Upload
fransiska-puteri
View
457
Download
5
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Citation preview
ACARA II
PENGECATAN BAKTERI
A. Tujuan
Mempelajari morfologi bakteri dan membedakan jenis bakteri.
B. Tinjauan Pustaka
Escherichia coli merupakan bakteri indikator kualitas air minum
karena keberadaannya di dalam air mengindikasikan bahwa air tersebut
terkontaminasi oleh feses, yang kemungkinan mengandung mikroorganisme
enterik patogen lainnya. Beberapa galur Escherichia coli digolongan sebagai
penyebab diare, yaitu ntherophatogenic Escherichia coli (EPEC),
Enteroaggregative Escherichia coli (ETEC), Enteroinvative Escherichia coli
(EIEC) dan Escherichia coli yang memproduksi shiga-toxin (STEC).
Bakteri Escherichia coli yang ada di dalam air atau makanan biasanya galur
Escherichia coli non-patogen walaupun beberapa kasus terdapat galur yang
patogen seperti enterotoksigenik dan galur Escherichia coli yang
memproduksi Escherichia coli (Radji dkk, 2010).
Bakteri asam laktat. Istilah bakteri asam laktat (BAL) mulanya
ditujukan hanya untuk sekelompok bakteri yang menyebabkan keasaman
pada susu. Secara umum BAL didefinisikan sebagai suatu kelompok bakteri
gram positif, tidak menghasilkan spora, berbentuk bulat atau batang yang
memproduksi asam laktat sebagai produk akhir metabolic utama selama
fermentasi karbohidrat. BAL dikelompokkan ke beberapa jenis genus antara
lain Sterptococcus (Lactococcus), Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus
(Pato, 2003).
Mikobakteri diklasifikasikan sebagai asam-cepat karena kemampuan
mereka untuk melawan decolourisation dengan asam mineral setelah
pewarnaan dengan pewarna arymethane. Sebelum mikroskop elektron asam
ini tahan luntur disebabkan hipotetis luar 'lilin kemudian', tetapi sekarang
diketahui tergantung pada residu asam mycolic dari peptidoglycolipids dari
outers pewarnaan kompleks terbentuk antara residu asam dan pewarna
(misalnya carbol fuchsin) yang menjebak noda intraseluler (Allen, 1992).
Di dalam semua ruangan akan selalu didapati mikroorganisme yang
tersuspensi dengan udara dan dapat mengendap bersama debu pada berbagai
macam permukaan seperti pakaian, meja, lantai dan benda-benda lain.
Ukuran sel mikroorganisme yang sedemikian kecil dan ringan menyebabkan
mudah terhembuskan oleh aliran udara. Keberadaan mikroorganisme dapat
menyebabkan kontaminasi, hal ini sangat berpengaruh pada ruangan yang
seharusnya terjaga keseterelilannya missal ruang operasi, laboratorium dan
lainnya. Dalam ruangan laboratorium sering ditemukan mikroorganisme
kontaminan yang ikut tumbuh dalam suatu media nutrient agar. Bakteri
kontaminan yang sering ditemukan antara lain Bacillus sp, Sterptococcus sp,
staphylococcus, Pseudomonas dan Sarcina. Dari mikroorganisme tersebut,
yang paling menyebabnkan kontaminasi adalah Bacillus subtilis
(Ariyadi, 2009).
Seperti jelas tercermin dari namanya, metode ini bukan untuk
mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.
Metode ini meliputi pencampuran mikroorganisme di dalam setetes tinta
India atau nigrosin lalu menyebarkannya dia atas sebuah kaca obyek yang
bersih. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus
pandang) dan tampak jelas di antara medan yang gelap karena pewarna –
pewarna tersebut tidak menembus mikroorganisme. Teknik ini berguna
untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Berbeda dengan metode -
metode pewarnaan yang lain, pada pewarnaan negatif olesan tidak
mengalami pemanasan ataupun perlakuan keras dengan bahan – bahan
kimia, maka terjadinya penyusutan sel dan salah satu bentuk agak kurang
sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih cepat
(Hadioetomo, 1990).
Dimodifikasi Ziehl - Neelsen Pewarnaan yang klasik dilakukan
dengan pewarnaan metanol smear tipis tetap dengan bahan tinja murni solusi
carbol-fuchshin selama minimal 15 menit. Selanjutnya, slide dibilas dalam
air keran dan ditempatkan dalam larutan asam-alkohol untuk menghilangkan
noda, sementara struktur asam cepat akan menolak dengan tindakan asam-
alkohol destaining. Setelah membilas lagi, slide ditempatkan untuk jangka
waktu yang singkat dalam produk kontra-pewarnaan, seperti biru metilen,
memberikan kontras antara materi latar belakang dan struktur asam cepat.
Slide dibilas sekali lagi dan sesudah slide telah dikeringkan, dapat diperiksa
dengan menggunakan x 10 eyepieces dan tujuan minyak imersi x
pembesaran 100 (Potters and Marjan, 2010).
Mula- mula dibuat film tipis seperti pada pewarnaan gram,
dikeringkan di udara, dan difiksasi di atas nyala api kecil. Pewarna hijau
malasit (malachit green) diteteskan di atas film tersebut, dan dibiarkan
selama 20 menit tanpa penangas, atau 5 menit di atas penangas air. Setiap
kali pewarna menjadi kering, ditetesi lagi pewarna yang baru. Kemudian
dicuci secara hati – hati dengan air selama 20 -30 detik, atau sampai warna
hijau tidak luntur. Film ditetesi dengan safranin (untuk mewarnai sel) selama
30 detik, dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap. Obyek
diperiksa dibawah mikroskop menggunakan lensa obyektif minyak imersi.
Endospora bakteri akan berwarna hijau- hijau muda, sedangkan sel vegetatif
berwarna merah-merah muda. Diamati bentuk dan besar spora, letak spora di
dalam sel, pembengkakan sel vegetatif, atau spora mungkin telah
dikeluarkan dari sel jika kultur yang diamati sudah terlalu tua
(Fardiaz, 1993).
Hanya sekelompok bakteri yang dapat membentuk endospora. Makna
yang amat besar dari sekelompok endospora ini terletak dari ketahanannya
terhadap pemanasan. Meskipun semua bakteri lain dan juga sel – sel
vegetative dari bakteri – bekteri pembentuk spora dapat dimatikan dengan
pemanasan pada suhu 800 C selama 10 menit, endospora termosisten dapat
bertahan pada pemanasan yang jauh lebih kuat, beberapa spora bahkan tahap
dimasak untuk beberapa jam. Teknik sterilisasi (tindakan pensucihamaan)
yang memerlukan tenaga dan biaya yang bertujuan untuk mematikan
endospora ini. Di lain pihak sifat termoresisten spora menyediakan
kemungkinan yang tidak ada bandingnya untuk membiakkan secara selektif
pembentuk-pembentuk spora,tanah atau bahan huni lain dipanasi pada suhu
800 C atau 1000 C selama 10 menit, sehingga semua sel vegetative dimatikan,
hanya spora termoresisten saja yang dapat mempertahankan kemampuan
hidup dan dapat berkecambah apabila kemudian diinkubasi dalam media
biak yang cocok (Schmidt, 1994).
Fiksasi adalah suatu usaha manusia untuk mempertahankan elemen-
elemen sel atau jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami
perubahan bentuk maupun ukuran. Untuk mencapai tujuan tersebut maka
para ahli sitologi berusaha keras mencari suatu media yang terdiri dari
unsure – unsure kimia, yang kemudian dibuat suatu larutan atau dalam
bentuk gas. Media ini kemudian disebut fiksatif (Suntoro, 1980).
C. Metodologi
1. Alat
a. Gelas objek
b. Batang gelas
c. Mikroskop
d. Tabung reaksi
e. Bunsen
f. Jarum oase
g. Pipet tetes
2. Bahan
a. Biakan murni Lactococcus lactis
b. Biakan murni Escherichia coli
c. Biakan murni Lactococcus subtilis
d. Larutan cat Nigrosin atau tinta cina
e. Aquades steril
f. Larutan cat Ziehl Neelsen carbol fuchsinb (ZN.A)
g. Larutan peluntur alkohol asam (ZN B)
h. Larutan penutup Loeffler methlyne blue (ZN C)
i. Larutan malakit hijau
j. Larutan safranin
3. Cara kerja
a. Pengecatan Negatif
Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak, panggang diatas lampu spritus
Diambil suspensi biakan murni Lactococcus lactis dengan ose secara aseptik
Diambil sedikit larutan tinta cina dengan batang gelas, campur dengan suspensi
Diamati preparat dengan mikroskop,
Diletakkan diatas gelas objek
Di ratakan dengan batang gelas hingga merupakan lapisan tipis, preparat dikeringkan
Digambar preparat dengan latar belakang diarsir
Diulangi untuk biakan murni E.coli
b. Pengecatan Acid Fast
Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak, panggang diatas lampu spritus
Diambil suspensi biakan murni Lactococcus lactis dengan ose secara aseptik, letakkan diatas gelas objek
Diletakkan diatas gelas objek
Dikeringkan dianginkan dan difiksasi diatas lampu spritus
Diletakkan preparat diatas suatu rak, bubuihkan larutan cat utama (ZN A), panasi dengan lampu spritus selama 5 menit
Preparat didinginkan, dicuci dengan air, dikering anginkan, dicuci dengan larutan peluntur (ZN B), dicuci lagi dengan
air, dikering anginkan
Dibubuhkan zat penutup (ZN C), cuci dengan air mengalir, kering anginkan, amati dalam mikroskop
Digambar hasil pengamatan
Diulangi langkah diatas untuk biakan E. coli
Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak, panggang diatas lampu spritus
c. Pengecatan Endospora
Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak, panggang diatas lampu spritus
Diambil suspensi biakan murni Lactococcus lactis dengan ose dan biakan Bacillus subtilis secara aseptik, letakkan
diatas gelas objek
Dikering dianginkan dan difiksasi diatas lampu spritus
Dibubuhkan pewarna hijau (malachit green) diatas gelas obyek
Diletakkan diatas penangas air selama 5 menit
Diamati dalam mikroskop, ulang untuk biakan Bacillus subtilis
Dicuci secara hati-hati dengan air yang mengalir sampai warna hijau tidak luntur
Dibubuhi dengan safranin, kemudian dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap
Digambar hasil pengamatan
C. Hasil dan Pembahasan
Tabel 2.1 Pengecatan Bakteri
Kelompok Sampel Gambar Hasil Praktikum Keterangan
1 dan 7 E. Coli Bakterinya
transparan
dengan latar
gelap dan
berbentuk agak
lonjong (basil)
2 dan 8 Lactococcus
lactis
Bakterinya
transparan
dengan latar
gelap
9 dan 15 E. Coli Latar belakang
gelap (hitam)
Bentuk bakteri
lonjong
10 dan 16 Lactococcus
lactis
Bakterinya
transparan
Latarnya gelap
Sumber : Laporan Sementara
Pengecatan negatif sesuai dengan namanya, metode ini bukan
untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi
hitam/gelap. Metode ini meliputi pencampuran mikroorganisme di
dalam setetes tinta cina/nigrosin lalu menyebarkannya di atas sebuah
kaca obyek yang bersih. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan dan tampak jelas di antara medan yang gelap karena
pewarna-pewarna tersebut tidak menembus mikroorganisme.
Teknik ini bertujuan untuk melihat bentuk-bentuk sel yang
sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran sel serta melihat dan
membedakan bakteri yang hidup dan yang mati. Berbeda dengan
metode-metode pewarnaan lain, pada pengecatan negatif olesan tidak
mengalami pemanasan ataupun perlakuan keras dengan bahan-bahan
kimia, maka terjadinya penyusutan sel dan salah bentuk agak kurang
sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Akan tetapi,
harus diperhatikan bahwa selama mengeringnya pewarna, sel-sel
tersebut dapat saja mengalami penyusutan atau salah bentuk. Metode ini
biasa digunakan untuk bakteri yang sulit diwarnai.
Faktor yang mempengaruhi berhasilnya metode ini adalah kaca
obyek harus benar-benar bersih (bila terdapat sisa-sisa lemak atau debu
pada kaca obyek, olesan mikroorganisme tidak akan merata). Jumlah
nigrosin yang digunakan campuran mikroorganisme dan pewarna harus
diseret di atas kaca obyek, bukan sekedar di dorong.
Pada praktikum ini mula-mula mensterilkan gelas benda dengan
alkohol hingga bebas lemak kemudian panggang di atas nyala lampu
spiritus, setelah dingin ambil suspensi biakan murni secara aseptik di
atas gelas benda, kemudian ambil larutan cat nigrosin/tinta cina dan
campurkan lalu ratakan hingga merupakan lapisan yang tipis sekali,
kemudian keringkan. Amati dengan mikroskop perbesaran kuat dengan
minyak imersi yang berfungsi sebagai indikator. Sel-sel bakteri yang
hidup akan tampak transparan dengan latar belakang hitam/gelap. Sel
bakteri yang mati akan terlihat gelap.
Biakan murni yang digunakan adalah Lactococcus lactis dan
Escherichia coli dalam medium nutrien cair 24 jam. Larutan yang
digunakan adalah nigrosin/tinta cina, larutan congo-red, dan larutan
alkohol asam (alkohol yang mengandung 1 – 2 % HCl). Dalam hasil
pengamatan yang dilakukan didapatkan bentuk bakteri dengan bentuk
agak lonjong dan transparan. Hal disebabkan masih banyak terdapat
bakteri yang hidup. Dimana sel-sel bakteri yang hidup akan tampak
transparan dengan latar belakang hitam atau gelap. Sel bakteri yang mati
akan terlihat gelap.
Pewarnaan ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai
latar belakangnya menjadi gelap. Caranya secara umum dengan
mencampur mikroba dalam setetes tinta bak/ tinta cina/ tinta india
(negrosin) lalu meyebarkan diatas kace objek yang bersih. Pewarnaan
negatif menyebabkan mikroba kelihatan transparan (tembus pandang)
dan tampak jelas pisah diatara medan yang gelap karenapewarnaan ini
berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Berbeda dengan
metode pewarnaan yang lain, pada pewarnaan negative tidak mengalami
pemanasan atau perlakuan lain dengan dengan bahan kimia
(Waluyo, 2008).
Tabel 2.2 Pengecatan Acid Fast (Pengecatan Ziehl Neelsen)
Kelompok Sampel Gambar Hasil
Praktikum
Keterangan
3 E. Coli Tidak tahan
asam, berwarna
biru
Latar biru muda
4 Lactococcus
lactis
Tahan asam
Berwarna merah
Latar merah
muda
11 E. Coli Bakterinya
berwarna biru
ungu
Tidak tahan asam
12 Lactococcus
lactis
Bakterinya
berwarna merah
Tahan asam
Latarnya
berwarna merah
muda
Sumber : Laporan Sementara
Tujuan pengecatan acid fast adalah untuk membedakan bakteri
yang bersifat acid fast (tahan terhadap pencucian asam) dan bakteri yang
bersifat non acid fast (tidak tahan terhadap pencurian asam). Biakan
murni yang digunakan lactococcus lactis dalam medium nutrien agar
miring umur 48 jam dan Escherichia coli dalam medium nutrien agar
miring umur 24 – 48 jam. Larutan yang digunakan adalah larutan Ziehl
Neelsen carbol fuchsin (ZN A), peluntur alkohol asam (ZN B), dan
penutup Loeffler methylene blue (ZN C).
Sekalipun sitoplasma berwarna, sel-sel organisme seperti mikro
bakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak
terpusatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti alkohol asam.
Alkohol asam merupakan pemucat yang sangat intensif. Pada kondisi
ini, organisme yang dapat menahan zat warna dikatakan acid fast (tahan
asam) dan berwarna merah. Pada bakteri biasa yang dinding selnya tidak
bersifat terlampau lipoid pewarna karbol fuchsin yang mewarnai sel
dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol asam sehingga dikatakan
non acid fast (tidak tahan asam). Tercucinya karbol fuchsin dapat
diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan Loeffler methlyne blue
oleh sel, sehingga bakteri tampak biru.
Pada praktikum ini mula-mula mensterilkan gelas benda dengan
alkohol hingga bebas lemak kemudian dipanggang di atas nyala lampu
spiritus. Kemudian ambil secara aseptik aquadest dan letakkan di atas
gelas benda dan suspensikan biakan murni secara aseptik ke dalam
aquadest kemudian ratakan seluas ± 1 cm dan kering-anginkan lalu
fiksasi di atas lampu spiritus. Kemudian bubuhkan larutan zat utama
(ZN A) yang berlebihan dan panasi selama 5 – 10 menit dan cegah agar
cat jangan sampai kering/mendidih. Kemudian dinginkan dan cuci lalu
keringkan. Kemudian cuci lagi dengan larutan peluntur (ZN B) sampai
zat peluntur yang mengalir tampak kemerah-merahan. Setelah kering,
bubuhi larutan zat penutup (ZN C) selama 30 detik, kemudian cuci dan
keringkan. Amati dengan mikroskop perbesaran kuat dan dengan
minyak imersi untuk indikator. Bakteri yang acid fast tampak berwarna
merah sedangkan non acid fast berwarna biru.
Faktor yang mempengaruhi berhasilnya metode ini adalah kaca
obyek harus benar-benar bersih (bila terdapat sisa-sisa lemak atau debu
pada kaca obyek, olesan mikroorganisme tidak akan merata). Jumlah
nigrosin yang digunakan campuran mikroorganisme dan pewarna harus
diseret di atas kaca obyek. Bukan sekedar di dorong.
Berdasarkan hasil percobaan, dapat diketahui bahwa
mikroogranisme pertama yang diamati yaitu E. Coli berwarna biru
dengan warna dasar biru muda yang menandakan bahwa E.Coli todak
tahan terhadap asam. Sedangkan untuk mikroorganisme kedua yang
diamati yaitu Lactococcus lactis berwarna merah dengan bentuk coccus
(bulat) yang menandakan bahwa bakteri ini merupakan bakteri yang
tahan terhadap asam.
Tabel 2.3 Pengecatan Endospora
Kelompok Sampel Gambar Hasil
Praktikum
Keterangan
5 Bacillus
subtilis
Latar berwarna
kuning, tidak ada
endospora.
6 Lactococcus
laktis
Ada endospora
Latar berwarna
kuning
Bakteri seperti
noda garis- garis
hijau tipis
13 Bacillus
subtilis
Latar berwarna
kuning
Tidak terdapat
endospora
14 Lactococcus
laktis
Latar berwarna
kuning. Bakteri
berbentuk garis
hijau dan bercak
Terdapat
endospora
Sumber : Laporan Sementara
Sifat endospora yang demikian menyebabkan dibutuhkan perlakuan
yang keras untuk mewarnainya. Prosedur pewarnaan Gram misalnya, tidak
dapat mewarnainya. Hanya bila diberi perlakuan panas yang cukup,
pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna
memasuki endospora, sukar dihilangkan. Ada dua metode yang umum
dipakai, yaitu metode Shaeffer-Fulton dan metode Dorner. Metode Dorner
menggunakan nogroin dan menghasilkan spora berwarna merah dan
sporangium yang tak berwarna (Hadioetomo, 1990).
Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat
digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal
dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif
yang letaknya tepat ditengah. Tipe terminal memliki pengertian letak sel
vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal
berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir sel vegetatif.
Endospora dapat berukuran lebih besar ataupun kecil dari sel vegetatif yang
terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki
resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan malakit
hijau adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan
hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus suntilis
memiliki endospora yang terletak di subtermal (Ncbi, 2008). Perbedaan
antara bakteri yang terdapat endospora dengan bakteri yang tidak terdapat
endospora yaitu, bakteri yang terdapat endospora terdapat garis-garis hijau
tipis seperti bercak. Sedangan yang tidak terdapat endospora terdapat garis-
garis ada yang merah pudar dan abu –abu. Pada praktikum yang kita
lakukan dapat disimpulkan jenis spora yang kita dapatkan adalah tipe
subtermal, dimana letak endosporanya diantara tengah dan pinggir sel
vegetatif.
Malachite green merupakan senyawa organik yang digunakan sebagai
zat warna dan telah muncul sebagai agen kontroversial dalam akuakultur.
Malachite green secara tradisional digunakan sebagai pewarna untuk bahan
seperti sutra, kulit, dan kertas. Meskipun disebut malachite green, senyawa
ini tidak berhubungan dengan perunggu mineral - nama hanya berasal dari
kesamaan warna. Dalam pewarnaan bakteri fungsi Malachite green ini
adalah untuk melihat ada tidaknya endospora pada bakteri.
E. Kesimpulan
Dari praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan sebagai berikut :
1. Bakteri yang hidup berwarna transparan dengan latar belakang
hitam/gelap dan tampak jelas karena pewarna-pewarna tersebut tidak
menembus mikroorganisme.
2. Bakteri yang mati berwarna gelap.
3. Bakteri pada biakan Lactococcus lactis bentuknya lonjong-lonjong.
4. Bakteri pada Escherichia coli bentuknya bulat-bulat.
5. Bakteri acid fast adalah bakteri yang tahan terhadap pencucian/zat warna
dan berwarna merah yaitu pada biakan Lactococcus lactis.
6. Bakteri non acid fast adalah yang tidak tahan terhadap pencucian/zat
warna dan berwarna biru yaitu pada biakan Escherichia coli.
7. Bakteri pada biakan Bacillus subtilis tidak terdapat endospora karena
berwarna merah.
8. Bakteri pada biakan Lactococcus lactis terdapat endospora karena
berwarna hijau.
DAFTAR PUSTAKA
Allen, Janet L. 1992. A Modified Ziels_Neelsen Stain for Mycobakteria. Journal of Medical laboratory 99 – 102. United kingdom.
Ariyadi, T dan Sinto Dewi. 2009. Pengaruh Sinar Ultraviolet Terhadap Pertumbuhan Bakteri Bacillus sp. Sebagai Bakteri Kontaminan. Jurnal Kesehatan Volume 2 No. 2. Semarang.
Fardiaz, Srikandi. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Hadioetomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Pato, Usman. 2003. Potensi Bakteri Asam Laktat yang diisolasi dari Dadih untuk Menurunkan Resiko Penyakit Kanker. Jurnal Natur Indonesia Volume 5 No. 2 :162-166. Riau.
Potters, Idzi and Marjan Van Esbroeck. 2010. Negative Staining Technique of Heine for The Detection of Cryptosporidium spp.:A fast and Simple Screening Technique. The open parasitology Journal Volume 4 No 1-4. Belgium.
Radji, Maksum dkk. 2010. Deteksi Cepat Bakteri Escherichia coli Dalam Sampel Air dengan Metode Polymerase Chain Reaction Menggunakan Primer 16E1 dan 16E2. Jurnal Makara, Sains Volume 14 No. 1, April 2010: 39 – 43. Depok.
Schmidt, Karin. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Enam. Gadjah Mada University Press. Yoyakarta
Suntoro, S. Handari. 1980. Metode Pewarnaan. Bhatara Karya Aksara. Jakarta