KOLOKALIZACIJA PROTEINOV SINKRIP IN SINAPTOTAGMIN 7 V ... · Sl. 13: Vzdolžni prerez podganjih možganov, bazalna jedra. ..... 24 Sl. 14: Drsni mikrokriotom in zamrznjeni možgani

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ STRUKTURNE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE

Ana JERENKO

KOLOKALIZACIJA PROTEINOV SINKRIP IN

SINAPTOTAGMIN 7 V MOŽGANIH PODGANE

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij – 2. stopnja

Ljubljana, 2015

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ STRUKTURNE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE

Ana JERENKO

KOLOKALIZACIJA PROTEINOV SINKRIP IN SINAPTOTAGMIN 7 V

MOŽGANIH PODGANE

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij – 2. stopnja

COLOCALIZATION OF PROTEINS SYNCRIP AND SYNAPTOTAGMIN

7 IN RAT BRAIN

M. SC. THESIS

Master Study Programmes

Ljubljana, 2015

II Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.

Mag. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, študij strukturne in funkcionalne biologije, 2015

Magistrsko delo je zaključek Univerzitetnega študija II. Bolonjske stopnje Strukturna in

funkcionalna biologija. Opravljeno je na Inštitutu za patološko fiziologijo Medicinske

fakultete v Ljubljani.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje oz. Senat oddelka je dne 21. 2. 2014 odobrila naslov

magistrskega dela. Za mentorja magistrskega dela je bila imenovana doc. dr. Gordana

Glavan, za recenzenta pa prof. dr. Marko Kreft.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: prof. dr. Kristina SEPČIĆ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Mentor: doc. dr. Gordana GLAVAN


Recenzent: prof. dr. Marko KREFT


Datum zagovora: 3. 3. 2015

Podpisana izjavljam, da je naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela. Izjavljam, da je

elektronski izvod identičen tiskanemu. Na univerzo neodplačno, neizključno, prostorsko in

časovno neomejeno prenašam pravici shranitve avtorskega dela v elektronski obliki in

reproduciranja ter pravico omogočanja javnega dostopa do avtorskega dela na svetovnem

spletu preko Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete.

Ana Jerenko

III Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Du2

DK UDK 591:577(043.2)=163.6

KG kolokalizacja / SINKRIP / sinaptotagmin 7 / možgani podgane

AV JERENKO, Ana, diplomirana biologinja (UN)

SA GLAVAN, Gordana (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij strukturne in funkcionalne

biologije

LI 2015

IN KOLOKALIZACIJA PROTEINOV SINKRIP IN SINAPTOTAGMIN 7 V

MOŽGANIH PODGANE

TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja)

OP XI, 71 str., 5 preg., 37 sl., 1 pril., 91 vir.

IJ sl

JI sl/en

AI Namen magistrske naloge je bil raziskati kolokalizacijo (pojavljanje na istem mestu)

proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v nevronih štirih različnih anatomskih področij

možganov laboratorijske podgane (Rattus norvegicus): v hipokampusu, striatumu, skorji

velikih možganov in skorji malih možganov. Možgane podgan smo transkardialno

perfundirali s fiksativom, jih narezali ter pobarvali z metodo dvojne imunofluorescence.

Uporabili smo specifična protitelesa proti proteinoma SINKRIP in sinaptotagmin 7.

Kolokalizacijo smo analizirali z uporabo fluorescenčnega mikroskopa (Apotom). Stopnja

kolokalizacije proteinov je v večini preučevanih področjih zelo nizka. Signal za

sinaptotagmin 7 je najmočnejši v nevropilu vseh štirih preučevanih anatomskih področij, za

SINKRIP pa v somah celic teh področij. Izjema so le some Purkinjejevih celic, kjer je stopnja

kolokalizacije obeh proteinov visoka. Ugotovili smo tudi, da sta oba proteina v dendritih teh

celic. Hipotezo o kolokalizaciji lahko samo delno potrdimo. Kolokalizacija v somah ter

prisotnost obeh proteinov v dendritih nakazuje na možno vključenost proteina sinaptotagmin

7 pri prenosu mRNA v dendrite Purkinjejevih celic, ki ga uravnava protein SINKRIP.

Analizirali smo še prisotnost preučevanih proteinov v različnih anatomskih področjih

možganov z metodo imunohistokemije. Potrjujemo hipotezo, da sta proteina SINKRIP in

sinaptotagmin 7 prisotna v večini anatomskih področij možganov podgane.

IV Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Du2

DC UDK 591:577(043.2)=163.6

CX colocalization / SYNCRIP / synaptotagmin 7 / rat brain

AU JERENKO, Ana

AA GLAVAN, Gordana (supervisor)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical faculty, Master Study Programmes in

Structural and Functional Biology

PY 2015

TI COLOCALIZATION OF PROTEINS SYNCRIP AND SYNAPTOTAGMIN 7 IN

RAT BRAIN

DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes)

NO XI, 71 p., 5 tbl., 37 fig., 1 ann., 91 ref.

LA sl

AL sl/en

AB The aim of this study was to investigate colocalization (occurrence at the same

location) of proteins SYNCRIP and synaptotagmin 7 in neurons of four anatomical areas in

laboratory rat (Rattus norvegicus) brain: the hippocampus, striatum, cerebral cortex and

cerebellum cortex. We perfused rat brain with fixative, then cut and stained the brain with

the method of double immunofluorescence. We used specific antibodies against proteins

SYNCRIP and synaptotagmin 7. We analyzed colocalizaton by fluorescence microscopy

(Apotom). Colocalization of proteins in the majority of anatomical areas is low,

synaptotagmin 7 is in all anatomical areas expressed mostly in neuropil, on contrary

SYNCRIP is expressed predominantly in cell bodies. Exceptions are cell bodies of Purkinje

cells, where the colocalization of proteins is relatively high and we conclude that both

proteins are present in dendrites of Purkinje cells. We partially confirm the hypothesis about

colocalization of proteins SYNCRIP and synaptotagmin 7. It is possible that synaptotagmin

7 may be involved in the transport of mRNA in dendrites of Purkinje cells, which is regulated

by protein SYNCRIP. We also analyzed the occurrence of proteins SYNCRIP and

synaptotagmin 7 in different anatomical areas of the brain with the method of

immunohistochemistry. The results of immunohistochemical staining suggest that both

proteins are present in most anatomical areas of the rat brain.

V Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI)….…………………..……III

KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)…...………………………………………IV

KAZALO VSEBINE…………………………………………….……………….……….V

KAZALO PREGLEDNIC………………………………………..……………….…….VII

KAZALO SLIK…………………………………………………………….….……….VIII

SLOVARČEK (POJMI IN OKRAJŠAVE)……………………….………….……….…..X

1 UVOD ............................................................................................................................... 1

2 PREGLED OBJAV ......................................................................................................... 2

2. 1.1 NEVRONI IN SINAPTIČNI PRENOS ................................................................... 2

2. 1.1.1 Sinaptični vezikli in večji optično gosti vezikli ....................................................... 2

2. 1.1.2 Od kalcija odvisna eksocitoza .................................................................................. 3

2. 1.1.3 Endocitoza ................................................................................................................ 4

2. 1.2 SINAPTOTAGMINI ................................................................................................. 5

2. 1.2.1 Zgradba sinaptotagmina ........................................................................................... 5

2. 1.2.2 Prisotnost sinaptotagmina v možganih ..................................................................... 6

2. 1.2.3 Različne izooblike sinaptotagmina ........................................................................... 6

2. 1.3 SINAPTOTAGMIN 7 ............................................................................................... 8

2. 1.3.1 Funkcionalna vloga sinaptotagmina 7 pri eksocitozi ............................................... 8

2. 1.3.2 Izražanje in prisotnost sinaptotagmina 7 ................................................................ 10

2. 1.3.3 Pojavljanje sinaptotagmina 7 na sinaptičnih in večjih optično gostih veziklih ...... 11

2. 1.3.4 Vloga sinaptotagmina 7 v patoloških procesih ....................................................... 12

2. 1.3.4.1 Fagocitoza ............................................................................................................ 12

2. 1.3.4.2 Popravilo membrane mišične celice .................................................................... 13

2. 1.3.4.3 Izločanje inzulina iz sekretornih β–celic trebušne slinavke ................................ 13

2. 1.3.4.4 Nevrodegenerativne bolezni ................................................................................ 13

2. 1.4 SINKRIP .................................................................................................................. 15

2. 1.5. PRENOS mRNA V DENDRITE NEVRONOV ................................................... 16

2. 1.5.1 mRNA ..................................................................................................................... 16

2. 1.5.2 Prenos granul mRNA v nevronih ........................................................................... 17

2. 1.6 ANATOMSKA PODROČJA PODGANJIH MOŽGANOV ............................... 21

2. 1.6.1 Možganska skorja ................................................................................................... 21

2. 1.6.2 Hipokampus ............................................................................................................ 22

2. 1.6.3 Mali možgani .......................................................................................................... 23

2. 1.6.4 Striatum in druga subkortikalna jedra bazalnih jeder ............................................. 24

3 MATERIALI IN METODE ......................................................................................... 25

3. 1.1 EKSPERIMENTALNE ŽIVALI ........................................................................... 25

3. 1.2 TRANSKARDIALNA PERFUZIJA ..................................................................... 25

3. 1.3 PRIPRAVA PROSTO PLAVAJOČIH MOŽGANSKIH REZIN ...................... 25

3. 1.4 IMUNOHISTOKEMIČNA LOKALIZACIJA PROTEINOV ........................... 26

3. 1.4.1 Analiza in zajem slike imunohistokemičnih preparatov ........................................ 28

3. 1.5 IMUNOFLUORESCENČNA LOKALIZACIJA PROTEINOV ........................ 31

3. 1.5.1 Analiza in zajem slike imunofluorescenčnih preparatov ........................................ 32

3. 1.5.2 Analiza kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP ............................. 33

3. 1.5.2.1 Pearsonov korelacijski koeficient ........................................................................ 35

VI Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


4 REZULTATI .................................................................................................................. 37

4. 1.1 LOKACIJA PROTEINOV SINAPTOTAGMIN 7 IN SINKRIP ....................... 37

4. 1.1.1 Protein sinaptotagmin 7 je prisoten v večini anatomskih področij ......................... 37

4. 1.1.2 Protein SINKRIP je prisoten v večini anatomskih področij ................................... 40

4. 1.1.3 Signal za protein sinaptotagmin 7 je najmočnejši v nevropilu ............................... 43

4. 1.1.4 Signal za protein SINKRIP je najmočnejši v somah celic ..................................... 46

4. 1.2 STOPNJA KOLOKALIZACIJE PROTEINOV SINAPTOTAGMIN 7 IN

SINKRIP JE NIZKA, RAZEN V PURKINJEJEVIH CELICAH MALIH

MOŽGANOV ..................................................................................................................... 49

4. 1.2.1 Kolokalizacija v hipokampusu ............................................................................... 49

4. 1.2.2 Kolokalizacija v skorji velikih možganov .............................................................. 51

4. 1.2.3 Kolokalizacija v striatumu ...................................................................................... 51

4. 1.2.4 Kolokalizacija v skorji malih možganov ................................................................ 52

5 RAZPRAVA ................................................................................................................... 55

5. 1.1 MOREBITNA VLOGA PROTEINOV SINKRIP IN SINAPTOTAGMIN 7 NA

PODLAGI UGOTAVLJANJA PRISOTNOSTI V MOŽGANSKIH PODROČJIH .. 55

5. 1.1.1 Hipokampus ............................................................................................................ 57

5. 1.1.2 Skorja velikih možganov ........................................................................................ 57

5. 1.1.3 Striatum .................................................................................................................. 58

5. 1.1.4 Skorja malih možganov .......................................................................................... 58

5. 1.1.5 Ostala anatomska področja ..................................................................................... 59

5. 1.2 NIZKA STOPNJA KOLOKALIZACIJE PROTEINOV .................................... 60

5. 1.3 UPORABA METODE DVOJNEGA IMUNOFLUORESCENČNEGA

OZNAČEVANJA .............................................................................................................. 61

6 SKLEPI .......................................................................................................................... 61

7 POVZETEK ................................................................................................................... 62

8 VIRI ................................................................................................................................ 63

ZAHVALA

PRILOGA

VII Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


KAZALO PREGLEDNIC

Pregl. 1: Primarna in sekundarna protitelesa ter neimuni serumi za imunohistokemično

dokazovanje proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v možganskih rezinah. .................... 27

Pregl. 2: Optimizacija razredčitev primarnih protiteles za imunohistokemično dokazovanje

proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v možganskih rezinah in optimalne razredčitve

primarnih ter sekundarnih protiteles. ................................................................................... 28

Pregl. 3: Primarna in sekundarna protitelesa ter neimuni serumi za imunofluorescenčno

dokazovanje proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v možganskih rezinah. .................... 32

Pregl. 4: Optimizacija razredčitev primarnih protiteles za imunofluorescenčno dokazovanje

proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v možganskih rezinah in optimalne razredčitve

primarnih ter sekundarnih protiteles. ................................................................................... 32

Pregl. 5: Vrednosti Pearsonovega koeficienta za posamezno področje hipokampusa. ...... 49

VIII Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


KAZALO SLIK

Sl. 1: Kemična sinapsa. ......................................................................................................... 2

Sl. 2: Eksocitoza. ................................................................................................................... 3

Sl. 3: Tvorba fuzijske pore v štirih korakih in proteini sinaptičnega vezikla ter presinaptične

membrane nevrona. ............................................................................................................... 4

Sl. 4: Zgradba sinaptotagmina. .............................................................................................. 5

Sl. 5: Interakcija med proteini SNARE in SIT 7 med Ca2+ odvisno eksocitozo ................... 8

Sl. 6: SIT 7 je v nevronih prisoten na lizosomih. ................................................................ 11

Sl. 7: SIT 7 je v celicah PC12 prisoten na večjih optično gostih veziklih. ......................... 12

Sl. 8: SINKRIP je prisoten v granulah mRNA. . ................................................................. 15

Sl. 9: mRNA se v dendrite prenaša s pomočjo granul mRNA. .......................................... 18

Sl. 10: Možganska skorja. ................................................................................................... 21

Sl. 11: Hipokampus. ............................................................................................................ 22

Sl. 12: Zgradba malih možganov. ........................................................................................ 23

Sl. 13: Vzdolžni prerez podganjih možganov, bazalna jedra. ............................................. 24

Sl. 14: Drsni mikrokriotom in zamrznjeni možgani. ........................................................... 26

Sl.15: Prikaz anatomskih področij možganov podgane, koronarni prerez možganov -3,24

mm od bregme. .................................................................................................................... 29

Sl. 16: Prikaz anatomskih področij možganov podgane, koronarni prerez možganov 1,56

mm od bregme. .................................................................................................................... 29

Sl. 17: Prikaz anatomskih področij možganov podgane, koronarni prerez možganov -10,32

mm od bregme. .................................................................................................................... 30

Sl. 18: Mikroskop AxioImager.Z1 z dodatkom ApoTome ................................................. 33

Sl. 19: Shema anatomskih področij, v katerih smo določali kolokalizacijo proteinov,

koronarni prerezi možganov. ............................................................................................... 34

Sl. 20: Fluorogrami različnih tipov kolokalizacije. ............................................................. 36

Sl. 21: Sinaptotagmin 7 je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov

-3,24 mm od bregme. . ......................................................................................................... 38


1,56 mm od bregme. . .......................................................................................................... 38


-10,32 mm od bregme. . ....................................................................................................... 39

IX Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


Sl. 24: SINKRIP je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov -3,24

mm od bregme. .................................................................................................................... 41

Sl. 25: SINKRIP je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov 1,56

mm od bregme. .................................................................................................................... 41

Sl.26: SINKRIP je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov -10,

32 mm od bregme. ............................................................................................................... 42

Sl. 27: Sinaptotagmin 7 je najbolj prisoten v nevropilu vseh področij hipokampusa. ........ 44

Sl. 28: Sinaptotagmin 7 je najbolj prisoten v nevropilu možganske skorje, matriksa striatuma

in skorje malih možganov. .................................................................................................. 45

Sl. 29: SINKRIP je prisoten v večini som celic vseh področij hipokampusa. .................... 47

Sl. 30: SINKRIP je najbolj prisoten v somah celic skorje velikih možganov, matriksa

striatuma in skorje malih možganov. ................................................................................... 48

Sl. 31: Nizka stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v CA1, CA3 ter

dentatnem girusu hipokampusa. .......................................................................................... 50

Sl. 32: Nizka stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v skorji velikih

možganov. ........................................................................................................................... 51

Sl. 33: Nizka stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v striatumu . 52

Sl. 34: Sinaptotagmin 7 in SINKRIP sta prisotna v Purkinjejevih celicah.......................... 53

Sl. 35: Stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v skorji malih

možganov. ........................................................................................................................... 53

Sl. 36: Visoka stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v somah

Purkinjejevih celic in prisotnost obeh proteinov v dendritih. .............................................. 54

Sl. 37: Zgradba skorje malih možganov. Dendriti Purkinjejevih celic segajo v molekularno

plast. ..................................................................................................................................... 59

X Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


SLOVARČEK (POJMI IN OKRAJŠAVE)

Bleedthrough fluorescenčna emisija

BSA goveji serumski albumin

C2A, C2B Ca2+ vezavni podenoti sinaptotagmina

D1, D2 dopaminska receptorja

DA dopaminski

DAB substrat encima hrenove peroksidaze 3'3-diaminobenzidin

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DTE dendritični tarčni elementi (angl. "dendritic targeting elements")

EPN entopedunkularno jedro (angl. "entopeduncular nuclei")

EV zunajcelični vezikli

Fluorogram razsevni graf moči sivin slikovnih točk dveh izbranih kanalov

FMRP protein sindroma lomljivega kromosoma X

(angl. "fragile X mental retardation protein")

FXS sindrom lomljivega kromosoma X (angl. "fragile X syndrome")

GABA γ-aminomaslena kislina

GPe eksterni palidum (angl. "globus pallidus external")

JACoP vmesnik za izračun kolokalizacije

(angl. "Just Another Colocalization Plugin")

KA kainat

KIF družina motoričnih proteinov kinezina (angl. "kinesin superfamily")

KPBS kalij-fosfatni pufer

LDCV veliki mešički z elektronsko gosto notranjostjo oz. večji optično gosti

vezikli (angl. "large dense-core vesicles")

XI Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


L-DOPA Levodopa

LTP signal (angl. "long-term potentiation")

6-OHDA 6-hidroksidopamin

M1 in M2 Mandersova koeficienta

´model 6-OHDA´

model enostranske denervacije striatuma s 6-OHDA

mRNA obveščevalna ribonukleinska kislina

OT olfaktorni tuberkul

PBS natrij-fosfatni pufer

PCR verižna reakcija s polimerazo (angl. "Polymerase Chain Reaction")

PI pilokarpin hidroklorid

Pixel slikovna točka

PK Pearsonov korelacijski koeficient

RNP RNA-vezavni proteini (angl. "trans-acting RNA-binding proteins")

ROI območje analize (angl. "region of interest")

STR striatum

SINKRIP citoplazemski RNA-vezavni protein, ki se veže na sinaptotagmin

(angl. "Synaptotagmin-binding, Cytoplasmic RNA-Interacting Protein")

SN črno jedro (lat. "substantia nigra")

SNARE topni NSF vezavni receptor (angl. "soluble NSF attachment receptor")

SNc kompaktni del črnega jedra (angl. "substantia nigra pars compacta")

SNr retikulatni del črnega jedra (angl. "substantia nigra pars reticulate")

1 Jerenko A. Kolokalizacija proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v možganih podgane.


1 UVOD

Sinaptotagmin (SIT) je sinaptični protein (poznamo 17 njegovih izooblik), ki sodeluje pri

regulaciji izločanja nevrotransmiterjev. Sodeluje pri spremembah nevrotransmisije (prenosu

živčnih signalnih molekul, npr. dopamina), pri gibanju, učenju, uporabi drog, patoloških

spremembah možganov (npr. parkinsonovi bolezni) ... Sinaptotagmin sproži od kalcija

odvisno ali neodvisno interakcijo z molekulami, ki sodelujejo pri membranski fuziji in

posledično pri eksocitozi in endocitozi sinaptičnih veziklov. SINKRIP je mRNA-vezavni

protein, ki se veže na protein sinaptotagmin. Prenos mRNA v dendrite poteka s pomočjo

granul RNA, nekateri raziskovalci dopuščajo možnost, da tak prenos poteka s pomočjo

veziklov. Prenos molekul mRNA v dendrite nevronov (v dendrite potujejo tudi encimi, na

primer za sintezo nevrotransmiterjev) zagotavlja hitrejše lokalno prepisovanje specifičnih

proteinov, ki so potrebni za tvorbo novih sinaps. Pri prenosu mRNA v dendrite verjetno

sodeluje protein SINKRIP, vendar je njegova natančna vloga v nevronih nepoznana. Z

raziskavami in vitro so pokazali, da se protein SINKRIP veže na protein sinaptotagmin 7.

Sinaptotagmin 7 je protein, udeležen pri procesih eksocitoze večjih optično gostih veziklov

ter lizosomov v nevronih. Pokazali so, da ima sinaptotagmin 7 vlogo v patoloških procesih

nevrodegeneracije, za katere je med drugim značilna okvarjena sposobnost tvorbe sinaps.

Nekateri raziskovalci domnevajo, da ima sinaptotagmin 7 zaradi sposobnosti vezave s

proteinom SINKRIP morebitno vlogo pri prenosu mRNA v dendrite nevronov. Narejena ni

bila še nobena raziskava in vivo, ki bi raziskala morebitno interakcijo obeh proteinov v

nevronih.

Namen magistrske naloge je bil raziskati kolokalizacijo (pojavljanje na istem mestu)

proteinov SINKRIP in sinaptotagmin 7 v nevronih v različnih anatomskih področjih

možganov laboratorijske podgane (Rattus norvegicus). V primeru, da sta oba proteina v

nevronih skupaj, obstaja možnost za njuno fiziološko interakcijo. Možgane podgan smo

transkardialno perfundirali s fiksativom, jih narezali ter pobarvali z metodo dvojne

imunofluorescence z uporabo specifičnih protiteles proti preučevanima proteinoma. Z

uporabo fluorescenčnega mikroskopa Apotom smo analizirali kolokalizacijo obeh proteinov

v različnih anatomskih področjih možganov. Prav tako smo preučili prisotnost proteinov

SINKRIP in sinaptotagmin 7 v različnih anatomskih področjih možganov z metodo

imunohistokemije.

Hipoteze:

1. Protein SINKRIP je kolokaliziran s proteinom sinaptotagmin 7 v nevronih možganov

podgane.

2. Proteina SINKRIP in sinaptotagmin 7 sta prisotna v večini anatomskih področij

možganov podgane.



2 PREGLED OBJAV

2. 1.1 NEVRONI IN SINAPTIČNI PRENOS

Nevroni spadajo med polarizirane celice, njihova membrana je napetostno odvisna. Zgrajeni

so iz some (celičnega telesa), jedra, aksona in dendritov. Dendriti so specializirani za

sprejemanje in izločanje signalnih molekul, na svoji membrani imajo številne receptorje.

Proteini se izločijo iz celice skozi membrano, tako celice med seboj komunicirajo (Alberts

in sod., 1994). Obstajata dva tipa povezav med celicami, kemične in električne sinaptične

špranje (Pollard in Earnshaw, 2004). Presinaptična membrana enega nevrona in

postsinaptična membrana drugega nevrona sta ločeni s kemično sinaptično špranjo (v

nadaljevanju sinapsa), široko od 20 do 50 nm (sl. 1). Sinapsa je napolnjena s sinaptičnimi

vezikli, ki vsebujejo živčni prenašalec (v nadaljevanju nevrotransmiter), kemično snov, s

katero informacija potuje do postsinaptične membrane. Izločanje nevrotransmiterja sproži

akcijski potencial aksona. Depolarizacija sproži odprtje napetostno odvisnih kalcijevih

kanalčkov. Kalcijevi ioni (Ca2+) začnejo skoznje vdirati v nevrone. Povečana koncentracija

kalcijevih ionov je signal za izločanje nevrotransmiterja iz sinaptičnih veziklov. To

imenujemo eksocitoza (Bear in sod., 2006). Eksocitoza poteka izredno hitro, v 1 ms (Kandel

in sod., 2000).

Slika 1: Kemična sinapsa (prilagojeno po Bear in sod., 2006: 114)

2. 1.1.1 Sinaptični vezikli in večji optično gosti vezikli

Sinaptični vezikli so samostojni celični organeli, veliki okoli 40 nm, ključni za prenos

nevrotransmiterjev v nevronih. Vsak presinaptični del nevrona vsebuje na stotine sinaptičnih

veziklov z nevrotransmiterji, ki se iz njih sprostijo z od Ca2+ odvisno eksocitozo (Südhof in

Rizo, 2011). Nevrotransmiterji so snovi, ki se prenašajo preko sinapse in nanjo vplivajo.

Poznamo več vrst nevrotransmiterjev: aminokisline, biogeni amini in peptidi (Kandel in sod.,



2000). Na membrani sinaptičnih veziklov najdemo proteine s specifično vlogo. Njihova

vloga je, da prevzemajo nevrotransmiterje iz citosola ter sodelujejo pri zlivanju membrane

vezikla in membrane celice (Pollard in Earnshaw, 2004).

Peptidni nevrotransmiterji so v velikih mešičkih z elektronsko gosto notranjostjo (LDCV,

angl. "large dense-core vesicles", v nadaljevanju večji optično gosti vezikli). Ti so veliki

okoli 100 nm (Bear in sod., 2006) in so vrsta sekretornih zrnc, ki jih najdemo v različnih

vrstah celic, npr. nevronih, eksokrinih in endokrinih celicah, krvnih celicah, endotelijskih

celicah. Tudi eksocitoza večjih optično gostih veziklov poteka v odvisnosti od kalcijevih

ionov, njihova sinteza pa se razlikuje od sinteze sinaptičnih veziklov (Burgoyne in Morgan,

2003).

2. 1.1.2 Od kalcija odvisna eksocitoza

Ločimo prehodno in popolno od kalcija odvisno eksocitozo. V primeru, da celica dobi nekaj

milisekund dolg signal in je koncentracija kalcijevih ionov visoka, poteče prehodna (angl.

"kiss and run") eksocitoza (sl. 2a). Pri tem se vezikel in celica ne zlijeta popolnoma, nastane

fuzijska pora. Ko je signal dolg nekaj sekund in koncentracija kalcijevih ionov manjša (okoli

50 µM), poteče popolna (angl. "full fusion") eksocitoza. Pri tem se vezikel in celica

popolnoma zlijeta (sl. 2b) (Moghadam in Jackson, 2013).

Slika 2: Eksocitoza. (a) Prehodna eksocitoza (b) Popolna eksocitoza

(prilagojeno po Moghadam in Jackson, 2013: 4)

Tvorba fuzijske pore se začne z enim samim kanalčkom, ki poveže membrano sinaptičnega

vezikla in membrano nevrona. Zlivanje membrane vezikla in membrane nevrona se začne

že 5 ms po začetku dražljaja, vse skupaj pa traja le 2 ms (Kandel in sod., 2000). Tvorba

fuzijske pore poteka v štirih korakih in je prikazana na sl. 3. Najprej pride do pritrditve

sinaptičnega vezikla s citoskeletom končiča nevrona, torej mobilizacije (1). Sledi prenos (2)

sinaptičnega vezikla na aktivno cono izločanja nevrotransmiterja. Naslednja je priprava za

izločanje oz. razširitev fuzijske pore (3) in nato izločanje sinaptičnega vezikla skozi fuzijsko

poro (4) (Kandel in sod., 2000).



Sinapsini so proteini sinaptičnega vezikla, ki so ključni pri mobilizacji. Pri prenosu

sinaptičnega vezikla na aktivno cono sodelujejo proteini Rab. VAMP (sinaptobrevin),

SNAP-25, sinaptotagmin (v nadaljevanju SIT) na membrani sinaptičnega vezikla in

sintaksin na presinaptični membrani nevrona pa so proteini, ki sodelujejo pri pripravi na

izločanje in pri izločanju nevrotransmiterjev. VAMP (sinaptobrevin), SNAP-25 in sintaksin

so tarče nekaterih živčnih strupov, kot sta tetanus in botulinum toksin, ki preko teh proteinov

lahko vplivajo na izločanje nevrotransmiterja (Kandel in sod., 2000). Nekateri proteini

sinaptičnega vezikla in presinaptične membrane nevrona so prikazani na sl. 3.

Slika 3: Tvorba fuzijske pore v štirih korakih in proteini sinaptičnega vezikla ter presinaptične membrane

nevrona (prilagojeno po Kandel in sod., 2000: 245)

2. 1.1.3 Endocitoza

Z endocitozo celica privzema makromolekule, med drugim tudi nevrotransmiterje. Poteka

na enak način kot eksocitoza. Makromolekule še pred privzemom v celico obda manjši del

plazmaleme, ki se nato uviha in se nato kot vezikel odcepi v notranjost celice. Obstajata dve

vrsti endocitoze. Prvega imenujemo pinocitoza ali celično pitje. Gre za privzemanje tekočine

z raztopljenimi snovmi iz zunajceličnega prostora. Drugi je receptorsko uravnavana

endocitoza, s katero celica privzema specifične makromolekule (Pollard in Earnshaw, 2004).

Endocitozo omogočajo prevlečene jamice na površini veziklov, ki vsebujejo klatrin (angl.

"coated pit"). Te prevlečene jamice sestavljata dve komponenti: klatrinski del in AP-2

kompleks (angl. "adaptor protein complex") (von Poser in sod., 2000).



2. 1.2 SINAPTOTAGMINI

Sinaptotagmin (SIT) je transmembranski protein (Kandel in sod., 2000), pomemben pri

tvorbi fuzijske pore pri eksocitozi, odvisni od kalcija. Deluje kot senzor za povečano

koncentracijo kalcijevih ionov. Odkrili so ga pred več kot dvajsetimi leti, prva je bila odkrita

izooblika SIT 1 (Burgoyne in Morgan, 2003). Pri vretenčarjih je poznanih 17 izooblik SIT,

pri metazojih 3 (SIT 1, 4 in 7). To nakazuje, da so te 3 izooblike evolucijsko najbolj

ohranjene (Liu in sod., 2014). Naprej so izooblike razdeljene na poddružine, ki so si po

zgradbi bolj podobne: SIT 1, 2 in 9 tvorijo eno poddružino, SIT 3, 5, 6, 10 drugo ter SIT 4,

11 tretjo poddružino. Ostale izooblike niso razdeljene v poddružine (Fukuda, 2006).

2. 1.2.1 Zgradba sinaptotagmina

Sinaptotagmin je zgrajen iz dveh delov, kratkega znotrajceličnega (okoli 70 aminokislin

(Fukuda, 2006)) ter daljšega zunajceličnega oz. citoplazemskega dela. Znotrajcelični del

imenujemo tudi N-terminalna transmembranska domena (NTD). Citoplazemski del ima dve

Ca2+ vezavni podenoti C2, C2A in C2B (Andrews in Chakrabarti, 2005). Ti sta homologni

C2 podenotam različnih protein kinaz C in fosfolipaz A2 (Burgoyne in Morgan, 2003). C2A

in C2B sta povezani s kratko povezujočo sekvenco. Obe podenoti C2 imata sendvič zgradbo

dveh štirislojnih β-ravnin (angl. "β-sheet"). Pri usmerjanju kalcijevih ionov je

najpomembnejši del Asp (angl. "conserved acidic residues") v zanki C2B podenote. Mesto

vezave ionov na C2 področji se med izooblikami SIT razlikuje, oblika vezave pa je vedno

ista - v obliki žepka (Andrews in Chakrabarti, 2005).

Slika 4: Zgradba sinaptotagmina (prilagojeno po Andrews in Chakrabarti, 2005: 2)

Obe C2 podenoti se vežeta na fosfolipide v membrani nevrona. SIT je negativni in pozitivni

regulator izločanja nevrotransmiterja. Kot negativni preprečuje tvorbo fuzijske pore in

izločanje, če ni povečanja koncentracije kalcijevih ionov. Kot pozitivni sodeluje pri tvorbi

fuzijske pore, če je koncentracija kalcijevih ionov povečana (Kandel in sod., 2000).



2. 1.2.2 Prisotnost sinaptotagmina v možganih

SIT 1, 3, 4, 5, 7, 11, 12, 13 so prisotni v večini možganskih področij, medtem ko so SIT 2,

6, 9, 10 specifični, prisotni le v določenih možganskih anatomskih področjih. Prepisovanje

mRNA SIT 1-5, 10, 11, 13 je vezano predvsem na nevrone. SIT 1 je najpogostejša izooblika,

najbolj specifična za določena področja pa je izooblika SIT 2. Ti izoobliki sta delno

komplementarni, SIT 1 je pogostejši v rostalnem področju, SIT 2 v kavdalnem področju

možganov. Vzorca izražanja mRNA SIT 11 in 4 v možganih se prekrivata. V CA1 področju

hipokampusa so v nevronih najpogostejše izooblike SIT 1, 4, 5 in 11, v astrocitih tega

področja pa sta bolj izraženi izoobliki SIT 4, 7. Na sinaptičnih veziklih so zaznali največ SIT

1, 2, 9, 12, na plazemski membrani pa SIT 3, 6, 7. Znotrajcelična prisotnost SIT 10 in 11 za

zdaj še ni znana (Glavan in sod., 2009).

2. 1.2.3 Različne izooblike sinaptotagmina

SIT 1 je najbolj raziskana ter v živčnem in endokrinem sistemu najpogostejša (Moghadam

in Jackson, 2013) izooblika SIT. Veže tri kalcijeve ione na C2A podenoti, dva na C2B

podenoti. Je na površju sinaptičnih veziklov (Andrews in Chakrabarti, 2005) in na večjih

optično gostih veziklih nevroendokrinih celic ter ob pojavu Ca2+ odvisnega signala sproži

zlitje sinaptičnega vezikla v procesu hitre eksocitoze (Moghadam in Jackson, 2013) s

sinaptično membrano nevrona preko aktivacije proteinov SNARE (sintaksin-1a, SNAP-25

in VAMP-2/sinaptobrevin-2 ali PIP2 (fosfatidilinozitol 4,5-bifosfat)) (Fukuda, 2006). Brez

vezave na Ca2+ odvisne ligande, kot so fosfolipidi, je verjetnost vezave Ca2+ na SIT 1 zelo

majhna (Andrews in Chakrabarti, 2005). SIT 2 je bil zaznan v hipotalamusu, najverjetneje

deluje kot Ca2+ senzor (Moghadam in Jackson, 2013).

SIT 3, 5 in 6 so prisotni samo pri vretenčarjih. SIT 5 in 6 sta večinoma prisotna na sekretornih

veziklih, SIT 3 bolj na presinaptični membrani. Slednji deluje kot Ca2+ senzor za eksocitozo

nevrotransmiterjev, SIT 5 deluje kot Ca2+ senzor za eksocitozo specifičnih večjih optično

gostih veziklov v možganih, SIT 6 pa ima pomembno vlogo pri akrosomski reakciji. To je

specifična reakcija od Ca2+ odvisne eksocitoze pri moški spolni celici (Andrews in

Chakrabarti, 2005).

SIT 4 je v največji meri zaznan v Golgijevem aparatu ter končičih aksonov in dendritov na

novo rastočih nevronov. Pri zrelih nevronih njegova prisotnost v aksonih in dendritih skoraj

izgine (Andrews in Chakrabarti, 2005). Najdemo ga predvsem na membrani še nezrelih

sekretornih veziklov, ni pa prisoten na membrani večjih optično gostih veziklov. Vpliva na

dozorevanje nezrelih sekretorenih veziklov, količina SIT 4 pa vpliva tudi na njihovo velikost

(Moghadam in Jackson, 2013).

SIT 9 je soroden SIT 1, najdemo ga na večjih optično gostih veziklih nevroendokrinih celic

PC12 ter inzulin sekretornih β–celicah trebušne slinavke (Moghadam in Jackson, 2013).



SIT 10 se izraža po epileptičnih napadih, induciranih s kainatom, kje točno je, še ni znano

(Andrews in Chakrabarti, 2005).

SIT 11 je soroden SIT 9. O njem je znano, da interagira s proteinom Parkin, to je avtosomalni

recesivni juvenilni produkt gena za parkinsonovo bolezen (Andrews in Chakrabarti, 2005).

Ugotovili so (Duque in sod., 2014) tudi, da je vpleten v fagocitozo pri makrofagih.

SIT 8, 12, 13, 14, 15 nimajo Ca2+ odvisne vezave na fosfolipide v celični membrani. SIT 12

je najbolj izražen v možganih, njegova koncentracija pa je odvisna od tiroidnih hormonov.

Pomemben je za nastanek LTP (angl. "long-term potentiation") v hipokampusu (Kaeser-

Woo in sod., 2013). SIT 8 ima tako kot SIT 6 pomembno vlogo pri akrosomski reakciji, saj

v odvisnosti od Ca2+ interagira s sintaksin-2. Druge izooblike SIT še niso dobro raziskane

(Fukuda, 2006).

Izooblika, ki se pojavi na sekretornem veziklu, določa, kakšen Ca2+ odvisen signal bo sprožil

fuzijo vezikla z membrano, ali bo eksocitoza prehodna ali popolna ter količino molekul, ki

se sprosti iz vezikla (Moghadam in Jackson, 2013).



2. 1.3 SINAPTOTAGMIN 7

2. 1.3.1 Funkcionalna vloga sinaptotagmina 7 pri eksocitozi

SIT 7 je vpleten v evolucijsko ohranjene dogodke vzpostavljanja fuzijskih por. Lokalizirali

so ga na membranah določenih sekretornih veziklov. SIT 7 ima specifično, in povsod kjer

je, enako vlogo eksocitoze sekretornih veziklov v odvisnosti od Ca2+. Citoplazemski

kalcijevi ioni se vežejo na C2 podenoti SIT 7 v membrani sekretornega vezikla. To povzroči

vezavo SIT 7 na fosfolipide in proteine SNARE v sinaptični membrani nevrona. C2 podenoti

predreta lipidni dvosloj in s proteini SNARE vijačne oblike oblikujeta fuzijsko poro. Na sl.

5 sta prikazani dve molekuli SIT 7, lahko pa tvorijo oligomere. V tem primeru lahko omejijo

širjenje fuzijske pore. SIT 7, ki je večinoma vključen v eksocitozo lizosomov, interagira z

v-SNARE (VAMP-7), t-SNARE (sintaksin-4 in SNAP-23). Interakcija je prikazana na sl. 5

(Andrews in Chakrabarti, 2005).

Slika 5: Interakcija med proteini SNARE in SIT 7 med Ca2+ odvisno eksocitozo

(prilagojeno po Andrews in Chakrabarti, 2005: 2)

SIT 7 sodeluje pri počasni in nesinhroni eksocitozi (Bacaj in sod., 2013). Če bo potekla

prehodna ali popolna eksocitoza, je odvisno od izooblike SIT. Afiniteta SIT 7 do Ca2+ je ob

vezavi na Ca2+ odvisne ligande, kot so fosfolipidi, večja kot pri SIT 1, tako je SIT 7 aktiviran

ob manjši koncentraciji kalcijevih ionov kakor SIT 1. SIT 7 prej sproži popolno eksocitozo,

kar je pomembno za eksocitozo od membrane oddaljenih sekretornih veziklov. SIT 1 pa prej

sproži prehodno eksocitozo, pomembno za eksocitozo veziklov blizu membrane. Kinetika

kalcijev ion - SIT 7 kompleksa je počasnejša kot kinetika kompleksa kalcijev ion - SIT 1

(Moghadam in Jackson, 2013).



Na klatrinski prilagojevalni protein AP-2 se preko podenote C2B SIT 7 močno veže in je

glede na to vključen ne samo v proces eksocitoze, ampak tudi v proces endocitoze. Njegova

vloga pri endocitozi je podobna kot pri eksocitozi (von Poser in sod., 2000).

Izražanje SIT 7 je odvisno od vezave Ca2+. Če je onemogočena vezava Ca2+ na obe C2

podenoti SIT 7, se izražanje SIT 7 izrazito zmanjša. V kolikor je onemogočena vezava Ca2+

na C2B podenoto, se izražanje SIT ne spremeni (Maximov in sod., 2007). Pri vezavi Ca2+

na SIT 7 je C2B podenota pomembnejša ob C2A (Schonn in sod., 2008). Od SIT 7 je odvisno

širjenje fuzijske pore v procesu eksocitoze. Pri prehodni eksocitozi v celicah, kjer je prisoten,

se pora razširi do 30 nm, pri celicah, ki ga ne izražajo, pa se sekretorni vezikli popolnoma

zlijejo z membrano (Andrews in Chakrabarti, 2005). C2 podenoti SIT 7 različno vplivata na

širjenje fuzijske pore. Obe podenoti vzpostavita odprtje fuzijske pore, C2B pa je tista, zaradi

katere je fuzijska pora stabilna in široka. Tudi brez C2B podenote C2A podenota sproži

vzpostavitev, vendar so v tem primeru fuzijske pore ozke in labilne. Največ raziskav SIT 7

je bilo narejenih na sinapsah, fuzijske pore pa je tam težko natančno študirati, zato so

raziskave (Segovia in sod., 2010) vpletenosti SIT 7 v fuzijskih porah potekale na

nevroendokrinih celicah in v večini na celičnih kulturah.

Za Ca2+ odvisno endocitozo in eksocitozo sekretornih veziklov in vzpostavitev fuzijske pore

je potreben fosfatidilinozitol bifosfat (PtdIns(4,5)P2). SIT 7 se ob odsotnosti Ca2+ nanj veže

s C2B podenoto, če je Ca2+ prisoten, pa z obema C2 podenotama. Brez vezave na

fosfatidilinozitol bifosfat hitra in učinkovita vzpostavitev fuzijske pore ne bi bila mogoča

(Osborne in sod., 2007).

Obnovitev sinaptičnega vezikla po eksocitozi in endocitozi vpliva na učinkovitost

prenašanja nevrotransmiterjev v primeru zaporednih dražljajev. Obnovitev sinaptičnega

vezikla poteka v odvisnosti od SIT 7. Alternativno izrezovanje mRNA SIT 7 lahko bodisi

pospeši ali upočasni obnovitev. Na celični kulturi hipokampusnih nevronov so ugotovili

(Virmani in sod., 2003), da krajša oblika SIT 7 brez C2 podenot pospeši obnovitev, daljša

oblika pa jo upočasni. V obnovitev je vključen tudi kalmodulin. Kalmodulin veže Ca2+ in

skupaj s SIT 7 tvori Ca2+ vezavni kompleks. Ta kompleks sodeluje pri ponovni obnovitvi

sinaptičnega vezikla po eksocitozi. Pri obnovitvi sinaptičnega vezikla se s kalmodulinom

veže tudi Munc 13-1. Če se Munc 13-1 veže istočasno s SIT 7, še ni raziskano. SIT 1, 2, 4,

9 in 10 izooblike tega kompleksa niso tvorile (Liu in sod., 2014).

Eksocitoza večjih optično gostih veziklov nevroendokrinih celic PC12, ki vsebujejo SIT 7,

tako kot eksocitoza sinaptičnih veziklov, poteka v odvisnosti od Ca2+ (Fukuda in sod., 2004).

Raziskave (Tsuboi in Fukuda, 2007) so potrdile, da SIT 7 ne usmerja prenosa (angl. "docking

step") in razporeditve večjih optično gostih veziklov v teh celicah, ampak sodeluje pri

kinetiki (vzpostavljanju, razširjanju in trajanju odprtja) fuzijske pore ter posledično pri

izločanju hormonov iz nevroendokrinih celic PC12. Membrani večjega optično gostega

vezikla in celice PC12 se pri tem popolnoma zlijeta.



Uravnavanje usmerjanja veziklov v različne endocitozne oz. eksocitozne poti naj bi bilo po

enem od teoretičnih modelov odvisno od razmerja med oblikami SIT 7 z različno dolgo

povezujočo sekvenco. Kratke spojitvene oblike SIT 7 npr. zavrnejo od klatrina odvisno

endocitozo (von Poser in sod., 2000).

2. 1.3.2 Izražanje in prisotnost sinaptotagmina 7

Izražanje in prepisovanje gena za SIT 7 in drugih proteinov sinaptičnih veziklov je odvisno

od metilacije aminokisline lizin na tretjem histonu. Tretiranje z retinoično kislino zavira

izražanje tega gena (Ekici in sod., 2008).

SIT 7 se pri podgani izraža v malih koncentracijah v črevesju, ledvicah, trebušni slinavki,

srcu, pljučih, hrbtenjači. V višjih koncentracijah kakor pri teh neživčnih tkivih pa je bila

koncentracija mRNA SIT 7 zaznana v velikih in malih možganih ter v vohalnem bulbusu. V

možganih je bila zaznana že obdelana mRNA SIT 7, v ostalih pa 65 kDa velika, še

neobdelana oblika mRNA SIT 7a (Andrews in Chakrabarti, 2005). V mišjih možganih se

oblike SIT 7 z večjo molekulsko maso pričnejo izražati šele v postnatalnem obdobju, v 3.

tednu pa postanejo v prednjem delu možganov najpogostejše oblike SIT 7 (Fukuda in sod.,

2002). Različna anatomska področja v možganih podgane izražajo različni profil oblik SIT

7 (Sugita in sod., 2001).

SIT 7 se na začetku razvoja organizma izraža drugače, kot kasneje v življenju. Vedno je

prisoten v vseh delečih se celicah, med njimi so npr. trajne linije rakavih celic (Maximov in

sod., 2007). Znotrajcelično je bilo njegovo pojavljanje zaznano v sinaptičnih veziklih in

presinaptični membrani nevronov in nevroendokrinih celic, na večjih optično gostih veziklih

endokrinih celic, na membrani lizosomov in večjih optično gostih veziklih (Andrews in

Chakrabarti, 2005) fibroblasta (Fukuda, 2006).

SIT 7 najdemo med molekulami, ki sestavljajo tesne stike1 (Tang, 2006).

SIT 7 ni prisoten pri mušicah, kar je v nasprotju s tem, da bi naj imel pomembno vlogo pri

eksocitozi (Andrews in Chakrabarti, 2005). To je razložljivo s tem, da ne sodeluje pri hitri

in sinhroni, temveč pri počasni in nesinhroni eksocitozi (Moghadam in Jackson, 2013).

1 Tesni stiki (angl. "tight junction") so specializirana vrsta interakcije membran dveh epitelijskih celic (Tang,

2006).



2. 1.3.3 Pojavljanje sinaptotagmina 7 na sinaptičnih in večjih optično gostih veziklih

Da je SIT 7 prisoten na sekretornih veziklih, je bilo raziskano na podganjih celicah ter

potrjeno še na mišjih, človeških in celicah hrčka (Andrews in Chakrabarti, 2005).

SIT 7 ima pomembno vlogo v kromafinskih celicah2, kje je eksocitoza ob njegovi odsotnosti

signifikantno zmanjšana (Schonn in sod., 2008). Pri nevronih je SIT 7 najbolj prisoten v

dendritih presinaptičnih celic oz. presinaptični aktivni coni (Andrews in Chakrabarti, 2005).

V teh celicah interagira z glikoproteinom 1 (Lamp1)/VAMP7 na membrani lizosoma, kar je

prikazano na sl. 6 (Arantes in Andrews, 2006).

Slika 6: SIT 7 je v nevronih prisoten na lizosomih. (a) Označen glikoprotein 1(Lamp1)/VAMP7 prisoten na

lizosomih (b) Z green fluorescenčnim proteinom označen SIT 7 (c) Lamp1/VAMP7 in SIT 7 označena

skupaj (prilagojeno po Arantes in Andrews, 2006: 5)

Njegovo znotrajcelično pojavljanje kaže tudi na njegovo vlogo pri prenosu sinaptičnih

veziklov v dendrite (Monterrat in sod., 2007), kajti prisotnost SIT 7 na plazemski membrani

je bila dokazana z elektronsko mikroskopijo (Sugita in sod., 2001). Vloga SIT 7 pri prenosu

sinaptičnih veziklov z nevrotransmiterji iz some v dendrite je bila dokazana na primeru

prenosa dopamina. Ko pride do znižanega izražanja SIT 7, se zmanjša koncentracija

dopamina v somi in dendritih celice. Za izločanje nevrotransmiterja iz sinaptičnih veziklov

je SIT 7 nujno potreben (Mendez in sod., 2011).

Prisotnost SIT 7 je bila dokazana (Fukuda in sod., 2004) tudi na večjih optično gostih

veziklih celic PC12, kar je prikazano na sl. 7.

2 Kromafinske celice (angl. "Cromaffin cells") so nevroendokrine celice sredice nadledvične žleze, ki so pod

nadzorom simpatičnega živčnega sistema. Ko jih ta spodbudi, izločijo skozi fuzijske pore v večjih optično gostih

veziklih kateholemine in nevropeptide (Fulop in sod., 2005).



Slika 7: SIT 7 je v celicah PC12 prisoten na večjih optično gostih veziklih. (a) Z green fluorescenčnim

proteinom označen SIT 7 (b) Označen Rab3A, prisoten na večjih optično gostih veziklih (c) Rab3A in SIT 7

označena skupaj (prilagojeno po Fukuda in sod., 2004: 2)

Dokazali so (Fukuda in sod., 2004), da je SIT 7 prisoten na nekaterih znotrajceličnih

strukturah, kot je membrana Golgijevega aparata in je kolokaliziran s SIT 1 in 9, ne pa s SIT

4. Povezan je z endokrinimi inzulin sekretornimi β-celicami trebušne slinavke podgan.

Izločanje inzulina iz teh celic poteka v odvisnosti od Ca2+, vloga SIT 7 je pri tem ključna

(Gao in sod., 2000). Zraven SIT 5 in 8 je SIT 7 najbolj prisotna izooblika SIT pri Ca2+ odvisni

eksocitozi inzulina in je prisotna na večjih optično gostih veziklih teh celic, ki vsebujejo

inzulin (Gut in sod., 2001). Pojavlja se tudi skupaj z Rab7 na endosomih in drugih celičnih

strukturah blizu celične membrane. Druge raziskave (Monterrat in sod., 2007) nakazujejo,

da SIT 7 ni prisoten na večjih optično gostih veziklih celic PC12 in inzulin sekretornih β-

celicah trebušne slinavke. Na inzulin sekretornih β-celicah trebušne slinavke (INS-1E) je

vidno, da pri eksocitozi iz teh celic najbolj sodeluje α, β in γ spojitvena oblika mRNA SIT 7

(Gauthier in sod., 2007). To so druge spojitvene oblike, kakor v nevronih (Monterrat in sod.,

2007).

2. 1.3.4 Vloga sinaptotagmina 7 v patoloških procesih

2. 1.3.4.1 Fagocitoza

SIT 7 sodeluje pri fagocitozi. To je proces, kjer makrofag vnese v svojo notranjost delce

večje od 0,5 µm v premeru. Miši brez SIT 7 nimajo fagocitotskega procesa, odvisnega od

SIT 7, ki vključuje vezavo membrane lizosoma na membrano makrofaga (Czibener in sod.,

2006). V raziskavi (Flannery in sod., 2010) na makrofagih je bilo ugotovljeno, da so za

vezavo potrebne specifične mikrodomene oziroma t.i. palmitoilacijska mesta, kjer se zgodi

palmitoilacija (vezava lizosoma in membrano makrofaga) v območju Golgijevega aparata.

Po vezavi na te domene poteče prenos SIT 7 v celici in njegova vezava makrofaga na

lizosom.



2. 1.3.4.2 Popravilo membrane mišične celice

V mišični celici SIT 7 sodeluje pri uravnavanju eksocitoze lizosomov kot Ca2+ senzor in

pripomore k popravilu celične membrane. Miši, ki nimajo gena za SIT 7, razvijejo vnetno

miopatijo, v mišične celice vdrejo levkociti in začne se odlagati kolagen. Pri miših se

pojavijo tudi značilnosti nekaterih avtoimunih bolezni, kot je odziv s protitelesi (Chakrabarti

in sod., 2003).

2. 1.3.4.3 Izločanje inzulina iz sekretornih β–celic trebušne slinavke

V endokrinih inzulin sekretornih β–celicah trebušne slinavke je SIT 7 najpogostejša SIT

izooblika. Povezana je s pojavom glukozne občutljivosti in od glukoze odvisnega izločanja

inzulina iz teh celic. Miši brez SIT 7 kažejo normalno glukozno občutljivost, normalno

količino izdelanega inzulina, vendar zaradi odsotnosti SIT 7 ne pride do sekrecije inzulina,

kar posledično vodi v pojav sladkorne bolezni. Te miši kažejo zmanjšano količino maščob

(vsebnost lipidov v mišičnih celicah in koncentracija prostih maščobnih kislin) in imajo

manjšo telesno težo kakor miši s SIT 7 (Gustavsson in sod., 2008).

2. 1.3.4.4 Nevrodegenerativne bolezni

Pri nevrodegenerativnih boleznih (huntingtonova, parkinsonova, alzheimerjeva bolezen) je

težava v degeneraciji nevronov ali sinaptičnih medceličnih povezavah. Pride do

patofizioloških procesov, kakor je pomanjkanje energije, porušenje ionske homeostaze,

pojav reaktivnega kisika, ki poškoduje membrane … Vse to pa vodi v apoptozo, nekrozo

nevronov. SIT 7 ima vlogo popravljanja teh degeneriranih nevronov in prilagajanja pri

njihovi izgubi (nevroplastičnost) (Glavan in sod., 2009). Nevroni v superiornih cervikalnih

ganglijih miši brez SIT 7 ne kažejo normalne rasti in razvejanja, kar kaže na vlogo SIT 7 pri

nastanku novih membran in razširjanju nevronov (Arantes in Andrews, 2006). V raziskavi

(Glavan in Živin, 2005) vloge SIT 7 in drugih izooblik SIT pri parkinsonovi bolezni so bile

uporabljene podgane z lezijami v levi polovici striatuma (poškodovani dopaminski (DA)

nevroni), narejenimi s toksinom 6-OHDA. Hemiparkinsonske zaradi tega, da druga polovica

možganov z nepoškodovanimi DA nevroni služi kot kontrola. Podgane so razvile močna

stereotipna vedenja, vrtenje v krogu, kar je bil znak poškodbe. Pri parkinsonovi bolezni se

izločanje dopamina v striatumu (STR) zmanjša zaradi poškodb v črnem jedru (SN), kjer

pride do degeneracije DA nevronov. Receptorji za dopamin v STR t.j. postsinaptično,

postanejo preobčutljivi - temu rečemo DA hipersenzitivizacija. Slednje se zgodi zaradi

spremenjenega izražanja proteinov DA receptorjev ali pa proteinov, ki sodelujejo pri

znotrajcelični signalizaciji. Levodopa (L-DOPA), prekurzor za dopamin, se lahko pri

zdravljenju parkinsonove bolezni uporablja za izboljšanje bolezenskega stanja. Izražanje

mRNA SIT 7 se v denerviranem STR poveča po dajanju učinkovine L-DOPA poskusnim

hemiparkinsonskim podganam. Raziskovalci (Glavan in Živin, 2005) domnevajo, da je SIT

7 vključen v patofiziološke spremembe sinaptičnega prenosa pri parkinsonovi bolezni.



Spremembe se zgodijo ob stimulaciji DA receptorjev D1, ne pa tudi D2. Izražanje mRNA

SIT 7 se torej spremeni v nevronih direktne striatne poti. Stimulacija D2 receptorjev zavira

adenilil ciklaze3 in na izražanje mRNA SIT 7 nima vpliva (Pal in sod., 2007). Pomanjkanje

dopamina so v drugi raziskavi (Pal in sod., 2007) simulirali z rezerpinom (RES), da bi

ugotovili, če je DA hipersenzitivizacija (povečano izražanje mRNA SIT 7) vezana le na

STR, ali tudi na druga anatomska področja možganov. RES blokira monoaminski

transporter, ki je potreben za prenos dopamina v vezikle, zaradi česar dopamin ostaja v

citoplazmi in ga encimi metabolizirajo. S tem se zmanjša ali prepreči sproščanje dopamina

v sinapsah in se pojavijo učinki podobni uničenju nevronov s 6-OHDA. Rezultati kažejo na

to, da za razliko od STR, v prilagoditvah v nevronih z DA sinapsami v drugih območjih

možganov, po depleciji dopamina, SIT 7 ne sodeluje (Pal in sod., 2007).

SIT 7 je udeležen pri pojavu epileptičnih napadov. Kainat (KA) in pilokarpin hidroklorid

(PI) sta snovi, ki epileptične napade sprožita umetno, s hiperekscitacijo nevronov, ta pa

potem povzroči nevrodegeneracijo, patološke spremembe hipokampusnih nevronov in celic

glije. PI je antagonist muskarinskih acetilholinskih receptorjev, napade sproži indirektno, s

preveliko stimulacijo glutamatnih receptorjev nevronov korteksa. Ta se po prenehanju

draženja s PI ne preneha. KA je antagonist specifičnega podtipa glutamatnih receptorjev,

zato epileptične napade sproži kar direktno (Glavan in sod., 2012). V raziskavi (Glavan in

sod., 2012) so ugotovili, da se po epileptičnih napadih, izzvanih s PI, izražanje mRNA SIT

7 v striatumu poveča dolgotrajneje kot po napadih, izzvanih s kainatom, a le v

ventromedialnem delu striatuma. Povečanje pa je verjetno posledica povečane koncentracije

dopamina med epileptičnimi napadi. Epileptični napadi, sproženi s KA in PI, se razlikujejo

glede na izražanje SIT 7 zaradi zapletenih mehanizmov uravnavanja izražanja SIT 7 v

možganih med napadi.

3 Adenilil ciklaze (angl. "adenylyl cyclase") so družina membranskih proteinov z desetimi izooblikami.

Omogočajo nastanek molekul ciklični AMP, ki so vpletene v delovanje kompleksnih poti prenosa signala med

nevroni (Sunahara in sod., 1996).



2. 1.4 SINKRIP

SINKRIP (angl. "Synatotagmin-binding, Cytoplazmatic RNA-Interacting Protein") je

citoplazemski RNA-vezavni protein, ki naj bi se vezal na SIT 7. Z metodo

koimunoprecipitacije so pokazali, da s proteinom SINKRIP interagirata tudi izoobliki SIT 8

in SIT 10. SINKRIP se s SIT poveže preko podenote C2B. Sodeluje pri znotrajceličnem

prenosu mRNA v dendrite celic. Ker je vezan tako na granule mRNA kot na SIT 7,

interakcija med njima nakazuje vključenost SIT 7 pri prenosu mRNA v dendrite nevronov.

Velikost molekule proteina SINKRIP je 66 kDa (Mizutani in sod., 2000). SINKRIP so

odkrili pri miših, obstaja pa tudi človeški homologni protein. Ta protein je prisoten v

granularni obliki, neenakomerno. Granule mRNA potujejo proti dendritom z različno

hitrostjo. Tiste, v katerih je prisoten SINKRIP, potujejo proti dendritom s hitrostjo okoli 0,05

µm/s. Raziskave (Bannai in sod., 2004) nakazujejo, da SINKRIP ni prisoten v tistih granulah

mRNA, ki se prenašajo hitreje. Natančna vezava proteina SINKRIP v granule mRNA še ni

znana, prav tako tudi ni dobro poznana njegova fiziološka vloga. Znano je le, da stabilizira

mRNA pri prenosu v dendrite. Na njegovo vezavo na mRNA močno vpliva fosforilacija

tirozina, ki jo lahko povzročijo inzulin ali drugi faktorji (npr. fibroblast rastni faktor). V poli-

A repu 3´mRNA molekule, kjer je SINKRIP najverjetneje vezan, je veliko adenin in uracil

nukleotidov. Prisotnosti proteina SINKRIP v mitohondrijih do sedaj še niso potrdili, so pa

jo (Bannai in sod., 2004) v dendritih cerebelarnih Purkinjejevih celic in drugih nevronov

možganske skorje ter somah hipokampusnih nevronov podgane.

Slika 8: SINKRIP je prisoten v granulah mRNA. (a) SINKRIP v granulah mRNA (glave puščic) (b) Prenos

proteina SINKRIP skupaj z granulami mRNA iz some v dendrite nevronov glede na časoven potek

(prilagojeno po Bannai in sod., 2004: 4)



SINKRIP je eden izmed dejavnikov, ki pozitivno uravnavajo sintezo RNA mišjega virusa

hepatitisa (angl. "mouse hepatitis virus"). Veže se na 3´ in 5´ konec virusne RNA z

receptorjem za poglavitni histokompatibilnostni kompleks (Choi in sod., 2004).

2. 1.5. PRENOS mRNA V DENDRITE NEVRONOV

2. 1.5.1 mRNA

Biokemično sintezo proteinov imenujemo translacija, zapis za sintezo pa nosijo nukleotidi4

na obveščevalni ribonukleinski kislini (mRNA). Zaporedje nukleotidov, ki je zapisano na

mRNA, se na ribosomih prevede v zaporedje aminokislin (AK), ki gradijo proteine.

Obveščevalna mRNA ima tri dele: 5´ konec z nukleotidi za vezavo na ribosome, osrednji del

z nukleotidi, ki kodirajo zaporedje za AK, ter 3´ konec, ki uravnava in od katerega je odvisna

obstojnost mRNA. Nukleotidi se držijo skupaj po tri, urejeni so v triplete, imenovane kodoni

(Pollard in Earnshaw, 2004). Nukleotidi so podobni kakor v DNA: adenin (A), citozin (C),

guanin (G). Namesto timina (T) je v mRNA prisoten uracil (U) (Nelson in Cox, 2005).

Obdelava mRNA pred prenosom do ribosomov pri evkariontih je zelo zahtevna in se

razlikuje od prokariontskega. V nadaljevanju je opisan primer evkariontov. mRNA se najprej

sintetizira v jedru. Po prepisovanju (transkripciji), dobimo pre-mRNA, ki se dodatno obdela

v jedru. Na 5´ koncu se doda metilguanozin kapa, da se mRNA stabilizira za prenos do

ribosomov v citoplazmi ter za lažjo vezavo na ribosome. Na 3´ koncu mRNA se doda poli-

A-rep. Poli-A-rep vpliva na potek translacije in poveča obstojnost mRNA (Cooper in

Hausman, 2004). mRNA je sestavljena iz AK kodirajočih in AK nekodirajočih sekvenc

nukleotidov. Deli, ki imajo zapis za AK so eksoni, tisti ki jih nimajo, pa introni. Introni se

med procesiranjem mRNA izrežejo. mRNA v citoplazmi niso zelo obstojne in preživijo od

nekaj minut do nekaj dni (Pollard in Earnshaw, 2004).

Po prepisovanju gena za SIT 7 nastane okoli 20 spojitvenih oblik mRNA SIT 7. Gen je na

11. kromosomu q12.2, njegova sekvenca nukleotidov je velika okoli 114 kb (Sugita in sod.,

2001). Primer sekvence za mRNA SIT 7 je: mRNA SIT 7 = 5’ - CCG AGU CUG GCG UGC

CCA CCG UCU CCA AGG AGU UCU UGU AGC GUU - ’3 (Glavan in sod., 2012) Večina

genov za SIT ima okoli 14 eksonov (Gauthier in sod., 2007). Metoda za prenos northern je

pokazala, da je mRNA SIT 7 velika približno 4,4 do 7,5 kb (Marqueze in sod., 2000) protein

SIT 7 pa 45 kDa (Osborne in sod., 2007).

4 Nukleotid je spojina, sestavljena iz org. dušikove baze (pirimidinska ali purinska baza), ogljikovega hidrata

(pentoza) in fosfatne skupine (Strgar, 2002).



2. 1.5.2 Prenos granul mRNA v nevronih

Največje koncentracije mRNA so v dendritih celice. Tam se celo sintetizirajo nekateri

proteini in so tako podaljšek some nevrona (Kandel in sod., 2000). mRNA se prenašajo iz

some v dendrite predvsem v obliki granul mRNA. Granule mRNA so velike od 100 do 700

nm (Batish in sod., 2012). Vsebujejo okoli 42 proteinov, od katerih je bolje opisanih le 12

(Hirokawa, 2006). Večinoma so ti proteini ribosomi in drugi elementi translacijskega aparata

ter razni RNA-vezavni proteini (Anderson in Kedersha, 2006). Vloga vezavnih proteinov

RNA, kot je SINKRIP, je stabilizacija molekul mRNA (Bannai in sod., 2004), imajo pa tudi

druge pomembne vloge pri prenosu granul mRNA.

Prenos granul mRNA in drugega sinaptičnega tovora je v kar največji meri odvisen od dveh

tipov citoskeleta, aktinskih filamentov in mikrotubulov. Mikrotubuli so polimeri α in β

tubulinskih dimernih molekul in imajo premer okoli 25 nm. Aktinski filamenti so zgrajeni

iz tubulinskih monomernih molekul, dolgih okoli 8 nm, in imajo v začetku aksona predvsem

vlogo selektivne pregrade za prenos granul mRNA ter vzdržujejo polarnost nevrona

(vzdržujejo stabilnost kanalčkov za natrijeve ione). Mikrotubuli so polarni, imajo plus in

minus konec. Polarnost citoskeleta je ključna pri prenosu in potovanju granul mRNA na

pravo mesto. Tako mikrotubuli kot aktinski filamenti so izredno dinamične strukture, kar

igra ključno vlogo pri sinaptični plastičnosti in samem razvoju nevronov. Dinamičnost

(odvzemanje in dodajanje dimernih molekul tubulina) mikrotubulov se dogaja na plus

koncu, na katerem se tudi prenaša največ granul mRNA. Oba citoskeletna elementa sta

prisotna tako v somi kot v aksonih in dendritih nevronov (Kreutz in Sala, 2012).

Granule mRNA po mikrotubulih prenašata motorična proteina kinezin in dinein. Pri miših

in ljudeh obstaja kar 45 vrst kinezina, ki so del večje družine motoričnih proteinov kinezina

(KIF, angl. "kinesin superfamily"). KIF1A in KIF1Bβ sta tista, ki prenašata sinaptične

vezikle s sinaptotagminom. Sam način, kako prenos točno poteka, še ni dobro znan. Pri

prenosu granul mRNA sodeluje tudi motorični protein miozin, ki prenaša granule mRNA po

aktinskih filamentih (Hirokawa, 2006). V aksonu dinein običajno prenaša granule mRNA

proti somi nevrona, medtem ko jih kinezin prenaša proti sinapsi. V dendritih je prenos

kompleksnejši, oba lahko prenašata granule v obe smeri, odvisno od orientacije mikrotubula,

na katerega sta pritrjena. V primeru trnov na dendritih je kot motorični protein vključen

miozin (Kreutz in Sala, 2012). Molekule mRNA se na motorične proteine vežejo na točno

določen način. Vežejo se na molekule ribonukleoproteinov, natančneje na RNA-vezavne

proteine (RNP, angl. "trans-acting RNA-binding proteins"). Šele RNP potem vežejo mRNA

na motorične proteine ter nadalje omogočajo prenos v dendrite. Obstaja več vrst RNP, med

njimi tudi protein sindroma lomljivega kromosoma X (FMRP, angl. "fragile X mental

retardation protein"). Če pride do nepravilnosti nadzora translacije in do vezave mRNA na

FMRP, pride do sindroma lomljivega kromosoma X (FXS, angl. "fragile X syndrome"),

avtizma, težav s kognicijo, ... (Kreutz in Sala, 2012).



Pred kratkim so ugotovili (Jansen in sod., 2014), da obstaja povezava med prenosom

molekul mRNA in membranami celičnih organelov. RNA-vezavni proteini prepoznajo

ukrivljenost membrane. Dokazali so, da je od mikrotubulov odvisni prenos granul mRNA

povezan z endoplazmatskim retikulumom (ER) in endosomi (Jansen in sod., 2014).

Za prenos v samih dendritih so odgovorni dendritični tarčni elementi (DTE, angl. "dendritic

targeting elements"). Dokazano je, da granule mRNA prepoznajo in se vežejo na točno

določene DTE in so tako pomemben faktor pri prenosu granul mRNA v dendritih (Kreutz in

Sala, 2012). Za prepoznavo DTE elementov so pomembni RNA-vezavni proteini v granulah

(Jansen in sod., 2014). Molekule mRNA, ki se vežejo na enake DTE, se ne združujejo v iste

granule mRNA. Vedno se prenaša le ena molekula mRNA (Batish in sod., 2012).

Slika 9: mRNA se v dendrite prenaša s pomočjo granul mRNA (prilagojeno po Kreutz in Sala, 2012: 528)

Katere molekule mRNA se prenašajo na ta način in katere so pomembne za sintezo proteinov

v možganih (ključnih za spremembe sinaptičnega delovanja) ni dobro znano. PCR (angl.

"Polymerase Chain Reaction") tehnika je pokazala več kot 400 različnih mRNA, vendar so

prisotne v različnih koncentracijah in so različno pomembne (Kreutz in Sala, 2012).

Porušenje homeostaze v živčnih celicah vodi v nastanek nevrodegenerativnih bolezni

(huntingtonova, alzheimerjeva, creutzfeldt-jacobova bolezen, bolezen motoričnih nevronov,

lizosomalne bolezni shranjevanja (angl. "lysosomal storage disease") in druge). Zaradi

degeneracije ali slabega delovanja sinaps pri pojavu teh bolezni sklepajo (Wishart in sod.,

2006), da gre pri vseh za isti celični in molekularni mehanizem - osredotočen na sinapse -



nastanka bolezni. Število sinaps se zmanjša, poslabša se njihovo delovanje v živčnih celicah

različnih delov možganov. Zakaj so ravno sinapse tako občutljive, še ni znano, vendar

njihovo občutljivost na degenerativne dražljaje potrjujejo spremembe celičnih značilnosti in

molekularnih poti vezanih na pojav in delovanje sinaps oz. njihovih delov (angl. "synaptic

compartments"). Z aktivacijo antiapoptotičnih poti v sinapsah nevronov in celic glije s

pomočjo nevrotrofičnih faktorjev se degeneracija sinaps zmanjša, kar kaže, da je

najverjetnejši mehanizem degeneracije apoptoza (angl. "synapoptosis pathway"). Tudi

drugih molekularnih poti v sinapsah ne gre zanemariti, npr. nekroze in poti, odvisne od

ubikvitina.

Za nastajajnje novih ter delovanje že obstoječih sinaps je pomemben prepis nekaterih

molekul mRNA za proteine, ki so sestavni del sinaps (Czaplinski, 2014), to so med drugim

receptorji za nevrotransmiterje in napetostno odvisni kanalčki (Hanus in sod., 2014). Za

plastičnost sinapse so pomembne naslednje mRNA:

mRNA, ki kodirajo presinaptične membranske receptorje AMPA (alfa-amino-3-

hidroksi-5-metil-4-izoksazol propionic kislinske glutamate receptorje) (Kreutz in Sala,

2012) ter druge mRNA, ki kodirajo receptorske proteine (glicin, glutamat, inozitol

1,4,5-trifosfat receptor 1 (IP3R1)) (Bannai in sod., 2004).

mRNA, ki kodirajo kinaze (Ca2/CaM1 kinazo II (CaMKII)) (Bannai in sod., 2004).

mRNA družin proteinov Shank (1–3) in SAPAP (1–4), kajti vplivajo na

postsinaptično gostoto (angl. "postsynaptic density") (Kreutz in Sala, 2012). Tako

imenujemo večje signalizacijske objekte (angl. "signaling machines") v postsinaptičnih

celicah, ki nadzorujejo moč sinaptične povezave. Na te signalizacijske objekte so vezani

receptorji. Postsinaptična gostota je odvisna od mRNA molekul. mRNA vplivajo na

moč sinaptične povezave, prispevajo k obdelovanju informacij in sodelujejo pri

ustvarjanju spomina (Kennedy, 2000).

mRNA Jacob proteina, katerega produkt vpliva na transkripcijo mRNA v

postsinaptični celici in posledično zmanjša sinaptično povezavo med dvema celicama

(Kreutz in Sala, 2012).

mRNA za proteine citoskeleta. To je npr. MAP2 mRNA (Bannai in sod., 2004).

Raziskave so pokazale, da je okoli 100 MAP2 mRNA molekul na nevron (Batish in

sod., 2012). Tudi Arc (angl. "activity-regulated cytoskeleton associated protein")

mRNA kodira proteine citoskeleta (Bannai in sod., 2004). 3.1/Arc mRNA se je pri miših

sintetizirala že nekaj ur po učenju, kar pomeni, da je ključna za vzpostavljanje novih

sinaptičnih povezav (Montag-Sallaz in Montag, 2003).



Cona translacije teh molekul mRNA je v dendritih, v t.i. coni rasti nevrona. To področje in

molekule mRNA (njihova prisotnost, koncentracija) v njem se spreminjajo med razvojem

organizma in tudi če pride do patoloških sprememb. mRNA v tej coni vplivajo na moč

sinaptične povezave med dvema nevronoma (Crino in Eberwine, 1996). mRNA je izredno

pomembna tudi na drugih področjih. Pri oocitah žabe krempljičarke (Xenopus) mRNA

določa sam potek razvoja embria. Pri prenosu mRNA v tem primeru sodelujeta

citoplazemski razdelek imenovan mitohondrijski oblak in endoplazmatski retikulum

(Schnapp in sod., 1997).

mRNA se prenašajo tudi z zunajceličnimi vezikli (EV). EV so veliki od 30 do 1000 nm,

nastajajo v nevronih, oligodendrocitih, astrocitih in mikrogliji. EV nastanejo z eksocitozo in

endocitozo znotraj t.i. multivezikularnih teles v celici in se prenašajo od ene do druge živčne

celice. Tudi EV imajo vlogo pri komunikaciji med nevroni in nove raziskave (Candelario in

Steindler, 2014) kažejo, da se mRNA, ki so med drugim tudi vpletene v nevrodegenerativne

bolezni, lahko prenašajo s pomočjo teh veziklov. Treba je poudariti, da ne gre za prenos teh

mRNA v dendrite, kakor pri granulah mRNA. Razumevanje vloge prenosa mRNA z EV bi

prav tako veliko pripomoglo k razvoju raznih molekularnih in bioloških terapij.



2. 1.6 ANATOMSKA PODROČJA PODGANJIH MOŽGANOV

2. 1.6.1 Možganska skorja

Glede na celično strukturo so znani trije glavni tipi možganske skorje, prikazani na sl. 10a.

Prvi tip je hipokampus, zvita struktura na sredi lateralnega ventrikla. Zaradi svoje značilne

oblike je ime dobil iz grške besede, ki pomeni morski konjiček. Spredaj in ob strani

hipokampusa je drugi tip možganske skorje, imenovan vohalni korteks. Tako ime je dobil,

ker je povezan z vohalnim bulbusom. Tretji in prevladujoči tip skorje je neokorteks. Vohalni

korteks od neokorteksa loči struktura, imenovana rinalna fisura (Bear in sod., 2006).

Neokorteks (v nadaljevanju skorja velikih možganov) je večplasten, kar je prikazano na sl.

10a. Some nevronov v skorji velikih možganov so vedno urejene v plasteh. Plast najbližje

lobanji in prva pod možgansko ovojnico je imenovana molekularna plast ali preprosto plast

1 (Bear in sod., 2006). Sledijo ji zunanja granularna (2) in piramidalna (3) plast, ter notranja

granularna (4) in piramidalna (5) plast. Pod temi je še šesta t.i. multiformna plast (angl.

"multiform layer"). Zgradba skorje velikih možganov je prikazana na sl. 10b (Brodal, 2010).

Piramidalna plast vsebuje piramidaste nevrone z dendriti, ki so veliki in jih imenujemo tudi

apikalni dendriti. Ti dendriti segajo do plasti 1 in se tam razvejajo. V plasteh 2 in 4 so

granularne celice, v plasteh 1, 2, 3 pa so prisotni dendriti piramidastih nevronov, s somami

v nižjih plasteh. V plasteh 2 in 3 poteka ključni del procesiranja dražljajev (Bear in sod.,

2006).

Slika 10: Možganska skorja. (a) Trije glavni tipi možganske skorje (prilagojeno po Bear in sod., 2006: 197)

(b) Plasti skorje velikih možganov / neokorteksa (prilagojeno po Bear in sod., 2006: 196; Brodal, 2010: 468)



2. 1.6.2 Hipokampus

Struktura hipokampusa je plastovita. Some piramidalnih nevronov so močno nakopičene v

piramidalni plasti (lat. "striatum pyramidale"), radiatna plast (lat. "striatum radiatum") pa je

tam, kjer so aksoni in dendriti piramidalnih nevronov. Glede na velikosti piramidalnih

nevronov, njihove povezave ter razvejanost dendritov delimo piramidalno plast

hipokampusa v tri različna področja: CA1, CA2, CA3. Dendriti piramidalnih nevronov v

CA3 področju tvorijo sinapse z dendriti piramidalnih nevronov v CA1 področju. Ti področji

sta večji, CA2 je manjše. Piramidalni hipokampusni nevroni so izredno pomembni pri tvorbi

spomina. Aksoni teh nevronov, ki izraščajo na vsaki strani some, tvorijo apikalno in bazalno

vejo (Kandel in sod., 2000). V dentatnem girusu so prisotne granularne celice, njihovi aksoni

se imenujejo mahovita (angl. "mossy") vlakna (Gutierrez, 2003). Celotna zgradba je

prikazana na sl. 11a (Kandel in sod., 2000). Potovanje informacije v obliki akcijskega

potenciala je prikazano na sl. 11b. Najprej pride po večih perforantnih vlaknih vzburjenje

oz. signal in se združi na poti do posameznih celic dentatnega girusa (združen signal). Te

vzburijo več aksonov mahovitih vlaken. Mahovita vlakna pa vodijo do posameznih

piramidalnih nevronov CA3 področja hipokampusa (nezdružen signal). Po Schafferjevi

kolaterali se na poti od CA3 do CA1 področja signal spet združi in tako pride do piramidalnih

nevronov v CA1 (Kandel in sod., 2000).

Slika 11: Hipokampus. (a) Zgradba hipokampusa (prilagojeno po Kandel in sod., 2000: 78)

(b) Potovanje signala (prilagojeno po Kandel in sod., 2000:1050)

Hipokampus sodeluje pri spominu, predvsem pretvorbi kratkoročnega spomina v

dolgoročnega. Udeležen je tudi pri prostorskem spominu. Če pride do poškodbe

hipokampusa, oseba ne more tvoriti novih spominov, stari spomini pa vseeno ostanejo.

Zanimivo je tudi, da hipokampus regulira stresni odziv organizma, dokazali so vpliv nanj pri

različnih travmatičnih izkušnjah. Glukokortikoidni receptorji hipokampusa se odzovejo na

kronično povišano koncentracijo kortizola in hipokampusni nevroni odmrejo (Kandel in

sod., 2000).



2. 1.6.3 Mali možgani

Mali možgani so zgrajeni iz treh večjih delov, prikazanih na sl. 12. Prvi del je zunanji ovoj

cerebelarnega korteksa, imenovan sivina in ga sestavljajo molekularna plast, plast

Purkinjejevih celic in granularna plast. Je zguban in zato tvori značilne strukture tako

imenovanih lističev. Pod sivino je drugi del malih možganov, belina. Tretji del so jedra v

notranjosti. Najbolj zunanja plast sivine je molekularna plast in je iz som dveh tipov celic:

zvezdastih in košaričastih internevralnih celic. Ta plast vsebuje tudi aksone granularnih celic

in dendrite Purkinjejevih celic. Aksoni granularnih celic potekajo vzporedno z dolgo osjo

lističev in jih tako imenujemo tudi paralelna (vzporedna) vlakna. Pod molekularno plastjo

ležijo v eni sami plasti some Purkinjejevih celic. Purkinjejeve celice izločajo nevrotransmiter

GABA, prvič so bile opisane že leta 1837 (Bear in sod., 2006). Iz njihovih som segajo

navzgor v molekularno plast razvejani dendriti (angl. "fanlike dendritic arborization")

(Kandel in sod., 2000). Aksoni Purkinjejevih celic segajo navzdol v belino. Notranja plast

sivine malih možganov je granularna. Je iz mnogih granularnih celic, ocenjujejo, da okoli

1011. Ime so dobile zaradi tega, ker so majhne in imajo kompaktna jedra. V tej plasti je še

nekaj večjih Golgijevih internevralnih celic. Te tvorijo z mahovitimi vlakni cerebelarne

preplete (glomerule). Po mahovitih in vzpenjajočih vlaknih informacije prihajajo v male

možgane (Kandel in sod., 2000).

Slika 12: Zgradba malih možganov (prilagojeno po Kandel in sod., 2000: 715)

V malih možganih pride do obdelovanja podatkov, posledica tega so želeni gibi. Če se zgodi

poškodba malih možganov, pride do neusklajenega in nerodnega gibanja (Bear in sod.,

2006). Do malih možganov pride 40-krat več informacij, kakor jih zapusti. Čeprav

zavzemajo le 10 odstotkov volumna, je v malih možganih kar 50 odstotkov vseh nevronov

možganov (Kandel in sod., 2000).



2. 1.6.4 Striatum in druga subkortikalna jedra bazalnih jeder

Striatum je eno od subkortikalnih jeder bazalnih jeder. V kavdalnem delu je sestavljen iz

kavdatusa ter putamna, v ventralnem pa iz akumbensa in olfaktornega tuberkula. Striatum je

medsebojno kompleksno povezan z drugimi subkortikalnimi jedri bazalnih jeder. Ti so

palidum, subtalamično jedro ter črno jedro (Albin in sod., 1989). Palidum gradita dva

segmenta, eksterni in interni del paliduma. Podgane so brez internega paliduma, imajo pa

temu jedru analogno strukturo, imenovano entopedunkularno jedro. Črno jedro je tudi

sestavljeno iz dveh delov: kompaktni in retikulatni del (Brodal, 2010; Gerfen in Surmeier,

2011).

Slika 13: Vzdolžni prerez podganjih možganov, bazalna jedra: striatum (kavdatus, putamen, akumbens, OT

oz. olfaktorni tuberkul), GPe (eksterni palidum, angl. "globus pallidus external"), EPN (entopedunkularno

jedro, angl. "entopeduncular nuclei"), SNc (kompaktni del črnega jedra, angl. "substantia nigra pars

compacta"), SNr (retikulatni del črnega jedra, angl. "substantia nigra pars reticulate") ter subtalamično

jedro (prilagojeno po David, 2009: 2)

Striatum ima raznoliko strukturo in funkcijo, saj je iz dveh različnih delov, to sta matriks in

strije. Matriks se med seboj histokemično razlikuje glede na prisotne DA receptorje. D1

(družina DA receptorjev 1) so povezani z aktivacijo gibov, D2 pa z zaviranjem. Največ

informacij pride iz možganske skorje v bazalna jedra ravno preko striatuma, naprej pa

nevroni vodijo do paliduma po dveh možnih poteh - posredni poti preko D1 in neposredni

poti preko receptorjev D2 (Kandel in sod., 2000). D1 aktivirajo adenilil ciklaze, D2 adenilil

ciklaze inhibirajo (Zhang in sod., 2004). Matriks torej vsebuje nevrone posredne in

neposredne poti. Nekatere bolezni (parkinsonova, huntingtonova) močno prizadenejo

bazalna jedra in zmožnost nadzorovanja gibov. Striatum najbolj sodeluje pri habituaciji

(navajanju) in proceduralnem spominu, deluje pa tudi kot stikalo med preklapljanjem enega

gibanja v drugega (Bear in sod., 2006).



3 MATERIALI IN METODE

3. 1.1 EKSPERIMENTALNE ŽIVALI

Naša eksperimentalna žival je bila laboratorijska rjava podgana (Rattus norvegicus). V

raziskavi kolokalizacije proteinov SIT 7 in SINKRIP smo uporabili možgane treh različnih

podgan. Poškodbe in nelagodje živali smo omejili na minimum. Pred začetkom poskusa so

bile živali nameščene v klimatiziranem hlevu z 12-urnim umetnim dnevno-nočnim ciklom.

Ves čas so imele dostop do hrane in vode. Podgane, ki smo jih uporabili, so tehtale od 250

do 300 gramov. Za izvajanje poskusov na živalih smo dobili dovoljenje Veterinarske uprave

Republike Slovenije - za odvzem tkiva (34401-33/2011/3) ter priglasitev za delo na

izoliranih organih, tkivih in truplih (34401-7/2011/2). Poskuse smo izvajali na Inštitutu za

patološko fiziologijo Medicinske fakultete v Ljubljani.

3. 1.2 TRANSKARDIALNA PERFUZIJA

V raziskavi smo uporabili in situ fiksirane možgane, zato je bilo potrebno opraviti

transkardialno perfuzijo. Anestetik smo inicirali intraperitonealno (skozi trebušno steno).

Anestetik je bil pripravljen iz ksilazina (10 mg/kg telesne teže; Chanelle Pharmaceuticals

Manufacturing, Galway, Irska), bioketana (75 mg/kg; Vetoquinol Biowert, Gorzow, Poljska)

in fiziološke raztopine. Podgano smo položili na hrbet na rešetko. Pod žličko smo pri koži s

pomočjo pincete s škarjicami zarezali in prerezali mišice ter spustili srce na prosto. V levi

ventrikel smo zarezali in vstavili kanilo, ki smo jo porinili v aorto. Ko je bilo to opravljeno,

smo preščipnili s škarjicami desni atrij, da je začel krvaveti. Odprli smo križno tesnilo, da je

skozi kanilo začela teči fiziološka raztopina z dodanim heparinom (5000 enot/l, Braun

Melsungen AG, Melsungen, Nemčija) in spirali tako dolgo, da je kri odtekla. Sočasno smo

spirali krvne strdke iz trebušne in prsne votline. Ko je tkivo pobledelo, smo odprli križno

tesnilo, da je skozi kanilo začel teči 4-odstotni paraformaldehid (Sigma) pripravljen v 0,1

natrij-fosfatnem pufru (PBS, pH 7,2) in počakali, da je žival otrdela. Takrat smo živali

odstranili in situ fiksirane možgane.

3. 1.3 PRIPRAVA PROSTO PLAVAJOČIH MOŽGANSKIH REZIN

Postfiksacija možganov je potekala čez noč pri 4°C. Kot postfiksativ smo uporabili fiksativ

z dodano 20-odstotno saharozo (Sigma). Iz postfiksativa smo možgane vzeli naslednji dan

ter jih prenesli v 0,1 M PBS, dokler nismo pripravili drsnega mikrokriotoma. Z njim smo

narezali možgane na poltanke (20 µm) koronarne možganske rezine od 1,56 mm do -10,32

mm oddaljenosti od bregme. Možgane smo pred rezanjem zamrznili s suhim ledom, rezali

pa smo jih s toplim rezilom pri sobni temperaturi. Možganske rezine smo imeli shranjene v

24-prekatni plastični posodici. Rezine so v posodici prosto plavale v krioprotektantu (30-

odstotna saharoza (Sigma), 5-odstotni polivinilpirilidon (Sigma), 30-odstotni etilenglikol



(Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) v PBS) pri -20°C. Tako smo pripravili t.i. prosto

plavajoče možganske rezine.

Slika 14: Drsni mikrokriotom in zamrznjeni možgani. (a) Drsni mikrokriotom (b) Zamrznjeni možgani

3. 1.4 IMUNOHISTOKEMIČNA LOKALIZACIJA PROTEINOV

Plavajoče možganske rezine smo najprej iz krioprotektanta prenesli v koške znotraj 6-

prekatne plastične posodice s kalij-fosfatnim pufom (KPBS, pH 7,3) za 30 minut. Volumen

tekočine v enem košku je bil 3,5 mL. Možganske rezine smo nato prenesli v

mikrocentrifugirke in jih 30 minut inkubirali v citratnem pufru (pH 8,75) na 80ºC, da smo

odkrili antigene, ki se zamrežijo med fiksacijo z aldehidi (angl. "antigen retrieval"). Ker smo

možganske rezine tretirali s citratnim pufrom, smo omogočili vezavo primarnih protiteles na

specifične antigene. Po odkrivanju antigenov smo možganske rezine prenesli nazaj v koške

s KPBS in jih spirali 15 minut. Nato smo možganske rezine inkubirali eno uro v KPBS z 1-

odstotnim govejim serumskim albuminom (BSA, Sigma), 0,4-odstotnim triton-X 100

(Sigma) ter 4-odstotnim neimunim serumom (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija,

ZDA). Triton smo dodali za izboljšanje prepustnosti celic v tkivu, BSA za stabiliziranje

protiteles, neimun serum (uporabljeni neimuni serumi so navedeni v pregl. 1) pa zato, da

smo zmanjšali nespecifično ozadje. Protitelesa v naravnem serumu prekrijejo antigene, da

se kasneje nanje ne vežejo biotinizirana sekundarna protitelesa. Po tej enourni inkubaciji z

neimunim serumom smo možganske rezine inkubirali s specifičnimi primarnimi protitelesi.

Specifična primarna protitelesa smo redčili v KPBS, ki je vseboval 1-odstotni BSA, 0,4-

odstotni triton-x 100 ter 1-odstotni neimun serum. Inkubacija je potekala čez noč na 4°C ter

dve uri na sobni temperaturi na stresalniku. Možganske rezine smo naslednji dan inkubirali

z biotiniziranimi sekundarnimi protitelesi za 90 minut na sobni temperaturi. V pregl. 1 so

navedena uporabljena primarna in sekundarna protitelesa ter njihove razredčitve. Da bi



dobili optimalni signal proteinov SIT 7 in SINKRIP, smo uporabili različne razredčitve

primarnih protiteles in nato izbrali najbolj optimalno. V pregl. 2 so navedene razredčitve

protiteles, ki smo jih uporabili, preden smo dobili optimalne. Možganske rezine smo po

inkubaciji s sekundarnimi protitelesi na sobni temperaturi eno uro inkubirali s kompletom

ABC (Vectastain elite ABC kit, Vector Laboratories). Ta komplet vsebuje avidin-biotinski

kompleks, na katerega je vezanih več peroksidaz, ki vizualizirajo mesta vezave sekundarnih

protiteles. Po inkubaciji s kompletom ABC smo možganske rezine inkubirali še z DAB

(substratom encima hrenove peroksidaze 3'3-diaminobenzidinom; Aldrich Chemicals,

Milwaukee, Wisconsin, ZDA). DAB se po delovanju peroksidaz obarva rjavo. Po

imunooznačevanju smo plavajoče možganske rezine pobrali na silanizirana krovna stekla

(Starfrost, Waldemar Knittel, Braunschweig, Nemčija) ter jih dehidrirali v naraščajočih

koncentracijah alkoholov (50-, 70-, 100-odstotni etanol) in ksilolu. Pokrili smo jih z medijem

DePeX (Sigma) za pokrivanje. Vzporedno z možganskimi rezinami, na katere smo vezali

primarna protitelesa, smo pripravili tudi negativne imunohistokemične kontrole. Namesto

inkubacije možganskih rezin v raztopini primarnih protiteles smo rezine inkubirali samo v

raztopini, v kateri smo sicer redčili primarna protitelesa. Ostali postopek je bil enak. Signali

negativnih kontrol so bili šibki in nespecifični. Možganskih rezin nismo označevali s

protitelesi za oba proteina, temveč posebej za SIT 7 in posebej za SINKRIP. Trajne

preparate, ki smo jih naredili, smo po imunohistokemičnem barvanju pregledali s svetlobnim

mikroskopom in po optimizaciji še slikali s svetlobnim mikroskopom, povezanim s kamero

ter transiluminatorjem.

Preglednica 1: Primarna in sekundarna protitelesa ter neimuni serumi za imunohistokemično dokazovanje

proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v možganskih rezinah

Primarno protitelo Sekundarno protitelo Neimun serum

SIT 7

Kunčje poliklonsko

protitelo proti proteinu SIT

7 narejeno v kozi

(Immuno-Biological

Laboratories, Gunma,

Japonska).

Kozje protitelo, ki prepozna

kunčje antigene, konjugirano z

biotinom

(Vector Laboratories).

Kozji neimun

serum

(Vector

Laboratories,

Burlingame,

Kalifornija,

ZDA).

SINKRIP

Mišje poliklonsko protitelo

proti proteinu SINKRIP

narejeno v konju

(Immuno-Biological


Japonska).

Konjsko protitelo, ki prepozna

mišje antigene, konjugirano z

biotinom

(Vector Laboratories).

Konjski neimun

serum

(Vector

Laboratories,

Burlingame,

Kalifornija,

ZDA).



Preglednica 2: Optimizacija razredčitev primarnih protiteles za imunohistokemično dokazovanje proteinov

sinaptotagmin 7 in SINKRIP v možganskih rezinah in optimalne razredčitve primarnih ter sekundarnih

protiteles

Protitelo

Razredčitve pri

optimizaciji

Optimalne

razredčitve protiteles

Primarno protitelo za SIT 7 1:500, 1:1000, 1:1500 1:1000

Sekundarno protitelo za SIT 7 1:1500 1:1500

Primarno protitelo za SINKRIP 1: 100, 1:250, 1:500 1:250

Sekundarno protitelo za SINKRIP 1: 500 1:500

3. 1.4.1 Analiza in zajem slike imunohistokemičnih preparatov

Svetlobne razmere ter nastavitve objektiva in zaslonke so bile konstantne pri analizi vseh

možganskih rezin. Ob zajemanju slik je program sam opravil zmanjšanje nehomogenosti

ozadja svetlobnega vira. Zmanjšal je tudi vplive elektronskega šuma zaradi videokamere in

zajemalnika. Možganske rezine vseh treh živali z imunohistokemično označenim SIT 7 in

možganske rezine z imunohistokemično označenim proteinom SINKRIP smo najprej dobro

pregledali s svetlobnim mikroskopom Olympus IX81.

Nato smo možganske rezine, tako rezine z imunohistokemično označenim SIT 7, kot rezine

z imunohistokemično označenim proteinom SINKRIP, slikali najprej s transiluminatorjem,

povezanim s kamero CoolSNAP. Krovna stekla z možganskimi rezinami smo polagali na

negatoskop, ki jih je presvetljeval z difuzno neonsko svetlobo. S programom MCID Elite, ki

je digitaliziral signal, smo dobili osem-bitno črno-belo sliko z več odtenki sivine. Na teh

slikah so vidne celotne možganske rezine. Prisotnost proteina v možganskih rezinah smo,

tako kot pri svetlobnem mikroskopu, določili glede na rjavo obarvanje. Obarvanje je

pomenilo prisotnost proteinov SIT 7 in SINKRIP v posameznem anatomskem področju.

Zanimala so nas anatomska področja v možganskih rezinah treh različnih oddaljenosti od

bregme: -3,24 mm, 1,56 mm in -10,32 mm. Pomagali smo si z Atlasom možganov podgane

(Paxinos in Watson, 2007).

V koronarnem prerezu možganov -3,14 mm od bregme (sl. 15) smo analizirali naslednja

anatomska področja: hipokampus (področja CA in dentatni girus), skorjo velikih možganov

(h kateri štejemo cingulatni korteks, primarni in sekundarni motorični korteks, primarni in

sekundarni somatosenzorični korteks, avditorni korteks ter entorinalni korteks), piriformni

korteks, amigdaloidna, talamična in hipotalamična jedra, interno kapsulo, belino, kalozni

korpus (lat. "corpus callosum"), ventrikel in lateralni ventrikel.



Slika 15: Prikaz anatomskih področij možganov podgane, koronarni prerez možganov -3,24 mm od bregme.

Hipokampus: CA1, CA2, CA3, mahovita vlakna (mv), radiatna plast (Rad), piramidalna plast (Pp). Dentatni

girus (DG): molekularni (trikotnik), granularni (zvezdica) in polimorfni sloj (krog). Skorja velikih

možganov - cingulatni korteks (Cing), primarni (M1) in sekundarni (M2) motorični korteks, primarni (S1) in

sekundarni (S2) somatosenzorični korteks, avditorni korteks (Au), entorinalni korteks (Ent). Piriformni

korteks (Pir – 1, 2, 3 sloj). Amigdaloidna jedra (AMG). Talamična jedra (Tal). Hipotalamična jedra (HIP).

Belina (bel). Interna kapsula (ka). Kalozni korpus (cc). Forniks (f). Mamilotalamični trakt (mt). Ventrikel (v)

in lateralni ventrikel (lv) (prilagojeno po Paxinos in Watson, 2007: 62)

V koronarnem prerezu možganov 1,56 mm od bregme (sl. 16) smo analizirali naslednja

anatomska področja: skorjo velikih možganov, striatum (kavdatus in putamen), akumbens,

olfaktorni tuberkul striatuma, interno kapsulo, kalozni korpus in lateralni ventrikel.

Slika 16: Prikaz anatomskih področij možganov podgane, koronarni prerez možganov 1,56 mm od bregme.

Striatum (CPu). Akumbens (Ac). Olfaktorni tuberkul striatuma (OT – sloj 1, 2, 3). Kalozni korpus (cc).

Interna kapsula (ka). Lateralni ventrikel (v) (prilagojeno po Paxinos in Watson, 2007: 20)



V koronarnem prerezu možganov -10,56 mm od bregme (sl. 17) smo analizirali naslednja

anatomska področja: skorjo malih možganov, izvenkortikalna jedra (h katerim štejemo

interposedna jedra, lateralno cerebelarno jedro, intersticialno celično jedro), olivarno jedro,

obrazni živec, jedra obraznega živca, interno kapsulo, belino, ventrikel, lateralni ventrikel in

možgansko deblo.

Slika 17: Prikaz anatomskih področij možganov podgane, koronarni prerez možganov -10,32 mm od bregme.

Skorja malih možganov, ki tvori lističe, kateri se povezujejo v lobule, iz treh plasti: molekularna (1), tanka

plast Purkinjejevih celic (2) ter granularna (3) plast. Pet izvenkortikalnih jeder: interposedno anteriorno

(IntA), interposedno medialno (IntM ali fastigialno), interposedno posteriorno (IntP ali globozno), lateralno

cerebelarno jedro (Lat) ter intersticialno celično jedro (IJ). Olivarno jedro (OJ). Obrazni živec (OŽ) in jedra

obraznega živca (jOŽ). Možgansko deblo (MD). Ventrikel (v) in lateralni ventrikel (lv) (prilagojeno po

Paxinos in Watson, 2007: 119)

Nato smo v teh možganskih rezinah s svetlobnim mikroskopom, povezanim s kamero

Olympus DP71 (Olympus Optical), posneli hipokampus, striatum, skorjo velikih možganov

in skorjo malih možganov. Naredili smo posnetke pri 10-, 20-, in 40-kratni povečavi

mikroskopa. Zajemanje vseh slik je potekalo pri istih svetlobnih pogojih in z enakimi

nastavitvami.



3. 1.5 IMUNOFLUORESCENČNA LOKALIZACIJA PROTEINOV

Imunofluorescenčno označevanje antigenov v možganskih rezinah je bilo v začetku enako

kot pri postopku imunohistokemije (glej poglavje nazaj). Razlika je bila v uporabljenih

sekundarnih protitelesih. Pri imunohistokemičnem označevanju proteinov smo uporabili

biotinizirana sekundarna protitelesa, pri imunofluorescenčnem pa sekundarna protitelesa

konjugirana s fluorokromi različnih valovnih dolžin (AlexaFluor). V pregl. 3 so označena

primarna in sekundarna protitelesa, uporabljena v postopku imunofluorescenčnega

označevanja proteinov v možganskih rezinah. Tako kot pri imunohistokemičnem barvanju

smo tudi pri imunofluorescenčnem barvanju izvedli optimizacijo razredčitve primarnih

protiteles. Razredčitve, ki smo jih uporabili pri optimizaciji, so navedene v pregl. 4, prav

tako najbolj optimalne razredčitve. Po inkubaciji možganskih rezin s sekundarnimi

protitelesi, smo možganske rezine obarvali z 0,1-odstotno raztopino barvila Sudan Black

(Sigma), raztopljenega v 70-odstotnem etanolu. Barvanje je trajalo 5 minut pri sobni

temperaturi. Sudan Black barva lipofusceinske granule v možganih in s tem prekrije njihovo

avtofluorescenco. Po obarvanju smo možganske rezine pobrali na silanizirana krovna stekla

ter jih pokrili s Prolongom z DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol; Molecular Probes). Prolong

z DAPI jedra celic fluorescenčno označi, veže se specifično na kromatin. Pokrivni medij, v

katerega je vključen, preprečuje bledenje fluorescenčnega signala.

Pri imunofluorescenčnem označevanju proteinov SIT 7 in SINKRIP v možganskih rezinah

smo barvali s protitelesi za oba hkrati. Barvali smo s protitelesi za en protein naenkrat,

uporabili smo zaporedno imunofluorescenčno označevanje. To pomeni, da je inkubaciji s

prvim primarnim in ustreznim sekundarnim protitelesom sledila inkubacija z drugim

primarnim in ustreznim sekundarnim protitelesom. Vrstni red barvanja je bil vedno enak.

Najprej smo označili SIT 7, ki mu je sledil SINKRIP.

Sočasno smo delali negativne imunofluorescenčne kontrole. Te so bile pripravljene po istem

postopku, razlika je bila v inkubaciji s primarnimi protitelesi. Namesto inkubacije

možganskih rezin v raztopini primarnih protiteles, smo kontrolne možganske rezine

inkubirali v raztopini, v kateri smo sicer redčili primarna protitelesa. Signali negativnih

kontrol so bili šibki in nespecifični.



Preglednica 3: Primarna in sekundarna protitelesa ter neimuni serumi za imunofluorescenčno dokazovanje

proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v možganskih rezinah

Primarno protitelo Sekundarno protitelo Neimun serum

SIT 7

Kunčje poliklonsko protitelo

proti proteinu SIT 7 narejeno

v kozi

(Immuno-Biological


Japonska).

Kozje protitelo, ki prepozna

kunčje antigene, konjugirano z

AlexaFluor 488

(Invitrogen, Molecular Probes).

Kozji neimun

serum

(Vector

Laboratories,

Burlingame,

Kalifornija,

ZDA).

SINKRIP

Mišje poliklonsko protitelo

proti proteinu SINKRIP

narejeno v konju

(Immuno-Biological


Japonska).

Konjsko protitelo, ki prepozna

mišje antigene, konjugirano z

AlexaFluor 555

(Invitrogen, Molecular Probes).

Konjski neimun

serum

(Vector

Laboratories,

Burlingame,

Kalifornija,

ZDA).

Preglednica 4: Optimizacija razredčitev primarnih protiteles za imunofluorescenčno dokazovanje proteinov

sinaptotagmin 7 in SINKRIP v možganskih rezinah in optimalne razredčitve primarnih ter sekundarnih

protiteles

Protitelo

Razredčitve pri

optimizaciji

Optimalna razredčitev

protiteles

Primarno protitelo za SIT 7 1:250, 1:400, 1:750 1:400

Sekundarno protitelo za SIT 7 1:300 1:300

Primarno protitelo za SINKRIP 1:100, 1:300, 1:500 1:300

Sekundarno protitelo za SINKRIP 1:300 1:300

3. 1.5.1 Analiza in zajem slike imunofluorescenčnih preparatov

Slikanje in pregledovanje preparatov imunofluorescenčnih barvanj je potekalo z

mikroskopom AxioImager.Z1 z dodatkom ApoTome (Carl Zeiss MicroImaging GmbH,

Heidelberg, Nemčija) na Inštitutu za biologijo celice Medicinske fakultete v Ljubljani. S

fluorescenčnim mikroskopom z dodatkom ApoTome smo lahko posneli imunofluorescenčni

signal v več posameznih optičnih rezinah. Optične rezine, ki smo jih posneli, so bile 240 nm

narazen. Slikali smo pri 63-kratni povečavi.



Slika 18: Mikroskop AxioImager.Z1 z dodatkom ApoTome

na Inštitutu za biologijo celice Medicinske fakultete v Ljubljani

3. 1.5.2 Analiza kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP

S fluorescenčnim mikroskopom z dodatkom ApoTome smo posneli 10 naključnih mest (pri

63-kratni lastni povečavi) v CA1 in CA3 področju hipokampusa, striatumu in skorji velikih

možganov vsake od treh živali (n=3). V dentatnem girusu hipokampusa smo posneli 10

naključnih mest pri eni živali (n=1), v skorji malih možganov pa 10 naključnih mest v

vsakem posameznem delu slike (n=1). Vsaka slika je bila sestavljena iz (vsaj) treh optičnih

rezin, katerih goriščne ravnine so bile oddaljene 240 nm. Stopnjo kolokalizacije SIT 7 in

SINKRIP v posameznem anatomskem področju smo ovrednotili s programom ImageJ z

vmesnikom JACoP (angl. "Just Another Colocalization Plugin"). Pri skorji malih možganov

smo ovrednotili posamezni del slike (molekularni sloj, sloj Purkinjejevih celic in granularni

sloj), ki ga imenujemo območje analize (ROI, angl. "region of interest"). Purkinjejeve celice

smo analizirali z obkroževanjem som. Na vsaki sliki (in pri malih možganih v vsakem

območju analize) smo analizirali stopnjo kolokalizacije tako, da smo izračunali vrednosti

Pearsonovega koeficienta. Podatke v grafih smo prikazali kot povprečne vrednosti

kolokalizacijskih koeficientov ± SD posameznega področja.

Raziskovalci (Bolte in Cordelieres, 2006) pravijo, da sta lokacija določenega proteina v

celici in njegova vloga močno povezani, zato je lokacija izredno pomembna za razumevanje

vloge določenega proteina v biološkem procesu. Kolokalizacija je prostorsko sovpadanje

lokalizacij dveh ali več različnih proteinov v preparatu (Bolte in Cordelieres, 2006).

Kolokalizacijo smo ocenili tako, da smo imunofluorescenčno istočasno označili dva

antigena v preparatu s protitelesi označenimi s fluorokromi. Potem smo ugotavljali ali se

pojavljata na istem mestu in kolokalizacijo tudi kvantitativno ovrednotili.



Anatomska področja, v katerih smo določali kolokalizacijo, so prikazana na sl. 19, na

koronarnih prerezih možganov: hipokampus (CA1, CA3, dentatni girus) in skorja velikih

možganov -3,24 mm od bregme (sl. 19a), striatum 1,56 mm od bregme (sl. 19b) ter skorja

malih možganov -10,32 mm od bregme (sl. 18c). Pomagali smo si z Atlasom možganov

podgane (Paxinos in Watson, 2007).

Slika 19: Shema anatomskih področij, v katerih smo določali kolokalizacijo proteinov. Koronarni prerezi

možganov: (a) Hipokampus: CA1 (prazen krog), CA3 (polni krog), dentatni girus (kvadrat) in skorja velikih

možganov (zvezdice) -3,24 mm od bregme (b) Mali možgani (zvezdice) -10,36 mm od bregme (c) Striatum

(zvezdice) 1,56 mm od bregme (prilagojeno po Paxinos in Watson, 2007)

Glede na naravo in obliko fluorescenčnega signala (kaj analiziramo, kakšno je ozadje oz.

šum) smo se odločili za ustrezen pristop k analizi kolokalizacije. Tega smo se lotili tako, da

smo najprej izbrali specifične antigene, ki so nas zanimali, in nato izključili nespecifične

pojave, ki nastanejo zaradi ozadja. Fluorokromi v preparatu se pojavljajo na nivoju

nanometrov, medtem ko je ločljivost optičnega sistema bližje nivoju mikrometra, zato je

kvantitativno ovrednotenje kolokalizacije dveh antigenov označenih s fluorokromi odvisno

od več dejavnikov (Bolte in Cordelieres, 2006). Med dejavniki, na katere smo pazili zraven

optičnega sistema, sta tudi zajemanje slik ter kvaliteta in zanesljivost antigenskih

fluorescenčnih označevalcev.

Za označevanje antigenov za SIT 7 smo uporabili fluorokrom AlexaFluor 488, ki fluorescira

pri valovni dolžini 488 nm, v zelenem delu barvnega spektra. Fluorokrom AlexaFluor 555

smo uporabili za označevanje antigenov za SINKRIP. Ta fluorokrom fluorescira pri valovni

dolžini 555 nm, kar je v rdečem delu barvnega spektra. Vizualicacija fluorokromov je v

našem primeru torej potekala v zelenem in rdečem kanalu.

Za kvantificiranje kolokalizacije je najpreprostejša metoda metoda prekrivanja. Gre za to,

da pride slika iz vsakega od dveh fluorescenčnih kanalov (rdečega in zelenega) in se obe

sliki nato prekrijeta. Rdeča in zelena slikovna točka (angl. "pixel") skupaj naredita rumeno.

Kolokalizacija je s to metodo določena glede na pojavnost rumenih slikovnih točk.

Pojavljanje rumene barve pa je na žalost odvisno od moči fluorescence fluorokromov v

kanalih, zato metoda prekrivanja ni vedno primerna. Obseg kolokalizacije je možno

podceniti ali preceniti, še posebej, če gre za analizo tkivnih območij z visoko gostoto



antigenskih fluorescenčnih označevalcev, ki se jih zaradi optičnega sistema fluorescenčnega

mikroskopa ne da ločiti. Obstajata dva osnovna načina za določanje kolokalizacije v

bioloških preparatih (Bolte in Cordelieres, 2006). Prvi način je analiza kolokalizacije, ki

temelji na korelacijskih koeficientih moči fluorescenčnega signala, in je uporaben pri slikah

posnetih v dveh kanalih. Pri tem načinu gre za statistično analizo povezave med vrednostmi

moči zelenega in rdečega fluorescenčnega signala (fluorescenčni signal se pojavlja v obliki

slikovnih točk). Največkrat se z njim kvantitativno ovrednoti moč linearnega razmerja med

dvema spremenljivkama. Ti spremenljivki sta vrednosti moči sivin fluorescence slikovnih

točk v rdečem in zelenem kanalu. Drugi način temelji na iskanju sovpadajočih objektov. To

metodo se uporablja za kolokalizacijo celičnih struktur v večji velikosti od ločljivosti

optičnega sistema, z njo pa je možno kvantitativno ovrednotiti krivulje moči fluorescence in

določiti, katere strukture so prisotne. Mi smo uporabili prvi način, ki temelji na korelacijskih

koeficientih moči fluorescenčnega signala iz dveh kanalov, saj nismo kolokalizirali celičnih

struktur v večji velikosti, temveč proteine. Obstaja več kolokalizacijskih koeficientov za

kvantitativno oceno stopnje kolokalizacije. Vsak kolokalizacijski koeficient ima svoje

značilnosti (občutljivost, nanašanje na iskanje prekrivajočih se slikovnih točk v obeh

kanalih) in posledično uporabnost. Vsaka slikovna točka pri tem načinu kvantitativnega

vrednotenja kolokalizacije je kot del slike in ne del določene celične strukture (Bolte in

Cordelieres, 2006).

3. 1.5.2.1 Pearsonov korelacijski koeficient

Pearsonov korelacijski koeficient (PK) je leta 1896 definiral in zanj napisal formulo

matematik Karl Pearson. Za namene fluorescenčne mikroskopije ga je skoraj 100 let kasneje

karakteriziral Manders (Dunn in sod., 2011). Fluorogram, razsevni graf moči sivin slikovnih

točk dveh izbranih kanalov, prikaže način vrednotenja pojavljanja slikovnih točk iz teh dveh

kanalov na istem mestu. Moč sivin slikovnih točk iz enega kanala (npr. A) je prikazana na x

osi fluorograma, moč sivin iz drugega (npr. B) pa na y osi (Ai in Bi za posamezno slikovno

točko) (Bolte in Cordelieres, 2006).

Fluorogrami različnih tipov kolokalizacije so prikazani na sl. 20. V primeru, da preučevana

proteina popolnoma kolokalizirata, nastane fluorogram, kjer točke tvorijo linearno linijo (sl.

20a). Ko je kolokalizacija popolna, vendar moči signalov v obeh kanalih niso enake, točke

tvorijo linearno linijo, ki pa je samo pomaknjena k eni izmed osi (sl. 20b). V primeru delnega

prekrivanja signalov točke v fluorogramu ne tvorijo popolne linearne linije in so razpršene

(sl. 20c). Če se signala v kanalih popolnoma izključujeta, so točke ob oseh fluorograma (sl.

20d).



Slika 20: Fluorogrami različnih tipov kolokalizacije. (a) Popolna kolokalizacija (b) Popolna kolokalizacija z

različnimi intenzitetami fluorescence v zelenem in rdečem kanalu (c) Delna kolokalizacija (d) Izključevanje

signalov, ni kolokalizacije (prilagojeno po Bolte in Cordelieres, 2006: 10)

Vrednosti PK, ki se izračunajo po formuli (1) (Dunn in sod., 2011), so vedno med -1 in 1.

Pri popolni izključitvi signalov je vrednost PK -1, ko ni kolokalizacije 0, pri popolni

kolokalizaciji pa 1. V bioloških vzorcih je vrednost 1 mogoča samo, ko podvojimo določeno

sliko (Bolte in Cordelieres, 2006).

PK =∑ 𝑖 (𝑅𝑖 − �̅�) 𝑥 (𝐺𝑖 −�̅�)

√∑ 𝑖 (𝑅𝑖−�̅�)2 𝑥 ∑ 𝑖 (𝐺𝑖 −�̅�)2 ... (1)

𝑅𝑖 v formuli (1) pomeni moč fluorescence v rdečem (angl. "red") kanalu, 𝐺𝑖 moč

fluorescence v zelenem (angl. "green") kanalu za povprečno točko v fluorogramu (Ai, Bi).

�̅� in �̅� predstavljata povprečno moč fluorescence v posameznem kanalu (Dunn in sod.,

2011).

PK vrednoti pojavljanje slikovnih točk iz dveh kanalov na istem mestu, ni pa zanesljiv način

za pravo kvantifikacijo kolokalizacije. Vrednotenje vrednosti PK je lahko težavno zaradi

deljenih mnenj raziskovalcev o negativnih vrednostih PK. Pri vrednotenju je mogoče tudi,

da pride do zapletov zaradi nespecifičnega ozadja ali prehajanja fluorescenčne emisije (angl.

"bleedthrough") in neenakomerne razporeditve proteinov v preparatu (Bolte in Cordelieres,

2006).



4 REZULTATI

4. 1.1 LOKACIJA PROTEINOV SINAPTOTAGMIN 7 IN SINKRIP

V možganskih rezinah intaktnih možganov podgane smo z imunohistokemičnim

označevanjem proteinov SIT 7 in SINKRIP s specifičnimi protitelesi analizirali lokalizacijo

teh dveh proteinov v anatomskih področjih možganov v treh različnih oddaljenostih od

bregme: 1,56 mm, -3,24 mm ter -10,56 mm, ter zajeli vsa prisotna anatomska področja.

Prisotnost proteinov smo določevali glede na prisotnost obarvanja. Protitelesa, konjugirana

z biotinom, obarvajo protein-pozitivna mesta rjavo.

4. 1.1.1 Protein sinaptotagmin 7 je prisoten v večini anatomskih področij

Z imunohistokemičnim označevanjem SIT 7 s kozjimi protitelesi, ki prepoznajo kunčje

antigene in so konjugirana z biotinom, so se SIT 7-pozitivna mesta obarvala rjavo.

Ugotavljali smo, ali se SIT 7 pojavlja v možganih podgane in v katerih anatomskih področjih

je prisoten.

Na sl. 21 je vidno, da je signal za SIT 7 prisoten v večini anatomskih področij v koronarnem

prerezu možganov -3,24 mm od bregme; močno je prisoten v naslednjih področjih: v

hipokampusu (v CA1, CA3, dentatnem girusu ter izrazito močno v mahovitih vlaknih), skorji

velikih možganov, piriformnem korteksu (v vseh treh slojih, najmočneje se je obarval sloj

2), amigdaloidnih, talamičnih in hipotalamičnih jedrih. Slabo je signal za SIT 7 zaznaven v

belini, kaloznem korpusu, interni kapsuli, forniksu, mamilotalamičnem traktu, ventriklu in

lateralnem ventriklu te možganske rezine. Skorja velikih možganov se je obarvala

enakomerno v vseh predelih: v cingulatnem korteksu, v primarnem in sekundarnem

motoričnem korteksu, primarnem in sekundarnem somatosenzoričnem korteksu, avditornem

korteksu, entorinalnem korteksu.


prerezu možganov 1,56 mm od bregme; močno v naslednjih področjih: v možganski skorji,

striatumu ter olfaktornem tuberkulu striatuma. Slabo je signal za SIT 7 zaznaven v kaloznem

korpusu, interni kapsuli in ventriklu. Skorja velikih možganov se je obarvala enakomerno

po plasteh v vseh predelih. Močno se je obarval striatum v predelu matriksa, ne pa v predelu

strij. V olfaktornem tuberkulu je signal močen predvsem v plasti 1 in 3, manj v plasti 2.

Akumbens se je zelo šibko obarval.


prerezu možganov -10,32 mm od bregme; močno v naslednjih področjih: v izvenkortikalnih

jedrih (interposednih jedrih, lateralnem cerebelarnem jedru, intersticialnem celičnem jedru),

olivarnem jedru in skorji malih možganov. V belini, ventriklu in lateralnem ventriklu,

obraznem živcu, jedrih obraznega živca in možganskem deblu signala skoraj ni. V skorji



malih možganov je najmočneje obarvana plast Purkinjejevih celic, granularna in

molekularna plast sta šibkeje obarvani.

Slika 21: Sinaptotagmin 7 je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov -3,24 mm od

bregme. Močen signal v skorji velikih možganov (MS, vsi predeli) in hipokampusu: CA1, CA2, CA3,

dentatnem girusu (DG) ter mahovitih vlaknih (mv), v sloju 1 in 3 piriformnega korteksa (Pir – 1, 3),

amigdaloidnih (AMG), talamičnih (Tal) in hipotalamičnih (HIP) jedrih. Malo šibkejši signal v sloju 2

piriformnega korteksa (Pir – 2). V belini (bel), kaloznem korpusu (cc), interni kapsuli (ka), forniksu (f),

mamilotalamičnem traktu (mt), ventriklu (v) in lateralnem ventriklu (lv) je zelo šibek oz. skoraj odsoten.

Slika 22: Sinaptotagmin 7 je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov 1,56 mm od

bregme. Močen signal v striatumu (STR) - v matriksu (trikotnik) ne v predelu strij (krog), v plasti 1 in 3

olfaktornega tuberkula striatuma (OT – 1, 3). Malo šibkejši signal v plasti 2 olfaktornega tuberkula (OT – 2).

Najšibkejši in skoraj odsoten signal v kaloznem korpusu (cc), interni kapsuli (ka), ventriklu (v) ter

akumbensu (Ac).



Slika 23: Sinaptotagmin 7 je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov -10,32 mm

od bregme. Močen signal je prisoten v izvenkortikalnih jedrih: interposednih jedrih (Int), lateralnem

cerebelarnem jedru (Lat), intersticialnem celičnem jedru (IJ) in olivarnem jedru (OJ) ter v plasti

Purkinjejevih celic (2) skorje malih možganov (SMM). Malo šibkejši signal je v molekularni (1) in

granularni plasti (3) skorje malih možganov. V obraznem živcu (OŽ), jedrih obraznega živca (jOŽ), belini

(bel), ventriklu (v), lateralnem ventriklu (lv) in možganskem deblu (MD) je signal zelo šibek.



4. 1.1.2 Protein SINKRIP je prisoten v večini anatomskih področij

Z imunohistokemičnim označevanjem proteina SINKRIP s konjskimi protitelesi, ki

prepoznajo mišje antigene in so konjugirana z biotinom, so se rjavo obarvala SINKRIP-

pozitivna mesta. Zanimalo nas je, ali se SINKRIP pojavlja v vseh preučevanih možganskih

anatomskih področjih in v katerih področjih je prisoten.

Na sl. 24 je vidno, da je signal za SINKRIP prisoten v večini anatomskih področij v

koronarnem prerezu možganov -3,24 mm od bregme; močno v naslednjih področjih: v

hipokampusu, skorji velikih možganov, piriformnem korteksu (v vseh treh slojih,

najmočneje sta se obarvala sloj 1 in 3), amigdaloidnih, talamičnih in hipotalamičnih jedrih.

Slabo je signal za SINKRIP zaznaven v belini, kaloznem korpusu, interni kapsuli, forniksu,

mamilotalamičnem traktu, ventriklu in lateralnem ventriklu te možganske rezine. V

hipokampusu so se močno obarvala vsa tri CA področja ter dentatni girus. Malo šibkejši

signal je v mahovitih vlaknih, nitju granularnih celic dentatnega girusa. Skorja velikih

možganov se je obarvala enakomerno v vseh predelih: v cingulatnem korteksu, primarnem

in sekundarnem motoričnem korteksu, primarnem in sekundarnem somatosenzoričnem

korteksu, avditornem korteksu, entorinalnem korteksu.


koronarnem prerezu možganov 1,56 mm od bregme; močno v naslednjih področjih: v

možganski skorji, striatumu ter olfaktornem tuberkulu striatuma. Slabo je signal za SINKRIP

zaznaven v kaloznem korpusu, interni kapsuli in ventriklu. Skorja velikih možganov se je

obarvala enakomerno po plasteh v vseh predelih. Močno je obarvan striatum v predelu

matriksa, v predelu strij zelo šibko. V olfaktornem tuberkulu je signal močen predvsem v

plasti 2, manj v plasti 1 in 3. Akumbens se je zelo šibko obarval.


koronarnem prerezu možganov -10,32 mm od bregme; močno v naslednjih področjih: v

izvenkortikalnih jedrih (interposednih jedrih, lateralnem cerebelarnem jedru, intersticialnem

celičnem jedru), olivarnem jedru in skorji malih možganov. V belini, ventriklu in lateralnem

ventriklu, obraznem živcu, jedrih obraznega živca in možganskem deblu signala skoraj ni.

V skorji malih možganov je najmočneje obarvana plast Purkinjejevih celic, granularna plast

in molekularna plast sta šibkeje obarvani.

Signal za SINKRIP je v vseh možganskih rezinah nasploh šibkejši kot za SIT 7.



Slika 24: SINKRIP je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov -3,24 mm od

bregme. Močen signal v skorji velikih možganov (MS), v CA1, CA2, CA3 ter dentatnem girusu (DG)

hipokampusa, v sloju 2 piriformnega korteksa (Pir – 2), amigdaloidnih (AMG), talamičnih (Tal) in

hipotalamičnih (HIP) jedrih. Malo šibkejši signal v mahovitih vlaknih (mv) hipokampusa, sloju 1 in 3

piriformnega korteksa (Pir – 1, 3). V belini (bel), kaloznem korpusu (cc), interni kapsuli (ka), forniksu (f),

mamilotalamičnem traktu (mt), ventriklu (v), lateralnem ventriklu (lv) je signal zelo šibek.

Slika 25: SINKRIP je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov 1,56 mm od

bregme. Močen signal v skorji velikih možganov (MS), striatumu (STR) - v matriksu (trikotnik) ne v

predelu strij (krog), v plasti 2 olfaktornega tuberkula striatuma (OT – 2). Malo šibkejši signal v plasti 1 in 3

olfaktornega tuberkula (OT – 1, 3). Najšibkejši in skoraj odsoten signal v kaloznem korpusu (cc), interni

kapsuli (ka), ventriklu (v) ter akumbensu (Ac).



Slika 26: SINKRIP je prisoten v večini anatomskih področij, koronarni prerez možganov -10, 32 mm od

bregme. Močen signal je prisoten v izvenkortikalnih jedrih: interposednih jedrih (Int), lateralnem

cerebelarnem jedru (Lat), intersticialnem celičnem jedru (IJ) in v olivarnem jedru (OJ) ter v plasti

Purkinjejevih celic (2) skorje malih možganov (SMM). Malo šibkejši signal je v molekularni (1) in

granularni plasti (3) skorje malih možganov (SMM). V obraznem živcu (OŽ), jedrih obraznega živca (jOŽ),

belini (bel), ventriklu (v), lateralnem ventriklu (lv) in možganskem deblu (MD) je signal zelo šibek.



4. 1.1.3 Signal za protein sinaptotagmin 7 je najmočnejši v nevropilu

Ugotovili smo, da je SIT 7 v vseh področjih hipokampusa, torej v CA1, CA3 in dentatnem

girusu. Signal je močen v nevropilu5 obeh CA področij ter v nevropilu molekularnega in

polimorfnega sloja dentatnega girusa. V somah celic v CA1 (sl. 27b), CA3 (27d) in

granularnem sloju - v somah granularnih celic dentatnega girusa (sl. 27c) hipokampusa je

signal za SIT 7 zelo šibek. Predvsem močen je v mahovitih vlaknih, nitju granularnih celic

dentatnega girusa (sl. 27d).

SIT 7 je prisoten v skorji velikih možganov. Močen signal je v nevropilu zunanje, t.i.

molekularne plasti, kjer so dendriti piramidastih nevronov. V nevropilu bolj notranjih plasti

(zunanja granularna in piramidalna plast, notranja granularna in piramidalna plast ter plast

6) je šibkejši. V somah celic teh plasti je signal za SIT 7 zelo šibek (sl. 28b).

SIT 7 smo zaznali v striatumu. Tam je signal zanj najbolj prisoten v nevropilu matriksa,

predvsem v izrastkih celic posredne in neposredne poti (v nadaljevanju celice matriksa). V

strijah in v somah celic matriksa je signal zelo šibek (sl. 28d).

SIT 7 smo zaznali tudi v skorji malih možganov. V malih možganih je najbolj SIT 7-

pozitivno mesto zunanja, molekularna plast. V vseh treh plasteh je SIT 7 najbolj prisoten v

nevropilu v izrastkih zvezdastih in košaričastih internevralnih celic, ter granularnih celic

(paralelnih vlaknih) in Purkinjejevih celic. Signal je izrazit v plasti Purkinjejevih celic, torej

somah Purkinjejevih celic (sl. 28h). V granularni plasti smo SIT 7 zaznali prav tako v

nevropilu v izrastkih granularnih celic in Golgijevih internevralnih celic, some teh celic niso

dobro obarvane in signal v njih je zelo šibek.

5 Nevropil je splet izrastkov nevronov (aksonov in dendritov), sinaps in celic glije (Pearsall J., Neuropil).



Slika 27: Sinaptotagmin 7 je najbolj prisoten v nevropilu vseh področij hipokampusa. (a) Koronarni prerez

možganov -3,24 mm od bregme (b) Povečano CA1 področje hipokampusa; močen signal v nevropilu (glava

puščice), šibek pa v somah piramidalnih nevronov (zvezdica) (c) Povečan dentatni girus; močen signal v

nevropilu molekularnega (trikotnik), granularnega (zvezdica) in polimorfnega sloja (krog), v somah

granularnih celic (zvezdica) šibek signal (d) Povečano CA3 področje hipokampusa; močen signal v

mahovitih vlaknih (glava puščice), v somah piramidalnih nevronov (zvezdica) zelo šibek. Merilce: 100µm



Slika 28: Sinaptotagmin 7 je najbolj prisoten v nevropilu skorje velikih možganov, matriksa striatuma in

nevropilu skorje malih možganov. (a) Koronarni prerez možganov -3,24 mm od bregme (b) Povečana skorja

velikih možganov; največ signala v nevropilu zunanjih plasti (glava puščice) in malo manj v nevropilu

notranjih plasti (zvezdica), v somah celic možganske skorje ga je zelo malo (c) Koronarni prerez možganov

1,56 mm od bregme (d) Povečan striatum; največ signala v nevropilu matriksa (glava puščice), v somah celic

matriksa in strijah ga je zelo malo (zvezdica) (e) Koronarni prerez možganov -10,32 mm od bregme (f) 10-

krat povečan list malih možganov (g) 20-krat povečan list malih možganov (h) 40-krat povečana skorja

malih možganov; močen signal v nevropilu molekularne plasti, kjer so prisotni dendriti Purkinjejevih celic

(krog) in vzporedna vlakna granularnih celic, v somah Purkinjejevih celic (glava puščice) in somah celic

granulane plasti (zvezdica). Merilce: 100µm



4. 1.1.4 Signal za protein SINKRIP je najmočnejši v somah celic

Ugotovili smo, da je tako kot SIT 7 tudi SINKRIP v vseh področjih hipokampusa (CA1,

CA3 in dentatnem girusu). V CA1 (sl. 29b) in CA3 (sl. 29d) področju hipokampusa je signal,

obratno kot za SIT 7, močen v somah piramidalnih nevronov in postaja šibkejši v dendritih

piramidalnih nevronov, v ostalem nevropilu je skoraj odsoten. V dentantnem girusu (sl. 29c)

je SINKRIP, obratno kot SIT 7, prisoten v somah in dendritih celic, zaradi števila celic

predvsem v granularni plasti, v drugih plasteh manj. V nevropilu molekularne, granularne in

polimorfne plasti dentatnega girusa je signal šibek. Šibek je tudi v mahovitih vlaknih, nitju

granularnih celic dentatnega girusa (sl. 29d).

Protein SINKRIP je prisoten v skorji velikih možganov; zaradi številčnosti celic najbolj v

molekularni plasti. V nevropilu te in drugih plasti (zunanja granularna in piramidalna plast,

notranja granularna in piramidalna plast ter plast 6) je signal nasploh zelo šibek. V vseh

plasteh so se močno obravale some piramidastih in granularnih celic (sl. 30b).

Protein SINKRIP smo zaznali v striatumu. V striatumu je močno prisoten v somah in malo

šibkejše v izrastkih celic matriksa. V področju strij je signal za protein SINKRIP zelo šibek

(sl. 30d).

Ugotovili smo, da je protein SINKRIP prisoten v skorji malih možganov. Najbolj močno so

obarvane some Purkinjejevih celic (sl. 30f). Signal smo v granularni plasti dobili predvsem

verjetno v somah granularnih in Golgijevih internevralnih celic. V nevropilu granularne

plasti proteina SINKRIP nismo močno zaznali, kar pomeni, da verjetno ni prisoten v

izrastkih Purkinjejevih celic ter paralelnih vlaknih. Signal je tudi v somah in izrastkih celic

molekularnih plasti - verjetno v zvezdastih ter košaričastih internevralnih celicah.



Slika 29: SINKRIP je prisoten v večini som celic vseh področij hipokampusa. (a) Koronarni prerez

možganske rezine v oddaljenosti -3,24 mm od bregme (b) Povečano CA1 področje hipokampusa; močen

signal v somah in dendritih piramidalnih nevronov (glava puščice), ne pa v ostalem nevropilu (zvezdica) (c)

Povečan dentatni girus; močen signal v granularni plasti v somah in dendritih granularnih celic (glava

puščice) ter v somah celic molekularne in polimorfne plasti, v ostalem nevropilu dentatnega girusa je šibek

signal (zvezdica) (d) Povečano CA3 področje hipokampusa; močen signal v somah in dendritih nevronov

CA3 področja (glava puščice), v mahovitih vlaknih granulanih celic in ostalem nevropilu (zvezdica) šibek.

Merilce: 100µm



Slika 30: SINKRIP je najbolj prisoten v somah celic skorje velikih možganov, matriksa striatuma in skorje

malih možganov. (a) Koronarni prerez možganov -3,24 mm od bregme (b) Povečana skorja velikih

možganov; največ signala je v piramidalni plasti (glava puščice) in prisoten je v večini som celic vseh plasti,

v nevropilu je zelo šibek (zvezdica) (c) Koronarni prerez možganov 1,56 mm od bregme (d) Povečan

striatum; močen signal v somah in dendritih celic matriksa (glava puščice), v ostalem nevropilu matriksa in

strijah je signal šibek (zvezdica) (e) Koronarni prerez možganov -10,32 mm od bregme (f) Povečana skorja

malih možganov; močno obarvane some Purkinjejevih celic (glave puščic), signal v granularni plasti

predvsem verjetno v somah granularnih in Golgijevih internevralnih celic (zvezdica), v somah in izrastkih

celic molekularne plasti (krog), verjetno so to zvezdaste ter košaričaste internevralne celice. Merilce: 100µm



4. 1.2 STOPNJA KOLOKALIZACIJE PROTEINOV SINAPTOTAGMIN 7 IN

SINKRIP JE NIZKA, RAZEN V PURKINJEJEVIH CELICAH MALIH

MOŽGANOV

V možganskih rezinah intaktnih možganov podgane smo z dvojnim imunofluorescenčnim

označevanjem proteinov SIT 7 in SINKRIP s specifičnimi protitelesi, ki označijo ta proteina,

analizirali njuno kolokalizacijo v štirih možganskih področjih: v hipokampusu (v CA1, CA3,

dentatnem girusu), skorji velikih možganov, striatumu in skorji malih možganov (v

granularni in molekularni plasti ter somah Purkinjejevih celic).

Kozje protitelo, ki prepozna kunčje antigene, konjugirano z AlexaFluor 488, označi protein

SIT 7 zeleno. Konjsko protitelo, ki prepozna mišje antigene, konjugirano z AlexaFluor 555,

označi protein SINKRIP rdeče. Jedra celic so označena modro zaradi Prolong z DAPI.

Kolokalizacijo smo analizirali in kvantitativno ovrednotili s Pearsonovim koeficientom ±

SD za vsako preučevano anatomsko področje možganov.

4. 1.2.1 Kolokalizacija v hipokampusu

Ugotovili smo, da je signal za SIT 7 močen v večini nevropila, malo šibkejši v nekaterih

izrastkih (verjetno dendritih) piramidalnih celic v CA1 (sl. 31 B) in CA3 (sl. 31 Bʺ) področju

hipokampusa. V somah piramidalnih nevronov v CA1 in CA3 hipokampusa ter v somah

granularnih celic dentatnega girusa signala skoraj nismo zaznali. SIT 7 je močno prisoten v

mahovitih vlaknih (sl. 31 Bʺ) ter v nevropilu granularnega in polimorfnega sloja dentatnega

girusa (sl. 31 B*).

Protein SINKRIP je prisoten v vseh področjih hipokampusa (v CA1, CA3 in dentatnem

girusu). V hipokampusu je signal, obratno kot za SIT 7, močen v somah piramidalnih

nevronov v CA1 (sl. 31 C) in CA3 (sl. 31 Cʺ) področju, ter postaja šibkejši v dendritih

piramidalnih nevronov. V ostalem nevropilu teh dveh področij je skoraj odsoten. Signal za

SINKRIP je močen v somah granularnih celic dentatnega girusa, ter šibek v nevropilu (sl.

31 C*). Stopnja kolokalizacije v vseh področjih hipokampusa je nizka, signala se

izključujeta. Signal za SIT 7 je v vseh področjih hipokampusa močno prisoten v nevropilu,

signal za SINKRIP pa v somah nevronov. Graf vrednosti PK za CA1 področje je na sl. 31

D, za CA3 na sl. 31 Dʺ, za dentatni girus na sl. 31 D*. V pregl. 5 so navedene vrednosti

Pearsonovega koeficienta za posamezno področje hipokampusa.

Preglednica 5: Vrednosti Pearsonovega koeficienta za posamezno področje hipokampusa

CA1 CA3 Dentatni girus

-0,25 (± 0,037) -0,09 (± 0,025) -0,15 (± 0,042)



Slika 31: Nizka stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v CA1, CA3 ter dentatnem

girusu hipokampusa. (A) CA1: oba proteina (B) Sinaptotagmin 7 v CA1 področju; močen signal v večini

nevropila (glava puščice), šibkejši v izrastkih (verjetno dendritih) in somah piramidalnih celic (zvezdica) (C)

SINKRIP v CA1 področju; močen signal v somah in dendritih piramidalnih nevronov (glava puščice), v

ostalem nevropilu šibek (zvezdica) (Aʺ) CA3 področje: oba proteina (Bʺ) Sinaptotagmin 7 v CA3 področju;

močen signal v mahovitih vlaknih (krog), šibek v somah in dendritih piramidalnih nevronov (zvezdica) (Cʺ)

SINKRIP v CA3 področju; močen signal v somah in dendritih piramidalnih nevronov (glava puščice), v

ostalem nevropilu šibek (zvezdica) (A*) Dentatni girus: oba proteina (B*) Sinaptotagmin 7 v dentatnem

girusu; močen signal v nevropilu granularnega sloja (glava puščice) ter polimorfnega sloja (kara), šibek v

somah granularnih celic (zvezdica) (C*) SINKRIP v dentatnem girusu; močen signal v somah granularnih

celic (glava puščice), v nevropilu granularnega in polimorfnega sloja (zvezdica) šibek (D) Graf povprečja PK

za CA1 področje (PK=-0,25 (± 0,037), n=3, št. posnetkov=30) (Dʺ) Graf povprečja PK za CA3 področje

(PK=-0,09 (± 0,025), n=3, št. posnetkov=30) (D*) Graf povprečja PK za dentatni girus

(PK=-0,152 (± 0,042), n=1, št. posnetkov=10)



4. 1.2.2 Kolokalizacija v skorji velikih možganov

Ugotovili smo, da je v skorji velikih možganov močen signal za SIT 7 v nevropilu, v somah

nevronov pa šibek (sl. 32 B). Protein SINKRIP je, nasprotno, prisoten v somah in izrastkih

nevronov, verjetno v dendritih (sl. 32 C), v ostalem nevropilu šibek. Stopnja kolokalizacije

proteinov je nizka. Vrednost Pearsonovega koeficienta je -0,06 (± 0,04), kar je prikazano z

grafom na sl. 32 D.

Slika 32: Nizka stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v skorji velikih možganov.

(A) Oba proteina (B) Sinaptotagmin 7; močen signal v nevropilu (glava puščice), v somah nevronov šibek

(zvezdica) (C) SINKRIP; močen signal v somah in nekaterih izrastkih nevronov (glava puščice), v ostalem

nevropilu šibek (zvezdica) (D) Graf povprečja PK za skorjo velikih možganov (možgansko skorjo; PK=-0,06

(± 0,04), n=3, št. posnetkov=30)

4. 1.2.3 Kolokalizacija v striatumu

Proteina SIT 7 in SINKRIP sta prisotna v striatumu. Močen signal za SIT 7 je v nevropilu

matriksa, v strijah in somah celic matriksa je skoraj odsoten (sl. 33 B). Signal za SINKRIP

je, ravno obratno, močno prisoten v somah celic matriksa medtem ko je v strijah in nevropilu

matriksa skoraj odsoten (sl. 33 C). Stopnja kolokalizacije proteinov je nizka. Vrednost

Pearsonovega koeficienta je 0,04 (± 0,05), kar prikazuje graf na sl. 33 D.



Slika 33: Nizka stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v striatumu. (A) Oba proteina

(B) Sinaptotagmin 7; močen signal v nevropilu (glava puščice), šibek v somah celic matriksa ter strijah

(zvezdica) (C) SINKRIP; močen signal v somah celic matriksa (glava puščice), v nevropilu (zvezdica) in

strijah signala skoraj ni (D) Graf povprečja PK za striatum (PK=0,04 (± 0,05), n=3, št. posnetkov=30)

4. 1.2.4 Kolokalizacija v skorji malih možganov

V skorji malih možganov je pri imunohistokemičnih barvanjih dobro vidno, da se oba

proteina pojavljata v plasti Purkinjejevih celic. To je prikazano na sl. 34.

Prisotnost proteinov smo preučili tudi pri imunofluorescenčnih barvanjih. Signal za SIT 7 je

v granularni plasti najbolj močen v nevropilu, v somah granularnih celic je šibek (sl. 35 B).

Signal za SINKRIP je, obratno, močen v somah granularnih celic in šibek v nevropilu (sl.

35 C). Stopnja kolokalizacije proteinov v tej plasti skorje malih možganov je nizka, vrednost

Pearsonovega koeficienta je 0,16 (± 0,028). V molekularni plasti skorje malih možganov je

signal za SIT 7 močen v nevropilu (sl. 35 B), signal za SINKRIP je v nevropilu te plasti

šibek (sl. 35 C). Stopnja kolokalizacije proteinov je tudi v tej plasti nizka, vrednost

Pearsonovega koeficienta je 0,07 (± 0,042).

Oba signala, tako za SIT 7 kot za SINKRIP, sta močna v somah Purkinjejevih celic (sl. 35

B za SIT 7, sl. 35 C za SINKRIP). Stopnja kolokalizacije proteinov v tej plasti je visoka,

vrednost Pearsonovega koeficienta je 0,55 (± 0,059). Vrednosti Pearsonovega koeficienta za

vsako področje skorje malih možganov so prikazane na grafu, sl. 35 D.



Slika 34: Sinaptotagmin 7 in SINKRIP sta prisotna v Purkinjejevih celicah. (A) Sinaptotagmin 7 v somah

Purkinjejevih celic (glave puščic) (B) SINKRIP v somah Purkinjejevih celic (glave puščic)

Slika 35: Stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v skorji malih možganov.

Posamezno območje smo analizirali z obkroževanjem. (A) Oba proteina (B) Sinaptotagmin 7; močen signal v

nevropilu granularne plasti (glava puščice), nevropilu molekularne plasti (krog) in somah (trikotnik) ter

dendritih (puščica) Purkinjejevih celic; v somah granularnih celic (zvezdica) je šibek (C) SINKRIP; močen

signal v somah granularnih celic (zvezdica) in Purkinjejevih celicah (trikotnik) ter dendritih Purkinjejevih

celic (puščica), v nevropilu granularne (glava puščice) in molekularne plasti (krog) šibek (D) Graf povprečja

PK za male možgane (some Purkinjejevih celic (PC)=0,55 (±0,059) n=1, št. posnetkov=10. Molekularni

sloj=0,07 (± 0,042), n=1, št. posnetkov=10. Granularni sloj=0,16 (± 0,028), n=1, št. posnetkov=10)



Slika 36: Visoka stopnja kolokalizacije proteinov sinaptotagmin 7 in SINKRIP v somah Purkinjejevih celic

in prisotnost obeh proteinov v dendritih. Some celic smo analizirali z obkroževanjem. (A) Oba proteina (B)

Sinaptotagmin 7; močen signal v somah Purkinjejevih celic (trikotnik) in dendritih (puščica) (C) SINKRIP;

močen signal v somah Purkinjejevih celic (trikotnik) in dendritih (puščica)

Graf 1: Povprečne vrednosti Pearsonovih korelacijskih koeficientov v posameznih anatomskih področjih.

CA1 (PK=-0,25 (± 0,037), n=3, št. posnetkov=30). CA3 (PK= -0,09 (± 0,025), n=3, št. posnetkov=30).

Dentatni girus (PK=-0,152 (± 0,042), n=1, št. posnetkov=10). Skorja velikih možganov (PK=-0,06 (±

0,04), n=3, št. posnetkov=30). Striatum (PK=0,04 (± 0,05), n=3, št. posnetkov=30). Skorja malih

možganov (PK some Purkinjejevih celic (PC)=0,55 (±0,059) n=1, št. posnetkov=10. PK molekularni sloj=0,07 (±

0,042), n=1, št. posnetkov=10. PK granularni sloj=0,16 (± 0,028), n=1, št. posnetkov=10).



5 RAZPRAVA

5. 1.1 MOREBITNA VLOGA PROTEINOV SINKRIP IN SINAPTOTAGMIN 7 NA

PODLAGI UGOTAVLJANJA PRISOTNOSTI V MOŽGANSKIH PODROČJIH

V naši raziskavi smo se osredotočili na morebitno vlogo proteinov SINKRIP in SIT 7 na

podlagi ugotavljanja prisotnosti v možganskih področjih. Osnovna specifična vloga proteina

SIT 7 v tistih anatomskih področjih možganov, kjer je prisoten, je verjetno eksocitoza

različnih membranskih struktur, kot so sekretorni vezikli in lizosomi. Eksocitoza poteka v

odvisnosti od Ca2+, kalcijevi ioni v citoplazmi se vežejo na C2 podenoti SIT 7 v membrani

sekretornega vezikla (Andrews in Chakrabarti, 2005) in na ta način SIT 7 sodeluje pri

počasni in nesinhroni eksocitozi (Bacaj in sod., 2013) snovi iz sekretornih veziklov. O vlogi

SIT 7 v nevronih možganov ni veliko znanega, veliko poskusov o SIT 7 je bilo namreč

narejenih na drugih celicah in tkivih, saj SIT 7 ni vezan le na živčevje. Tako obstaja malo

relevantnih raziskav v povezavi z našo raziskavo. Znano je, da v nevronih SIT 7 najdemo v

dendritih presinaptičnih celic oz. presinaptični aktivni coni (Andrews in Chakrabarti, 2005),

kjer med drugim interagira s specifičnim glikoproteinom na membrani lizosomov.

Domnevajo, da v takšnem primeru SIT 7 posreduje združevanje lizosomalnih membran s

plazmalemo in rast nevritov nevronov simpatičnega sistema (Arantes in Andrews, 2006).

Tudi v hipokampusnih nevronih SIT 7 najdemo v aksonih na področju sinaps (Monterrat in

sod., 2007), kjer naj bi bil ključen pri prenosu sinaptičnih veziklov v dendrite. Na to funkcijo

kaže prav tako prisotnost SIT 7 na plazemski membrani (Sugita in sod., 2001). SIT 7 torej

sodeluje tudi pri samem prenosu sinaptičnih veziklov (ti vsebujejo nevrotransmiterje) iz

some v dendrite nevronov. Slednje je bilo dokazano samo na primeru nevrotransmiterja

dopamina - ko pride do znižanega izražanja SIT 7, se zmanjša koncentracija tega

nevrotransmiterja v somi in dendritih (Mendez in sod., 2011). SIT 7 je zaradi morebitnega

sodelovanja pri nastanku novih membran in s tem rasti nevronov (Arantes in Andrews, 2006)

pomemben pri raziskavah nevrodegenerativnih bolezni. Patofiziološki procesi pri teh

boleznih, npr. pomanjkanje energije, porušenje ionske homeostaze, pojav reaktivnega kisika

in drugo, vodijo v apoptozo in nekrozo nevronov ter nepravilnosti sinaptičnih medceličnih

povezav. SIT 7 je morda pomemben pri obnavljanju degeneriranih nevronov in pri

prilagajanju ob njihovi izgubi (Glavan in sod., 2009). Raziskovalci (Wishart in sod., 2006)

sklepajo, da gre pri vseh nevrodegenerativnih boleznih za isti celični in molekularni

mehanizem nastanka, mehanizem, osredotočen na sinapse. Za nastajajnje novih ter delovanje

že obstoječih sinaps je pomemben prepis nekaterih molekul mRNA za proteine, ki so

sestavni del sinaps (Czaplinski, 2014). Vloga proteina SINKRIP v vseh anatomskih

področjih, kjer se le-ta pojavlja, pa je povezana prav s prepisom mRNA, saj sodeluje pri

znotrajceličnem prenosu mRNA (s pomočjo granul mRNA) v dendrite nevronov, kjer se te

molekule potem prepisujejo. Interakcija med njima bi posledično lahko nakazovala

vključenost SIT 7 pri prenosu mRNA v dendrite (Mizutani in sod., 2000). RNA-vezavni

citoplazemski protein SINKRIP se sicer veže na SIT 7 preko podenote C2B (Mizutani in

sod., 2000), vendar so dosedaj to pokazali samo in vitro (te raziskave so potekale na celičnih



kulturah COS-7 in Sf9 celic in ne iz nevronov možganov) (Mizutani in sod., 2000). Zato

smo to preverili še in vivo, da bi v primeru njune kolokalizacije lahko potrdili našo hipotezo

o vključenosti SIT 7 pri prenosu mRNA v dendrite nevronov. V raziskavi smo s tem

namenom z metodo imunofluorescence analizirali kolokalizacijo proteinov SIT 7 in

SINKRIP. mRNA se prenašajo tako z granulami mRNA kot tudi z zunajceličnimi vezikli

(EV) - tudi ti imajo pomembno vlogo pri sinaptični komunikaciji med nevroni (Candelario

in Steindler, 2014). V nadaljnjih raziskavah bi lahko raziskali prisotnost SIT 7 še v teh

veziklih in to bi pripomoglo k razumevanju vloge prenosa mRNA, vendar v tem primeru ne

prenosa mRNA v dendrite. Tudi na ta način bi lahko izboljšali razvoj raznih molekularnih

in bioloških terapij za nevrodegenerativne bolezni.

Pokazano je bilo sicer, da transport mRNA v dendrite v nevronih poteka predvsem s pomočjo

granul RNA (Batish in sod., 2012), a nekateri avtorji navajajo, da je transport možen tudi s

pomočjo določenih organelov, npr. citoplazemskega razdelka, imenovanega mitohondrijski

oblak in endoplazmatskega retikuluma, na podlagi lokalizacije citoplazemske mRNA s

pomočjo specifičnega proteina v žabjih oocitih (Schnapp in sod., 1997; Deshler in sod.,

1998). Možno bi bilo, da obstaja podoben način transporta mRNA v dendrite tudi v nevronih.

S pomočjo imunohistokemije smo analizirali prisotnost proteinov SIT 7 in SINKRIP v

koronarnih prerezih možganov 1,56 mm, -3,24 mm ter -10,56 mm oddaljenosti od bregme

ter ugotovili, da se oba proteina pojavljata v večini anatomskih področij. Signal za SIT 7 v

celotnih možganskih rezinah je viden na sl. 21, sl. 22, sl. 23, signal za SINKRIP pa na sl. 24,

sl. 25, sl. 26. Signal za oba proteina je močen v hipokampusu, matriksu striatuma, skorji

velikih možganov, skorji malih možganov, piriformnem korteksu, olfaktornem tuberkulu,

amigdaloidnih, talamičnih in hipotalamičnih jedrih, izvenkortikalnih jedrih in olivarnem

jedru malih možganov. Večina predhodnih raziskav kaže na to, da imata v celotnih možganih

podgane proteina SIT 7 in SINKRIP različne funkcije. SIT 7 v vsakem od anatomskih

področij kjer je, sodeluje pri izločanju specifičnih snovi (nevrotransmiterjev), medtem ko

SINKRIP sodeluje pri znotrajceličnem prenosu specifičnih mRNA v dendrite celic.

Vsebnost teh proteinov je manjša v mieliziranih anatomskih področjih - v belini, kaloznem

korpusu, interni kapsuli, strijah striatuma, forniksu, mamilotalamičnem traktu, obraznem

živcu in jedrih obraznega živca. V teh področjih so povezave različnih struktur možganov

in mielizirana vlakna, tako da predvidevamo, da SIT 7 in SINKRIP nista ključna pri

povezavah različnih delov možganov. Zelo šibek imunohistokemični signal smo zaznali v

lateralnih ventriklih, ker sta napolnjena s cerebrospinalno tekočino, ependimalne celice pa

ne izločajo nevrotransmiterjev (Bear in sod., 2006). Šibek signal je tudi v akumbensu, ki

vsebuje končiče dopaminskih nevronov (Kandel in sod., 2000). V vsakem od zgoraj

omenjenih anatomskih področij smo analizirali prisotnost za vsak protein posebej. V

področju, kjer je posamezen protein, smo sklepali o njegovi domnevni vlogi v tem področju.



5. 1.1.1 Hipokampus

V hipokampusu se oba proteina pojavljata v obeh CA področjih in dentatnem girusu (na sl.

21 SIT 7, sl. 24 SINKRIP), vendar ne na istem mestu. Signal za protein SIT 7 (sl. 27) je

izrazito prisoten v mahovitih vlaknih, radiatni plasti vseh treh CA področij ter polimorfnem

in molekularnem sloju dentatnega girusa (DG), v piramidalni plasti CA področij in

granularnem sloju DG pa malo manj. Protein SINKRIP je, ravno obratno (sl. 29), izrazito

prisoten v piramidalni plasti CA področij in granularnem sloju DG, manj v radiatni plasti

CA področij, polimorfnem in molekularnem sloju DG ter mahovitih vlaknih. Naši rezultati

(sl. 27) se skladajo z rezultati drugih raziskav (Sugita in sod., 2001), kjer je bilo ugotovljeno,

da je SIT 7 izrazito prisoten v mahovitih vlaknih hipokampusa in zaznan v nevropilu,

predvsem v izrastkih nevronov. V predelu nevropila se sproščajo sinaptični vezikli z

nevrotransmiterji. V hipokampusnih nevronih (piramidalnih in granularnih celicah) so to

acetilholin, γ-aminomaslena kislina (GABA) in glutamat (Giovannini in sod., 2001), v

internevronih pa GABA (Freund in Buzsáki, 1996) - sklepali bi lahko, da SIT 7 sodeluje pri

njihovem sproščanju. Granularne celice omogočajo brstenje mahovitih vlaken, pojav

veziklov (Rekart in sod., 2007) in zaradi prisotnosti SIT 7 na tem področju lahko postavimo

hipotezo, da ima SIT 7 pomembno vlogo pri omogočanju brstenja mahovitih vlaken. SIT 7

v prejšnjih raziskavah (Sugita in sod., 2001) ni bil prisoten v somah hipokampusnih

nevronov, kar se tudi sklada z rezultati naše raziskave (sl. 27). V somah granularnih celic in

piramidalnih nevronov smo dokazali močno prisotnost proteina SINKRIP (sl. 29) in tudi v

določenih izrastkih teh celic v bližini som, ne pa v ostalem nevropilu. Prisotnost proteina

SINKRIP v dendritih je bila do sedaj potrjena tudi v cerebelarnih Purkinjejevih celicah in

drugih nevronih možganske skorje (Bannai in sod., 2004), protein SINKRIP pa v

hipokampusnih področjih ni vezan na mahovita vlakna, zato lahko domnevamo, da

SINKRIP za razliko od SIT 7 nima neposredne vloge pri pojavu dolgoročnega spomina.

Prisotnost proteina SINKRIP v somah hipokampusnih nevronov so dokazali že v prejšnjih

raziskavah (Bannai in sod., 2004), v naši raziskavi smo to potrdili (sl. 29) in predvidevamo,

da sodeluje pri znotrajceličnem prenosu specifičnih mRNA v dendrite hipokampusnih

nevronov.

5. 1.1.2 Skorja velikih možganov

Oba proteina se pojavljata v skorji velikih možganov (na sl. 21 SIT 7, sl. 24 SINKRIP), a

tudi ne na istem mestu. Najbolj je SIT 7 prisoten v nevropilu molekularne plasti (sl. 28b), to

je najbolj zunanja plast, kjer je v največ izrastkov (apikalnih dendritov) piramidastih

nevronov in kolateral različnih nevronov, ki tvorijo sinapse s temi dendriti. Ko pride v celico

signal, presinaptična celica iz aksona sprosti glutamat. Sklepamo lahko, da SIT 7 sodeluje

pri sproščanju glutamata iz aksonov teh celic. Seveda pa so v nevropilu celice glije. Omeniti

velja astrocite, saj na njih najdemo receptorje za glutamat približno v enaki gostoti kot na

živčnih celicah. Zraven glutamata so na astrocitih dokazali tudi transportne proteine za druge

nevrotramiterje, npr. GABA, glicin in biogene amine (Križan, 2001). Proteini sinaptičnega



vezikla in presinaptične membrane astrocitov so podobni kot pri nevronih in njihova vloga

je enaka. Pri astrocitih najdemo sinaptobrevin 2, sintaksin in SNAP-23 (Montana in sod.,

2006), za prenos veziklov pa sta pomembna Rab4 and Rab5 (Potokar in sod., 2012). SIT 7

prav tako najdemo v astrocitih, vendar njegova vloga v njih ni znana. Vlogo sproščanja

glutamata ima v astrocitih SIT 4, za SIT 7 to ni znano. Nekatere raziskave (Mittelstead in

sod., 2009) na astrocitih v hipokampusu samo nakazujejo, da se SIT 7 pojavlja skupaj s SIT

11. V tej raziskavi je zanimiv podatek, da so tisti astrociti, ki niso izražali SIT 7, izražali tako

SIT 1 kot SIT 4. Ker so astrociti v nevropilu, sklepamo, da SIT 7 sodeluje pri eksocitozi in

endocitozi nevrotransmiterjev iz teh celic. Raziskave kažejo (Kreft in sod., 2004), da se

eksocitoza veziklov razlikuje pri astrocitih in nevronih glede na kapacitivnost membrane.

Pri astrocitih je Ca2+ odvisna sprememba približno 100-krat počasnejša kot pri nevronih.

SINKRIP je v skorji velikih možganov najbolj prisoten v somah piramidastih nevronov, je

pa prisoten tudi v somah celic drugih plasti (v somah granularnih celic (sl. 30b)).

Domnevamo lahko, da v teh celicah sodeluje pri znotrajceličnem prenosu specifičnih mRNA

v dendrite nevronov tega področja.

5. 1.1.3 Striatum

V striatumu smo dokazali prisotnost obeh proteinov (na sl. 22 SIT 7, sl. 25 SINKRIP), sta

pa prisotna na različnih mestih tega področja. SIT 7 je prisoten v nevropilu, ne pa tudi v

somah nevronov matriksa (sl. 28d). V matriksu striatuma so prisotni nevroni posredne in

neposredne poti, ki so GABAergični, internevroni pa so holinergični. Ti izločajo v predelu

izrastkov različne nevrotransmiterje: kalretinin, parvalbumin, somatostatin in nevropeptid Y

(Gerfen in Surmeier, 2011). SIT 7 morda sodeluje pri njihovem izločanju. Sklepamo, da

SINKRIP, ki je v somah celic matriksa (sl. 30d), v teh celicah sodeluje pri znotrajceličnem

prenosu specifičnih mRNA v dendrite nevronov.

5. 1.1.4 Skorja malih možganov

V skorji malih možganov sta prav tako prisotna oba proteina (na sl. 23 SIT 7, sl. 26

SINKRIP). Glede na naše rezultate imunohistokemičnega barvanja sta oba prisotna v

Purkinjejevih celicah (sl. 34), kar je precej zanimivo. Zaradi visoke stopnje kolokalizacije

proteinov v somah teh celic (sl. 35 D) lahko delno potrdimo našo prvo hipotezo. To nakazuje

na možno vključenost SIT 7 pri prenosu mRNA v dendrite Purkinjejevih celic. To sklepamo

zaradi same zgradbe Purkinjejevih celic prikazane na spodnji sliki, sl. 37. Glede na to, da

obarvani izrastki Purkinjejevih celic v naši raziskavi segajo v molekularno plast (sl. 36),

sklepamo, da sta oba proteina prisotna v dendritih.



Slika 37: Zgradba skorje malih možganov. Barvanje z MAP2 proteinom, ki je specifičen za dendrite:

molekularna ter granularna plast in plast s somami Purkinjejevih celic. Dendriti Purkinjejevih celic segajo v

molekularno plast (prilagojeno po Kandel in sod., 2000: 72)

Njuna prisotnost se razlikuje v ostalih dveh delih skorje malih možganov, molekularni in

granularni plasti. Dokazali smo, da se SIT 7 najmočneje pojavlja v nevropilu molekularne

plasti, kjer so prisotni predvsem dendriti Purkinjejevih celic in vzporedna vlakna granularnih

celic (sl. 28h). Lahko omenimo, da je interakcija med Purkinjejevimi celicami in

vzporednimi vlakni ključna za ustvarjanje spomina (D'Angelo, 2014). Predvidevamo, da ima

zaradi pojavljanja v nevropilu molekularne plasti SIT 7 vlogo pri eksocitozi sinaptičnih

veziklov z nevrotransmiterjem GABA (Bear in sod., 2006) iz trnov na dendritih

Purkinjejevih celic, ki so področje sinaptičnih povezav Purkinjejevih celic z drugimi

celicami (Gray, 1961). Lahko gre tudi za sproščanje iz kolateral oz., da se SIT 7 sintetizira

v somah granularnih celic in potuje do sinaps, ki jih tvorijo te kolaterale z dendriti

Purkinjejevih celic. Protein SINKRIP je prisoten le v somah in izrastkih celic molekularnih

plasti (verjetno so to zvezdaste ter košaričaste internevralne celice) ter izrastkih

Purkinjejevih celic, ne pa tudi v ostalem nevropilu (sl. 30f). Torej sklepamo, da ni prisoten

ali pa je manj v celotnem dendritičnemu drevesu Purkinjejevih celic, saj je le-to zelo

razvejano in bi se moralo močneje barvati. Najmočneje je prisoten v granularni plasti,

verjetno predvsem v somah granularnih in Golgijevih internevralnih celic. Domnevamo, da

ima v teh celicah vlogo pri znotrajceličnem prenosu specifičnih mRNA v dendrite.

5. 1.1.5 Ostala anatomska področja

Preučevana proteina se pojavljata še v piriformnem korteksu in olfaktornem tuberkulu

striatuma. V piriformnem korteksu signal za SIT 7 najbolj izstopa v sloju 1 in 3 (sl. 21),

signal za SINKRIP pa v plasti 2 (sl. 24). Enako je v olfaktornem tuberkulu: signal za SIT 7

je močen predvsem v plasti 1 in 3 (sl. 22), šibek pa v plasti 2. Pri proteinu SINKRIP je ravno

obratno (sl. 25), v plasti 2 piriformnega korteksa je namreč največja koncentracija

glutamatnih nevronov z gostimi jedri (Bekkers in Suzuki, 2013), podobno pri olfaktornem

tuberkulu (Wesson in Wilson, 2011). Njuno pojavljanje se ne prekriva, zato ne moremo

sklepati, da gre za isto funkcijo v teh predelih. SIT 7 je prisoten predvsem v nevropilu (več



ga je v plasteh 1 in 3), kjer so tudi izrastki celic in lahko predvidevamo, da sodeluje pri

eksocitozi predvsem glutamata (ter drugih nevrotransmiterjev, npr. dopamina), SINKRIP pa

pri znotrajceličnem prenosu specifičnih mRNA v dendrite, saj je prisoten v predelu, kjer je

največ som nevronov, v plasti 2 (sl. 24). Oba proteina najdemo v amigdaloidnih, talamičnih

in hipotalamičnih jedrih (na sl. 21 SIT 7, sl. 24 SINKRIP). Amigdaloidna jedra vsebujejo

nevrone z nevrotransmiterji: kortikotropin-sproščujoči faktor, somatostatin in nevrotenzin

(Davis, 1992) in lahko bi domnevali, da SIT 7 sodeluje pri njihovem izločanju. V talamičnih

jedrih, katerih nevroni oživčujejo celice možganske skorje, SIT 7 domnevno sodeluje pri

izločanju nevrotransmiterjev GABA in glutamat, v hipotalamičnih jedrih pa pri izločanju

nevrotransmiterja iz celic REM (angl. "non-REM-on cells") ter drugih: nevropeptida Y,

dopamina in histamina (Kandel in sod., 2000). Za protein SINKRIP lahko predvidevamo, da

v teh anatomskih področjih sodeluje pri znotrajceličem prenosu mRNA v dendrite nevronov.

Tudi v izvenkortikalnih jedrih malih možganov in olivarnem jedru (na sl. 23 SIT 7, sl. 26

SINKRIP) se pojavljata oba proteina. Lahko bi domnevali, da SIT 7 sodeluje pri eksocitozi

nevrotransmiterja glutamata iz prehodnih (angl. "relay cells") celic, nevrotransmiterja

GABA iz GABAergičnih in glicina, ki je bil kot nevrotransmiter zaznan pri miših (Voogd

in sod., 2013) tako v nevronih kot tudi astrocitih olivarnega jedra (Stephan in Friauf, 2014).

Glede na to, kaj je znano glede vloge proteina SINKRIP, tudi za to anatomsko področje

lahko domnevamo, da sodeluje pri znotrajceličnem prenosu specifičnih mRNA v dendrite

nevronov.

5. 1.2 NIZKA STOPNJA KOLOKALIZACIJE PROTEINOV

Raziskovalci (Bolte in Cordelieres, 2006) pravijo, da sta lokacija proteina v celici in njegova

vloga močno povezani, zato je lokacija izredno pomembna za razumevanje vloge

določenega proteina v biološkem procesu. Kolokalizacija, prostorsko sovpadanje lokalizacij

dveh ali več različnih proteinov v preparatu (Bolte in Cordelieres, 2006), dokazuje, da sta

vlogi (funkciji) teh dveh proteinov tesno povezani. Kolokalizacijo smo analizirali s pomočjo

metode dvojnega imunofluorescenčnega označevanja in z mikroskopom AxioImager.Z1 z

dodatkom ApoTome. Rezultati naše raziskave kažejo, da je stopnja kolokalizacije

preučevanih proteinov zelo nizka v večini analiziranih anatomskih področij: v hipokampusu

(sl. 31), skorji velikih možganov (sl. 32), striatumu (sl. 33), v granularni in molekularni plasti

skorje malih možganov (sl. 35). V somah Purkinjejevih celic se pod svetlobnim

mikroskopom oba proteina pojavljata skupaj (sl. 34). Kolokalizacijo smo potrdili (sl. 35 D)

in sklepamo, da sta oba proteina prisotna tudi v dendritih teh celic. Ker smo v raziskavi z

analizo kolokalizacije v večini področij dokazali zelo nizko stopnjo kolokalizacije (graf 1)

med proteinoma v možganih podgane, sklepamo, da med njima verjetno ne pride do

fiziološke interakcije in SIT 7 nima pomembne vloge pri prenosu mRNA v dendrite

nevronov, vsaj v povezavi s proteinom SINKRIP ne. Vrednotenje kolokalizacije je glede na

različna mnenja raziskovalcev precej vprašljivo. Ko sta fluorescenčna signala neodvisna in

ni kolokalizacije, je vrednost Pearsonovega koeficienta 0. Pearsonovi koeficienti so bili v

našem primeru tudi negativni (graf 1). Nekateri avtorji (Zinchuk in sod., 2007) so mnenja,



da pri popolni izključitvi fluorescenčnega signala na sliki, ne dobiš vrednosti -1, in je v

primeru slik vrednotenje kolokalizacije nezanesljivo; potrebno je izračunati še Mandersove

koeficiente. Drugi (Barlow in sod., 2010) so mnenja, da je za vrednotenje kolokalizacije

boljša uporaba enega samega koeficienta (ne računanje še drugih koeficientov) in so tudi

negativne vrednosti PK, kakor v našem primeru, zanesljive in uporabne.

5. 1.3 UPORABA METODE DVOJNEGA IMUNOFLUORESCENČNEGA

OZNAČEVANJA

Za analizo kolokalizacije proteinov SIT 7 in SINKRIP smo uporabili metodo dvojnega

imunofluorescenčnega označevanja. Uporaba te metode ima tudi nekaj pomanjkljivosti. Za

možgansko tkivo je značilna avtofluorescenca možganskega tkiva (avtofluorescenčno

ozadje), ki moti imunofluorescenčno detekcijo proteinov. Ti se relativno šibko sintetizirajo

v tkivu oz. v celici. Omejitev metode imunofluorescence na tkivu, fiksiranem z aldehidi, je

nedostopnost antigenov za vezavo protiteles. Fiksacija tkiva z aldehidi namreč zamreži

proteine (angl. "cross-linking"), tako da nastanejo metilenski mostički med aminokislinami

proteinov (Fox in sod., 1985), in tako onemogoči vezavo protiteles na epitope antigenov.

Znanih je kar nekaj metod za odkrivanje epitopov oz. antigenov (angl. "antigen retrieval"),

pri vsaki od metod pa je odkrivanje antigenov omejeno, saj je potrebno zagotoviti, da so

poškodbe tkiva oz. antigenov pri tem minimalne (D'Amico in sod., 2009). Obstaja verjetnost,

da z metodo imunofluorescence zaradi avtofluorescenčnega ozadja in zamreženosti

antigenov v tkivu nismo dobili točne lokacije in kolokalizacije preučevanih proteinov.

6 SKLEPI

Naša prva hipoteza je bila, da je protein SINKRIP kolokaliziran s proteinom sinaptotagmin

7 v nevronih možganov podgane. Hipotezo smo delno potrdili. Z imunohistokemičnim in

imunofluorescenčnim barvanjem je vidno, da se oba proteina pojavljata skupaj v

Purkinjejevih celicah (somah in dendritih) skorje malih možganov. Stopnja kolokalizacije v

somah teh celic je relativno visoka. Hipoteze za ostala možganska področja ne moremo

potrditi. Stopnja kolokalizacije proteinov v hipokampusu, skorji velikih možganov,

striatumu, v granularni in molekularni plasti skorje malih možganov je nizka in tako

sklepamo, da sinaptotagmin 7 najverjetneje v preučevanih možganskih regijah (razen sloja

Purkinjejevih celic) ne sodeluje pri transportu mRNA v dendrite, katerega uravnava protein

SINKRIP.

Druga hipoteza je bila, da sta proteina sinaptotagmin 7 in SINKRIP prisotna v večini

anatomskih področij možganov podgane. Hipotezo smo potrdili. Signal za sinaptotagmin 7

je najmočnejši v nevropilu, za SINKRIP pa v somah celic preučevanih anatomskih področij.



7 POVZETEK

Sinaptotagmin 7 je transmembranski protein iz družine 17 sinaptotagminov, ki so v

možganih podgane vpleteni v procese uravnavanja od Ca2+ odvisne eksocitoze in endocitoze

sinaptičnih in večjih optično gostih veziklov. Sinaptotagmin 7 sodeluje pri počasni in

nesinhroni eksocitozi nevronov, njegovo pojavljanje pa kaže na njegovo vlogo tudi pri

transportu veziklov v njihove dendrite. Sinaptotagmin 7 sodeluje pri fagocitozi, popravilu

membrane mišične celice in izločanju inzulina iz sekretornih β–celic trebušne slinavke. O

vlogi proteina sinaptotagmin 7 v nevronih možganov ni veliko znanega, veliko poskusov je

bilo narejenih na drugih celicah in tkivih in tako obstaja malo relevantnih raziskav v

povezavi z našo raziskavo. Znano je, da ima pomembno vlogo pri sproščanju dopamina iz

dendritov v črnem jedru možganov. V živčevju ima sinaptotagmin 7 domnevno vlogo

popravljanja degeneriranih nevronov, za katere je med drugim značilna okvarjena

sposobnost tvorbe sinaps. Za nastajajnje novih ter delovanje že obstoječih sinaps je

pomemben prepis nekaterih molekul mRNA za proteine, ki so sestavni del sinaps. Vloga

proteina SINKRIP je povezana s prepisom mRNA, saj sodeluje pri znotrajceličnem prenosu

mRNA v dendrite nevronov. mRNA se prenašajo s pomočjo granul mRNA, na katere je

SINKRIP vezan. Interakcijo med njima so dosedaj pokazali samo in vitro. Mi smo to

preverili še in vivo in bi v primeru njune kolokalizacije lahko potrdili našo hipotezo o

vključenosti proteina sinaptotagmin 7 pri prenosu mRNA v dendrite nevronov. Namen

magistrske naloge je bil raziskati kolokalizacijo proteinov v nevronih v različnih regijah

možganov: v treh področjih hipokampusa (CA1, CA3 in dentatnem girusu), skorji velikih

možganov, striatumu ter v skorji malih možganov (granularni in molekularni plasti ter plasti

Purkinjejevih celic) laboratorijske podgane (Rattus norvegicus). V primeru, da bi proteina

kolokalizirala, bi obstajala možnost za njuno fiziološko interakcijo. To smo ugotavljali z

metodo imunofluorescenčne analize.

Z imuhistokemično analizo smo najprej lokalizirali posamezen protein, potem pa na podlagi

ugotavljanja prisotnosti v možganskih področjih sklepali na morebitno vlogo proteinov.

Intaktne možgane treh različnih podgan smo transkardialno perfundirali s fiksativom, jih

narezali ter pobarvali z metodo imunohistokemije z uporabo specifičnih protiteles proti

proteinoma sinaptotagmin 7 in SINKRIP. Glede na predhodne raziskave lahko domnevamo,

da imata proteina različne funkcije v področjih, kjer smo ju zasledili. Sinaptotagmin 7

najverjetneje v vsakem od anatomskih področij kjer je, sodeluje pri izločanju

nevrotransmiterjev iz celic posameznega anatomskega področja, SINKRIP pa pri

znotrajceličnem prenosu specifičnih mRNA v dendrite celic. Signal za protein sinaptotagmin

7 je izrazito prisoten v mahovitih vlaknih, radiatni plasti vseh treh CA področij hipokampusa

ter polimorfnem in molekularnem sloju dentatnega girusa (DG), v piramidalni plasti CA

področij in granularnem sloju DG pa malo manj. Protein SINKRIP je, ravno obratno, izrazito

prisoten v piramidalni plasti CA področij in granularnem sloju DG, manj pa v radiatni plasti

CA področij, polimorfnem in molekularnem sloju DG ter mahovitih vlaknih. V skorji velikih

možganov je sinaptotagmin 7 prisoten v nevropilu molekularne plasti, SINKRIP pa v somah

piramidastih nevronov in somah celic drugih plasti, tudi somah granularnih celic. V

striatumu je sinaptotagmin 7 najbolj prisoten v nevropilu, ne pa tudi somah celic matriksa,



SINKRIP pa je najbolj prisoten ravno v somah teh celic. V malih možganih se sinaptotagmin

7 najmočneje pojavlja v nevropilu molekularne plasti, SINKRIP je prisoten le v somah in

izrastkih celic molekularnih plasti, ne pa tudi v ostalem nevropilu. Najmočneje je protein

SINKRIP prisoten v granularni plasti predvsem verjetno v somah celic te plasti. Zanimivo

je, da se oba proteina pojavljata v somah Purkinjejevih celic. Oba preučevana proteina se

pojavljata tudi v piriformnem korteksu in olfaktornem tuberkulu striatuma. V piriformnem

korteksu signal za sinaptotagmin 7 najbolj izstopa v sloju 1 in 3, signal za SINKRIP v plasti

2. Tudi v olfaktornem tuberkulu je signal za sinaptotagmin 7 močen predvsem v plasti 1 in

3, šibek v plasti 2, pri proteinu SINKRIP pa je ravno obratno. Oba proteina najdemo v

amigdaloidnih, talamičnih in hipotalamičnih jedrih, pojavljata se še v izvenkortikalnih jedrih

malih možganov in olivarnem jedru. Vsebnost teh proteinov je manjša v mieliziranih

anatomskih področjih: belini, kaloznem korpusu, interni kapsuli, strijah striatuma, forniksu,

mamilotalamičnem traktu, obraznem živcu in jedrih obraznega živca. V teh področjih so

prisotne povezave različnih struktur možganov in mielizirana vlakna, tako da predvidevamo,

da noben preučevan protein ni ključen pri povezavah različnih delov možganov. Signal za

proteina je šibek v lateralnih ventriklih (ker sta napolnjena s cerebrospinalno tekočino,

ependimalne celice pa ne izločajo nevrotransmiterjev) ter v akumbensu.

V drugem delu raziskave smo uporabili iste možgane podgan, že transkardialno perfundirane

s fiksativom in narezane, vendar smo jih tokrat pobarvali z metodo dvojne

imunofluorescence. Uporabili smo specifična protitelesa proti proteinoma SINKRIP in

sinaptotagmin 7. Z uporabo fluorescenčnega mikroskopa AxioImager.Z1 z dodatkom

ApoTome smo analizirali kolokalizacijo obeh proteinov v štirih različnih regijah podganjih

možganov in jo ovrednotili s programom ImageJ z vmesnikom JACoP. Stopnjo

kolokalizacije smo ovrednotili tako, da smo izračunali vrednosti Pearsonovega koeficienta

(PK) na sliki. V primeru skorje malih možganov smo izračunali vrednosti koeficienta

kolokalizacije samo dela slike (območje analize), some Purkinjejevih celic pa smo analizirali

z obkroževanjem. Podatke smo prikazali kot povprečne vrednosti PK ± SD posameznega

področja. Povprečna vrednosti PK v CA1 področju je -0,25 (± 0,037), v CA3 področju -0,09

(± 0,025), v dentatnem girusu hipokampusa -0,152 (± 0,042), v skorji velikih možganov -

0,06 (± 0,04), v striatumu 0,04 (± 0,05), v somah Purkinjejevih celic 0,55 (±0,059), v

molekularnem sloju 0,07 (± 0,042) in v granularnem sloju 0,16 (± 0,028). Ti rezultati naše

raziskave kažejo, da je stopnja kolokalizacije proteinov v veliki večini preučevanih

anatomskih področij nizka.

V raziskavi smo dopolnili znanje o lokalizaciji proteinov sinaptotagmin 7 in predvsem

SINKRIP (o katerem je zelo malo znanega), ki je bistvena za določanje funkcije proteinov

v fizioloških razmerah. Sklepamo, da se proteina, sinaptotagmin 7 in SINKRIP, pojavljata v

večini anatomskih področij možganov podgane, stopnja njune kolokalizacije v večini

preučevanih področjih pa je nizka. Zaradi nizke stopnje kolokalizacije sinaptotagmin 7

najverjetneje ne sodeluje pri transportu mRNA v dendrite, ki ga uravnava protein SINKRIP.

Izjema je le plast Purkinjejevih celic v skorji malih možganov, kjer visoka stopnja

kolokalizacije v somah in pojavljanje obeh proteinov v dendritih teh celic nakazujeta na

možno vključenost proteina sinaptotagmin 7 pri transportu mRNA v dendrite teh celic.



8 VIRI

Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. D. 1994. Molecular biology of

the cell. 4rd ed. New York, Garland Publishing: 1294 str.

Albin R. L., Young A. B., Penney J. B. 1989. The functional anatomy of basal ganglia

disorders. Trends in neurosciences, 12, 10: 366–375

Anderson P., Kedersha N. 2006. RNA granules. The Journal of Cell Biology, 172, 6: 803–

808

Andrews N. W., Chakrabarti S. 2005. There’s more to life than neurotransmission: the

regulation of exocytosis by synaptotagmin VII. Trends in Cell Biology, 15, 11: 626–631

Arantes R. M. E., Andrews N. W. 2006. A role for synaptotagmin VII-regulated exocytosis

of lysosomes in neurite outgrowth from primary sympathetic Neurons. The Journal of

Neuroscience, 26, 17: 4630–4637

Bacaj T., Wu D., Yang X., Morishita W., Zhou P., Xu W., Malenka R. C., Südhof T. C. 2013.

Synaptotagmin-1 and synaptotagmin-7 trigger synchronous and asynchronous phases of

neurotransmitter release. Neuron, 80, 4: 947–959

Bekkers J. M., Suzuki N. 2013. Neurons and circuits for odor processing in the piriform

cortex. Trends in neurosciences, 36, 7: 429–438

Bannai H., Fukatsu K., Mizutani A., Natsume T., Iemura S., Ikegami T., Inoue T., Mikoshiba

K. 2004. An RNA-interacting Protein, SYNCRIP (Heterogeneous Nuclear Ribonuclear

Protein Q1/NSAP1) is a Component of mRNA Granule Transported with Inositol 1,4,5-

trisphosphate receptor type 1 mRNA in neuronal dendrites. The Journal of Biological

Chemistry, 279, 51: 53427–53434

Barlow A. L., MacLeod A., Noppen S., Sanderson J., Guérin C. J. 2010. Colocalization

analysis in fluorescence micrographs: Verification of a more accurate calculation of

Pearson’s correlation coefficient. Microscopy & Microanalysis, 16, 6: 710–724

Batish M., van den Bogaarda P., Kramera F. R., Tyagi S. 2012. Neuronal mRNAs travel singly

into dendrites. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109, 12: 4645–4650

Bear F. M., Connors B. W., Paradiso M. A. 2006. Neuroscience: Exploring the brain. 3rd ed.,

Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins: 857 str.



Bolte S., Cordelieres F. P. 2006. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light

microscopy. Journal of Microscopy, 224, 3: 213–232

Brodal P. 2010. The central nervous system: Structure and function. 4th ed. New York, Oxford

University Press: 606 str.

Burgoyne R. D., Morgan A. 2003. Secretory granule exocytosis. Physiological Reviews, 83,

2: 581–632

Candelario K. M., Steindler D. A. 2014. The role of extracellular vesicles in the progression

of neurodegenerative disease and cancer. Trends in Molecular Medicine, 20, 7: 368–374

Chakrabarti S., Kobayashi K. S., Flavell R. A., Marks C. B., Miyake K., Liston D. R., Fowler

K. T., Gorelick F. S., Andrews N. W. 2003. Impaired membrane resealing and autoimmune

myositis in synaptotagmin VII–deficient mice. The Journal of Cell Biology, 162, 4: 543–

549

Choi K. S., Mizutani A., Lai M. M. C. 2004. SYNCRIP, a member of the heterogeneous

nuclear ribonucleoprotein family, is involved in mouse hepatitis virus RNA synthesis.

Journal of Virology, 78, 23: 13153–13162

Cooper G. M., Hausman R. E. 2004. The Cell: A molecular approach. 3rd ed. Washington,

Sinauer Associates: 713 str.

Crino P. B., Eberwine J. 1996. Molecular characterization of the dendritic growth cone:

regulated mRNA transport and local protein synthesis. Nevron, 17, 6: 1173–1187

Czaplinski K. 2014. Understanding mRNA trafficking: Are we there yet? Seminars in cell &

developmental biology, 32: 63–70

Czibener C., Sherer N. M., Becker S. M., Pypaert M., Hui E., Chapman E. R., Mothes W.,

Andrews N. W. 2006. Ca2+ and synaptotagmin VII-dependent delivery of lysosomal

membrane to nascent phagosomes. The Journal of Cell Biology, 174, 7: 997–1007

Deshler J. O., Highett M. I., Abramson T., Schnapp B. J. 1998. A highly conserved RNA-

binding protein for cytoplasmic mRNA localization in vertebrates. Current biology, 8, 9:

489–496.

David H. N. 2009. Towards a econceptualization of striatal interactions between glutamatergic

and dopaminergic neurotransmission and their contribution to the production of

movements. Current neuropharmacology, 7, 2: 132–141



Davis M. 1992. The role of the amygdala in fear and anxiety. Annual review of neuroscience,

15, 1: 353–375

D'Amico F., Skarmoutsou E., Stivala F. 2009. State of the art in antigen retrieval for

immunohistochemistry. Journal of Immunological Methods, 341, 1: 1–18

D'Angelo E. 2014 The organization of plasticity in the cerebellar cortex: from synapses to

control. Progress in Brain Research, 210: 31–58

Dunn K. W., Kamocka M. M., McDonald J. H. 2011. A practical guide to evaluating

colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology, 300, 4: C723–

C742

Duque G. A., Fukuda M., Descoteaux A. 2014. Synaptotagmin XI regulates phagocitosis and

cytokine secretion in macrophages. The Journal of Imunology, 190, 4: 1737–1745

Fox C. H., Johnson F. B., Whiting J., Roller P. P. 1985. Formaldehyde fixation. Journal of

Histochemistry & Cytochemistry, 33, 8: 845–53

Freund T. F., Buzsáki G. Y. 1996. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus, 6, 4: 347–

470

Fulop T., Radabaugh S., Smith C. 2005. Activity-dependent differential transmitter release in

mouse adrenal chromaffin cells. The Journal of Neuroscience, 25, 32: 7324 –7332

Ekici M., Hohl M., Schuit F., Martinez-Serrano A., Thiel G. 2008. Transcription of Genes

Encoding Synaptic Vesicle Proteins in Human Neural Stem Cells; Chromatin accessibility,

histone methylation pattern, and the essential role of the rest. The Journal of Biological

Chemistry, 283, 14: 9257–9268

Flannery A. R., Czibener C., Andrews N. W. 2010. Palmitoylation-dependent association with

CD63 targets the Ca2+ sensor synaptotagmin-VII to lysosomes. The Journal of Cell

Biology, 191, 3: 599–613

Fukuda M. 2006. The role of Synaptotagmin and synaptotagmin-like protein (Slp) in regulated

exocytosis. Molecular Mechanisms of Exocytosis Regazzi R. (ed.). New York, Springer:

42–61

Fukuda M., Kanno E., Satoh M., Saegusa C., Yamamoto A. 2004. Synaptotagmin VII Is

Targeted to Dense-core Vesicles and Regulates Their Ca2+ dependent Exocytosis in PC12

Cells. The Journal of Biological Chemistry, 279, 50: 52677–52684



Fukuda M., Ogata Y., Saegusa C., Kanno E., Mikoshiba K. 2002. Alternative splicing

isoforms of synaptotagmin VII in the mouse, rat and human. Biochemical Jounal, 365:

173–180

Gao Z., Reavey-Cantwell J., Young R. A., Jegier P., Wolf B. A. 2000. Synaptotagmin III/VII

isoforms mediate Ca2+ induced insulin secretion in pancreatic islet β-cells. Journal of

Biological Chemistry, 275, 46: 36079–36085

Gauthier B. R., Duhamel D. L., Iezzi M., Theander S., Saltel F., Fukuda M., Wehrle-Haller

B., Wollheim C. B. 2007. Synaptotagmin VII splice variants α, β, and γ are expressed in

pancreatic β-cells and regulate insulin exocytosis. The Journal of the Federation of

American Societies for Experimental Biology, 22, 1: 194–206

Gerfen C. R., Surmeier D. J. 2011. Modulation of striatal projection systems by dopamine.

Annual Review of Neuroscience, 34: 441–466

Giovannini M. G., Rakovska A., Benton R. S., Pazzagli M., Bianchi L., Pepeu G. 2001. Effects

of novelty and habituation on acetylcholine, GABA, and glutamate release from the frontal

cortex and hippocampus of freely moving rats. Neuroscience, 106, 1: 43–53

Glavan G., Schliebs R., Živin M. 2009. Synaptotagmins in neurodegeneration. The

Anatomical Record, 292, 12: 1849–1862

Glavan G., See R. E., Živin M. 2012. Differential Patterns of Synaptotagmin7 mRNA

expression in rats with kainate- and pilocarpine- induced seizures. PLoS ONE, 7, 5:

e36114: 7 str.

Glavan G., Živin M. 2005. Differential expression of striatal synaptotagmin mRNA isoforms

in hemiparkinsonian rats. Neuroscience, 135, 2: 145–154

Gray E. G. 1961. The granule cells, mossy synapses and Purkinje spine synapses of the

cerebellum: light and electron microscope observations. Journal of Anatomy, 95, 3: 345–

356

Gustavsson N., Lao Y., Maximov A., Chuang J. C., Kostromina E., Repa J. J., Li C., Radda

G. K., Südhof T. C., Han W. 2008. Impaired insulin secretion and glucose intolerance in

synaptotagmin-7 null mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105,

10: 3992–3997

Gut A., Kiraly C. E., Fukuda M., Mikoshiba K., Wollheim C. B., Lang J. 2001. Expression

and localisation of synaptotagmin isoforms in endocrine β-cells: their function in insulin

exocytosis. Journal of Cell Science, 114, 9: 1709–1716



Gutierrez R. 2003. The GABAergic phenotype of the "glutamatergic" granule cells of the

dentate gyrus. Progress in Neurobiology, 71, 5: 337–358

Hanus C., Kochen L., tom Dieck S., Racine V., Sibarita J. B., Schuman E. M., Ehlers M. D.

2014. Synaptic control of secretory trafficking in dendrites. Cell Reports, 7, 6: 1771–

1778

Hirokawa N. 2006. mRNA transport in dendrites: RNA granules, motors, and tracks. The

Journal of Neuroscience, 26, 27: 7139–7142

Jansen R. P., Niessing D., Baumann S., Feldbrügge M. 2014. mRNA transport meets

membrane traffic. Trends in Genetics, 30, 9, 408–417

Kaeser-Woo Y. J., Younts T. J., Yang X., Zhou P., Wu D., Castillo P. E., Südhof T. C. 2013

Synaptotagmin-12 phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase is essential for

hippocampal mossy fiber LTP. The Journal of Neuroscience, 33, 23: 9769–9780

Kandel E. R., Schwartz J. H., Jessell T. M. 2000. Principles Of Neural Science. 4th ed. New

York, McGraw-Hill Companies: 1229 str.

Kennedy M. B. 2000. Signal-processing machines at the postsynaptic density. Science, 290,

5492: 750–754

Kreft M., Stenovec M., Rupnik M., Grilc S., Kržan M., Potokar M., Pangršič T., Haydon P.

G., Zorec R. 2004. Properties of Ca2+- dependent exocytosis in cultured astrocytes. Glia,

46, 4: 437–445

Kreutz M. R., Sala C. 2012. Synaptic Plasticity: Dinamics, development and disease. Wien,

Springer: 618 str.

Križan M. 2001. Funkcija Astrocitov. Zdravniški vestnik, 70: 553–559

Liu H., Bai H., Hui E., Yang L., Evans C. S., Wang Z., Kwon S. E., Chapman E. R. 2014

Synaptotagmin VII functions as a Ca2+ sensor for synaptic vesicle replenishment. eLIFE,

3: e01524: 18 str.

Marqueze B., Berton F., Seagar M. 2000. Synaptotagmins in membrane traffic: Which

vesicles do the tagmins tag? Biochimie, 82, 5: 409−420

Maximov A., Lao Y., Li H., Chen X., Rizo J., Sørensen J. B., Südhof T. C. 2007. Genetic

analysis of synaptotagmin-7 function in synaptic vesicle exocytosis. Proceedings of the

National Academy of Sciences, 105, 10: 3986–3991



Mendez J. A., Bourque M. J., Fasano C., Kortleven C., Trudeau L. E. 2011. Somatodendritic

dopamine release requires synaptotagmin 4 and 7 and the participation of voltage-gated

calcium channel. The Journal of Biological Chemistry, 286, 27: 23928–23937

Mittelsteadt T., Seifert G., Alvárez‐Barón E., Steinhäuser C., Becker A. J., Schoch S. 2009.

Differential mRNA expression patterns of the synaptotagmin gene family in the rodent

brain. Journal of Comparative Neurology, 512, 4: 514–528

Mizutani A., Fukuda M., Ibata K., Shiraishi Y., Mikoshiba K. 2000. SYNCRIP, a Cytoplasmic

counterpart of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein R, interacts with ubiquitous

synaptotagmin isoforms. The Journal of Biological Chemistry, 275, 13: 9823–9831

Moghadam P. K., Jackson M. B. 2013. The functional significance of synaptotagmin diversity

in neuroendocrine secretion. Frontiers of Endocrinology, 4, 124: 7 str.

Montag-Sallaz M., Montag D. 2003 Learning-induced arg 3.1/arc mRNA expression in the

mouse brain. Learning & Memory 10, 2: 99–107

Montana V., Malarkey E. B., Verderio C., Matteoli M., Parpura V. 2006. Vesicular transmitter

release from astrocytes. Glia, 54, 7: 700–715

Monterrat C., Grise F., Benassy M. N., Hemar A., Lang J. 2007. The calcium-sensing protein

synaptotagmin VII is expressed on different endosomal compartments in endocrine,

neuroendocrine cells or neurons but not on large dense core vesicles. Histochemie Cell

Biology, 127, 6: 625–632

Nelson D. L., Cox M. M. 2005. Principles of biochemistry. 4th ed. New York, W. H. Freeman

& Company: 1119 str.

Osborne S. L., Wallis T. P., Jimenez J. L., Gorman J. J., Meunier F. A. 2007. Identification of

secretory granule phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate interacting proteins using an

affinity pulldown strategy. Molecular & Cellular Proteomics 6, 7: 1158–1169

Pal R., Živin M., Milutinovič A., Jernej B., Glavan G. 2007. Effect of apomorphine on striatal

synaptotagmin 7 mRNA levels in reserpinized rats. Neuroscience Letters, 424, 3: 194–198

Paxinos G., Watson C. 2007. The rat brain in stereotaxic coordinates. San Diego, Elsevier

Academic Press: 210 str.

Pearsall J. Neuropil. Oxford Dictionaries Online. Oxford University Press.

http://www.oxforddictionaries.com/definition/english/neuropil (30. 10. 2014)

http://www.oxforddictionaries.com/definition/english/neuropil



Pollard T. D., Earnshaw W. C. 2004. Cell biology. Philadelphia, Elsevier Science: 813 str.

Potokar M., Lacovich V., Chowdhury H. H., Kreft M., Zorec R. 2012. Rab4 and Rab5 GTPase

are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia, 60, 4: 594–

604

Rekart J. L., Sandoval C. J., Bermudez-Rattoni F., Routtenberg A. 2007. Remodeling of

hippocampal mossy fibers is selectively induced seven days after the acquisition of a spatial

but not a cued reference memory task. Learning & Memory, 14, 6: 416–421

Segovia M., Ales E., Angeles Montes M., Bonifas I., Jemal I., Lindau M., Maximov A.,

Südhof T. C., Alvarez de Toledo G. 2010. Push-and-pull regulation of the fusion pore by

synaptotagmin-7. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107, 44: 19032–

19037

Schnapp B. J., Arn E. A., Deshler J. O., Highett M. I. 1997. RNA localization in Xenopus

oocytes. Cell & Developmental Biology, 8, 6: 529–540

Schonn J. S., Maximov A., Lao Y., Südhof T. C., Sørensen J. B. 2008. Synaptotagmin-1 and

-7 are functionally overlapping Ca2+ sensors for exocytosis in adrenal chromaffin cells.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 105, 10: 3998–4003

Sugita S., Han W., Butz S., Liu X., Fernandez-Chacon R., Lao Y., Südhof T. C. 2001.

Synaptotagmin VII as a Plasma Membrane Ca2+ Sensor in Exocytosis. Neuron, 30, 2: 459–

473

Sunahara R. K., Dessauer C. W., Gilman A. G. 1996. Complexity and diversity of mammalian

adenylyl cyclases. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 36, 1: 461–480

Stephan J., Friauf E. 2014. Functional analysis of the inhibitory neurotransmitter transporters

GlyT1, GAT‐1, and GAT‐3 in astrocytes of the lateral superior olive. Glia, 62, 12: 1992–

2003

Strgar J. 2002. Biologija; Zbirka, tematski leksikon. Tržič, Učila internacional: 489 str.

Südhof T. C., Rizo J. 2011. Synaptic Vesicle Exocytosis. Cold Spring Harbor Perspectives in

Biology, 3, 12: a005637: 15 str.

Tang V. W. 2006. Proteomic and bioinformatic analysis of epithelial tight junction reveals an

unexpected cluster of synaptic molecules. Biology Direct, 1, 37, doi: 10.1186/1745-6150-

1-37: 30 str.



Tsuboi T., Fukuda M. 2007. Synaptotagmin VII modulates the kinetics of dense-core vesicle

exocytosis in PC12 cells. Genes to Cells, 12, 4: 511–519

Virmani T., Han W., Liu X., Südhof T. C., Kavalali E. T. 2003. Synaptotagmin VII splice

variants differentially regulate synaptic vesicle recycling. European Molecular Biology

Organization Journal, 22, 20: 5347–5357

von Poser C., Zhang J. Z., Mineo C., Ding W., Ying Y., Südhof T. C., Anderson R. G. W.

2000. Synaptotagmin regulation of coated pit assembly. The Journal of Biological

Chemistry, 275, 40: 30916–30924

Voogd J., Shinoda Y., Ruigrok T. J. H., Sugihara I. 2013. Cerebellar nuclei and the inferior

olivary nuclei: organization and connections. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar

Disorders, 377-436

Zhang L., Lou D., Jiao H., Zhang D., Wang X., Xia Y., Zhang J., Xu M. 2004. Cocaine-

induced intracellular signaling and gene expression are oppositely regulated by the

dopamine D1 and D3 receptors. The Journal of Neuroscience, 24, 13: 3344–3354

Zinchuk V., Zinchuk O., Okada T. 2007. Quantitative colocalization analysis of multicolor

confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological

phenomena. Acta Histochemica et Cytochemica; 40, 4: 101–111

Wesson D. W., Wilson D. A. 2011. Sniffing out the contributions of the olfactory tubercle to

the sense of smell: hedonics, sensory integration, and more? Neuroscience & Biobehavioral

Reviews, 35, 3: 655–668

Wishart T. M., Parson S. H., Gillingwater T. H. 2006. Synaptic vulnerability in

neurodegenerative disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 65, 8:

733–773

ZAHVALA

Najprej bi se zahvalila mentorici, doc. dr. Gordani Glavan. Hvala za natančno spremljanje

mojega dela, za pripravljenost prisluhniti in pomagati, za vse strokovne nasvete pri

praktičnem delu in pisanju naloge ter vse prijazne in tople besede.

Posebna zahvala gre tudi asist. dr. Larisi Tratnjek in asist. dr. Tanji Višnjar. Ves čas

opravljanja raziskovalnega dela sta mi stali ob strani z neprecenljivimi nasveti ter popravki

in stalno pripravljenostjo za praktično pomoč v laboratoriju.

Zahvaljujem se prof. dr. Marku Živinu, ki mi je omogočil opravljanje magistrskega dela v

Inštitutu za patološko fiziologijo Medicinske fakultete.

Prof. Tatjani Lukovnjak se zahvaljujem za lektoriranje magistrske naloge. Recenzentu prof.

dr. Marku Kreftu in predsednici komisije, prof. dr. Kristini Sepčić se zahvaljujem za pregled

naloge ter dane popravke in komentarje.

Nenazadnje bi se želela zahvaliti še staršema, Karmen in Marjanu Jerenko. Hvala, da sta me

ves čas izobraževanja podpirala z brezpogojno ljubeznijo in mi omogočila doseganje

zastavljenih ciljev.

PRILOGA

Vrednosti Pearsonovih korelacijskih koeficientov (PK)

CA1 hipokampus n1 n2 n3 n skupaj

1 -0,35 -0,169 -0,378

2 -0,310 -0,087 -0,306

3 -0,348 0,068 -0,299

4 -0,337 0,046 -0,285

5 -0,243 0,017 -0,266

6 -0,252 -0,231 -0,308

7 -0,405 -0,207 -0,369

8 -0,288 -0,024 -0,346

9 -0,426 -0,273 -0,308

10 -0,405 -0,221 -0,323

PK -0,336 -0,108 -0,319 -0,254

± SD 0,031 0,061 0,019 0,037

CA3 hipokampus n1 n2 n3 n skupaj

1 -0,30 -0,241 -0,375

2 -0,374 -0,240 -0,400

3 -0,408 -0,254 -0,359

4 -0,301 -0,194 -0,342

5 -0,290 -0,231 -0,302

6 -0,326 -0,317 -0,352

7 -0,393 -0,328 -0,296

8 -0,351 -0,210 -0,268

9 -0,374 -0,142 -0,270

10 -0,379 -0,237 -0,235

PK -0,351 -0,239 0,320 -0,090

± SD 0,023 0,026 0,027 0,025

DG hipokampus n1

1 -0,058

2 -0,216

3 -0,071

4 -0,084

5 -0,239

6 -0,022

7 -0,187

8 -0,222

9 -0,229

10 -0,193

PK -0,152

± SD 0,042

Skorja

velikih

možganov

n1 n2 n3 n skupaj

1 -0,155 -0,061 -0,079

2 -0,193 0,063 -0,089

3 0,114 0,035 -0,153

4 0,182 -0,033 -0,092

5 -0,127 0,022 -0,079

6 -0,185 0,046 -0,033

7 -0,185 0,003 -0,062

8 -0,307 -0,040 -0,028

9 -0,156 -0,062 -0,038

10 -0,158 0,052 0,023

PK -0,117 0,003 -0,063 -0,059

± SD 0,070 0,025 0,023 0,039

Striatum n1 n2 n3 n skupaj

1 0,340 0,196 -0,176

2 -0,042 0,098 -0,175

3 -0,121 0,030 -0,094

4 0,136 0,137 -0,152

5 -0,076 0,039 -0,165

6 0,125 0,180 -0,153

7 0,205 0,089 -0,114

8 0,142 0,047 -0,099

9 0,275 0,270 0,025

10 0,253 0,077 -0,142

PK 0,124 0,116 -0,125 -0,039

± SD 0,081 0,039 0,030 0,050

Skorja

malih

možganov

Granularni

sloj

Some

Purkinjejevih

celic

Molekularni

sloj

1 0,201 0,682 0,078

2 0,249 0,471 -0,021

3 0,208 0,617 0,119

4 0,146 0,56 0,189

5 0,137 0,559 0,119

6 0,059 0,573 0,044

7 0,196 0,584 -0,092

8 0,126 0,682 0,072

9 0,116 0,466 0,137

10 0,121 0,286 0,014

PK 0,156 0,548 0,066

± SD 0,028 0,059 0,042

Documents

KOLOKALIZACIJA PROTEINOV SINKRIP IN SINAPTOTAGMIN 7 V ... · Sl. 13: Vzdolžni prerez podganjih možganov, bazalna jedra. ..... 24 Sl. 14: Drsni mikrokriotom in zamrznjeni možgani