KOLORIMETRIJAKOLORIMETRIJA I I SPEKTROFOTOMETRIJASPEKTROFOTOMETRIJA

KOLORIMETRIJAKOLORIMETRIJA I I SPEKTROFOTOMETRIJASPEKTROFOTOMETRIJA

Instrumentalna analiza , Profesor Hemije

Dr D. Manojlović, Hemijski fakultet Beograd

Kolorimetrijskim metodama se određuju koncentracije obojenih rastvora koji apsorbuju u vidljivom ili bliskom UV delu spektra

Boja koju ima rastvor neke supstance komplementarna je boji koju ta supstanca apsorbuje Akva-bakar(II) jon je bledoplave boje, što znači da apsorbuje u žutom delu spektra

U kolorimetriji se uvek radi sa polihoromatskim zračenjem što isključuje mogućnost kvalitativne analize

Da bi se supstanca mogla odrediti kolorimetrijski mora ispunjavati sledeće uslove: - intenzitet boje mora biti stabilan u dužem vremenskom intervalu - boja mora biti intenzivna -apsorpcija zraćenja mora da se pokorava Lambert-Beerovom zakonu

•  

-male promene temeprature, pH i drugih faktora ne smeju bitno da utiču na intenzitet boje

 Ukoliko je intenzitet neke boje nedovoljan onda se dodatkom pogodnog reagensa može prevesti u intenzivnije obojeno jedinjenje

 

Reagens u kolorimetriji mora da poseduje sledeće osobine : -reagens treba da reaguje stehiometrijski sa ispitivanom supstancom i uvek treba dodati dovoljnu i istu količinu reagensa u ispitivane rastvore i standarde -reagens ne sme da apsorbuje u vidljivom delu spektra -reagens mora biti selektivan u odnosu na ispitivanu supstancu

•  

-boja nastalog proizvoda mora se brzo razvijati

-reagens ili ispitivana supstanca ne smeju da stupaju u reakcije sa drugim sastojcima u rastvoru koji ih mogu prevesti u neaktivne oblike ili kompleksno jedinjenje zbog čega bi izostalo razvijanje boje U kolorimetriji se obično intenzitet boje nepoznatog rastvora upoređuje sa jednim ili više standardnih rastvora poznate koncentracije

Prema tehnici rada kolorimetrijske metode delimo na: metode standardne serijemetode balansovanjametode kolorimetrijske titracije

Aparati koji se koriste u kolorimetriji su jednostavne konstrukcije i kao izvor svetlosti koriste belu svetlost

Tipični kolorimetrijski aparati su Helligeov komparator i Duboscquov kolorimetar. 

Fotokolorimetrijske metode

Optička shema fotoelektričnog kolorimetra

SPEKTROFOTOMETRIJA Spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na praćenju zavisnosti apsorbance ili apsortiviteta od talasne dužine zračenja koje je prošlo kroz analiziranu supstancu Apsorpcija se može pratiti u UV, Vis, IC, mikrotalasnoj i radiofrekventnoj oblasti.

 U analitičkoj hemiji su od interesa oblasti od 200-1000 nm, a u organskoj analizi još i IC oblast, EPR i NMR spektroskopija

Spektrofotometrija je kvalitativna i kvantitativna analiza

 Kvalitativna analiza se zasniva na činjenici da apsorpcioni spektar supstance zavisi od njenog sastava i strukture

Na osnovu zavisnosti apsortiviteta od talasne dužine i vrednosti apsortiviteta na određenoj talasnoj dužini moguće je identifikovati apsorbujuću supstancu

•  

Kvantitativna analiza sa zasniva na Beerovom zakonu:  Kod spektrofotometra b je jednako debljini kivete i konstantno je i onda apsorbanca zavisi samo od koncentracije i apsortiviteta Da bi se postigla moguća tačnost i osetljivost apsorbance bitan je izbor talasne dužine merenja

cbaA

Ona mora da ispuni sledeće uslove: -da se merenjem postiže maksimalna osetljivost

-da male promene talasne dužine ne utiču na reproduktivnost

-da važi Beerov zakon

Na osnovu ovih zahteva merenje apsorbance se izvodi na: -na talasnoj dužini gde je apsorbanca maksimalna max

-na taasnoj dužini optimalne apsorbance, opt i

-na talasnoj dužini izobestičke tačke, izob

 izob kada dva oblika imaju istu apsorbancu (kiseli i bazni indikator)

Shema spektrofotometra

DERIVATIVNA SPEKTROFOTOMETRIJA

Derivativna spektrofotometrija je relativno nova metoda čija je primena u poslednje vreme jako porasla pre svega zahvaljujući razvoju računarske tehnike

Primena derivativne spektrofotometrije:

-Pogodna je pri analizi višekomponentnih sistema

-Kvantitativno određivanje tragova u višekomponentnim sistemima

-Karakterizaciju čistih supstanci

-Eliminiše ili smanjuje apsorbancu pozadine čime omogućava određivanja u suspenzijama, mutnim rastvorima

-Derivatizacijom osnovnog spektra moguće je tačnije odrediti talasne dužine maksimuma širokih apsorpcionih traka

Dobijanje derivativnih spektara:

-Optički

-Elektronski

-Matematički

Optički:

Najmanje se smanjuje odnos signala i šuma

Elektronski:

Loš odnos signala i šuma, može se koristiti samo do četvrtog izvoda

Matematički:

Koristi se polinomska interpolacija, Furijeva transformacija

Optička metoda dobijanja derivativnih spektara se sastoji u modulaciji elektromagnetnog zračenja u nekoj oblasti talasnih dužina , koja se naziva interval modulacije

Ispred monohromatora se postavi kvarcna pločica koja vibrira napred-nazad za nekoliko stepeni i samim tim izvodi modulaciju talasne dužine upadnog zračenja po sinusoidalnom zakonu

td 2sin

Rezultujući signal se detektuje elektronski, detektorom koji je podešen na frekvenciju vibracije pločice .

Amplituda rezultujućeg modulisanog snopa biće proporcionalna nagibu apsorpcione trake unutar modulacionog intervla, a samim tim i prvom izvodu spektra, pod uslovom da je modulacioni interval dovoljno mali u odnosu na širinu trake

Elektronska metoda derivacije sastoji se od povezivanja električnog kola sa otpornikom i kondenzatorom (RC) na analogni izlaz detektora pomoću operacionog amplifikatora

Ovde se dobija izvod u funkciji vremena, , ali se na osnovu poznate brzine skeniranja može izračunati izvod apsorbance po talasnoj dužini;

dtdA /

dt

d

dt

dA

d

dA

Kod ovakvog načina dobijanja derivativnih spektara veliki uticaj imaju instrumentalni parametri kao što su brzina skeniranja spektra, širina razreza, veličina pojačanja

Pored toga svaki RC uređaj smanjuje odnos signala prema šumu za 2 što ograničava metodu do četvrtog izvoda

Matematičke metode derivacije se danas najviše koriste

Diferenciranje osnovnog spektra se izvodi bilo snimanjem spektra “tačku po tačku” (neregistrujućim uređajem ili uređajem sa jednim zrakom) i primenom formula za numeričko diferenciranje tako dobijenih vrednosti A=f() ili digitalizacijom spektra snimanjem registrujućim spektrofotometrima i primenom interpolacije i diferenciranja

Najčešće se koristi polinomska interpolacija, Furierova transformacija i interpolacija pomoću splajnova

Nakon toga se, pomoću odgovarajućih numeričkih algoritama ovako dobijene interpolacione formule diferenciraju potreban broj puta.

Razlika absorbanci za dve bekonačno bliske talasne dužine 1 i 2 u osnovnom spektru, A= f(), podeljena veličinom spektralnog intervala =2-1, predstavlja prvi izvod tog spektra

Daljim diferenciranjem dobijamo:

Ako ovo primenimo na apsorpcionu traku gausovog oblika onda dobijam derivativne spektre

)(lim

fAA

)(

nn

n

fd

Ad

Derivativni spektri neparnog rada imaju malo sličnosti sa originalnim spektrom i složeniji su od njega

Ono što je bitno za ove izvode je da prolaze kroz nulu (seku osu talasne dužine) apsorptivnog maksimuma što daje osnovu za kvalitativnu analizu.

U praksi se od neparnih spektara koriste samo spektri prvog reda

Derivativni spektri parnog reda imaju centralnu traku (pik) promenjivog znaka (u drugom izvodu negativan, u četvrtom pozitivan), praćenu sa dve satelitske trake suprotnog znaka i znatno manjeg intanziteta od centralne trake

Maksimumi apsorpcije u osnovnom spektru odgovara maksimumu centralne trake parnog reda

Poluširina te trake znatno je manja nego na osnovnom spektru i traka je uža ukoliko je red spektra veći pa parni izvodi imaju veću primenu od neparnih.

Osnovna osobina izvoda je da su amplitude užih traka relativno veće od amplituda širokih traka

Za n-ti izvod bilo gausovske ili lorencovske širine trake amplituda pika je povezana sa n-tim stepenom recipročne vrednosti širine trake, u osnovnom spektru, .

Zbog toga za trake istih apsorbanci a različitih širina u osnovnom spektru, amplituda uže trake u derivativnom spektru je veća od amplitude šire trake za faktor koji raste sa porastom reda izvoda

)/1( nn wD

n

w

w

D

D

1

2)2(

)1(

Nedostatak derivativne tehnike da odnos signala prema šumu postaje lošiji progresivno sa povećavanjem izvoda

Zbog toga se javlja potreba da se izvede ravnanje spektra kako bi se ovaj odnos poboljšao i šum sveo na najmanju meru

U tu svrhu se koriste različiti numerički algoritmi od kojih su najpoznatiji metoda A. Savitzkog i E. Golaya, metoda Furijerove transformacije i metoda splajn aproksimacije

Visok odnos signala prema šumu mora se postići pri nekom dozvoljenom nivou deformacije spektra s obzirom da se pri velikoj filtraciji šuma povećavaju sistematske greške

Drugi izvod spektra metil-digoksima snimljen na spektrofotometru Cary 3 Varian

Preciznost određivanja max

Kada se apsorpcioni spektar sastoji od širokih traka tačan položaj maksimuma apsorpcije može se odrediti samo aproksimativno

Na max prvi izvod prolazi kroz nulu tako da se talasna dužina maksimuma apsorpcije može odrediti veoma precizno

Povećanje rezolutivnosti

Primenom derivativnih spektara mogu se razdvojiti trake koje se preklapaju i ne mogu se razdvojiti niti razlikovati u osnovnom spektru

Prvi i drugi izvod dve preklapajuće Gaussovske trake

Spektrofotometrija u suspenzijama i mutnim rastvorima

Mutni rastvori i suspenzije ili emulzije jako otežavaju spektrofotometrijsku analizu

Zbog rasipanja zračenja koje raste sa smanjenjem talasne dužine na spektar uzorka se superponira manji ili veši intenzitet pozadine, a pored toga se gubi i intenzitet samog spektra

Zbog rasipanja zračenja na nehomogenostima sredine primena derivativnih spektara eliminiše uticaj fona na spektar analiziranog uzorka

Apsorpciona traka u rasipajućoj sredini i njen prvi izvod (a) Gaussovska traka (b) prvi izvod

Spektar uzorka traka (A), Spektar pozadine traka(B), traka uzorka + pozadina (C) i odgovarajući prvi izvodi

Analiza tragova

Određivanje tragova supstanci u različitim uzorcima izvodi se radi utvrđivanja njihove čistoće

Određivanje benzola u etanolu. I – etanol, II-etanol +1 ppm benzola, III-etanol + 10 ppm benzola, IV-4-ti-izvod od II, V-4-ti izvod od III

U osnovnom spektru prisustvo benzola se jedva uočava

Tek u spektru 4-tog izvoda benzol se može kvantitativno odrediti (AB je srazmerno koncentraciji benzola).

Kvantitativna nalaiza

Kod kvantitativne derivativne spektrofotometrije meri se samo amplituda trake u derivativnom spektru u zavisnosti od koncentracijie jer je koncentracija linearno povezana sa amplitudom n-tog izvoda

Merenja amplitude mogu biti rezultat računarskog izračunavanja, ali može da se izvede i gafički, a važenje Lamber-Beerovog zakona kao i aditivnost apsorbance se podrazumeva

bcd

ad

d

Adn

n

n

n

Za određivanje amplitude koriste se sledeće metode:

-piki-pik maetoda, kod koje se meri rastojanje između maksimuma i njemu odgovarajućeg minimuma

-metoda tangente kada se povlači tangenta između dva susedna maksimuma (ili minimuma) i meri rastojanje između tangente do maksimuma (ili minimuma) između tih maksimuma paralelno sa ordinatom

-pik-nula metoda gde se meri rastojanje od maksimuma ili minimuma do apscise paralelno sa ordinatom.

Ova metoda se koristi kod spektara višeg rada koji imaju simetrične pikove u odnosu na apscisu (spektri prvog reda)

Obrada derivativnog spektra. Metoda tangente (t), pik-pik metoda (p) i pik-nula metoda (z).

Arsenazo III gradi obojene komplekse sa Th(IV) i U(IV) jonima sa maksimumima apsorpcije na oko 665 nm.

Drugi izvod kompleksa U pokazuje dve nule na 650 i 684 nm, a Th na 648 i 680 nm.

Nulte tačke na 680 i 684 nm mogu se koristiti za simultano određivanje metala u smesi.

Na nultoj tački Th (680 nm) meri se amplituda apsorpcije U, a na nultoj tački apsorpcije U (684 nm) meri se amplituda kompleksa Th.