Upload
alyssa-obrien
View
32
Download
6
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Kompleksne DNA populatsioon, näiteks genoomne DNA, totaalne cDNA teatud koest jne. Spetsiifiline amplifitseerimine (DNA kloneerimine). Spetsiifiline detekt sioon. Spetsiifiliste DNA järjestusete üldised uurimismeetodid. Meetodid. Rakuline (in vivo ) kloneerimine. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Kompleksne DNA populatsioon, näiteks genoomne DNA, totaalne
cDNA teatud koest jne.
Kompleksne DNA populatsioon, näiteks genoomne DNA, totaalne
cDNA teatud koest jne.
Spetsiifiline amplifitseerimine
(DNA kloneerimine)
Spetsiifiline amplifitseerimine
(DNA kloneerimine)
Spetsiifiline
detektsioon
Spetsiifiline
detektsioon
Spetsiifiliste DNA järjestuseteüldised uurimismeetodid
Rakuline (in vivo) kloneerimine
Rakuline (in vivo) kloneerimine
DNA kloneerimine in virto PCR-i abil
DNA kloneerimine in virto PCR-i abil
1. Sobiv peremeesrakk
2. Replikon
3. Vahendid võõrDNA sisestamiseks replikoni ja selle ülekandeks peremeesrakku
1. Sobiv peremeesrakk
2. Replikon
3. Vahendid võõrDNA sisestamiseks replikoni ja selle ülekandeks peremeesrakku
1. Termostabiilne DNA polümeraas
2. Informatsioon järjestuse kohta, mille alusel saab sünteesida spetsiifilised praimerid
1. Termostabiilne DNA polümeraas
2. Informatsioon järjestuse kohta, mille alusel saab sünteesida spetsiifilised praimerid
Meetodid
Mida on selleks vaja
Molekulaarne hübridisatsioon
Molekulaarne hübridisatsioon
1. Märgitud DNA või RNA proov
2. Prooviga seondunud fragmentide detekteerimine
1. Märgitud DNA või RNA proov
2. Prooviga seondunud fragmentide detekteerimine
Hübridisatsiooni proovid
Hübridisatsiooni proovid
DNADNA RNARNA Oligonukleotiid
Oligonukleotiid
DNA rakuline
kloneerimine või PCR
DNA rakuline
kloneerimine või PCR
Transkriptsioon sobivasse vektorisse
kloneeritud DNA-lt
Transkriptsioon sobivasse vektorisse
kloneeritud DNA-lt
Keemiline süntees
Keemiline süntees
Tavaliselt kahe- ahelaline 0,1 kb kuni 100 kb DNA
kloonide puhul; 0,1 kb kuni 20 kb PCR-i produktide
puhul
Tavaliselt kahe- ahelaline 0,1 kb kuni 100 kb DNA
kloonide puhul; 0,1 kb kuni 20 kb PCR-i produktide
puhul
Üheahelaline, kuni mõni 1000
nukleotiidi
Üheahelaline, kuni mõni 1000
nukleotiidi
Üheahelaline tavaliselt 15-50
alust pikk
Üheahelaline tavaliselt 15-50
alust pikk
Tavaliselt DNA polümeraasiga
Tavaliselt DNA polümeraasiga RiboproovRiboproov OtsmärkimineOtsmärkimine
Tüüp
Päritolu
Prooviiseloomustus
Märkimine
DNA, RNA ja oligonukleotiidide perfektsete hübriidide Tm-e saab välja arvutada vastavate valemite alusel:
DNA-DNA hübriidi jaoks Tm=81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) – 0.61 (% form) – 500/L
RNA-DNA hübriidi jaoksTm= 79.8°C + 18.5 (logM) + 0.58 (%GC) – 11.8 (%GC)2 –
0.56(%form) – 820/L
M on monovalentsete katioonide molaarsus%GC on guanosiini ja tsütosiini protsent DNA-s%form on formamiidi protsent hübridisatsiooni lahusesL on dupleksi pikkus aluspaarides