8/20/2019 jbacter00551-0142b
1/2
NOTES
A
SIMPLE
ME IUM FOR
THE
CULTIVATION OF
LEPTOSPIRA
LEIF M. RINGEN AND
RUSSELL
W. H . GILLESPIE
D e p a r t m e n t o f
V e t e r i n a r y
M i c r o b i o l o g y , C o l l e g e
o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,
S t a t e C o l l e g e o f
1 I a s h i n g t o n
P u l l m a n , l V a s h i n g t o n
R e c e i v e d
f o r p u b l i c a t i o n
A u g u s t
1 0 ,
1 9 5 3
T h e r e a r e s e v e r a l
d i f f e r e n t t y p e s
o f
m e d i a
u s e d
f o r
t h e
c u l t i v a t i o n o f
L e p t o s p i r a s p e c i e s
( S t u a r t ,
J .
P a t h o l .
B a c t e r i o l . ,
5 8 ,
3 4 3 ,
1 9 4 6 ;
C h a n g ,
J .
I n f e c t i o u s
D i s e a s e s ,
8 1 ,
2 8 , 1 9 4 7 ;
V a n
T h i e l ,
T h e
L e p t o s p i r o s e s , U n i v e r s i t a i r e p e r
s
L e i d e n ,
4 2 , 1 9 4 8 ) .
S o m e o f t h e s e
a r e
d i f f i c u l t
t o
p r e p a r e
w h i l e
o t h e r s d o
n o t
m a i n t a i n
g o o d
g r o w t h
o v e r
e x t e n d e d
p e r i o d s
o f
t i m e .
T h e
m e d i u m
d e s c r i b e d
i n
t h i s
n o t e
i s
e a s i l y
m a d e
a n d
h a s
p r o v e n v e r y
s a t i s f a c t o r y
i n
m a i n t a i n -
i n g
s t o c k
c u l t u r e s
a n d
i n t h e
p r e p a r a t i o n
o f
a n -
t i g e n s .
T h i s m e d i u m i s
a
m o d i f i c a t i o n
o f
G a r d n e r s
m e d i u m
( T o p l e y a n d
W i l s o n ,
P r i n c i p l e s
o f
B a c t e r i o l o g y
a n d
I m m u n i t y ,
T h e
W i l l i a m s
W r i l k i n s C o . ,
V o l .
I
9 2 0 ,
1 9 4 6 )
a n d
i s
p r e p a r e d
i n
t h e
f o l l o w i n g
m a n n e r .
O n e
c a p s u l e
o f
P a r -
s t a i n s
B u f f e r S a l t
M i x t u r e
( p H
7 . 2 )
i s
d i s s o l v e d
i n
1 8 0
m l
g l a s s - d i s t i l l e d
w a t e r .
A b o u t
1 5 - 2 0
m l
o f
t h i s
s o l u t i o n
a r e
d r a w v n
t h r o u g h
a
s t e r i l e
S e i t z
f i l t e r a n d d i s c a r d e d .
T w e n t y - f o u r
m l
o f
f r e s h
P a r s t a i n s
B u f f e r
S a l t
M i x t u r e i s
o b t a i n a b l e
d i r e c t l y
f r o m
H a r t m a n - L e d d o n
C o . , I n c . ,
P h i l a -
d e l p h i a ,
P a . ,
a n d
i n d i r e c t l y
f r o m
s c i e n t i f i c
s u p p l y
h o u s e s .
r a b b i t s e r u m 2
( p r e v i o u s l y t e s t e d f o r
a n t i l e p t o -
s p i r a l
q u a l i t i e s )
a r e
a d d e d t o
t h e r e m a i n i n g
b u f f e r e d
w a t e r
t o g e t h e r
w i t h e n o u g h
f r e s h r a b b i t
h e m o g l o b i n t o g i v e
t h e m e d i u m a
d i s t i n c t p i n k
c o l o r . T h e
m e d i u m i s
s t e r i l i z e d t h e n b y f i l t e r i n g
t h r o u g h
t h e
p r e p a r e d S e i t z
f i l t e r
a n d t u b e d i n
5
m l
q u a n t i t i e s i n l a r g e
s c r e w - c a p p e d
c u l t u r e
t u b e s .
I m m e d i a t e l y
a f t e r
p r e p a r a t i o n i t s h o u l d
b e
p l a c e d
i n
t h e
o r d i n a r y
t y p e d e e p
f r e e z e
f o r
s t o r a g e . M e a n w h i l e a b o u t 1 0 o f t h e
t u b e s
may
b e
i n c u b a t e d f o r
s t e r i l i t y .
S e i t z
f i l t e r p a d s c a n
c h a n g e t h e
pH
o f
s o l u t i o n s
p a s s i n g
t h r o u g h t h em . I t
w a s
n o t e d t h a t
b y
f i l t e r
i n g
a
s m a l l a m o u n t o f b u f f e r
s o l u t i o n
t h r o u g h
t h e
p a d b e f o r e
u s i n g
t h i s
e f f e c t c o u l d
b e r e d u c e d
u n t i l
t h e r e
w a s n o
a p p r e c i a b l e
pH c h a n g e .
S t o c k
c u l t u r e s h a v e
b e e n
m a i n t a i n e d
f o r
p e r i o d s
u p t o 3 m o n t h s
w i t h o u t
t r a n s f e r
a n d
p r o b a b l y
w o u l d
r e m a i n
v i a b l e
f o r
l o n g e r
p e r i o d s .
T h i s
m e d i u m w i l l
s u p p o r t
t h e g r o w t h o f s m a l l
n u m b e r s
o f
o r g a n i s m s
a n d h a s b e e n u s e d
a s
t h e
p r i m a r y
i s o l a t i o n
m e d i u m w h e n
c u l t u r i n g
s t r a i n s o f
L e p t o s p i r a
f r o m
b l o o d .
I
To
r e d u c e
f o r m a t i o n
o f p r e c i p i t a t e , e a c h
l o t
s h o u l d
b e made
w i t h
s e r u m f r o m
o n e a n i m a l
r a t h e r t h a n w i t h
p o o l e d s e r a .
A USEFU L
BACTERIAL
CELL
WALL STAIN
R .
B .
WE
D e p a r t m e n t o f
P l a n t
S c i e n c e s ,
U n i v e r s i t y o f
O k l a h o m a ,
N o r m a n ,
O k l a h o m a
R e c e i v e d f o r
p u b l i c a t i o n O c t o b e r
1 1 9 5 3
V a r i o u s
t e c h n i q u e s
f o r
s t a i n i n g
t h e
b a c t e r i a l
B a k t e r i o l .
P a r a s i t e n k . ,
9 3 ,
3 9 3 ,
1 9 2 4 )
i s
o n e
o f
t h e
c e l l w a l l
h a v e
b e e n
d e v e l o p e d ,
o f
w h i c h
t h e
t a n n i c
m o s t
w i d e l y
u s e d . T h i s
t e c h n i q u e ,
w h i c h
r e q u i r e s
a c i d - c r y s t a l
v i o l e t
m e t h o d
( G u t s t e i n ,
C e n t r .
a
v e r y
d i l u t e
s o l u t i o n
o f
c r y s t a l v i o l e t ,
r e s u l t s
i n
T h i s
i n v e s t i g a t i o n
was
s u p p o r t e d
i n
p a r t
b y
t h e c e l l
w a l l a n d t h e
c I r o s s
w a l l s o f
many
b a c t e r i a
t h e
M e d i c a l
R e s e a r c h
a n d D e v e l o p m e n t
B o a r d ,
b e i n g
s t a i n e d
r a t h e r
f a i n t l y .
T h e t a n n i c
a c i d -
O f f i c e
o f
t h e
S u r g e o n
G e n e r a l , D e p a r t m e n t
o f
t h e
c r y s t a l
v i o l e t
t e c h n i q u e
a l s o
h a s
t h e
d i s a d v a n t a g e
A r m y ,
u n d e r
C o n t r a c t
n o .
D A - 4 9 - 0 0 7 - M D - 3 1 9 .
o f
b e i n g p r e p a r e d
a s
t e m p o r a r y
w a t e r
m o u n t s .
2 5 2
8/20/2019 jbacter00551-0142b
2/2
9]NOTES
B i s s e t
( L a b . P r a c t i c e , 2 , 1 1 5 , 1 9 5 3 ) p r e s e n t
s
a
p h o s o m o l y b d i c
a c i d - m e th y l g r e en c e l l w a l l s t a i n
w h i c h
p r o m i s e s t o b e a p p l i c a b l e t o s o m e b a c t
e r i a
n o t e f f e c t i v e l y s t a i n e d
b y
t h e
t a n n i c a c i d - c r y s t a l
v i o l e t
m e t h o d .
T h i s
s t a i n
a l s o
m u s t
b e
p r e p a r e d
a s
a
w a t e r
m o u n t
a n d
d o e s
n o t
g i v e
u n i f o r m
r e -
s u l t s .
A
n e w
p r i n c i p l e
i n
b a c t e r i a l
c e l l w a l l s t a i n -
i n g ( C h a n c e , S t a i n T e c h n o l . ,
2 8 ,
2 0 5 ,
1 9 5 3 )
i n -
v o l v e s t h e u s e
o f a
b a s i c d y e ,
s u c h a s n e w f u c h s i n
o r
c r y s t a l v i o l e t ,
a n d
d e c o l o r i z a t i o n
o f
t h e
c e l l
c o n t e n t s t h r o u g h t h e
u s e o f
c o n g o r e d ,
a n
a c i d
d y e .
T h e C h a n c e c e l l w a l l
s t a i n
a p p e a r s
t o
b e
e f f e c t i v e
o n
m o s t
o f
t h e
b a c t e r i a a n d o n o t h e r
f o r m s c o n s i d e r e d
d i f f i c u l t t o
s t a i n , s u c h
a s
N o c a r d i a
a n d
S t r e p t o m y c e s .
T h i s
t e c h n i q u e ,
h o w -
e v e r , h a s
t h e
d i s a d v a n t a g e
o f o n l y f a i n t l y s t a i n -
i n g
c r o s s s e p t a .
An
e f f e c t i v e
t e c h n i q u e f o r s t a i n i n g
t h e b a c -
t e r i a l c e l l
w a l l h as b e e n
d e v e l o p e d
w h i c h u t i l i z e s
p r o c e d u r e s
o f
b o t h
t h e
t a n n i c
a c i d - c r y s t a l
v i o l e t
a n d C h a n c e s f u c h s i n - c o n g o
r e d m e t h o d s .
By
u s i n g
t a n n i c a c i d
a s a
m o r d a n t
a n d
c o n g o
r e d
a s a s e l e c t i v e
d e c o l o r i z i n g
a g e n t ,
a 0 . 5
p e r
c e n t
t o 1 . 0
p e r
c e n t s o l u t i o n o f
c r y s t a l
v i o l e t
c a n
b e
u s e d w i t h o u t l e a v i n g
t h e
c y t o p l a s m i c
a r e a o f
t h e
c e l l
c o l o r e d . T h i s
m e t h o d
s t a i n s
t h e o u t e r
w a l l
a n d
c r o s s
w a l l s
v e r y
s h a r p l y
a n d
h a s
t h e
a d d e d
a d v a n t a g e
o f
y i e l d i n g
p e r m a n e n t
d r y
m o u n t s .
T h i s t e c h n i q u e
a p p e a r s
t o
h a v e
w i d e
a p p l i c a t i o n
a n d
s h o u l d
p r o v e e s p e c i a l l y
u s e f u l
s i n c e
c r o s s
s e p t a
a r e
s h o w n
c l e a r l y . T h e p r o c e d u r e
h a s b e e n
s a t i s f a c t o r i l y
u s e d t o s t a i n
s e v e r a l
g e n e r a
o f
b a c t e r i a
w i th u ni f o r ml y g o o d r e s u l t s .
F i g u r e s 1
t o
4
s h o w t h e
r e s u l t s o b t ai n e d w i th
t h e
s t a i n i n g
t e c h n i q u e w h e n a p p l i e d
t o
C o r y n e b a c t e r i u m
p s e u d o d i p h t h e r i t i c u m ,
M i c r o c o c c u s
a u r e u s ,
N o -
c a r d i a
c o r a l l i n a , a n d
a n u n k n o w n
b a c i l l u s
a n d
c o c c u s .
T h e s t a i n i n g p r o c e d u r e i s
a s
f o l l o w s :
B a c t e r i a l
s m e a r s
a r e
p r e p a r e d
a n d
a i r d r i e d
i n
t h e
u s u a l
m a n n e r a n d
s h o u l d b e l e f t u n f i x e d . T h e s l i d e i s
p l a c e d
i n 5 p e r c e n t t a n n i c
a c i d
f o r
1 2
t o
1
h o u r ,
r e m o v e d
a n d w a s h e d ,
b u t n o t d r i e d . A 0 . 5
p e r
c e n t
a q u e o u s
s o l u t i o n
o f
c r y s t a l
v i o l e t i s a d d e d
t o
t h e s m e a r
a n d a l l o w e d
t o
r e m a i n
1 1 2
t o 2
m i n u t e s .
T h e s l i d e
i s w a s h e d
a g a i n a n d
i s
f l o o d e d
w i t h
a
0 . 5
p e r
n t
a q u e o u s
s o l u t i o n
o f
c o n g o r e d
f o r
2
t o
3
m i n u t e s ,
w a s h e d , a n d b l o t t e d d r y .
T h e
s l i d e i s
r e a d y n o w
t o b e
e x a m i n e d .
S o m e w h a t
b e t t e r
r e s u l t s
may
b e
o b ta i ne d w i t h
t h e
a d d i t i o n
o f a
t h i n
f i l m
o f
c o n g o r e d
t o
t h e
s m e a r
a f t e r
t h e
s l i d e h a s b e e n w a r m e d
t o 5 0
C o n
a
s l i d e w a r m e r .
T h e
f i l m o f
c o n g o r e d i s
e f f e c t i v e i n
f u r t h e r
r e -
m o v i n g
s t a i n r e m a i n i n g i n t h e
p r o t o p l a s m a n d
s l i g h t l y d a r k e n i n g t h e b a c k g r o u n d
w h i c h
i m -
p r o v e s
d e f i n i t i o n
o f t h e
c e l l
w a l l . T h e
l e n g t h o f
m o r d a n t t i m e a n d c o n g o
r e d
d e c o l o r i z a t i o n
v a r i e s
s o m e w i t h v a r i o u s
b a c t e r i a l s p e c i e s .
H o w e v e r ,
t h e t i m e s
a r e
n o t c r i t i c a l a n d
may
b e d e te r m i ne d
e a s i l y
b y
t r i a l a n d
e r r o r .
T h i s
t e c h n i q u e
i s
n o t
s u p e r i o r t o
t h e
t a n n i c
a c i d - c r y s t a l
v i o l e t s t a i n
i n
a l l
u s e s ,
b u t i t
i s
e q u a l l y
g o o d a n d g i v e s u n i f o r m
r e s u l t s i n c e l l s n o t r e a d i l y s t a i n e
d
b y
o t h e r
m e t h o d s .
4
i2
3
PLATE 1 . C e l l w a l l
s t a i n
o f
v a r i o u s m i c r o o r g a n i s m s ( 3 , 2 5 0 X
m a g )
F i g u r e
1 .
U n i d e n t i f i e d
m i x e d c u l t u r e .
F i g u r e
2 . M i c r o c o c c u s
a u r e u s .
F i g u r e
3 . N o c a r d i a c o r a l l i n a .
F i g u r e 4 .
C o r y n e b a c t e r i u n i
p s e u d o d i p h t h e r i t i c u m .
2 5 3
9 5 4 ]
J
. . p
