UV-VIS spektrofotometrija

Zasniva se na apsorpciji svetlosti

UV znači: ultra (iznad, preko) + violet(ljubičasto) 200-380 nm

• VIS-visible (vidljivo) 380-780 nm

Apsorpcija zračenja dovodi do prelaza valentnih elektrona iz osnovnog u pobuđeno stanje

• hν = Eviše-Eniže

• hromoforna grupa ili hromofora

Molekul ili deo molekula koji je odgovoran za apsorpciju

u UV –VIS delu spektra

Pobuđuju se valentni elektroni:

�sigma (σ)elektroni�pi (π) elektroni�slobodni elektronski parovi (n)

Pobuđivanje:Iz vezivne u antivezivne

Dozvoljenielektronski prelazi

σ→σ*n→σ*π→π*n→π*

Jedan elektronski prelaz-jedna apsorpciona traka A=f(λλλλ)

λ max-ona talasna dužina koju jedinjenje najviše apsorbuje

1.Mesto u spektru2. Intenzitet3. Poluširina

Apsorcijom zračenja u UV-VIS oblasti spektra pobuđuju se

• A) joni• B) elektroni bliži jezgru• C) valentni elektroni• D) protoni

Deo molekula odgovoran za apsorpciju u UV-VIS oblasti zove

se• A) Hromobara• B) Hromofora• C) Hromozom• D) Hromatin

Apsorpcioni spektar predstavlja zavisnost

• A=f (λmax )• A=f (λ) • λ =f (A)• λ =f (c)

Da li su sledeći prelazi poređani po rastućim ili opadajućim

energijama?• σ→σ*• n→σ*• π→π*• n→π*

Obeležiti oblasti spektra

Skraćenica UV znači:

• A) ultra vidljiv• B) iznad vidljive• C) ispod vidljive• D) iznad ljubičaste• E) ispod ljubičaste

Koliko je λ max ?

Šta utiče na λmax ?

1.Priroda supstanceRazličita jedinjenja imaju

različite hromofore (molekul ili deo molekula koji je odgovoran za apsorpciju u UV-VIS oblasti)

Apsorpcioni spektar benzena (1) oko 255 nm i fenola (2) oko 270 nm

180 200 220 240 260 280 300

2

1

n-π∗

π−π∗

A

λ, nm

Više dvostrukih vezapomeranje ka većim talasnim

dužinama- batohromno pomeranje

Proteini (belančevine) apsorbuju u UV oblasti spektra

Belance je belo!

Hromofore:�Peptidna veza (-CONH-)�Aromatične aminokiseline u

bočnom lancu�Prostetične grupe

UV spektri :a)proteina b) nukleinskih kiselina

Šta nije hromofora kod proteina?

• Pepridna veza• Bazne aminokiseline• Aromatične aminokiseline• Prostetične grupe

Na većoj talasnoj dužini apsorbuje

• a) benzen• b) fenol

a) Naftalenb) Antracen

Pored strukture, na položaj apsorpcione trake utiču:

• pHSlaba baza ili slaba kiselina-u jonskom

ili molekulskom obliku u zavisnosti od pH

Izobestična tačka

Provera:Kapnite par kapilimuna u čaj…

Rastvarač• Jod u etru je ljubičast

• Jod u vodi je žućkasto-braon

Šta znači reč HROMOFORA?

• Grčki:• NOSILAC BOJE chroma + phoros

Boja jedinjenja

Selektivna apsorpcijau vidljivom delu

spektra(400-800 nm)

Komplementarne bojeKomplementarno-koje se dopunjuje,nadopunjujuće

Predmeti su one boje koju reflektuju

Rastvori su one boje koju propuštaju, a ne apsorbuju

Zašto je NaCl bezbojan, a NiCl2 obojen?

11Na→1s2 2s2 2p6 3s1

Na+ →1s2 2s2 2p6 isto kao i Ne Velika E da se prevede u pobuđeno

stanje ⇒u UV oblasti

28Ni → 1s22s22p63s23p64s23d8

Ni2+ → 1s22s22p63s23p64s23d6

Mala E da se prevede u pobuđeno stanje⇒ u VIS oblasti

Koje je boje ovo jedinjenje?

600 620 640 660 680 700

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A

λλλλ, nm

Ako neki rastvor maksimalno apsorbuje oko 300 nm, znači da je

• Obojen• Bezbojan

Šta nam govore UV-VIS spektri?

•Kvalitativna analiza:Koja supstanca je u uzorku?

Ali ne možemo biti 100% sigurni

Aktivnost enzima preko pojave ilinestanka spektara njihovih supstrata.

NADH ima maxna 340 nm

NAD+ nema max na 340 nm

Ispitivanja aktivnosti brojnih enzima kojikatalizuju

reakcije koje uključuju učešće redoks paraNAD+/NADH.

� Alkohol-dehidrogenaza katalizuje:

C2H5OH + NAD+ → CH3CHO + NADH + H+

Raste apsorbancija na 340 nm

� Sorbitol-dehidrogenaza katalizuje:

D-Fruktoza +NADH → D-Sorbitol +NAD+

• Smanjuje se apsorbancija na 340 nm

Kvantitativna analiza kolika je koncentracija?

LAMBERT-BEEROV ZAKON

Ikdb

dI =−

∫∫ =−bI

J

dbkI

dIp

00

bkI

I p =−0

ln

kbp eII −= 0

Eksponencijalni oblik Lambertovogzakona

kbp eII −= 0

Intenzitet propuštene svetlosti eksponencijalno opada sa debljinom sloja kroz koju svetlost prolazi.

U zakon se “ubacuje” i Beer sa koncentracijom…

cbaA=Apsorbancija nekog rastvora srazmerna je koncentraciji

tog rastvora, debljini sloja kroz koji svetlost prolazii apsorptivnosti rastvorene supstance.

Beerov zakon:

Lambert-Beerov zakon

A- apsorbancijaIo- intenzitet upadne svetlosti

Ip- intenzitet propuštene svetlostia-(molarni) apsorpcioni koeficijent ili (molarna) apsorptivnost

b-dužina optičkog putac-koncentracija

cbaI

IA

p

== 0log

Transparencija

• Izražava se u procentima:

• Veza između apsorbancije i transparencije:

0I

IT p=

100%0

⋅=I

IT p

TT

I

IA p 1

logloglog0

=−=−=

TT

A %log21001001

log −=⋅=

Važna veličina,jedino se može meriti

Ip

Veza između A i T

IZME ĐU 20 - 80%T, ODNOSNO 0,1 - 0,7 A

TA log−=

Kalibraciona krivaBeerov zakon:nagib=ab, odsečak

=0cbaA =

0,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

koncentracija

y= kx + njednačina prave

A

Metoda kalibracione krive (standardna, analitička

kriva)

A=f(c)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,00,0

0,2

0,4

Ax

cx

A

c,%

Serija standardnihrastvora (najmanje 6)

poznatih koncentracija.Sa krive se odredi

nepoznatakoncentracija

Ograničenja Lambert-Beerovog zakona

Jedan do dva reda veličine• U intervalu od 1x10-5 do 5x10-4

mol/dm3 ili1x10-4 do 1x10-3 mol/dm3

Dve grupe razloga:• Zbog rastvorka i rastvarača,

t°C slabo• Zbog aparata (pozadinsko

zračenje)

Isključivo za monohromatsku svetlost!

Izbor radne talasne dužine

Zašto je najbolja kalibraciona kriva br. 1?

Apsorbancija nije direktno srazmerna:

• a) koncentraciji• b) gustini• c) debljini sloja• d) apsorptivnosti

Direktno se može meriti

• A)apsorbancija• B) transparencija• C) koncentracija• d) rasuta svetlost

Ako je apsorbancija 0, transparencija je

• a) 0• b) 100• c) 100%• d) 50%

Ako je transparencija 0%, apsorbancija je

• A) 0• B) 100%• c) 100• d) beskonačna

Apsorbancija je srazmerna koncentraciji

• Da • Ne • Zavisi

Lambert-Beerov zakon predstavljalinearnu zavisnost

• apsorbancije od talasne dužine• apsorbancije od koncentracije• talasne dužine od koncentracije• koncentracije od apsorbancije

Instrumentimere APSORBANCIJU i

TRANSPARENCIJU• Fotometri (fotokolorimetri, kolorimetri)

• Spektrofotometri

IZVOR ZRA ČENJAMONOHROMATOR

DETEKTOR

Izvori zračenja-lampe

• VIS deo spektra: volframova lampa(360- 950 nm)

• UV deo spektra: deuterijumova i vodonična (190-420 nm)

cevi za pražnjenježivina lampa- linijske spektre

Monohromator

• Od polihromatske treba da izdvoji monohromatsku svetlost.

• Sastoji se od:1. Ulaznog i izlaznog razreza2. Sistema za kolimaciju (sočiva i ogledala)3. Disperzionog elementa: prizma ili

difrakciona rešetka

Disperzioni element

PRIZMA DIFRAKCIONA REŠETKA

U VIS oblasti spektra-stakleneU UV oblasti spektra- kvarcne

Kivete

• Staklene- za VIS oblast

• Kvarcne-za UV oblast

• Najčešće prečnika 1 cm (dužina

optičkog puta)

Kivete

Detektor: fotoćelija, fotomultiplikator i fotodiode

Intenzitet fotostruje srazmeran

intenzitetu svetlostii= k ×××× Ip

PHOTODIODE ARRAY

više desetina hiljada

dioda;

moguće merenje

istovremeno

svih talasnih dužina

iz jedne spektralne oblasti

Sheme spektrofotometra

Shema spektrofotometara

Dvozračni spektrofotometar

Fotometar

• Jednostavniji uređaji od spektrofotometara• Samo u VIS oblasti spektra• Meri se apsorbancija i transparencija obojenih rastvora-

određuje se koncentracija

Kao monohromatori FILTERI

“Vaš” fotometar

Kako izabrati filter prema boji ispitivanog rastvora?

• Boja filtera je komplementarna bojiispitivanog rastvora.

• To znači da filter treba maksimalno da propusti svetlost one boje koju rastvor maksimalno apsorbuje.

Ako merimo apsorbanciju žutom rastvoru, izabraćemo filter:

• Crveni• Zuti• Zeleni• Narandžasti• Plavi• Ljubičasti

Šta je slepa proba?

• Rastvor = rastvorak + rastvarač

• Apsorbuje i rastvorak i rastvarač• Eliminisati apsorbanciju (transparenciju)

rastvarača tako što se kazaljka instrumenta dovede na 0 apsorbancije, odnosno 100% transparencije

• Na taj način merenjem se dobija samo apsorbancija (transparencija) rastvorka.

Vežba - Fotometija

• Izmeriti apsorbanciju i transparenciju standardnog i nepoznatog rastvora

• Izračunati koncentraciju koristeći metodu standarda

Vežba - Spektrofotometrija“Vaš” spektrofotometar

Vežba - Spektrofotometrija“Vaš” spektrofotometar

Vežba - Spektrofotometrija“Vaš” spektrofotometar

Vežba: Spektrofotometrija

-snimiti apsorpcioni spektar A=f(λ)-naći λmax

-na toj talasnoj dužini izmeriti apsorbanciju standardnih rastvora (koji ste prethodno napravili)

-nacrtati kalibracionu krivu -i sa nje odrediti nepoznatu koncentraciju i

molarni apsorpcioni koeficijent

Objasniti slike

C1

C2

350 400 450 λλmax

A1

A2

A3

A

AX

340350

370

390

410

C C C C1 X 3 C

a) b)

A