BAB IPENDAHULUAN

Anestesi lokal banyak digunakan dalam praktek klinis untuk mencegah dan mengurangi rasa sakit selama operasi, namun, mekanisme aksinya sangat kompleks dan tidak sepenuhnya dipahami. Selain efek blocking menonjol pada saluran tegangan-gated Na +, anestesi lokal juga memodulasi banyak saluran saraf lainnya ( Hara et al, 1995. ; Scholz, 2002 ).Studi terbaru menunjukkan bahwa bupivacaine, anestesi lokal yang paling umum digunakan untuk tulang belakang, epidural, dan anestesi ekor, menghambat arus reseptor NMDA ( Nishizawa et al, 2002. ; Sugimoto et al, 2003. ; Hahnenkamp et al, 2006. ; . Furutani et al, 2010 ).

Mengingat bahwa menghambat arus reseptor NMDA adalah strategi yang efektif dalam pencegahan dan pengelolaan sindrom nyeri kronis ( South et al, 2003. ; Rondon et al, 2010. ; Woolf, 2010 ), bupivacaine yang aman dan tahan lama, dapat mewakili pengobatan berguna sentral sensitisasi akibat patologi. Reseptor NMDA merupakan heterotetramers dari dua GluN1 dan dua subunit GluN2 ( Karakas dan Furukawa, 2014 ; . Lee et al, 2014 ). Setiap subunit mengandung domain ekstraseluler modulator-mengikat ligand dan alosterik, domain transmembran terdiri dari tiga heliks yang membentuk membran (M1, M3, M4) dan P-lingkaran (M2), dan domain intraseluler besar. Sehubungan dengan saluran Na+, topologi reseptor NMDA dibalik, dengan ligan-dikendalikan gerbang eksternal, dan wilayah sempit dari pori terletak dua pertiga ke bidang membran. Perembesan jalur dilapisi oleh residu pada heliks M3 dan M2 loop masing-masing subunit, dan ini membentuk situs mengikat bagi kation divalen ( Nowak et al, 1984. ) Dan lainnya memblokir molekul ( Huettner dan Bean, 1988 ; Bormann, 1989 ; Parsons et al., 1993 ; . Sobolevsky et al, 1999 ). NMDA arus reseptor dapat dikurangi dengan blocker pori, yang menghalangi jalur peresapan dengan cara tegangan tergantung, dan oleh modulator alosterik, yang mengubah saluran gating kinetika ( Kawajiri dan Dingledine 1993; Popescu, 2005 ; . Traynelis et al, 2010 ) .

Di iris sumsum tulang belakang, bupivakain mengurangi NMDA-menimbulkan arus seluruh sel dari neuron tanduk dorsal dengan potensi di kisaran mikromolar rendah ( Furutani et al., 2010 ), yang baik dalam konsentrasi sumsum tulang belakang CSF (0,1-3,0 m M) berikut dosis klinis bupivakain ( Ruppen et al., 2009 ). Studi reseptor NMDA rekombinan dinyatakan dalam oosit menyarankan bahwa bupivacaine penghambatan kekurangan tegangan ketergantungan, dan menyimpulkan bahwa ia bertindak semata-mata sebagai nonkompetitif, inhibitor alosterik ( Sugimoto et al, 2003. ); selain itu, mekanisme PKC-dimediasi tidak langsung juga telah terlibat ( Hahnenkamp et al., 2006 ). Menggunakan elektrofisiologi dan pemodelan kinetik untuk reseptor GluN1 / GluN2A dinyatakan dalam sel HEK293, kami menemukan bahwa bupivacaine penghambatan sepenuhnya dijelaskan oleh penurunan tergantung konsentrasi di reseptor probabilitas terbuka, yang disebabkan gabungan durasi terbuka dan lebih lama ditutup lebih pendek. Secara keseluruhan, efek ini tergantung voltase dan bagian-independen;terlibat situs akses ekstraseluler dan intraseluler; dan digambarkan oleh gabungan channel-block dan mekanisme alosterik.Model bagian berkembang dengan pekerjaan ini merupakan alat kuantitatif baru untuk mengevaluasi mekanisme yang bupivacaine dapat mencegah, mengelola, atau mungkin sebaliknya sensitisasi sentral.

BAB II

ISI

ABSTRAK

Reseptor NMDA memediasi neurotransmisi rangsang di otak dan sumsum tulang belakang dan memainkan peran penting di bagian penyakit saraf nyeri kronis yang disebabkan oleh sensitisasi sentral. Bupivakain adalah anestesi lokal ditunjukkan di kaudal, epidural, dan anestesi spinal dan secara luas digunakan secara klinis untuk mengelola nyeri akut dan kronis. Selain memblokir saluran Na+, bupivakain mempengaruhi aktivitas banyak saluran lainnya, termasuk reseptor NMDA. Yang penting, bupivakain menghambat reseptor NMDA-dimediasi transmisi sinaptik di tanduk dorsal sumsum tulang belakang, area kritis terlibat dalam sensitisasi sentral. Kami menggunakan reseptor NMDA rekombinan dinyatakan dalam sel HEK293 dan menemukan bahwa peningkatan konsentrasi bupivacaine menurunkan probabilitas terbukanya kanal di subunit GluN2 dan cara pH-independen dengan meningkatkan durasi rata-rata penutupan dan mengurangi durasi rata-rata bukaan. Menggunakan pemodelan kinetik dari arus satu-channel, kami kaitkan penurunan saat ini terpantau dua mekanisme utama: voltage dependent "foot-in-the-door” blok pori dan efek alosterik gating. Selanjutnya, penghambatan itu bagian-independen karena terjadi pada tingkat yang sama apakah obat itu diterapkan sebelum atau setelah stimulasi glutamat dan dimediasi oleh situs penghambatan ekstraseluler dan intraseluler, melalui jalur hidrofilik dan hidrofobik. Hasil ini memprediksi bahwa dosis klinis bupivacaine akan menurunkan puncak dan mempercepat hilangnya arus reseptor NMDAsinaptik selama transmisi sinaptik normal. Prediksi kuantitatif ini menginformasikan kemungkinan aplikasi bupivacaine sebagai pendekatan pencegahan dan terapi sakit kronis.

BAHAN DAN METODE

Kultur sel dan ekspresi reseptor.

Sel HEK293 dipelihara di DMEM (Invitrogen) ditambah dengan 10% FBS pada 37 ° C di 5% CO 2 atmosfer. Sel di tempatkan di cawan 35 mm 24 jam sebelum transfeksi dengan kepadatan ~ 10 5 sel /cawan.

GluN1 (UO8261) dan GluN2A (M91561) atau GluN2B (M91562) subunit dari tikus diekspresikan dari pcDNA3.1. Plasmid di transfeksikan di GluN1 , GluN2 , GFP dengan rasio 1: 1: 1 dengan menggunakan metode kalsium fosfat (Chen dan Okayama, 1987 ; Kussius et al, 2009. ). Setelah 2 jam inkubasi, campuran transfeksi digantikan dengan DMEM dilengkapi dengan 2 mM Mg 2+ untuk mencegah excitotoxicity. Sel yang digunakan untuk rekaman elektrofisiologi 24-48 jam setelah transfeksi

ElektrofisiologiArus Whole-sel yang direkam dengan pipet api-dipoles (4-6 M Ω) diisi dengan

larutan intraseluler berisi sebagai berikut (dalam m M): 135 CsF, 33 CsOH, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 11 EGTA pada pH 7,4 (dengan CsOH). Solusi ekstraseluler berisi berikut (dalam

m M): 1 glutamat, 0,1 glisin, 150 NaCl, 2,5 KCl, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 0,5 CaCl2, tanpa (kontrol) atau dengan bupivacaine pada pH 7,4 atau 8,0 (dengan NaOH) dan diaplikasikan ke sel dijepit pada -70 mV atau seperti yang ditunjukkan, menggunakan katup yang dikendalikan solenoid sistem perfusi bertekanan (ALA-VM8, ALA Scientific Instruments), yang memiliki nilai tukar larutan ~200-400 ms. Hubungan arus-tegangan ditentukan dengan melangkah memegang potensi di 20 bertahap mV dari -100 mV sampai 60 mV dengan solusi intraseluler kurang MgCl2, untuk menghindari intraseluler Mg 2+ blok.Arus yang diperkuat dan disaring pada 2 kHz (Axopatch 200B), sampel di 5 kHz (Digidata 1440A) dan disimpan sebagai file digital menggunakan software pClamp10.2 (Molecular Devices). Makroskopik puncak arus dan kondisi mapan tingkat dan konstanta waktu desensitisasi ditentukan di landai tegangan menggunakan pClamp 10,2 software berdasarkan rata-rata minimal 5 jejak yang direkam dari setiap sel. kurva dosis-respons yang diperoleh pas persamaan Hill ke mean normalisasi saat steady state (OriginPro 9.1). Tegangan ketergantungan diperkirakan dengan pas pengurangan pecahan yang diukur dalam tegangan di saat ini dengan persamaan di bawah

ini diadaptasi dari persamaan Woodhull ( Woodhull 1973 ):di mana B adalah konsentrasi blocker, K d (0) adalah blocker disosiasi konstan pada 0 mV, z adalah valensi blocker, δ adalah sebagian kecil dari medan listrik bahwa pertemuan blocker di situs blocking-nya, V adalah potensial membran, dan F, R, dan T mengacu pada konstanta termodinamika konvensional.

Nilai untuk z δ dari persamaan Woodhull digunakan untuk menghitung tegangan yang diperlukan untuk perubahan e-kali lipat dengan menggunakan persamaan berikut:

Dipotong luar-out patch diuji dengan solusi yang dijelaskan di atas untuk percobaan seluruh sel dan dengan atau tanpa 1 m Mbupivakain pada pH 8,0. Solusi, dengan dan tanpa glutamat, cepat ditukar dengan memindahkan patch bolak-balik melintasi antarmuka antara dua solusi sungai dengan sistem terjemahan piezoelektrik (Burleigh LSS-3100/3200). Open-tip potensi pipet diukur pada akhir setiap percobaan untuk mengkonfirmasi nilai tukar solusi dari 0,2-0,4 ms. Arus yang rendah lulus disaring pada 5 kHz (Axopatch 200B), sampel di 50 kHz (Digidata 1440A), dan disimpan sebagai file digital dengan software pClamp10.2. amplitudo arus puncak, waktu naik (sebagai 10-90% dari puncak), dan waktu peluruhan (monoexponential muat) diukur di pClamp10.2.

Dipotong dalam keluar patch diuji dengan solusi internal yang berisi sebagai berikut (dalam m M): 1 glutamat, 0,1 glisin, 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 HEPES, dan 1 EDTA pada pH 7,4 (dengan NaOH). Solusi eksternal berisi sebagai berikut (dalam m M): 150 CsCl, 11 EGTA, 10 HEPES pada pH 7,4 (dengan CsOH) dan ± 6,0 m M bupivakain atau QX-314 yang perfusi ke wajah intraseluler terkena membran. Di patch dengan> 5 saluran, hubungan arus-tegangan dievaluasi oleh 2 s landai tegangan (100 mV untuk -100 mV). Dalam patch dengan kurang dari 3 saluran, hubungan arus-tegangan dievaluasi dari arus kesatuan dicatat oleh melangkah memegang potensi di 20 bertahap mV (> 5 s, 100 untuk -60 mV). Arus yang

low-pass disaring pada 2 kHz (Axopatch 200B), sampel di 40 kHz (Digidata 1440A), dan disimpan sebagai file digital menggunakan software pClamp10.2.Semburan yang berasal dari satu saluran (tidak ada bukaan tumpang tindih) dianalisis untuk durasi rata-rata bukaan menggunakan software QUB seperti yang dijelaskan di bawah ini untuk patch terpasang.

Sel-melekat satu-channel arus dicatat dengan api pipet dipoles (12-25 M Ω) berisi sebagai berikut (dalam m M): 1 glutamat, 0,1 glisin, 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 HEPBS, 1 EDTA, tanpa (kontrol ) atau dengan bupivacaine, pada pH 8,0 (dengan NaOH) ( Maki et al., 2014 ). Inward natrium arus yang diperkuat dan low-pass disaring pada 10 kHz dengan potensi pipet terapan dari 100 mV dengan Axopatch 200B (Molecular Devices), sampel di 40 kHz (NIDAQ papan), dan ditulis ke dalam file digital menggunakan software QUB ( www.qub .buffalo.edu ). Untuk menentukan tegangan ketergantungan, segmen berlangsung ~2 min dicatat secara berurutan, sementara potensi pipet itu melangkah di 20 kenaikan mV antara 100 dan 20 mV. hubungan arus-tegangan dihitung dengan memasang data dengan fungsi linear (OriginPro 9.1).

Catatan yang berasal dari patch yang mengandung saluran tepat satu aktif dianalisis dengan menggunakan software QUB seperti yang dijelaskan secara rinci sebelumnya ( Kussius et al., 2009 ). Secara singkat, setelah penyaringan pada 12 kHz, jejak single-channel yang ideal dengan menggunakan algoritma k segmental -means didasarkan pada model Markov tersembunyi ( Qin et al., 1996 ). Selanjutnya, semua model bagian kinetik dilakukan oleh model yang ditetapkan pengguna pas untuk daftar acara ideal diproduksi oleh -means k segmental, setelah memberlakukan mati-waktu 0,15 ms, dengan algoritma kemungkinan log Interval maksimum ( Qin et al., 1997 ). Model pas terbaik dipilih menggunakan ambang cutoff unit kemungkinan 10 log per bagian menambahkan. Semburan didefinisikan sebagai periode aktivitas kurang peristiwa lebih lama dari yang kritis tertutup waktu nilai (t crit), dengan t crit dihitung untuk memiliki nilai-nilai di antara E 3 (kontrol) atau E 6(bupivakain) dan E 4 ditutup komponen ( Magleby dan Pallotta, 1983 ). Asosiasi bupivakain dan tingkat pemisahan konstanta yang dihitung dengan model global pas di file single-channel diperoleh di beberapa konsentrasi obat (n = 3 / masing-masing).

Simulasi.Tanggapan makroskopik yang disimulasikan sebagai jumlah pertambahan waktu

tergantung dari reseptor di bagian-bagian terbuka. Semua reseptor (500, 10 pA) awalnya menduduki bagian glutamat bebas beristirahat dan disimulasikan dengan melompat persegi menjadi 1 m M glutamat. Glutamat mengikat dan tingkat disosiasi konstanta yang digunakan adalah sebagai sebelumnya diukur untuk reseptor / GluN2A GluN1 dalam kondisi mirip dengan yang digunakan di sini ( Popescu et al., 2004 ).Pulsa glutamat (1,0 m M, 5 s) dan bupivakain (1,0 m M, 5 s) yang diterapkan secara bersamaan dan arus disimulasikan dengan berikut: (1) model sederhana yang mewakili perilaku saluran rata (lihat . Gambar 2 D) atau (2) model berjenjang yang lebih kompleks, termasuk bupivacaine bebas dan reseptor bupivacaine-terikat (lihat Gambar. 4 B). Untuk mensimulasikan respon glutamat-menimbulkan di hadapan terus bupivacaine ambient, kami menggunakan model bupivacaine-terikat rata (lihatGambar. 2 D) di mana glutamat langkah mengikat yang ditambahkan ke bagian tertutup C3.

HASIL

Efek dari bupivacaine pada respon reseptor NMDA makroskopik

Reseptor NMDA secara luas dinyatakan dalam sumsum tulang belakang, termasuk tanduk dorsal, dan dianggap sebagai pemain kunci dalam induksi dan pemeliharaan sensitisasi sentral ( Ji et al., 2003 ). Bupivakain mengurangi NMDA-induced Arus seluruh sel di dorsal horn irisan tulang belakang ( Furutani et al., 2010 ). Demikian pula, bupivakain mengurangi arus NMDA-diinduksi dalam sel piramidal CA1 dan reseptor rekombinan dinyatakan dalam Xenopus oosit, ( Nishizawa et al, 2002. ; . Sugimoto et al, 2003 ; . Hahnenkamp et al, 2006 ). Kami berangkat untuk menyelidiki fenomena ini pada tingkat mikroskopis.

Karena bupivacaine rasemat dan enansiomer yang memiliki potensi serupa di reseptor NMDA ( Ueta et al., 2006 ), kami menggunakan campuran rasemat dalam penelitian kami. Kedua GluN1 / GluN2A dan GluN1 / GluN2B subtipe reseptor sangat dinyatakan dalam dorsal horn ( Shiokawa et al., 2010 ). Pertama, kami menguji efek dari bupivacaine pada jenis reseptor tersebut dengan menghasilkan kurva dosis-respons untuk pengurangan seluruh sel mapan level saat ini baik GluN2A- atau reseptor GluN2B mengandung, pada pH fisiologis 7,4 ( Gambar. 1 ) . Arus yang ditimbulkan dengan menerapkan glutamat (1,0 m M) di hadapan terus menerus dari glisin (0,1 m M), dan bupivacaine diterapkan selama fase mapan dari respon meningkatkan konsentrasi. Half-maksimal penghambatan (IC 50) nilai-nilai dihitung dari hubungan dosis-respons yang dihasilkan adalah serupa untuk kedua jenis reseptor diselidiki (GluN1 / GluN2A, 0,7 ± 0,1 m M vs GluN1 / GluN2B, 0,8 ± 0,1 mM) ( Gambar. 1 C ), konsisten dengan penelitian sebelumnya pada oosit Xenopus (1,0 m M vs M, masing-masing 1,1 m) (Sugimoto et al., 2003 ). Untuk reseptor NMDA, aktivitas single-channel yang terbaik dilihat pada pH 8,0, di mana penghambatan proton alami reseptor minimal ( Banke et al., 2005 ). Karena bupivacaine protonasi konstanta kesetimbangan adalah dalam kisaran ini (pKa = 8.1) ( Gambar. 1 A) ( Becker dan Reed, 2006 ), kami juga ditentukan hubungan dosis-respons pada pH 8,0. Untuk reseptor / GluN2A GluN1, nilai-nilai IC 50 diperoleh pada pH 7,4 dan pH 8,0 adalah serupa (0,7 ± 0,1 dan 1,2 ± 0,6 mM, masing-masing; p> 0,05, ANOVA satu arah) ( . Gambar 1 B, C). Hasil ini konsisten dengan laporan sebelumnya yang menunjukkan bahwa efek bupivacaine pada reseptor NMDA tidak mengenakan biaya-dependent ( Hahnenkamp et al, 2006. ; Furutani et al, 2010. ). Kami menyimpulkan bahwa, di tangan kita juga, bupivakain penghambatan respon reseptor NMDA adalah pH- dan GluN2 subunit-independen.

Sebagai persiapan terakhir untuk rekaman single-channel, kami memperkirakan kinetika ikatan dan disosiasi bupivacaine. Kami mencatat tanggapan seluruh sel (pH 8,0, dan -100 mV) ditimbulkan oleh glutamat (1,0 m M) aplikasi (glisin, 0,1 m M) dan berdenyut 1 m M bupivacaine ke fase mapan saat ini . Kami muat fungsi monoexponential ke onset dan pemulihan fase inhibisi untuk menghitung hubungan yang jelas (k pada, 7 ± 2 × 10 3 M -1 s -

1) dan disosiasi (k off, 10 ± 4 s -1)tingkat konstanta sebagai nilai-nilai kebalikan dari konstanta waktu yang diukur ( Gambar 1. D); konstanta laju ini memperkirakan K d 1,5 m M, yang konsisten dengan nilai IC 50 dihitung dari seluruh sel mapan penghambatan saat ini.Pengukuran ini menunjukkan bahwa timbulnya penghambatan bupivacaine adalah beberapa kali lipat lebih lambat dari kinetika dilaporkan glutamat yang mengikat (1,7 ± 2,4 × 10 7 M -1 s -1) ( Popescu et al., 2004 ). Berdasarkan hasil ini, kami mengantisipasi bahwa,

dalam konsentrasi tinggi mapan glutamat (1 m M), seperti pada single-channel penyelidikan on-sel, glutamat disosiasi akan tidak terdeteksi dan catatan akan mencerminkan setiap saat glutamat terikat konformasi ; Sebaliknya, bila menggunakan konsentrasi bupivacaine sekitar atau lebih rendah dibandingkan diukur K d, catatan akan mencerminkan gating dari kedua reseptor bupivacaine-terikat dan bupivacaine bebas, dan proporsi relatif dari ini akan tergantung pada konsentrasi bupivacaine yang digunakan.

Gambar 1.Bupivakain mengurangi arus makroskopik GluN1 rekombinan / reseptor GluN2. A, struktur bupivakain dan keseimbangan protonasi (Becker dan Reed, 2006) B., Jejak saat Whole-sel yang tercatat pada pH 8,0 (kiri) dan 7,4 (kanan) dari HEK 293 sel mengekspresikan reseptor GluN1 / GluN2A sebelum dan sesudah aplikasi dari peningkatan konsentrasi bupivacaine ke fase mapan saat ini. C, konsentrasi ketergantungan arus direkam pada pH 8,0 (GluN2A) dan 7,4 (GluN2A dan GluN2B) dihitung dengan pas fungsi Bukit untuk data. IC 50 nilai adalah sebagai berikut: untuk GluN2A, 0,7 ± 0,1 m M dan 1,2 ± 0,5 m M pada pH 7,4 (n = 8) dan pH 8,0 (n = 6), masing-masing; dan untuk GluN2B, 0,8 ± 0,1 m M, pada pH 7,4 (n = 3). D, Bupivakain (1,0 m M) diterapkan untuk kondisi mapan arus GluN1 / GluN2A (pH 8,0, -100 mV) untuk mengamati kinetika onset dan pemulihan dari inhibisi (n = 6).