dapat mengetahui

cara untuk mengidentifikasi mikrrorganisme/bakteri

tertentu melalui proses isolasi dan inokulasi.

C. Prinsip percobaan

Percobaan ini menggunakan air got sebagai sampel

yang akan diidentifikasi bakteri tertentu yang terdapat

dalam sampel dengan mengisolasi dan menginokulasi

sampel pada medium NA (nutrient agar).



BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Teori umum

Secara alami, mikroba di alam ditemukan dalam

poplasi campuran. Unruk memperoleh biakan murni dapat

dilakukan isolasi yang diawali dengan pengenceran

bertingkat. Proses isolasi mikroba adalah memisahkan

mikroba satu dengan mikroba lain yang berasal dari



campuran berbagai mikroba untuk dapat mempelajari sifat

biakan, morfologi dan sifat mikroba lainnya (puspitasari

dkk,2012).

Kultur yang menunjukkan indikasi adanya

pertumbuhan bakteri pengoksidasi amonia diambil dan

diisolasi secara tabur. Kultur tersebut kemudian diinkubasi

pada suhu ruang selama 3-5 hari. Isolat yang tumbuh

kemudian dimurnikan dan dipindahkan pada media agar

miring. Isolat yang diperoleh diseleksi kemampuan

tumbuhnya dengan cara menumbuhkannya dalam

erlenmeyer yang berisi 50ml media basal. Kultur tersebut

diinkubasi pada suhu ruang diatas penggoyang (shaker).

Pertumbuhan bakteri pengoksidasi amonia ditentukan

dengan mengukur perubahan amonia dan pembentukan

nitrit secara kualitatif, menggunakan indikator penentu

amoniumdan indikator penentu nitrit (agustiyani

dkk,2004).

Isolasi meupakan salah satu tahap yang terpenting

dalam proses pembuatan kultur murni. Pada tahap ini

dilakukan pengambilan eksplan. Eksplan yang di gunakan

adalah bagian tubuh dari jamur kuping. Pada proses isolasi,

diperlukan kecermatan yang tinggi dan keadaan yang



steril. Keadaan steril dapat diperoleh dengn cara

menggunakan ruang atau kotak isolasi khusus

(Suharyanto, 2010).

Inokulasi adalah proses penempatan ekspla atau

spora jamur pada media PDA dalam kondisi aseptik.

Caranya, eksplann atau spora dimasukkan kedalam media

PDA didalam tabung reaksi. Setelah itu, mulut tabung

langsung ditutup dengan kapas untuk menghindari

kontaminasi. Proses inokulasi ini juga dapat dilakukan di

dalam ruang atau kotak inokulasi (Rahmat, 2011).

Ruang isolasi dan inokulasi adalah tempat suci hama

(aseptik) yang di pergunakan untuk membuat media agar-

agar cawan, biakan murni, dan menginokulasi biakan

tersebut ke media lain utuk menghasilkan biakan induk,

bibit induk, ataupun bibit produksi. Di dalam ruangan

tersebut, tersedia berbagai peralatan untuk isolasi maupun

inokulasi (penanaman benih), seperti alkohol 70%, bunsen,

pembakar spiritus, skalpel, pinset, jarum inokulasi, tabung

reaksi, cawan botol, dan kotak inokulasi (Pustaka, 2002).

Pembuatan isolasi protein dilakukan dengan

menggunakan sifat-sifat fungsional protein. salah satu

yang paling berpengaruh adalah sifat kelarutan rotein.

Isolat protein dibuat dengan cara mengendapkan protein



pada titik isoelektriknya. Dengan cara ini, protei dapat

diisolasikan dan di pisahkan dari bagian bahan lainnya

yang tidak diiginkan (triyanto,2010).

Untuk menentukan apakah senyawa yang telah

diidolasi telah murni atau belum, maka perlu dilakukan uji

titik leleh terhadap senyawa tersebut. Rentang titik leleh

senyawa yang didapatkan yaitu 1,4°c , ini mengindikasikan

bahwa senyawa yang ddapatkan telah murni karena

senyawa dapat dikatakan murni apabila titik lelehnya

memiliki rentang ±2°c (ridhia dkk, 2013).

B. Uraian bahan

1. Aquades (Farmakope Indonesia, edisi III, Hal : 96)

Nama resmi : Aqua Destillata

Sinonim : Aquadest / Air Suling

RM / BM : H2O / 18,02

Rumus struktur : H – O – H

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak

berbau,tidak berasa.

Kegunaan : Sebagai sumber nutrien mikroba dan

pelarut medium.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.



2. Alkohol ( Dirjen POM, 1979)

Nama resmi : Aethanolum

Nama Lain : Etanol

RM / BM : C2H5OH / 47,06

Pemerian : Cairan tak berwarna, jernih muda

menguap, mudahbergerak, bau khas,

rasa panas, mudah terbakar,

memberikan nyala biru yang tak

berasap.

Kelarutan : Bercampur dengan air dan praktis

bercampur dengan semua pelarut

organik

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung

dari cahaya, ditempat sejuk, jauh dari

nyala api.

Kegunaan : Sebagai pelarut

3. Kapas ( Dirjen POM, 1979 : halaman 277 )

Nama resmi : Gossypium Depuratum.

Nama Lain : Kapas murni, Kapas tak berlemak.

Pemerian : Hampir tidak berbau, praktis tidak

berasa.



Kelarutan : Praktis tidak larut dalam pelarut biasa,

larut dalam larutan tembaga (II) klorida

ammonia P.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik, terlindung

dari cahaya, tidak boleh dibungkus

langsung dengan kertas lilin.

Khasiat : Pembalut.

BAB III

METODE PERCOBAAN

A. Pengambila sampel

Pengambilan sampel dilaksanakan pada :

1. Hari/tanggal : kamis, 5 maret 2015

2. Tempat : got perumahan dosen.

B. Alat dan bahan

1. Alat

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah :

a. Batang pengaduk

b. Cawan petri

c. Filler

d. Labu Erlenmeyer

e. Lampu spiritus

f. Oven

g. Pipet tetes



h. Rak tabung reaksi

i. Tabung reaksi

2. Bahan

Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah :

a. Alcohol

b. Air got

c. Aquades

d. Kapas

e. NA ( Nutrient Agar )

f. Plastik Warp

C. Prosedur kerja

Cara kerja yang dilakukan pada percobaan kali yaitu :

1. Disiapkan alat dan bahan.

2. Dibersihkan alat dan bahan menggunakan alcohol

70%.

3. Diletakkan 6 tabung reaksi kedalam rak tabung.

4. Diisi masing-masing tabung reaksi dengan aquades

sebanyak 9 ml.

5. Dimasukkan sampel air got pada tabung reaksi

pertama.

6. Dilakukan pengenceran bertingkat dengan

mengambil 1 ml aquades yang sudah dicampur



dengan sampel dan dimasukan pada tabung reaksi

ke dua.

7. Diulangi sampai pada tabung reaksi ke enam.

8. Disiapkan media NA (Nutrien Agar).

9. Dimasukan NA (Nutrien Agar) kedalam cawan petri.

10. Ditambahkan air sampel 1 ml kedalam cawan

petri.

11. Dihomogenkan.

12. Dibungkus dengan menggunakan kertas bekas.

13. Di inkubasi pada incubator dengan suhu 37 0

selama 1x24 jam .



BAB IV

HASIL PENGAMATAN

A. Gambar hasil pengamatan

Metode tuang

Sebelum inkubasi Setelak inkubasi 1x24 jam

Metode sebar

Sebelum inkubasi Setelah inkubasi 1x24 jam


Bakteri

Media NAMedia NA


B. Pembahasan

Isolasi adalah cara pemisahan mikroorganisme

tertentu dari lingkungan, sehingga dapat diperoleh biakan

yang sifatnya murni, sehingga dapat dibuat sebagai biakan

kultur murni. Metode inokulasi terbagi dua yaitu metode

agar tegak dimana Metode ini menggunakan medium yang

telah dipadatkan dengan tegak (permukaannya rata)

dalam tabung reaksi. Inokulasi dengan caraini

menggunakan ose lurus dengan cara menusukkan ose


Bakteri

Media NA Media NA


yang telah disentuhkan dengan biakan bakteri atau jamur

ke dalam medium yang memadat hingga ½ dari tinggi

medium. Kemudian diinkubasikan dalam inkubator pada

suhu 37oC selama 1 x 24 jam untuk bakteri dan selama 3 x

24 jam untuk jamur pada suhu kamar.

Metode inokulasi selanjunya yaitu metode agar

miring. Pada metode agar mirimh inokulasi menggunakan

medium yang telah dipadatkan degan posisi di miringkan

dalam tabung reaksi. Pada metode ini di gunakan ose bulat

yang telah di sentuhkan dengan biakan bakteri atau jamur

dengan cara digoreskan secara zig – zag pada permukaan

medium. kemudian diinkubaskan selam 1x24 jam untuk

bakteri, dalama inkubator pada suhu37oC dan selama

3x24 jam untuk jamur pada suhu kamar. Selain itu, dalam

kultur murni digunakan pula Metode isolasi dan terbagi

menjadi tiga bagian yaitu isolasi substrat padat dengan

metode gores. Pertama-tama medium dimasukkan dalam

cawan Petri, ditunggu hingga memadat.Lalu digoreskankan

sampel yang telah digerus pada medium yang

memadat.Setelah itu, cawan Petri tersebut dibungkus dan

diinkubasi secara terbalik.Diamati pertumbuhan koloni

mikrobanya.Selanjutnya yakni isolasi substrat cair dengan

metode tuang.



Sampel yang berupa larutan atau suspensi

dimasukkan ke dalam cawan Petri, lalu dimasukkan juga

medium. Dihomogenkan dengan cara digerakkan

membentuk angka delapan. Ditunggu hingga medium

memadat lalu cawan Petri tersebut dibungkus dan

diinkubasi secara terbalik dan diamati pertumbuhan koloni

mikrobanya.

Lamanya inkubasi bakteri dan jamur berbeda. Ini

dikarenakan perbedaan waktu yang dibutuhkan bakteri

dan jamur untuk bereprodiksi (melakukan pembelahan)

berbeda. Bakteri membutuhkan waktu untuk pembelahan

selama 1 - 2 hari sedangkan jamur membutuhkan waktu

untuk pembelahan selama 3 - 5 hari.Inkubasi dilakukan

dengan membalik cawan Petri. Hal ini dimaksudkan agar

uap air yang terjadi selama proses inkubasi, tidak jatuh ke

dalam medium yang dapat mengganggu petumbuhan

mikroba.

Bakteri dapat tumbuh dan berkembang biak dengan

cepat bila dalam keadaan yang menguntungkan.

Pertumbuhan bakteri dapat dibagi menjadi empat fase,

yaitu: (1) Fase Adaptasi (Lag Phase), merupakan periode

penyesuaian diri bakteri terhadap lingkungan dan lamanya



mulai dari satu jam hingga beberapa hari. Lama waktu ini

tergantung pada macam bakteri, umur biakan, dan nutrien

yang terdapat dalam medium yang disediakan. Pada fase

ini bakteri beradaptasi dengan lingkungan, belum mampu

mengadakan pembiakan, terapi metabolisme sel bakteri

meningkat dan terjadi perbesaran ukuran sel bakteri; (2)

Fase Pertumbuhan (Log Phase), merupakan periode

pembiakan yang cepat dan merupakan periode yang

didalamnya dapat teramati ciri khas sel-sel yang aktif.

Selama fase ini pembiakan bakteri berlangsung cepat, sel-

sel membelah dan jumlahnya meningkat secara logaritma

sesuai dengan pertambahan waktu, beberapa bakteri pada

fase ini biasanya menghasilkan senyawa metabolit primer,

seperti karbohidrat dan protein. Pada kurva, fase ini

ditandai dengan adanya garis lurus pada plot jumlah sel

terhadap waktu; (3) Fase Stasioner (Stationer Phase),

merupakan suatu keadaan seimbang antara laju

peryumbuhan dengan laju kematian, sehingga jumlah

keseluruah bakteri yang hidup akan tetap. Beberapa

bakteri biasanya menghasilkan senyawa metabolit

sekunder seperti antibiotika dan polimer pada fase ini; (4)

Fase Kematian (Death Phase), pada fase ini, laju kematian

bakteri melampaui laju pembiakan bakteri. Hal ini



disebakan karena habisnya jumlah makanan dalam

medium sehingga pembiakan bakteri terhenti dan keadaan

lingkungan yang jelek karena semakin banyaknya hasil

metabolit yang tidak berguna dan mengganggu

pertumbuhan bakteri.

Dalam percobaan ini ada beberapa kesalahan yang

di lakuan yaitu pada saat melakukan pengenceran tingkat

dengan konsentrasi yang lebih, pembagian dua Nutrient

Agar (NA) sehingga kurang bersih dan rapinya praktikan

dalam praktikum , sehingga hasil dari praktikum yag di

lakukan kurang memuaskan dan mendapatkan hasil yang

kurang baik.



BAB V

PENUTUP

A.Kesimpulan

Kesimpulan pada percobaan ini yaitu pada uji bakteri

dengan isolasi menggunakan metode tuang dan sebar

pada medium NA (Nutrien Agar) keduanya terdapat bakteri

dalam sampel yang digunakan.

B. Saran

Saran yang dapat disampaikan pada praktikum ini

adalah agar setiap pratikan dapat mengetahui tentang

inokulasi dan isolasi mikroba serta sebaiknya setelah

praktikum selesai praktikan lebih memperhatikan

kebersihan didalam laboratorium.



DAFTAR PUSTAKA

Agromedia Pustaka. 2002. Budidaya Jamur Konsumsi: Shiitake,

Kuping, Tiram, Ling Zhi, Merang. Jakarta.

Agustiyani Dwi., Hartati Imammuddin., Erni ,N,F.,Oedjijono. 2004.

“Pengaruh pH dan substrat organik terhadap pertumbuhan

dan aktivitas bakteri pengoksidasi amonia”. Biodiversitas Vol.5

No.2.

Rahmat, S., Nurhidayat. 2011. Untung Besar dari Bisnis Jamur

Tiram.

Agromedia Pustaka, Jakarta.

Ridhia, Sanusi Ibrahim., Mai Efdi., 2013. “Isolasi dan karateristik

dari fraksi N-heksan pada kulit batang srikaya (annona

squamosa L)”. Jurnal kimia unand Vol.2 No.1.

Puspitasari, Fajar Diah., Maya Shovitri., Nengah Dwianita

Kuswytasari, 2012. “Isolasi dan Karakteristik Bakteri Aerob

Proteolitik dan Tanki Septik”. Sains dan Seni ITS Vol.1

No.1.

Suharyanto, E., 2010. Bertanam jamur kuping di Lahan yang

Sempit. Agromedia Pustaka, Jakarta.



Triyanto agus., 2010. “Mempelajari pengaruh penambahan

beberapa asam pada proses isolasi protein terhadap tepung

protein isolat kacang hujau (phaseolus raditus L.)”. seminar

rekayasa kimia dan proses ISSN : 1411-4216.

LAMPIRAN

A. Skema Kerja

1. Isolasi Mikroorganisme


SAMPEL

Diencerkan sampel yang akan diisolasi dari pengenceran 10-

1 -10-6

Setelah selesai dilakukannya pengenceran, sebanyak 1 mL larutan tersebut dipipet ke dalam cawan petri steril.

Untuk metode sebar, dituangkan Nutrient Agar (NA) yang telah dicairkan kedalam cawan petri dan tunggu hingga memadat, setelah memadat dipipet sampel sebanyak 1 mL sampel kedalam cawan petri dan dihomogenkan dengan cara memutar cawan petri di atas meja dengan gerakan seperti angka delapan untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata. Setelah homogen, cawan tersebut diinkubasi selama 1 x 24 jam dengan posisi terbalik

Sedangkan untuk metode tuang, dituangkan Nutrient Agar (NA) ke dalam cawan petri lalu dipipet sampel sebanyak 1 mL ke dalam cawan petri, dihomogenkan dengan cara memutar cawan petri di atas meja dengan gerakan seperti angka delapan untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata. Sama seperti metode sebar, agar yang telah memadat diinkubasi selama 1 x 24 jam dengan posisi terbalik dan dimasukkan kedalam inkubator

Lalu diamati koloni mikroba yang terbentuk.


B. Komposisi Media

1. Nutrient Agar (NA)

Peptic digest of

Animal tissue 5, 00

Sodium chloride 5, 00

Beef extract 1, 50

Yeast extract 1, 50

Agar 15, 00

Aquadest ad 1000 ml


Documents

Isolasi Dan Inokulasi