Izoenzimi (prezentacija)

7/23/2019 Izoenzimi (prezentacija)

1/81

I Z O E N Z I M I

Damjan Ivkovi

VojislavDeletovi

Ivan Joji


2/81

I Z O E N Z I M I

Izoenzimi su razliite forme istog fermenta, koje katalizujuistu biohemijsku reakciju, prisutne su u biolokoj vrsti i

stoje pod genetskom kontrolom.

Nastaju kao posledica multiplih gena ili multiplih alela,

pri emu nastaju aleloenzimi


3/81

I Z O E N Z I M I

Izoenzimi kvarternerne strukture mogu biti homomerni ili

heteromeri

Struktura hibridnih izoenzima odredjena je od strane dva

nealelna gena ili razliitim alelima istog lokusa.

Tkivna specifinost


4/81

I Z O E N Z I M I

Genetski polimorfizam

Izoenzimi se ispituju metodom elektroforeze. Pri tome sepod terminom izonenzim oznaavaju frakcije koje serazvajaju pri elektroforezi, a imaju istu ili slinusupstratnu specifinost.


5/81

I Z O E N Z I M I

Obeleavanje izoenzima vri se na osnovu njihovepokretljivosti u elektrinom polju: najmanji broj ima ona

frakcija koja se najbre krede ka anoi, a najsporija forma(katona) se oznaava najvedim brojem.

Izoenzimi mogu da pretrpe posttranslacione modifikacije,

pri emu nastaju razliite forme izoenzima-izoforme


6/81

I Z O E N Z I M I - podela

1. Izoenzimi ija je struktura po kontrolom vedeg brojanealelnih gena

1) Sa monomernom strukturom (-amilaza)

2) Sa kvaternernom strukturom

a) koji stvaraju hibridne forme (aldolaza, CPK, LDH)

b)koji ne stvaraju hibridne forme (AST)


7/81

I Z O E N Z I M I

2. Izoenzimi iju strukturu orejuje jean gen, sarazliitim alelima (aleloenzimi)

1) sa monomernom strukturom

2) sa kvaternernom strukturom


8/81

LAKTAT DEHIDROGENAZA


9/81


Laktat dehidrogenaza (LDH) je NAD+ oksidoreduktaza ikatalizuje oksiaciju laktata u piruvat koristedi NAD+ kaoakceptor vodikovih iona

Reakcija je reverzibilna i ko fiziolokog pH favorizovana jeredukcija piruvata u laktat

Akoje ukupna LDH poviena kvantitativnaiferencijacija izoenzima moe omoguditi

ijagnostiki korisnu informaciju vezanu za

pojedini organ


10/81


Sastoji se od 4 polipeptidna lanca koji pripadaju tipu H (heart) i

M (muscle) 5 izoenzima, specifini za oreeni organ

H pojeinica prevlaava u tkivima sa povedanom potronjomkiseonika, a M u tkivima sa visokom glikolitikom aktivnodu


11/81

IZOENZIMI

Specifini za oreeni organ

LD1 H4 srce i eritrociti

LD2 H3M1 retikuloendotelni sistemLD3 H2M2 pluda, slezina, limfni vorovi

LD4 H1M3 bubreg, posteljica, guteraa

LD5 M4 jetra, popreno prugasti miid

Razliiti izoenzimi imaju razliito vrijeme

poluraspaa pa se razliito ugo mogu pratiti u

krvi


12/81

DIFERENCIJACIJA IZOENZIMA

ELEKTROFOREZOM na agaroznom ili celuloza-acetatnom gelu u

alkalnom pH

Izoenzimi koji sare H pojeinice putuju bre, ok izoenzimikoji sare M pojeinice putuju sporije

LDH1 putuje najbre, a LDH5 najsporije


13/81

PRIMER SPECIFINOG OREIVANJA LH1

HEMIJSKOM INHIBICIJOM

Dodatkom natrijumovog perhlorata ili 1,6-heksandiola

inhibiramo sve izoenzime koji sare M pojeinicu LDH1 ima samo H pojeinicu pa nije inhibiran i moemo ga

odrediti


14/81

KVANTITATIVNA ANALIZA IZOENZIMA

Razdvajanje elektroforezom

U dijagnostici su istaknuta tri elektroforetska izoenzimskauzorka:

Anodni - LDH1+LDH2

Katodni - LDH4+LDH5

Srednja grupa - LDH3


15/81

KVANTITATIVNA ANALIZA IZOENZIMA

Povedana aktivnost izoenzima:

LDH1 i LDH2 infarkt miokara, hemoliza, miidna

distrofija, infarkt bubrega LDH4 i LDH5 bolesti jetre, otedenje skeletnih miida,

maligne bolesti

LDH3 destrukcija trombocita, limforetikularne bolesti,

otedenje slezine, maligni tumori


16/81

PRIKUPLJANJE UZORAKA (plazma, serum)

oksalati i fluoridi se ne smeju upotrebljavati kao antikoagulansi

jer oni inhibiraju LDH

plazma koristi se samo nakon vrlo brze centrifuge jer inaezaostaju trombociti koji sare visoku koncentraciju LDH


17/81

UZORAK

Nakon telesne aktivnosti mogude su povedane koncentracijeLDH zbog njenog oslobaanja iz miida

Zbog hemolize tokom koagulacije koncentracija LDH moe bitiveda u serumu nego u plazmi


18/81

STABILNOST

Uzorak seruma pri sobnoj temperaturi (20 0C) stabilan je do 7

dana

Ne sme se pohranjivati na hladnijim temperaturama zbog

osetljivosti izoenzima LDH4 i LDH5 na hlanodu


19/81

BOLESTI KOJE UZROKUJU POVIENU AKTIVNOST LH USERUMU

INFARKT MIOKARDA

znaajno povienje LDH vrenosti nakon 6-12 h, LDH1 > 45% , max. vrednosti nakon 24-60h i o 10 puta vie o referentnih, normalizacija nakon 7-15 dana

OSTALE BOLESTI SRCA miokaritis, srane aritmije, kateterizacija srca, transplatancija zalistaka povien nivo

enzima, slino kao i ko infarkta miokara

PLUDNA EMBOLIJA

ko 30% pacijenata tokom 24h primedeno je blago povedanje LDH,

posebno LDH3

niska koliina LDH1 i LDH2 vana je zbog razlikovanja o infarkata

miokarda


20/81

APSCES JETRE

TUMOR JETRE

povieni LDH4 i LDH5 ko pacijenata sa karcinomom delija jetre, ok su ko metastazapovieni svi izoenzimi LDH

HEPATOBILIJARNA BOLEST

posebno povedani LDH4 i LDH5

INFEKTIVNA MONONUKLEOZA

PORTALNA HIPERTENZIJA



21/81


BOLESTI POPRENOPRUGASTIH MIIDA UCHENNEOVA MIIDNA ISTROFIJA

povedani su izoenzimi LDH1, LDH2, LDH3

ARAN-DUCHENNEOVA I KUGELBERG-WELANEROVA MIIDNA ATROFIJA

POLYMYOSITIS (hronina bolest vezivnog tkiva, propaanje miida)

EPILEPTIKI NAPA (GRAN MAL)

HEMOLITIKA ANEMIJA, MEGALOBLASTINE ANEMIJE

OK


22/81

-Hidroksibutirat dehidrogenaza (HBDH)

Anodne frakcije LDH1 i LDH2

Stabilan enzim

Najveda aktivnost u prisustvu H, a najmanja u prisustvu Msubjedinica

Infarkt mikarda i oboljenja jetre (pored LDH)


23/81

Glukozo-6 fosfat dehidrogenaza


24/81

Glukozo-6 fosfat dehidrogenaza

Katalizuje prvu reakciju u pentoznom putu katabolizma

glikoze

300 aleloenzima Najzastupljeniji:

A oblik (15-20 % crne rase)

B oblik (60-70 % svih rasa)

Na poloaju 376 umesto asparagina

nalazi se asparaginska kiselina (razlika A i B)

Veliki broj aleloenzima ima nisku enzimski

aktivnost


25/81

Superoksid dismutaza (SOD)


26/81


Uloga je antioksiativna zatita

Dve forme:

-Mn zavisna SOD

-Cu, Zn-zavisna SOD

-ekstracelularna SOD

Gen za SOD-CuZn na 21. hromozomu

(Down sindrom), a za SOD-Mn na 6.


27/81


Povedana aktivnost CuZn-SOD je ko sleedih bolesti:

Fanconi anemije, Gilber bolesti, srpaste anemije,

hemolitiko-uremijskog sindroma U leukemijskim delijama najene su niske vrenosti Mn-

SOD

CuZn-SOD ima veoma kratak poluivot u krvnoj plazmi.

Resorbuje se u proks. tubulima bubrega. U

serumu samo u toku bubrenih bolesti.


28/81

Aspartat transaminaza (AST)

Alanin transaminaza (ALT)


29/81


Omogudavaju prenoenje aminogrupa sa aminokiselina na-ketokiseline, vane su za sintezu aminokiselina

Dva izoenzima:

-citosolni izoenzim (AST1 ili cAST)

-mitohondrijski izoenzim (AST2 ili mAST)

U eritrocitima samo AST1, nemaju mitohondrije


30/81


Citosolni: asparaginsku kiselinu u oksalsirdetnu(prikljuivanje aminokiselina prometu ugljenih hirata)

Mitohondrijalni izoenzim konverzija oksalsirdetnekiseline u asparaginsku (biosinteza proteina)

U cirkulaciji cAST traje 4-5 ana, ok mAST brzo iezava

Oboljenja jetre, infarkt miokarda


31/81

Kreatinfosfokinaza (CPK)


32/81

Kreatinfosfokinaza

Poznata kao i kreatin kinaza

Zastupljena je mahom u jedinjenjima koje imaju visoke

energetske potrebe (mozak, miokar, skeletni miidi)

Katalizuje reakciju prenosa ostatka fosforne kiseline sa

ATP-a na kreatin i obrnuto, sa kreatin fosfata na ADP:

ATP + kreatin ADP + kreatinfosfat


33/81

Inhibitori I aktivatori; gubitak svojstava

Aktivator je Mg

Inhibitori: Mg (u vedim koliinama), Zn, joni Cu, mokradnakiselina, citrati, hloridi, fluoridi, sulfati

Inaktivacija se eava pri zagrevanju o 15 min na 56 C


34/81

Izoenzimi

CPK je dimer

Dve osnovne jedinice B (brain) i M (muscle)

etiri izoenzima:

1. CPK1 (BB)2. CPK2 (MB)

3. CPK3 (MM)

4. CPK-Mt


35/81

CPK 1 (BB izoenzim)

Zastupljenost: u mozgu, tiroideji, intestinumu i bubrezima

Najvede negativno naelektrisanje, najbre putuje ka anoipri elektroforezi

Veoma kratko bioloko poluvreme trajanja (1 - 3 h)

Lokalizovan u citosolu


36/81

CPK2 (MB izoenzim)

Zastupljenost: srede se skoro iskljuivo u miokaru, malekoliine su prisutne u muskulaturi jenjaka i ijafragmi

Srednja brzina pokretljivosti pri elektroforezi

Poluivot CPK2 je 6 - 8h

Lokalizovan u citosolu


37/81

CPK3 (MM izoenzim)

Zastupljenost: u vedini tkiva, zastupljen je u miokaru, apreovlaava u skeletnim miidima

MM ima najsporije kretanje pri elektroforezi Poluivot ovog izoenzima je 10 15 h

ini 90% ukupne kreatin kinaze u serumu zravih osoba

Rasporedjen u citosolu i miofibrilama


38/81

CPK-Mt

Nalazi se u mitohondrijama

Po strukturi je imer sastavljen iz ve ientinesubjedinice

Moe a egzistira u formi oligomernih agregata


39/81

Patoloki uslovi

Nakon prelaska u krvnu plazmu pretrpljuju izvesne

promene u strukturi, pri emu se formiraju izoforme

Najpoznatije izoforme:CPK-MM: MM3, MM2, MM1

CPK-MB: MB2, MB1

Prelasci MM3 MM2 MM1 i

MB2 MB1 su ireverzibilni


40/81

Dijagnostiki znaaj

Izoenzim BB se veoma retko nalazi u serumu, stoga nema

znaaja u ijagnostici

Izoenzim MB ima znaaj u ijagnostici akutnog infarktamiokarda. 12-16 h ostie max vrenost, a nakon 36h senormalizuje. Ne pokazuje lanopozitivne rezultate, alanonegativne pokazuje tek 36h nakon sranog uara.


41/81

Dijagnostiki znaaj

Pri infarktu miokara vanu ijagnostiku ulogu ima CPK-MM, tanije izoforme ovog izoenzima. Ko zravih ljui

odnos izoformi je MM1>MM2>MM3 U sluaju infarkta onosi su sleedi:

- 2-3h: slino kao ko zravih ljui

- 6-10h: preovladjuju MM3 i MM2

- 10-24h: preovladjuje MM2

- vie o 24h: MM1


42/81

-glutamiltransferaza (-GT)


43/81


Veliki broj oblika kao posledica posttranslacione

modifikacije

Pokazuje specifinost prema biolokoj vrsti, tkivu i uzrastu(-GT iz jetre ima tri puta vie sijalinske kiseline o -GT izbubrega)

Funkcija -GT je regulacija koncentracije

glutationa u tkivima


44/81


Poluivot -GT iznosi 3-4 dana

Do 5 ana se uva u friieru, a 9 meseci na -80C

Nije preporuljivo zamrzavati ga i omrzavati

jer onda gubi svoju funkciju


45/81


Razliiti oblici -GT su posledica:

1. modifikacije enzima pod dejstvom proteaza

2. kopmleksiranja sa sastojcima krvne plazme3. varijacije u saraju sijalinske kiseline

U serumu zravih osoba najvedi eo -GT ini

niskomolekularna hidrofilna frakcija, a kod

oboljenja jetre i unih puteva hirofobna

forma vezana za lipoproteine


46/81

-Amilaza


47/81

-Amilaza

Amilaze su hirolitiki enzimi koji katalizuju razgranjuskroba, glikogena, amiloze i amilopektina

Dva tipa izoenzima:

1. Amilaza I (salivarna S amilaza)

2. Amilaza II (pankreasna P amilaza)

Izoelektrina taka S-amilaze se krede u

intervalu pH 5.5-6.5, a P-amilaze pH 5.7-7.0


48/81

-Amilaza

-Amilaza se ko zravih ljui moe nadi u serumu i urinu,ali joj je mala aktivnost

Aktiviraju je joni hlora Potie iz egzokrinog pankreasa i pljuvanih leza

Poluivot u serumu je 2 sata

Amilaza iz pljuvake pokazuje vedi afinitet prema skrobu, apankreasna prema glikogenu


49/81

-Amilaza

Pankreasna amilaza je tremolabilnija; postojana je 7-9

ana na 20 C, a pljuvana o nekoliko meseci

Pankreasna amilaza se bre lui mokradom (ima vediklirens)

U fiziolokim uslovima u serumu preovlajuje

salivarna, a u urinu pankreasna amilaza


50/81

-Amilaza

Povedanje salivarne amilaze: parotit, karcinom pluda,pneumonija, karcinom ovarijuma, cerebralne traume

Povedanje pankreasne amilaze: pankreatit, aneurizmaaorte, trovanje opijatima, karicnom pankreasa perforacija

ulkusa eluca

Povedanje obe amilaze: hepatitis,posle

postoperativnih zahvata u abdomenu


51/81

Lipaza


52/81

Lipaza

Vri hirolizu lipia razlaudi estarske veze izmejuglicerola i masnih kiselina

Najznaajnija je pankreasna lipaza

Optimalna aktivnos pri pH 7-9 Ispituje se u serumu ili u heparinizovanoj plazmi, pri emu

se prvo ovoji o krvnih delija

Stabilna je u serumu 7 dana na sobnoj

temperaturi, ili nekoliko semica u friieru


53/81

Alkalna fosfataza


54/81

Alkalna fosfataza

U baznoj sreini uz uede voe razlae monoestrefosforne kiseline uz oslobadjanje fosfata.

Optimalni pH je od 9.8 do 10.5 Glikoproteid

Prisutnost: plazma membrana, Goli aparat, ER

U sastavu membrana tetramer, u telesnim tenostima

meavina imera i tetramera


55/81

Alkalna fosfataza

Monomerna jeinica sari va jona Zn (katalitikaaktivnost) i jon Mg (aktivator)

Zastupljenost: placenti, osteoblastima, unim kanalidima,sluznica intestinuma,proksimalni tubuli bubrega,

sekretujude delije mlene leze


56/81

Izoenzimi Af

Postoje etiri izoenzima Af i to su:

1. tkivno nespecifina Af ili L/K/B

2. intestinalna Af

3. placentalna Af4. placentalnoj slina Af

Prema termostabilnosti najstabilnije su placentalna i njoj

slina, zatim intestalni, a tek na kraju je L/K/B.

Razlike izmedju enzima


57/81

Aktivnost Af u serumu; dijagnostiki znaaj

Kod zdravih osoba u serumu je prisutna L/K/B Af (iz jetre i

kostiju), bubrena Af se ne pojavljuje ni u kom sluaju

Af iz jetre se moe uoiti u serumu nakon obroka koji jebogat mastima

Izmeju XVI i XX neelje trunode u serumu se nalaziplacentalna Af, izostanak dejstva ovog izoenzima ukazuje

na patoloke promene u placenti


58/81


Ko fraktura kostiju, rahitisa, Peetove bolesti,osteomalacije, osetosarkoma primetno je povedanjedelovanja enzima

Kod nekih oboljenja hepatobilijarnog sistema (bilijarna

ciroza, opstruktivna utica, sinrom holestaze, zapaljiviprocesi, kamen u unim putevima, virusni ikterus)


59/81


Pri holestazi se Af iz jetre pojavljuje u serumu u tri glavna

oblika:

a) kao slobodna

b) kao membranski vezanac) kao membranski vezana u kompleksu sa lipoproteinom X

Ispitivanje intestinalne i placentalnoj-sline Af nemaijagnostiki znaaj u meicini

Hipofosfotazija eficit Af, poremedajmineralizacije i deformiteti kostiju


60/81

Tumorski oblici Af

Za saa nemaju praktinu vrenost u meicini

Tri izoenzima:

1) Regan2) Nagao (seminom)

3) Kasahara (primarni hepatom)


61/81

Kisela fosfataza (KF)


62/81

Kisela fosfataza

Hidrolizuje monoestre fosforne kiseline

Veliki broj frakcija enzima posledica posttranslacionih

modifikacija

KF iz prostate deluje ekstracelularno, manji deo ulizozomima.

Po strukturi je dimer, optimum za delovanje je pH 5-6

Razlikovanje KF iz prostate o one u eritrocitima se vri

pomodu L-tartarata (inhibicija KF prostate)i formaldehida (inhibicija KF eritrocita)


63/81

Limfociti sare tartarat senzitivnu KF

Porast ukupne KF u serumu javlja se kod: Paget-ovebolesti, Gaucherove bolesti, pri metastazama karcinoma

drugih tkiva na kostima, hiperparatireodizma,

osteoporoze


64/81

Holinesteraza


65/81

Holinesteraza

Acetilholinesteraza razlae acetilholin, blokiranjem ovogenzima olazi o blokae prenoenja impulsa

Prisutna je na zavrecima holinergikih neurona, sivojmasi mozga, slezini, pludima i eritrocitima

Pseudoholinesteraza se nalazi u serumu, jetri, pankreasu i

beloj masi mozga

Spaa u specifine enzime jer se sintetie uhepatocitima, a funkciju vri u krvnoj plazmi


66/81

Holinesteraza

Ima etoksifikacionu ulogu, razlae toksine estre holina

Deluje kao inhibitor na acetilholinesterazu ukoliko jekoncentracija veda o 10 mmol/l

Inhibitori holinesteraze se koriste u proizvodnji bojnih

otrova


67/81

Holinesteraza

Izoenzimi se razdvajaju metodom elektroforeze, nemaju

za saa ijagnostiki znaaj

O aleloenzima bitna je atipina holinesteraza, koja jekarakteristina po tome to, ko osoba u ijoj se jetriproizvoi, ne mogu a se razgrajuju miidni relaksanti.Posle operacije se javlja apnea (pacijenti ne mogu da

iu). Problem se reava avanjem svee krvi,ili krvne plazme (normalna holinesteraza)


68/81

Adenozin dezaminaza (ADA)


69/81

Adenozin dezaminaza (ADA)

Uestvuje u katabolizmu purinskih erivata aenozina ideoksiadenozina

Pojavljuje se u multiplim oblicima

C-oblik je monomerni oblik, spajanjem sa specifinimproteinom nastaje A-oblik

ADA eterminiu va alelna gena (ADA1 i ADA2)

ijom ekspresijom se stvara vie enzimskih

fenotipova (ADA1-1, ADA2-1, ADA2-2)


70/81

Himotripsin


71/81

Himotripsin

Endopeptidaza (tirozin, fenilalanin, triptofan i leucin)

Sintetie se u acinusima pankreasa, u va oblika:

1.himotripsinogen I himotripsin I

2.himotripsinogen II himotripsin II Himotripsin I je anjojnska, dok je himotripsin II katjonska

forma

Normalnu u serumu vie ima himotripsina II


72/81

Himotripsin

Kod akutnog pankreatita himotripsin II se

povedava i o 35x, ko karcinoma pankreasa

2-3 puta, a kod pankreatektomije himotripsin nije

prisutan u plazmi (imunoreaktivni himotripsin II)


73/81

Tripsin


74/81

Tripsin

Peptidaza

Stvara se u egzokrinom pankreasu u vidu tripsinogena I i

II, zatim se sekretuje u duodenum pod uticajem vagusa i

intestinalnih hormona holecistokinina-pankreozina

Tripsinogena I je 2x vie o tripsinogena II

Enterokinaza prevodi tripsinogen u aktivni oblik

Tripsin I je katjonska, a tripsin II je anjojnska forma

Optimalni pH za tipsin I je 8-9, a za tipsin II

je 8-10


75/81

Tripsin

U neutralnoj i baznoj sreini tripsin II poleeautoproteolizi

Aktivatori su joni Ca i Mg, u manjoj meri Co, Mn, alifatinialkoholi

Inhibitori su citrat, fluoridi,cijanidi, sulfidi

i teki metali


76/81

Tripsin

Povedanje koncentracije tripsina I javlja se ko hroninihoboljenja bubrega

Niske vrenosti tripsina najene su ko ijabetiara

Ko hroninog pankreatita tripsin je u granicama normale

Kod edematoznog pankreatita u serumu je

tripsin u vidu tripsinogena I, vrlo malo ima tripsina I


77/81

Aldolaza (ALD)


78/81

Aldolaza

Uloga u metabolizmu fosfornih estara fruktoze

Dva izoenzima: aldolaza A i aldolaza B

Tri vrste subjedinica: A, B i C

U tkivu mozga glavne su A i C subjedinica, pa je mogudesastaviti pet vrsta izoenzima: A4, A3C,A2C2,A1C3,C4

U mozgu oraslih sisara preovlauje C4

Miidne delije sare A4 i A3C (manje koliine)

U jetri fetusa je A4, tokom razvoja postepeno

biva zamenjena B4


79/81

Aldolaza

Prema odredjenim supstratima (fruktozo-1,6-difosfat)

alolaze imaju razliite afinitete; A=50, B=1, a C=5.

Aldolaza B je glavni izoenzim u jetri gde ima ulogu umetabolizmu fruktoze; bitna je i zbog glikogeneze.

Aldolaza A je bitna za glikolizu.

Aldolaza A i C su termostabilni izoenzimi, a aldolaza B je

termolabilna


80/81

Aldolaza

Urodjeni deficit aldolaze B je poznat pod imenom

neponoljivost za fruktozu i izraen je mahom uejem periou

Urojeni eficit alolaze A je praden nesferocitnomhemoliznom anemijom.


81/81

K R A J

Documents

Izoenzimi (prezentacija)