Kháng Sinh Là Một Nhóm Thuốc Được Sử Dụng Trước Hết Để Chữa Những Bệnh Do Vi Khuẩn Gây Ra

8/15/2019 Kháng Sinh Là Một Nhóm Thuốc Được Sử Dụng Trước Hết Để Chữa Những Bệnh Do Vi Khuẩn Gây Ra

1/24

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng r! r!

th"n! l#! $u% c&' thực vật( Vùng r là n)i *uất +h#t nhi,u vi khuẩn nội sinh chui

vào r! th"n! l# đ- sống nội sinh. s'u khi *"m nhậ+ vào c"y ch& c/ th- tậ+ trung t0i

v1 tr2 *"m nhậ+ ho3c 4i chuy-n đi kh5+ n)i trong c"y đ6n c#c h7 m0ch c&' r! th"n!

l#! ho' 89inni:l :t 'l(! ;


2/24

V2 4 như tNi vj' là thực +hẩm! gi' v1 l0i c/ hi7u $u% không k@m gì kh#ng sinh! nhất là trong

trưOng hợ+ ngộ độc thực +hẩm 4o vi khuẩn(

Ao3c 4ùng một số kh#ng sinh th%o 4ược th'y cho iLu+ro:n! như c'o khô vN c"y liu tr5ng

8hit: illo L'rk=! c"y m/ng mo 8c'ts cl' th%o 4ược ở vùng nhi7t đbi Y'm Q=! Kos:lli'

8th%o mộc c/ kh% nHng kh#ng viEm! đi,u ch6 tj +hdn nhự' c&' c"y Los:lli'! lo0i c"y L%n đ1' ở

n pộ(

Yhự' loài c"y này c/ mùi hư)ng được cho rng ngHn ch3n l:ukotri:n:s! h/' chất g"y h0i t6 Lào

khb+ khN: m0nh! c'+s'icin 8ho0t chất chi6t tj $u% ch2n khô c&' một số loài bt=! curcumin 8thành

+hdn ch2nh c&' curcuminoit! c/ trong c& ngh7= và c#c lo0i 4du th)m(((

Năm 1951, Oatman mới đưa ra định nghĩa: Chất kháng sinhlà các chất hoá học tổng hợp hoặc do nấm tạo ra, có khảnăng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, thậm chí còn tiêudiệt chúng ở nồng độ loãng.

Ngày nay khái niệm kháng sinh còn được mở rộng đối vớihợp chất trị Vi khuẩn, Vi rút được chiết từ thực vật. Người tagọi những chất hữu cơ có khả năng diệt khuẩn có nguồn gốctừ thực vật này làkh#ng sinh thực vật h'y là qhyton*it(8+hytonci4 AX( +hyton thực vật! X(c':4:r: tiEu 4i7t!gi6t ch6t=( Như vậy kháng sinh thực vật không chỉ ức chế,

tiêu diệt vi khuẩn mà một số khác còn có tác dụng với cảVirut.

Trong lịch sử phát triển Y học của dân tộc ta cũng như nhiềudân tộc khác trên thế giới cũng đã từng sử dụng nhiều loạicỏ cây vào mục đích chống nhiễm trùng. Ở nước ta, từ thế kỷ14, đại danh Y Tuệ Tĩnh đã biết sử dụng nhiều loại thực vậtcó tính chất kháng khuẩn mạnh: Tỏi, Hẹ, Tô mộc… trị cácbệnh nhiễm trùng. Mãi về sau này đến thế kỷ 19, người tamới biết trong tỏi có alixin, hẹ có odorin, tô mộc có Brazilin là

những hoạt chất có tác dụng kháng sinh chống vi khuẩn gâybệnh. Trong tập I Bài giảng Đông Y dùng cho bác sỹ chuyênkhoa Đông y cũng nêu kháng sinh thực vật nằm trong nhómthuốc thanh nhiệt giải độc: Kim ngân hoa, Bồ công anh,Xạcan, Sài đất, Ngư tinh thảo, Liên kiều, Thanh đại, Lá mỏ quạ,Quán chúng. Trong đó từ lâu Y văn đã ghi nhận Kim ngân


3/24

hoa, Bồ công anh chống Vi khuẩn; Liên kiều, Xạ can, Thanhđại chống vi rut viêm gan, Viêm họng...

+u đi-m nJi Lật c&' kh#ng sinh thực vật là 'n toàn!không g"y r' nhGng t'i Li6n nguy hi-m! ch6t ngưOi

như thuốc kh#ng sinh tân dược. Những tai biến doPenicillin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol…được Y văn nói đến nhiều, nhưng những tai biến do khángsinh thực vật gây ra chưa thấy tài liệu nào ghi nhận. Giới hạnan toàn về mặt độc chất của những kháng sinh thực vật lớnhơn kháng sinh tân dược rất đáng kể. Về cách sử dụng:Phần lớn các kháng sinh thực vật rất bền vững và dễ hoà tantrong nước, do đó hầu hết các cây thuốc kháng sinh thườngđược dùng dưới dạng thuốc sắc – dạng bào chế đơn giản vàthông dụng.

+ Trong điều trị các vết thương phần mềm, nhiều tác giảtrong và ngoài nước cũng đã công nhận dùng kháng sinhthực vật làm thương chóng sạch, các đám hoại tử dễ bong,tổ chức hạt hạt phát triển mạnh, vết thương mau lành hơnchữa bằng kháng sinh tân dượcvì trong nưbc s5c c"ythuốc không +h%i ch c/ kh#ng sinh mà cTn c/ nhGngchất k2ch th2ch gi>+ v6t thư)ng ch/ng đdy mi7ng! c/c#c lo0i m:n! vit'min và c#c nguyEn tố vi lượng t0ođi,u ki7n cho v6t thư)ng ch/ng khNi(

+ So sánh với kháng sinh tân dược, người ta thấy các câythuốc kháng sinh tuy không mạnh bằng nhưng cũng đủ đểchữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn. Không những thế,chúng còn có nhiều ưu điểm mà thuốc kháng sinh tân dượckhông có. Trước hết là vấn đề kháng thuốc. Đây là chuyệnnan giải đối với kháng sinh tân dược hiện nay, nhưng đối vớikháng sinh thực vật người ta chưa thấy hiện tượng này.

+ Nguồn dược liệu của nước ta vô cùng phong phú, trong đócó nhiều cây thuốc kháng sinh được Y học dân tộc dùng làmthuốc từ lâu. Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc,mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như:Aành! _Ni! A`! ]im ng"n! "m đ0i hành! l# Q/ngt'y… được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm,sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt,chốc lở, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễmkhuẩn khác. Nhiều cây thuốc được nhân dân ta dùng chữa


4/24

vết thương có kết quả tốt như Mỏ quạ, Nọc sởi, lá Vối, láBòng bong, Sắn thuyền, Lô hội, lá Trầu không, Sài đất….Nhiều cây thuốc đã được các nhà khoa học nghiên cứu vàtìm thấy những chất kháng sinh có tác dụng diệt nhiều loại vikhuẩn như: Dùng nước sắc lá Đơn tướng quân (tên khoa học

là Eugenia Formosa Wall) để chữa các chứng lở loét, mụnnhọt, mẩn ngứa, viêm họng, viêm phế quản… có kết quả tốt;Dùng lá Trầu không chữa bỏng (giã nhỏ, vắt lấy nước bôi vàochỗ bỏng) hoặc dùng nước lá Trầu không rửa các vết thươngthay thuốc sát khuẩn.

Một trong những vấn đề nan giải đối với thuốc kháng sinhtân dược hiện nay l hiện tượng !u"n thuốc# kháng thuốcv lo$n khu%n do t&nh h&nh l$' d(ng kháng sinh trong điềutr) ngy cng *hát tri+n , nhiều nước tr-n th. giới/

Đấy là chưa kể những tai biến nguy hiểm do nhiều loại kháng sinh gây ra, có khi dn !ến t" #ong$ %h&nh #'#(y, g)n !ây, ngư*i ta nh+c nhiều !ến kháng sinh thc #(t #à có -u hư.ng tr/ lại #.i các cây thu0c, s"d1ng các kháng sinh t nhi2n c3a cây c4$

5rong thi2n nhi2n, có rất nhiều cây c4 có chất kháng sinh$ 6gu7n dư8c li9u c3a nư.c ta #: c;ng


5/24

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH

TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.)

Ở TỈNH KIÊN GIANG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS. TS NGUYỄN HỮU HIỆP

NGUYỄN MẠNHMSSV:3113729

LỚP : VI SINH VẬT K37

Cần Thơ, 11/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌCCHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH

TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.)Ở TỈNH KIÊN GIANG



PGS. TS NGUYỄN HỮU HIỆP

NGUYỄN MẠNH


6/24

MSSV:3113729

LỚP : VI SINH VẬT K37

Cần Thơ, 11/2014

PHẦN KÝ DUYỆT



(ký tên)

(ký tên)

PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp

Nguyễn Mạnh

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày 20 tháng 12 năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

αα&ββ

Trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ đếnnay tôi đã hoàn thành khóa học và trong quá trình làm luận văn, tôi luôn được sự hỗ


7/24

trợ về mặt tinh thần và vật chất từ gia đình, Thầy, Cô và bạn bè đã giúp tôi vượt qua

những khó khăn và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn đến:

Quý Thầy Cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường

Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôithực hiện luận văn.

PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinhvật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy đã nhiệt

tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trongsuốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn

thành luận văn này.Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên và chia

sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này.Tôi xin bày tỏ sự biết ơn đến gia đình, bạn bè lớp Vi sinh vật học khóa 37 đã

động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này!

Cần Thơ, ngày 20 tháng 12 năm 2014

Nguyễn Mạnh

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 -2014

Trường ĐHCT

TÓM LƯỢCDiếp cá là một loại cây trồng được ứng dụng làm thuốc trị bệnh từ rất lâu, từ

rễ, thân, lá của cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.) đã phân lập được mười lăm dòngvi khuẩn nội sinh trên môi trường PDA. Phần lớn vi khuẩn đều có dạng hình tròn, bìa

nguyên, độ nổi mô, màu trắng sữa, dạng que ngắn, Gram âm và có khả năng chuyển

động. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy,

lượng ammonium và IAA cao nhất vào ngày thứ hai sau đó giảm vào ngày thứ tư và

tăng lên vào ngày sáu sau khi chủng. Dòng ML4 và ML7 có khả năng tổng hợp NH4+

cao nhất so với các dòng còn lại (0,728 µg/ml và 0,755 µg/ml ), khác biệt không có ý

nghĩa với nhau và lượng IAA cao nhất (5,640 µg/ml ) do dòng MR4 tổng hợp được vào

ngày hai nhưng lại giảm vào ngày sáu sau khi chủng. Bên cạnh đó dòng MR4 cũng có

khả năng hòa tan lân cao nhất vào ngày sáu sau khi chủng (161 E) so với các dòng


8/24

còn lại, đồng thời có 6 dòng vi khuẩn có khả năng kháng lại vi khuẩn Aeromonas

hydrophila được phân lập từ rễ, thân, lá và có một dòng vi khuẩn kháng được vi khuẩn

gây bệnh E.coli được phân lập từ thân cây Diếp cá. Đặc biệt, dòng MT1 có khả năng

kháng lại cả hai vi khuẩn gây bệnh E.coli và Aeromonas hydrophila .

Ba dòng vi khuẩn được nhận diện ở cấp độ loài bằng phương pháp giải trình tự16S-rRNA. Dòng MT1 được nhận diện là Enterobacter cloacae (mức độ đồng hình là

94%). Dòng MT2 được nhận diện là Acinetobacter baumannii ( mức độ đồng hình là98%). Dòng MR4 được nhận diện là Enterobacter cloacae (mức độ đồng hình là 97%)

Từ khóa: Acinetobacter baumannii, Cây Diếp cá, Enterobacter cloacae, Khángkhuẩn, Vi khuẩn nội sinh

Chuyên ngành Vi sinh vật học

i

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

MỤC LỤCTrangPHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠTÓM LƯỢC .................................................................................................................... i

MỤC LỤC ...................................................................................................................... iiDANH SÁCH BẢNG .................................................................................................... vi

DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... vii

CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................... viii

CHƯƠNG 1 GIỚITHIỆU ............................................................................................. 1

1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1

1.2 Mục tiêu .......................................................................................................... 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................... 3

2.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Kiên Giang ......................................................... 3

2.1.1 Vị trí địa lý ............................................................................................. 3


9/24

2.1.2 Đặc điểm. ............................................................................................... 4

2.2 Sơ lược về cây Diếp cá ................................................................................... 4

2.3 Tác dụng của cây Diếp cá ............................................................................... 5

2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh ........................................................................... 7

2.4.1 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh : ................................................. 72.4.1.1 Khả năng cố định đạm: .................................................................. 8

2.4.1.2 Khả năng hòa tan lân khó tan: ....................................................... 82.4.1.3 Khả năng đối kháng:...................................................................... 9

2.4.2 Một số vi khuẩn nội sinh thường gặp: ................................................... 92.4.2.1 Vi khuẩn Enterobacter ................................................................. 10

2.4.2.2 Vi khuẩn Acinetobacter ............................................................... 102.4.2.3 Vi khuẩn Bacillus ........................................................................ 10

2.4.2.4 Vi khuẩn Pseudomonas ............................................................... 13


ii

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

2.4.2.5 Vi khuẩn Azospirillum ................................................................ 132.4.2.6 Vi khuẩn Azotobacter .................................................................. 14

2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................ 142.5.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR ..................................................... 15

2.5.2 Mồi (primer) sử dụng trong PCR ......................................................... 16

2.6 Điện di gel agarose ....................................................................................... 17

2.6.1 Nguyên tắc của kỹ thuật điện di ........................................................... 17

2.6.2 Các kỹ thuật điện di chủ yếu ................................................................ 18

2.6.2.1 Điện di trên gel agarose ............................................................... 18

2.6.2.2 Điện di trên gel polyacrylamide .................................................. 18

2.7 Phương pháp giải trình tự DNA ................................................................... 18

2.7.1 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy ....................................... 18


10/24

2.7.2 Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động .......................... 19

2.7.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã ............................... 19

2.8 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................. 19

2.8.1 Trong nước ........................................................................................... 19

2.8.2 Ngoài nước ........................................................................................... 20CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 22

3.1 Phương tiện nghiên cứu: ............................................................................... 223.1.1 Thời gian – địa điểm thực hiện ............................................................ 22

3.1.2 Vật liệu: ................................................................................................ 223.1.3 Dụng cụ - thiết bị : ............................................................................... 22

3.1.4 Hóa chất ............................................................................................... 233.1.4.1 Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh ....................................... 23

3.1.4.2 Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân .................................. 233.1.4.3 Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4 ............................. 24

3.1.4.4 Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn ................................................. 253.1.4.5 Hóa chất trích DNA ..................................................................... 25

3.1.4.6 Hóa chất đo IAA: ........................................................................ 25Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

3.1.4.7 Hóa chất đo lượng đạm vi khuẩn cố định.................................... 25

3.1.4.8 Hóa chất thực hiện phản ứng PCR .............................................. 25

3.2 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 26

3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh ................................................................... 26

3.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyên động của vi khuẩn nội sinh

trong cây Diếp cá .......................................................................................... 27

3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh ........................................................... 29

3.2.4 Xác định khả năng tổng hợp NH4+....................................................... 29

3.2.5 Xác định khả năng hòa tan lân ............................................................. 31


11/24

3.2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA ........................................................ 31

3.2.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của một số dòng vi khuẩn phân

lập .................................................................................................................. 33

3.2.8 Sử dụng kỹ thuật PCR nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh có

triển vọng ...................................................................................................... 333.2.9 Phần mềm xử lý số liệu ........................................................................ 35

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 364.1. Kết quả phân lập vi khuẩn ........................................................................... 36

4.1.1 Phân lập vi khuẩn ................................................................................. 364.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc .............................................................................. 37

4.1.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn..................................................................... 394.2. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn .............. 41

4.2.1 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phânlập từ rễ, thân cây Diếp cá ( MR1 – MR4, MT1, MT2) ............................... 41

4.2.2 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phânlập từ lá cây Diếp cá ( ML1 – ML9) ............................................................. 42

4.2.3 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng được phânlập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá........................................................................ 43

4.3. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indole –3– acetic acid (IAA)của cácdòng vi khuẩn ..................................................................................................... 45


iv

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

4.3.1 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập từ rễ,

thân cây Diếp cá (MR1 – MR4, MT1, MT2)................................................ 45

4.3.2 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá

cây Diếp cá ( ML1 – ML9 ) .......................................................................... 46

4.3.3 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng được phân lập từ


12/24

rễ, thân, lá cây Diếp cá .................................................................................. 48

4.4. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan ........................................... 49

4.5. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn ................ 51

4.5.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn

gây bệnh E.coli.............................................................................................. 514.5.2 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh ở

cá Aeromonas hydrophila ............................................................................. 524.6. Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh ................................................... 56

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 585.1. Kết luận ....................................................................................................... 58

5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 58TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 59

PHỤ LỤC


v

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNGTrang

Bảng 1 : Môi trường PDA ............................................................................................. 23Bảng 2 : Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) ....................................................... 23

Bảng 3 : Môi trường NFb (g/l) (Krieg và Dobereiner, 1984)........................................ 24

Bảng 4 : Thành phần dung dịch vi lượng. ..................................................................... 24

Bảng 5 : Thành phần dung dịch vitamin ....................................................................... 24

Bảng 6 : Thành phần các chất trong phản ứng PCR...................................................... 26

Bảng 7 : Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh ............... 34

Bảng 8 : Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây Diếp

cá trên môi trường PDA ................................................................................................ 37

Bảng 9 : Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường


13/24

PDA ............................................................................................................................... 38

Bảng 10 : Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA

....................................................................................................................................... 40

Bảng 11 : Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn nhóm 1(MR1 – MR4, MT1, MT2)

tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) ........................................................................... 42Bảng 12 : Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (ML1 – ML9) tổng hợp

được theo thời gian (µg/ml) ........................................................................................... 43Bảng 13 : Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1(MR1 – MR4, MT1,

MT2) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) ................................................................. 46Bảng 14 : Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (ML1 – ML9) tổng

hợp được theo thời gian (µg/ml).................................................................................... 48Bảng 15 : Hiệu quả hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường

NBRIP đặc. .................................................................................................................... 51Bảng 16 : Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E.coli

....................................................................................................................................... 52Bảng 17 : Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn

Aeromonas hydrophila .................................................................................................. 54Bảng 18 : Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn triển vọng .......................................... 56


vi

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Bản đồ hành chính tỉnh Kiên Giang .................................................................... 3

Hình 2 Lá cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.) ............................................................. 5

Hình 3 : Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ ....................................................... 30

Hình 4 : Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA ........................................................ 32

Hình 5 : Sự phát triển của vi khuẩn tạo thành vòng pellicle trong môi trường NFb bán


14/24

đặc .................................................................................................................................. 36

Hình 6 : Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA ............. 39

Hình 7 : Vi khuẩn Gram âm (A) và vi khuẩn Gram dương (B) được chụp dưới kính

hiển vi quang học ........................................................................................................... 40

Hình 8 : Lượng NH4+ (µg/ml) trung bình do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra đượcphân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá ............................................................................... 44

Hình 9 : Lượng IAA (µg/ml) trung bình do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra đượcphân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá ............................................................................... 49

Hình 10 : Vòng halo do dòng MR2 và MR4 tạo ra khi chủng vào trong môi trườngNBRIP đặc ..................................................................................................................... 50

Hình 11 : Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn MT1 với vi khuẩn E.coli ........... 52Hình 12 : Khả năng kháng khuẩn của dòng R2, T2, R4 với vi khuẩn gây bệnh

Aeromonas hydrophila .................................................................................................. 55Hình 13 : Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA ................................ 56


vii

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

CÁC TỪ VIẾT TẮT

A. hydrophila Aeromonas hydrophila

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

DMSO

Dimethyl sulfoxide


15/24

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

E. coli

Escherichia coli

IAA

Indole – 3 – Acetic Acid

LB

Luria - Bertani

NBRIP

National Botanical Research Institute's phosphate

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PDA

Potato dextrose agar


viii


16/24

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đềHiện nay, cùng với sự phát triển của các kỹ thuật hiện đại và tiên tiến, từ đó

nhiều loại thuốc đã được ra đời, đối với thuốc có nguồn gốc hóa dược ngoài những ưuđiểm nổi bật như hiệu quả nhanh, dễ bảo quản và sử dụng,… thì vấn đề hạn chế cần

đặc biệt quan tâm là tác dụng phụ của thuốc và thuốc còn mang tính độc kèm theo khiđiều trị lâu dài sẽ dễ gây biến chứng. Vì vậy, ngày nay người ta có xu hướng trở về với

thiên nhiên với những cây cỏ có tính kháng sinh và kháng khuẩn đã được Y học dântộc dùng làm thuốc từ lâu. Nhiều cây thuốc đã được các nhà khoa học tìm thấy và

nghiên cứu, trong đó có cây Diếp cá.Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa, động thực vật phong phú là tiền đề tốt để

phát triển các sản phẩm từ dược liệu. Nguồn dược liệu dồi dào là nền tảng cho việchình thành các cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu. Theo thống kê của Bộ Y tế, cả nước

hiện có hơn 300 cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu trong nước, trong đó có 10 cơ sở

đông dược đạt chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc của WHO. Nhiều công ty dược cũngcó thương hiệu riêng từ thế mạnh của cây dược liệu.Trong các loài dược liệu phổ biến, Diếp cá là loại rau quen thuộc trong nhân

dân, không chỉ được dùng làm rau ăn, gia vị mà còn dùng làm thuốc trị một số bệnhnhư táo bón, sởi, viêm cơ, nhiễm trùng, trĩ,…

Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất(Wedelia chinensis M.), cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.), cây Diệp hạ châu

(Phyllanthus urinaria L.)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng

khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất ceton như

methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất αpinen, camphen,.....Có

tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia,

Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006).

Nhiều nghiên cứu cho thấy trong các cây trồng không thuộc họ đậu cũng có các

nhóm vi sinh vật có ích sống trong cây hoặc ở vùng rễ cây đã kích thích cây trồng phát

triển tốt nhờ chúng có khả năng cố định nitơ, hòa tan lân, tổng hợp các hormone tăng


17/24

trưởng và các hợp chất có khả năng trực tiếp ức chế một số bệnh cho cây trồng hoặc


1

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

kích thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp giúp cây chống lại cáctác nhân gây bệnh. Đặc biệt là có những chủng vi sinh vật nội sinh với cây dược liệu

có thể sản xuất các hợp chất kháng khuẩn khi chúng sống bên trong cây dược liệu. Cácnhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum,

Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Klebsiella.Đến nay có rất ít nghiên cứu về nhóm vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá vì

vậy việc phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá ở tỉnh Kiên Giang được thựchiện.

1.2 Mục tiêu

Phân lập và tuyển chọn đựợc các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá(Houttuynia cordata T.) có những đặc tính: kháng khuẩn tốt, khả năng cố định đạmtốt, tổng hợp IAA tốt và khả năng hòa tan lân khó tan tốt.


2

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2


18/24

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Kiên Giang

2.1.1 Vị trí địa lý

Kiên Giang nằm ở phía Tây Nam của Tổ quốc, phần đất liền nằm trong tọa độ

từ 9°23'50 - 10°32'30 vĩ Bắc và từ 104°26'40 - 105°32'40 kinh Đông, có đường biêngiới chung với Vương quốc Campuchia dài 56,8 km, đường bờ biển dài trên 200 km.

Phía Đông và Đông Nam giáp Cần Thơ, An Giang; phía Nam giáp Cà Mau và BạcLiêu; phía Tây giáp vịnh Thái Lan. Phần hải đảo nằm trong vịnh Thái Lan bao gồm

hơn 100 hòn đảo lớn nhỏ, trong đó lớn nhất là đảo Phú Quốc và xa nhất là quần đảoThổ Chu.

Nằm trong vùng vịnh Thái Lan, gần với các nước Đông Nam Á nhưCampuchia, Thái Lan, Malaisia, Singapo

Hình 1 Bản đồ hành chính tỉnh Kiên Giang

(Nguồn : http://laptruyenhinhcap.com/Lap-dat-TH-An-Vien/An-Vien-Tai-Kien-Giang.htmlngày 26/7/2014)


3

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

2.1.2 Đặc điểm.-

Địa hình : Kiên Giang có đủ các dạng địa hình từ đồng bằng, núi rừng và biển

đảo. Trong đó, phần đất liền có địa hình tương đối bằng phẳng, thấp dần từ đông bắc

xuống tây nam.

-

Khí hậu : Kiên Giang có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm; nhiệt


19/24

độ trung bình hàng tháng từ 27 – 27,5oC. Lượng mưa trung bình hàng năm khoảng

1.600 – 2.000 mm ở đất liền và 2.400 – 2.800 mm ở vùng đảo Phú Quốc. Mùa mưa bắt

đầu từ tháng 4 đến tháng 11; mùa khô từ tháng 12 đến tháng 3 năm sau. Kiên Giang rất

ít thiên tai, không rét, không có bão đổ bộ trực tiếp, ánh sáng và nhiệt lượng dồi dào,nên rất thuận lợi cho nhiều loại cây trồng và vật nuôi sinh trưởng

-

Tài nguyên đất : Kiên Giang có 4 vùng đất đai chính là vùng phù sa ngọt thuộc

tây sông Hậu, vùng phèn ngập lũ thuộc tứ giác Long Xuyên, vùng nhiễm mặn thuộcbán đảo Cà Mau và vùng đồi núi, hải đảo ở hai huyện Phú Quốc và Kiên Hải. Trong

đó, đất nông nghiệp, chiếm 64,2% diện tích tự nhiên, đất rừng chiếm 122,8 nghìn ha,đất chuyên dùng 35,4 nghìn ha, đất ở 10,1 nghìn ha. Ngoài ra tỉnh còn có trên 70 nghìn

ha đất hoang hoá và sản xuất chưa ổn định với hơn 25 nghìn ha vườn tạp.-

Tài nguyên biển : Kiên Giang là tỉnh có nghề đánh bắt hải sản phát triển. Với

bờ biển dài trên 200 km, có diện tích biển khoảng 63.000 km2, Kiên Giang tiềm năng

rất phong phú để phát triển kinh tế biển.

2.2 Sơ lược về cây Diếp cáCây diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Dấp cá, có tên khoa học là Houttuyniacordata T., tên tiếng Anh của nó là heartleaf (lá hình tim), fish mint, fish herb,

hay lizardtail (đuôi thằn lằn), thuộc họ Giấp (Saururaceae).Cây Diếp cá có nguồn gốc ở Nhật Bản, miền nam Trung Quốc, Đông Nam Á, Ấn

Độ, Indonesia,…Diếp cá là loại thân cỏ, có hình trụ tròn, hay dẹt, cong dài 20 – 35cm, đường kính

2 – 3 cm. Rễ mọc ngầm dưới đất, lá mọc so le, hình tim, đầu lá nhọn, phiến lá gấp

cuộn lại, cuống đính ở gốc lá dài khoảng 2 – 3cm, cuống dài 3 cm. Vị hơi chát, se.

Mùa hoa nở vào tháng 5 – 8 và mùa quả vào tháng 7 – 10. Cụm hoa hình bông bao

bởi 4 lá bắc màu trắng, trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt. Quả nang mở ở đỉnh,

hạt hình trái xoan, nhẵn.


4


20/24

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

Theo Đỗ Tất Lợi (2006), trong cây có chừng 0,0049% tinh dầu và một ít

chất ancaloit gọi là cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton,chất myrcen, caprinic acid và laurinaldehyt. Hoa và quả chứa chất isoquexitrin và

không chứa quexitrin. Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là 2,7%.Thành phần chủ yếu của cây Diếp cá như sau : Nước 91,5; protid 2,9; glucid 2,7,

lipit 0,5, cellulose 1,8, dẫn xuất không protein 2,2, khoáng toàn phần 1,1 và theo mg%:calcium 0,3, kali 0,1, caroten 1,26, vitamin C 68. Trong cây có tinh dầu mà thành phần

chủ yếu là methylnonylketon, decanonylacetaldehyde và một ít alcaloid là cordalin,một hợp chất sterol v.v... Trong lá có quercitrin (0,2%); trong hoa và quả có

isoquercitrin.

Hình 2 Lá cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.)

(Hình tự chụp ngày 25/7/2014)

2.3 Tác dụng của cây Diếp cáTheo đông y, Diếp cá có vị cay chua, mùi tanh giống mùi cá, tính mát, có tácdụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, sát trùng, chữa viêm phổi, viêm khớp, lở loét cổ tử

cung, táo bón do thói quen, kiết lỵ do vi khuẩn cấp tính, viêm gan vàng mật cấptính,…

Tinh dầu Diếp cá có tác dụng kháng viêm, khánh khuẩn mạnh. Ngoài ra, câyDiếp cá còn ức chế trực tiếp virus herpes chủng I (HSV – 1), virus cúm, virus gây suy


5

Viện NC & PT CNSH



21/24

Trường ĐHCT

giảm miễn dịch mắc phải ở người loại I (HIV – 1) mà không biểu hiện độc tính, nhưng

không chống lại poliovirus và coxsackie virus. Ba thành phần chính có tác dụng là :

xeton methyl n – nonyl, aldehyde lauryl và aldehyde capryl.Trong y học dân gian, Diếp cá được dùng chữa các chứng bệnh như: táo bón,

trĩ, sởi, mề đay, viêm tai giữa, sưng tuyến vú, tắc tia sữa , viêm thận, phù thũng, kiếtlỵ , tiểu buốt, tiểu rát

Theo nghiên cứu của y học hiện đại, trong cây Diếp cá có chất decanoyl –acetaldehyde mang tính kháng sinh, có tác dụng ức chế tụ cầu vàng, liên cầu, phế cầu,

trực khuẩn bạch hầu, E.coli, trực khuẩn lỵ, xoắn khuẩn leptospira. Nó cũng có tácdụng đối với virus sởi, herpes, cúm và cả HIV, do tác động vào vỏ bọc protein của

virus. Diếp cá còn diệt ký sinh trùng và nấm.Cũng theo Tây y, Diếp cá giúp lợi tiểu do tác dụng của chất quercitrin, làm chắc

thành mao mạch, chữa trĩ do tác dụng của chất dioxy-flavonon. Ngoài ra, nó còn có tácdụng lọc máu, giải độc, giải nhiệt, kháng viêm, tăng sức miễn dịch của cơ thể.

Một nghiên cứu tại Viện đại học Y dược Toyama, Nhật Bản, đã cho thấy tácdụng chống oxy-hóa của 12 loại dược thảo và hợp chất được chiết xuất từ chúng. Diếp

cá là một trong 4 chất có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhấtTheo một nghiên cứu của Đại học Y khoa Koahsiung, Đài Loan, Diếp cá có tác

dụng ức chế đáng kể đối với sự sinh sản của virus herpes simplex. Nó được xem là

dược thảo chữa trị bệnh này. Đại học Koahsiung cũng phát hiện Diếp cá có tác dụngngăn chặn tế bào ung thư máu.Công trình nghiên cứu được thực hiện tại trường Đại học Thú y, thuộc Viện đại

học Nông nghiệp Zbejiang, Hangzbou, Trung Quốc. Từ Houttuynia cordata, các nhànghiên cứu đã chiết xuất được chất Houttuynia, sau đó cho Houttuynia phản ứng với

bisulphat natri để có được chất Houttuynia bisulphat natri. Từ chất này họ đã chế biếnđược một dung dịch tiêm vào vú để điều trị bệnh viêm tuyến vú ở bò.

(http://yume.vn/quangjimmy/article/rau-diep-ca-vi-thuoc-da-nang-35A8CEC7.htm,

ngày 25/7/2014))


6

Viện NC & PT CNSH


22/24


Trường ĐHCT

2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong cơ thể (mô) thực vật có thể sống sótvà phát triển bên ngoài môi trường và có thể có nguồn gốc từ những hạt giống và cây

con khi chúng ta phân phối hạt giống từ vùng này sang vùng khác. Chúng không làmtổn thương mô mà những loại vi khuẩn này có lợi ích đối với cây (Kobayashi et al.,

2000; Bandara et al., 2006)Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách

là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thôngqua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như

Azotobacter,

Bacillus,

Enterobacter,

Pantonae),

Beijerinckia,

Derxia,

Pseudomonas,

Enterobacteriaeae

Alcaligenes,

Azoarcus,

(Klebsiella,

Burkholderia,


23/24

Campylobacter, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich,

2007). Tuy nhiên, nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các

vị trí bị tổn thương của lá (Roos and Hattingh, 1983).

Sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc dichuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa (Zinniel et al.,

2002), thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cáchmạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ (Harari et al., 1988). Hiện nay các nhà nghiên cứu

quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt như vi khuẩn có khảnăng cố định nitơ trong không khí (Xu et al., 1998), tổng hợp kích thích tố auxin

(Barbieri et al, 1986), giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường (Rosenbluethvà Martinez, 2006), tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh

(Fahey et al., 1991), hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng(Lăng Ngọc Dậu et al., 2007).

2.4.1 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh :Vi khuẩn nội sinh là nhóm sinh vật tiền nhân được liên kết với thực vật, chúng

hình thành sự liên hợp với cây chủ của chúng bằng cách hình thành tập đoàn ở các môbên trong. Đối với nông nghiệp, phần lớn vi khuẩn nội sinh không gây hại cho sinh vật

chủ, mà ngược lại chúng còn được xem là công cụ để cải tiến năng suất cây trồng nhờvào các đặc tính sinh học của chúng (Muthukumarasamy et al., 2002).


7

Viện NC & PT CNSH


Trường ĐHCT

2.4.1.1 Khả năng cố định đạm:

Trong không khí có khoảng 78% thể tích là khí nitơ, tuy nhiên vì đây là khí trơ

nên có rất ít loài sinh vật có khả năng sử dụng nguồn chất dinh dưỡng này. Sự cố định

đạm sinh học chỉ giới hạn ở nhóm vi sinh vật sơ hạch chủ yếu là vi khuẩn và Archaea.

Nhóm vi sinh vật này có thể sống tự dưỡng hay dị dưỡng và quá trình cố định đạm của


24/24

chúng cần nguồn năng lượng, chủ yếu là nguồn carbohydrat do cây chủ cung cấp, do

đó nguồn năng lượng càng dồi dào thì sản lượng đạm cố định càng cao.

Thông qua hoạt động của các vi sinh vật này, N2 được chuyển thành dạng NH3

hữu ích cho cây trồng nhờ sự hoạt động của phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme

hydrogenase.N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP + 16H2O → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Các vi sinh vật cố định đạm trong tế bào vi khuẩn hay vi khuẩn lam đều nhờđến hệ thống gen nif, điều khiển quá trình tổng hợp enzyme nitrogenase. Enzyme này

dễ bị phá hủy bởi oxy. Nhiều vi khuẩn ngừng sản xuất enzyme này trong sự hiện diệncủa oxy. Nhiều vi sinh vật cố định đạm chỉ tồn tại trong điều kiện kỵ khí, vi hiếu khí

hoặc ràng buộc oxy với một protein như leghemoglobin.Theo Klucas (1991), để sự cố định đạm nội sinh có hiệu quả thì cần phải cung

cấp đầy đủ các chất cần thiết từ cây chủ và các điều kiện môi trường thích hợp cho sựcố định đạm liên kết. Do đó, sự chứng minh phân tử về sự có mặt của các gen nif

trong bộ gen của vi khuẩn được giả định là cố định đạm thường được xem là vật chỉthị đáng tin cậy để phân loại vi khuẩn (Elmerich, 2007).

2.4.1.2 Khả năng hòa tan lân khó tan:Lân (P) là một trong những chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu nhất cần cho sự

sinh trưởng và phát triển của cây trồng (Illmer and Schinner, 1992). Nhìn chung, lânsẵn có trong đất cần cho sự sinh trưởng thực vật thấp, hàm lượng lân trung bình trong

đất khoảng 0,05% (w/w) nhưng chỉ có 0,1% hàm lượng lân tổng số là có giá trị cho

cây (Zou et al., 1992).Việc thiếu lân ở đất là một trong những nhân tố quan trọng nhất ở đất hạn chế sựsinh trưởng của thực vật, vì vậy để đạt được năng suất thực vật tối đa người ta thường

dùng các dạng phân lân dễ tan để bón cho cây. Tuy nhiên, các dạng có thể hòa tan củaphân lân khi bón vào đất lại dễ dàng bị kết tủa thành các dạng không hòa tan được như


8

Viện NC & PT CNSH

Documents

Kháng Sinh Là Một Nhóm Thuốc Được Sử Dụng Trước Hết Để Chữa Những Bệnh Do Vi Khuẩn Gây Ra