LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI FARMASI

Judul :

Pengecatan Gram dan Tetes Gantung

DosenPengampu :

Rinda

Nama Kelompok :

Etik Puji Hastuti (20144166A)

Soraya Putri Orshita R (20144168A)

Miraziza Amanda (20144169A)

Asalia Nopriyanti M (20144170A)

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SETIA BUDI

2015

I. JUDUL

PENGECATAN

II. TUJUAN

Mahasiswa dapat mengetahui morfologi dan struktur sel mikroorganisme dengan

mewarnai sel.

III. DASAR TEORI

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena

selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi

hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel

dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri

ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian

mikrobiologi. Macam-macam pewarnaan antara lain:

1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis

pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi (coccus, basil, vibrio,

spiral) dan susunan selnya (rantai, bergerombol, berpasangan, tetrad). Pewarnaan

ini dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet,

metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin. Pewarnaan sederhana dibagi menjadi

dua yaitu Pewarnaan positive dan negative.

a. Pewarnaan positive

Sebelum dilakukan pewarnaan positif hendaknya membuat ulasan diatas

objek glass, kemudian difiksasi. Ulasan jangan terlalu tebal karena akan

mempersulit mencari bakteri dalam pengamatan dengan mikroskop. Fiksasi

bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object

glass tanpa merusak struktur selnya.

b. Pewarnaan positive

Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri

yang sulit diwarnai, seperti Spirochaeta.

2. Pewarnaan diferensial

Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi

dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam (acidfast). Selain itu juga

digunakan untuk visualisasi struktur. Pewarnaan differensial antara lain:

a. Pewarnaan gram

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompok

kan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan

antara lain : kristal violet sebagai gramA, iodine sebagai gram B, alkohol

sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.

b. Pewarnaan acid fast

Pewarnaan ini digunakan untuk membedakan bakteri yang tahan terhadap

larutan asam dan yang tidak tahan terhadap larutan asam. Reagen yang

digunakan dalam pewarnaan acid fast terdiri dari cat utama, peluntur alkohol

asam, dan cat lawan / tanding.

3. Pewarnaan khusus

Untuk mewarnai struktur khusus dari bakteri seperti kapsul, spora, flagel dll·

Pewarnaan kapsul. Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: Kristal violet

sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai

pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi.

Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna

ungugelap dari sel. Pewarnaan khusus antara lain :

a. Pewarnaan spora

Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green

dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijaupada

sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus

subtilis.

IV. ALAT dan BAHAN

ALAT:

1. Objek glassJarum inokulum / ose

2. Pembakar spirtus

3. Mikroskop monocular

4. Tabung reaksi

5. Pipet tetes

6. Rak tabung reaksi

BAHAN

1. Biakan bakteri Bacillus, Tetracoccus, Providencia, Staphyllococcus.

2. Aquadest

3. Spirtus.

4. Pewarna methylen blue, safranin, kristal violet

5. Kapas Xylol

6. Minyak imersi

7. Tinta cina.

V. CARA KERJA

a. Pewarnaan Positiv

1. membersihkan obyek glass dengan kapas

2. menuliskan nama bakteri pada sudut objek glass

3. memanaskan ose diatas api hingga membara

4. memutar kapas penutup tabung aquadest sebelum membuka tabung reaksi dan

kemudian menarik kapas peenutup tabung reaksi yang berisi aquadest. Setelah

di buka, memanaskan mulut tabung reaksi dengan api.

5. mengambil aquadest dengan menggunakan ose yang telah di sterilisasi

dengan api, kemudian mengoleskan ke tengah – tengah objek glass, lakukan

2-3 kali.

6. Sebelum menutup tabung reaksi memanaskan kembali mulut tabung reaksi.

7. Mengambil biakan bakteri di dalam tabung reaksi dengan cara memutar kapas

penutup tabung sebelum membuka tabung reaksi, dan kemudian menarik

kapas menutup tabung reaksi. Setelah di buka, memanaskan mulut tabung

reaksi dengan api. memasukan ose yang telah disterilisasi untuk mengambil

bakteri dengan cara mengoleskan ke permukaan kultur bakteri dan

mengoleskan pada objek glass, tepat diatas permukaan aquadest yang telah

diteteskan sebelumnya pada objek glass yang sama, memutar dan meratakan

bakteri dengan air hingga sedemikian rupa membentuk lingkaran.

8. memfiksasi perparat yang telah diolesi bakteri tersebut di atas api sampai

kering.

9. Setelah benar – benar kering, memberikan pewarna pada objek glass yang

berisi ulasan bakteri tersebut dengan cat pewarna ( methylen blue, safranin,

crystal violet) selama kurang lebih 30 detik.

10. Setelah 30 detik mencuci denggan air mengalir dan meringkan kembali ulasan

yang masih basah.

11. mengamati ulasan dibawah mikroskop dengan perbesaran lemah, setelah

fokus teteskan minyak emersi tepat diatas preparat dan ganti lensa obyektif

dengan perbesaran kuat 1000x.

b. Pewarnaan Negativ

1. Membersihkan kedua objek glass dengan alcohol.

2. Meneteskan nigrosin ( tinta cina ) pada ujung kanan dari salah satu objek

glass.

3. mengambil ose dan kemudian mensterilisasi ose tersebut dengan cara

memanaskan ujung ose di api spirtus sampai membara.

4. Mengambil tabung reaksi yang berisi biakan bakteri, memutar terlebih dahulu

sebelum menarik penutupnya, memanaskan mulut dari tabung reaksi sebelum

mengambil bakteri dengan ose, setelah dipanaskan mengambil bakteri dengan

ose. Sebelum menutup memanaskan kembali mulut tabung

5. Mengoleskan dan mencampurkan bakteri pada tinta cina yang kita teteskan di

ujung kanan objek glass.

6. menempelkan sisi objek glass yang lain tepat pada tinta cina dengan posisi

objek glass membentuk sudut 45°.

7. menggeser objek glass yang kita tempelkan di atas tinta cina tersebut ke arah

kiri, pastikan bahwa ada bagian yang cukup tipis dari olesan tinta tersebut

agar dapat diamati dengan mudah.

8. mengeringkan tinta cina tersebut tanpa adanya fiksasi dengan api.

9. Setelah kering melakukan pengamatan dengan mikroskop menggunakan

perbesaran lemah 40x. Setelah tercapai titik fokus ganti lensa objektif dengan

perbesaran sedang 100x.

VI. DATA PERCOBAAN

bacillus

Tetracoccus

Streptococcus

providonsia

Providonsia 40

VII. PEMBAHASAN

Pewarnaan sederhana, merupakan metode yang paling umum digunakan. Disebut

demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme.

Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena

sitoplasmaanya bersifat basofil (suka basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk

pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat

positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan

bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, bacillus, strepto cocus dll) dari

bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Dengan pewarnaan

sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa

yangbiasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah methylen blue, kristal violet,

dan safranin. Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir

transparan bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat, karena

sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias

lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dengan lingkungannya dapat

dipertajam dengan mewarnai sample tersebut. Tujuan pewarnaan adalah untuk

mengamati dengan lebih baik morfologi mikroorganisme secara kasar,

mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme dan membantu

mengidentifikasi atau membedakan mikroorganisme yang serupa.

Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yang memakai bahan pulas yaitu tinta-cina

(nigrosin), karena itu sering juga disebut pewarnaan tinta-cina. Pewarnaan ini dipakai

untuk mengetahui adanya golongan spirochaetales dan juga untuk memperlihatkan

adanya selubung (kapsul) pada bakteri-bakteri tertentu. Pewarnaan ini merupakan

pewarnaan yang tidak langsung. Kita hanya mewarnai latar belakang dari bakteri

tersebut, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengambil zat-zat warna. Pada negatif

tidak dilakukan ”fiksasi”, maka praktis bakteri tidak mengalami perubahan-

perubahan, tidak mengerut. Dengan demikian pewarnaan negatif berguna untuk

melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya serta berguna untuk pengukuran-

pengukuran bakteri. Pada pewarnaan bakteri ini sel-sel bakteri kelihatan ”transparan”

(terang jernih) sedangkan latar belakangnya kelihatan gelap (dengan tinta-cina).

Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan sederhana dan negatif pada bakteri

basilus, streptococcus, providensia, dan tetracoccus. Dalam pewarnaan sederhana

yang dipergunaakan dalam praktikum, digunakan biakan bakteri yang telah dikultur

dan diwarnai dengan pewarna – pewarna seperti methylen blue, safranin, dan Kristal

violet. Masing – masing dari pewarna tersebut memberikan warna – warna yang

berbeda, pewarnaan sederhana akan merubah warna dari bakteri sesuai dengan warna

cat yang kita beri kepada bakteri tersebut.Methylen blue akan memberikan warna

biru muda, safranin akan memberikan warna merah muda dan kristal violet akan

memberikan warna ungu pada bakteri. Dalam pewarnaan negatif kita dapat

membedakan dengan pewarnaan sederhana dari segi warna yang ada, dalam

pewarnaan sederhana yang berubah warna adalah bakteri tersebut dan pewarnaan

negatif adalah latar belakang yang menjadi gelap, dan bakteri akan tapak seperti

bintang – bintang putih transparan. Pastikan bahwa dalam pewarnaan negatif terdapat

usapan yang cukup tipis sehingga dapat diamati. Pada saat pemerataan, setelah

mengambil bakteri dari tabung kultur pastikan bahwa kita mengusapkan ose yang ada

bakteri ke tinta cina secara merata, tujuannya adalah ketika kita mengamati bagian

yang tipis dari pengecatan negatif, terdapat bakteri di tempat yang tipis tersebut

VIII. KESIMPULAN

1. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan

pengecatan sederhana dan pengecatan negative.

2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri

dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin, kristal violet,

methylen blue.

3. Pewarnaan dari bakteri akan memberikan penampilan baru dalam pengamatan

bakteri

4. Sterilisasi dari alat dan praktikan sangat penting peranannya dalam

pengamatan.

5. Fiksasi adalah teknik yang dilakukan untuk mematikan bakteri dan

melekatkan pada object glass tanpa merusah struktur sel bakteri.

IX. DAFTAR PUSTAKA

1. Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.Ekmon,

2008.

2. Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.

3. http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html

4. http://labmikrobiologi.blogspot.com/2012/02/pewarnaan-negatif-pewarnaan-

burry.html