KÜL- ÉS BELTENYÉSZTETT, TRANSZGENIKUS, GÉNKIÜTÖTT ÉS

GÉNBEÜTÖTT ÁLLATOK. KLÓNOZÁS

Dr. Jánossy TamásSZTE, ÁOK, Sebészeti Műtéttani

Intézet

Modellválasztás az orvostudományi és a biológiai kutatásokban

1. A megfelelő állatfaj kiválasztása:

Leggyakrabban használt állatfajok:Háziállatok: szarvasmarha, sertés, baromfi,

kutya, macskaNem ember főemlősök: majom, csimpánz,

cerkófmajom, selyemmajmokKis laboratóriumi emlősök: egér, patkány,

tengerimalac, hörcsög, nyúlEzek a leggyakoribbak: kis helyigény, szaporaság, rövid tenyészidő

2. A megfelelő genetikai tényezők, tulajdonságok kiválasztása: pl. változatos v. azonos állatok

Kültenyésztés: a rokontenyésztés elkerülésegenetikailag változatos állomány

<100 tenyészpár: a rokontenyésztés maximális elkerülése

>100 tenyészpár: rotációs v. találomra történő(random tenyésztés)

A beltenyésztési együttható (F) (a homozigóta génhelyek gyakoriságának) növekedése: <1%A kültenyésztett (outbred) állományegyedei heterozigóták: az apai (A) és az anyai gének (B) alléljei a génhelyek túlnyomórészében különbözőek (AB). A populáció anizogén: egyedei genetikailag különböznek (változatos genotípusúak).

Zárt kültenyészetben is megfigyelhető a növekvőhomozigótaság. Egyensúlyban lévő zárt tenyészetben az egyedek fele heterozigóta (AB), másik fele homozigóta (25% AA, ill. 25% BB)

Rokontenyésztés: 4 nemzedéken belüli közös ős a családfában

Beltenyésztés: szigorú rokontenyésztés: sorozatos testvér-testvér, gyermek-szülő pároztatás →növekvő homozigótaság (genetikai sodródás) (AB helyett AA v. BB)

Beltenyésztett törzsek létrehozása:>20 nemzedéken át végzett testvér-testvér (szülő-utód) pároztatás → az összes génlokusz 98,4%-a homozigóta (F=98,4%)

A beltenyésztett (inbred) törzs egyedei homozigótákés izogének (azonos genotípusúak).

A törzs bármely tagja elfogadja a bármelyik másik azonos nemű tagjából átültetett szöveteket (graft) → az izogenitás ellenőrzése bőrtranszplantációval (Silvers-félekörtranszplantáció)

A törzs fenntartása: a ritka mutációk miatt testvér-testvér pároztatással.

A beltenyésztett rágcsálótörzsek története:Jensen, Loeb, Ehrlich, Tyzzer: spontán

egértumorok sorozatos transzplantációval történő fenntartása → többnyire sikertelen (nem eredt meg v. visszafejlődött)

Jensen (1903), Loeb (1908): sikeres sorozatos tumorátoltások viszonylagosan beltenyésztett egerekben → a tumorokkal szembeni fogékonyság örökletes

Little (1914): a tumorrejekció, ill. a fogékonyság több dominánsan öröklődő génen alapul → a hisztokompatibilitási gének, a celluláris immunválasz tanulmányozása

Rommel, Wright (1906): beltenyésztett tengerimalacok (2-es és 13-as törzs)

King (1909): beltenyésztett patkányok (PA, WKA törzsek)

Little (1909): beltenyésztett egerek (DBA/1, DBA/2 törzsek)

Bagg (1913): BALB/c egértörzsStrong (1920): A, C3H, CBA egértörzsekLittle (1921): C57 egértörzsek családja1920-1930: a leggyakrabban használt egér- és

patkánytörzsek kifejlesztése1929: A Jackson Laboratórium megalapítása (Little)

Beltenyésztési depresszió (leromlás): a szaporodási képesség, életképesség, egészség stb. csökkenéseCsak az első néhány generációban fordul elő. Oka: a káros recesszív gének homozigótaságaA kialakult törzsben már nem fordul elő.

F1 hibridek: két genetikailag különbözőbeltenyésztett törzs keresztezéséből származóelső generációMinden egyed izogén és heterozigóta mindazon génlokuszokra, amelyekben a két szülői törzs különbözik (= a gének kodomináns öröklődése és kifejeződése).

Ha két transzplantációs antigénekben (H Ag) eltérő törzset keresztezünk, az F1-ek mindkét szülő H Ag-jeit kifejezik → ezért az egyik szülői törzstől származó bőrgraftot sem lökik ki, a szülői törzsek viszont kilökik az F1 graftokat.

Hibrid „életerő” vagy heterózis: a beltenyésztési depresszió ellentéte → a káros recesszív gének elfedése a kialakuló heterozigótaság miatt.

Nevezéktan: Nómenklatúra Bizottság (1952)Törzsnév: 1-4 nagybetűEgér: A, AKR, CBA, DBA stb.Patkány: LEW, WAG, BN, PVG stb.

Számok csak a korábban elterjedt törzsek eseténengedélyezettek (pl. egér: C3H, C57BL; patkány: F344, AS2, M520)

Altörzs:- a törzs két v. több ágra oszlik a 8-19.

testvérpároztatás között- ugyanabban a tenyészetben két párhuzamos

vonal genetikailag eltér.Példák: C57BL/6, C57BL/10; CBA/J, CBA/Ca; A/He, A/J stb.

Alvonal:- egy másik laboratóriumban történő hosszútenyésztés

- a törzs bármilyen manipulációja

Altörzs, alvonal neve: törzsnév/altörzs, alvonalszimbólum(ok) történeti sorrendben (a tenyésztő v. a laboratórium nevének rövidítése, ritkán szám: pl. C57BL/10ScSn: Sc=Scott, Sn=Snell

Manipulációk:f: dajkaság (foster nursing) egy másik törzsnél:

pl. C57BL/10ScSnfC3H. Pl. specifikált patogénmentes (SPF) törzsek létrehozása a magzatok méhhel együtt történő eltávolítása és dajkaságban történő felnevelése révén

e: embriótranszfer egy másik törzsbeh: mesterséges táplálás (hand rearing)o: ovárium-transzplantációp: petesejttárolás (preservation) cseppfolyós

nitrogénbenRövidített törzsnevek: AKR=AK, BALB/c=C,

C3H=C3, C57BL=B, C57BL/6=B6, C57BL/10=B10

F1 hibridek elnevezése:(nőstény szülői törzs x hím szülói törzs)F1pl. (BALB/c x C57BL/6)F1=CB6F1

Koizogén törzsek:Mutáció egy jelentős génlokuszon egybeltenyésztett törzsben → egy új beltenyésztett törzs kialakítása a mutációt hordozó állatokbólAz új törzs csak egyetlen génlokuszban (a mutált génben) különbözik az eredetitől → a génmutáció fenotipikus hatása tanulmányozható.

A mutáció betegség alapját képezheti:Egér:Anémia: sla génDiabétesz és elhízás (obesity): db, ob génekAnyagcsere-betegségek: his (hisztidinémia),

pro (prolinémia)Vesebetegség: kd génIzomsorvadás (dystrophia): dy, dy2J gén

Farok (tail) fejlődési rendellenességek: t-allélSzőrtelen (nude) és tímuszhiányos: nu

Patkány:Diabetes insipidus: di geneSzőrtelen (nude) és tímuszhiányos: rnu génBilirubinémia: j gene

Nevezéktan: törzsnév/altörzsnév-mutáns gén neve:BALB/c/Rij-nu, C57BL/6J-ob

Kongenikus, ill. kongenikus rezisztens törzsek:- A kívánt gén (D) bejuttatása egy beltenyésztett

donor törzsből (2.) egy másik, (d génallélű)recipiens törzsbe (1.) keresztezéssel → F1hibridek létrehozása;

- az F1-ek visszakeresztezése az 1. (recipiens) törzsű egerekkel;

- a D gént hordozó utódok (Dd) szelekciója ésvisszakeresztezése 1. egerekkel.

Legalább 10-12 visszakeresztezés szükséges →majd egy Dd heterozigóta hím és nőstény pároztatása → ezután egy DD homozigóta hím és nőstény beltenyésztése: az új, kongenikus törzs hordozza a donor D gént, míg az összes egyéb génjei (háttérgének) azonosak a recipiens (1.) törzsével.

Kongenikus rezisztens törzsek: a bőr-, ill. tumorgraftok rejekcióját kiváltó antigének génjeinek (MHC) bejuttatása a recipiens törzsbeNevezéktan: recipiens törzs.donor törzs (gyakran rövid nevekkel): pl. B10.D2 génrecipiens: C57BL/10 (B10) (MHC=H-2b), géndonor: DBA/2 (D2) (MHC=H-2d)→ kongenikus rezisztens törzs = B10.D2(másik elnevezés: C57BL/10ScSn-H-2d)A B10.D2 (H-2d) törzs kongenikus a B10 (H-2b)törzzsel: csak a H-2 lokuszban térnek el, háttérgénjeik azonosak.

A H-2 felfedezése = az egér fő hisztokompatibili-tási komplexe [major histompatibility complex (MHC)]

H-2 kongenikus törzsek közötti transzplantáció: az MHC felelős a graftrejekcióért.

Rekombináns törzsek: két nem rokon beltenyésztett törzs keresztezésével létrehozott F2 generációból származnak, >20 generáción át végzett testvér-testvér pároztatással állítják elő őket.

Elnevezés: BALB/c (C) x C57BL/6 (B6) → CXBvonalak

Mindkét ős génjeit hordozzák random eloszlásban.Poligénes tulajdonságok tanulmányozására

alkamasak:pl. élettartam, morfológiai és fiziológiai jellemzők, betegségek, viselkedés, gyógyszerhatások stb.

Transzgenikus állatok:- idegen DNS-szekvenciák = transzgének bejuttatása megtermékenyített petesejtek pronukleuszaiba mikroinjekcióval (v. embrionális őssejtekbe transzfekcióval, v. vírusvektorral)

- a petesejt bejuttatása álterhes nőstények petevezetékébe

- a transzgént kifejező transzgenikus állatok kiválasztása és homozigóta vonal kitenyésztése.

A transzgéneket ki lehet fejeztetni:- meghatározott szövetekben a megfelelőregulátoros szekvenciákhoz való kapcsolás révén (pl. antigénreceptor-gének lymphocytákban)

- gyógyszerekre v. hormonokra (pl. tetraciklin, ösztrogén) válaszoló promoterekhez kapcsolva

A transzgenikus állatokat lehet használni:- a transzgén élettani, patológiai hatásainak vizsgálatára;

- betegségmodellként;- transzgenikus fehérjék/peptidek (gyógyszerek,

hormonok stb.) nagy mennyiségben történőelőállítására.

Génkiütött (knockout, KO) állatok:Gének célzott mutációja v. szétrombolása homológ rekombináció révén: a kiütésre használt működésképtelen exogén génkonstrukció az endogén génnel homológ szekvenciákat tartalmaz → rekombináció → a kódoló szekvenciák diszrupciója → a génexpresszió és/vagy -funkciómegszűnése, deléciója

A génfunkció in vivo tanulmányozása

Génbeütött (knock-in) állatok:Egy normál génszekvencia bejuttatása a genommeghatározott helyére homológ rekombinációval(pl. endogén promoter v. enhancer régiók mellé)Génkonstrukció: vektor + bejuttatandó gén + a genomban a beépítés helyén lévő endogén génnel homológ szekvenciák

Klónozott állatok:Klón: az utód genomja teljesen azonos a kiindulóegyedével.Sejtosztódások (pl. megtermékenyített petesejtek és testi sejtek osztódása → a kiinduló sejt klónjai)

Többsejtű élőlények klónozása:I. Embrióosztási technika:

Rutin módszer a jó tulajdonságokkal rendelkezőháziállatok klónozására (pl. szarvasmarha).Mesterségesen egypetéjű ikreket állítanak elő. Lépések:1. Egy petesejtet mesterségesen

megtermékenyítenek spermiummmal.2. A zigótát hagyják osztódni 8-sejtes embrióvá.3. Az embriót 2 x 4-sejtes v. leggyakrabban 4 x 2-

sejtes darabokra osztják.A sejtek még nem differenciálódnak a 8-sejtes embrióban → a szétválasztott embriók genetikailag azonosak, mint az egypetéjűikrek: ikerkészítés embrióból.

4. A szétválasztott embriókat hagyják fejlődni in vitro.

5. Azután beültetik őket egy álterhes nőstény méhébe.

II. Testi sejtmag átvitele [somatic cell nucleartransfer (SCNT)]Ian Wilmut és Keith Campbell, Roslin Intézet,

Skócia, 1997: a Dolly bárány létrehozása Az SCNT-hez két sejt szükséges: a magdonor testi sejt + egy megtermékenyítetlen petesejt mint recipiens sejt:- A petesejt megfelelőbb recipiens sejt, mint a

testi sejtek: könnyebb osztódásra késztetni. - megtermékenyítetlen petesejt könnyebben

befogadja a sejtmagot, mint a megtermékenyített.

Az SCNT lépései (the Roslin-technika):1. A donorsejtet (a Dolly esetében emlőmirigysejt)

fötális borjúsavót tartalmazó tápfolyadékban tenyésztik, és hagyják osztódni in vitro.

2. Ezután a sejteket FCS-mentes tápfolyadékba helyezik → az osztódás leáll, és a sejtek G0 v. nyugalmi állapotba kerülnek. Ez szükséges, hogy a recipens sejt befogadja a donormagot.

3. A sejtmagot eltávolítják a petesejtből. 4. A donorsejtet a mag nélküli recipens sejt

közelébe helyezik. 5. 1-8 órával a mageltávolítás után → elektromos

inger:- donorsejt (v. izolált mag) fúziója a mag nélküli petesejttel;

- a sejtosztódás aktivációja és az embriófejlődése

A differenciált donorsejt genetikai programja lenullázódik a petesejtben → differenciálatlan, pluripotens sejt

6. Az embriót birka-petevezetékbe helyezik 5-6 napra (itt az embriók túlélése jobb, mint szövettenyészetben).

7. Amikor az embrió eléri a blasztoméra állapotot (kb. 100 sejt), az embriót beültetik egy dajka anya méhébe.

8. Az anya kihordja a terhességet. Az utódok a donor genetikailag pontos másolatai →reproduktív klónozásA blasztomérákat őssejtforrásként is lehet használni.

Honolulu-technika: egerek sikeres klónozásaA klónozott állatok képesek voltak normálisanszaporodni, fenntartani a klónt szexuálisreprodukció révén.

Kromatintranszfer: A klónozandó sejtek kezelése eltávolítja a sejtdifferenciálódással kapcsolatos molekulákat, mielőtt a magot eltávolítják → a genetikai program lenullázódása könnyebben megyvégbe.