Vežba br. 1-2-3

KVALITATIVNA ANALIZA (DOKAZIVANJE) ALKALOIDA

Alkaloidi su složena organska azotna jedinjenja, više ili manje baznog karaktera, sa jakim i specifičnim fiziološkim delovanjem. Predstavljaju sekundarne metabolite biljaka, ali se javlja i izvestan mali broj alkaloida životinjskog porekla.Većina alkaloida su heterociklična azotna jedinjenja, koji se u biljkama veoma retko nalaze slobodni i to uglavnom kratko vreme nakon biosinteze. Uglavnom su vezani sa nespecifičnim (jabučna, vinska, limunska, oksalna, itd.) ili specifičnim organskim (mekonska-Opium; helidonsku–Lobelia), a ređe sa neorganskim kiselinama (sulfatna-Opium). Kod nekih biljaka se alkaloidi javljaju vezani za tanine u nerastvorne kompleksne tanate, proteine, a ponekad i za šećere (glikoalkaloidi).Najčešće je u biljci jedan alkaloid glavni, a pored njega se u manjim količinama javljaju i sporedni. Poneka može da bude prisutno i više alkaloida, ali je njihova količinska zastupljenost različita. Slično biljkama, i odgovarajuće droge sadrže više ili manje iste alkaloide i u sličnom proporcionalnom odnosu.Po svojoj hemijskoj prirodi alkaloidi se međusobno jako razlikuju, ali sve strukture poseduju azot u prstenu, što ih međusobno objedinjuje.Pseudoalkaloidi - ne nastaju metabolizmom aminokiselina, već su to izoprenski molekuli (terpenski i steroidni alkaloidi), kao i jednostavna jedinjenja koja nastaju metabolizmom acetatnih jedinica (koniin).Protoalkaloidi - jednostavni amini kod kojih azot nije deo heterociklusa. Ova jedinjenja poseduju baznost i takođe, kao i pravi alkaloidi, nastaju metabolizmom aminokiselina (meskalin, katin, itd.). Neka proteinska jedinjenja (proteinski alkaloidi) se takođe svrstavaju u grupu protoalkaloida (frangulin iz Frangulae cortex).

IZOLACIJA ALKALOIDA

Alkaloidne baze (slobodni alkaloidi) se ne rastvaraju u vodi i etanonolu, a rastvaraju se u slabo polarnim organskim rastvaračima (etar, hloroform). Nasuprot tome, alkaloidne soli su rastvorljive u vodi i etanolu, a ne rastvaraju se u slabo polarnim organskim rastvaračima.Zahvaljujući ovim svojstvima, izolacija najvećeg broja alkaloida iz biljnog materijala vrši se:-ekstrakcijom organskim rastvaračem u alkalnoj sredini u prisustvu slabe neorganske baze (NH4OH): alkaloidi se izoluju kao slobodne baze, pri čemu amonijak istiskuje alkaloidnu bazu iz njenih soli ili kompleksa sa taninima.-ekstrakcijom zakišeljenom vodom ili etanolom: alkaloidi se ekstrahuju u obliku soli. Ako je alkaloid u drogi sav vezan u obliku soli, ekstrakcija se može vršiti i samo vodom (alkaloidi opijuma).Fenolski alkaloidi (morfin, cefelin, psihotrin) kao amfoterna jedinjenja, u baznoj sredini grade hidrosolubilne fenolate. Oni se iz alkalnog rastvora isoljavaju dodatkom slabo kisele soli (NH4Cl), a zatim preuzimaju organskim rastvaračem.Tečni, isparljivi alkaloidi (nikotin, anabazin, spartein, koniin) se iz droga izoluju destilacijom pomoću vodene pare, pri čemu se droga prethodno zaalkališe nekom neisparljivom bazom. Destilat se uvodi u rastvor kiseline, pa se iz presićenog rastvora izdvajaju kristalne soli.

DOKAZIVANJE ALKALOIDA

1

Za dokazivanje alkaloida koriste se opšte taložne i specifične bojene reakcije.Opšte taložne reakcije se karakterišu time što alkaloidi obrazuju nerastvorne taloge u reakcionoj sredini pri uzajamnom delovanju različitih reaktiva, od kojih se najčešće koriste soli teških metala.Opštim taložnim reakcijama se utvrđuje prisustvo alkaloida u nekoj drogi, pri čemu se koriste reagensi sa kojima alkaloidi grade slabo rastvorne komplekse, što se manifestuje pojavom zamućenja ili taloga u ekstraktu droge.Pošto se koriste vodeni rastvori odgovarajućih reagenasa, alkaloidi se ekstrahuju iz droge pomoću vode i kiseline, tj. u obliku hidrosolubilnih soli. Međutim, taloge s opštim raktivima na alkaloide ne daju samo ova, nego i mnoga druga organska jedinjenja sa azotom (belančevine i njihovi degradacioni proizvodi), a isto tako i niz heterocikličnih jedinjenja sa azotom. Zbog toga se samo prema taložnoj reakciji još uvek ne može sa sigurnošću utvrditi prisustvo alakloida, dok negativna reakcija sa sigurnošću svedoči o njihovom odsustvu.

Taložni reagensi: Mayerov reagens: rastvor KJ i HgJ2, kompleksni kalijum-živin jodid (K2HgJ4), sa većim

brojem alkaloida u slabo kiseloj ili neutralnoj sredini daje bele ili žućkaste taloge. Ovaj reaktiv može da služi i za kvantitativnu analizu alkaloida. Međutim, ne taloži kofein, kolhicin i solanin.

Vodeni rastvor tanina: sa alkaloidima daje bele ili taloge boje puti, odnosno kamilje dlake. Ovi talozi su koloidni, a neki se u višku reaktiva i rastvaraju.

Hagerov reagens: 1% vodeni rastvor pikrinske kiseline sa alkaloidima daje žute, kristalne pikrate karakteristične tačke topljenja, koja može da posluži za njihovu identifikaciju.

Lugolov (Vagnerov, Bouchardatov) rastvor: vodeni rastvor joda u KJ (KJ3) sa alkaloidima daje narandžasto-crvene taloge. Međutim, nikotin daje žuti talog, a kofein ne raguje sa ovim reagensom.

Dragendorfov ragens: rastvor KJ i bizmut-nitrata (KBiJ4) u razblaženoj HNO3 sa alkaloidima daje narandžasto-crvene ili taloge boje cigle i H2SO4.

Bertrandov reagens: vodeni rastvor silikovolframove kiseline je veoma osetljiv (osetljivost od 1:8.000 do 1:500.000) i sa velikim brojem alkaloida (iz slabo kisele sredine sa HCl) daje prljavobele taloge, koji se razlažu sa bazama.

Specifične bojene reakcije se koriste za dokazivanje pojedinih alkaloida ili grupa alkaloida. Vitalijevom reakcijom dokazuju se tropanski alkaloidi, Van-Urkovom ergot-alkaloidi, mureksidnom purinski alkaloidi. Dokazivanje može da se vrši:

Direktno: na osnovu stvaranja obojenih kompleksa alkaloida i specifičnih reagenasa ili Indirektno (posredno): dokazivanjem pratećih nealkaloidnih sastojaka karakterističnih za

datu drogu (mekonska kiselina u opijumu i suvim makovim čaurama, pigment sklereritrin u raženoj glavnici).

Osim specifičnim hemijskim reakcijama, alkaloidi se mogu dokazati i:-organoleptički: kapsaicin i piperin su ljuti, koniin miriše na mišji urin, berberin boji pljuvačku u žuto, emetin draži na povraćanje-fiziološki (biološki): hiosciamin i atropin izazivaju midrijazu, fizostigmin i pilokarpin miozu, ergot-alkaloidi izazivaju kontrakciju izolovanog uterusa mačke i potamnjivanje kreste kod petlova, strihnin dat parenteralno izaziva karakteristične grčeve kod životinja, itd.-na osnovu fizičkih svojstava: hina-alkaloidi fluoresciraju plavičastom bojom u UV delu spektra.

KVANTITATIVNA ANALIZA ALKALOIDA

2

Sadržaj alkaloida u drogama određuje se:-volumetrijski,-gravimetrijski,-kolorimetrijski i-visokoefikasnom tečnom hromatografijom (HPLC).

Volumetrijsko određivanje se primenjuje kod onih droga koje sadrže jedan alkaloid ili više hemijski srodnih i po molekulskoj masi bliskih alkaloida, koji imaju dovoljno izražene bazne osobine, da sa kiselinama mogu da grade soli (tropanski alkaloidi). Alkaloidi se titriraju rastvorom kiseline poznatog molariteta, a rezultat se izražava preko jednog od njih. Sadržaj može da se odredi i postupkom retitracije.

Gravimetrijsko određivanje se primenjuje kod onih droga koje sadrže alkaloide različite po hemijskoj strukturi i molekulskoj masi (Veratri radix et rhizoma), kao i kod onih čiji alkaloidi nemaju dovoljno izražena bazna svojstva (Theae folium, Coffeae semen i druge purinske droge).

Kolorimetrijsko određivanje se primenjuje kod onih droga čiji alkaloidi sa odgovarajućim reagensima daju stabilne obojene komplekse (Secale cornutum).

KVALITATIVNA ANALIZA ALKALOIDA

3

(praktični deo)

A) Opšte taložne reakcije:

Postupak: 0,5g droge u prašku (sito 0,75) mućka se 3 minuta sa smešom 2,5ml razblažene HCl i 3,5ml vode i filtrira. Dokazne reakcije se izvode sa bistrim filtratom. Reagensi se dodaju oprezno, u kapima, jer sa većina taloga rastvara u višku reagensa.

Ekstrakt drogeMayer-ov Rastvor tanina Hager-ov Lugolov Dragendorff-ov

Stramonii semenNicotianae foliumPapaveris capitaCapsici fructusPiperis fructusCoffeae semenTheae folium

B) Specifične bojene reakcije:

Dokazivanje tropanskih alkaloida - Vitalijeva reakcija (Ph. Eur. III, Ph. Jug. V):Postupak: 1g droge u prašku (sito 0,75) se mućka 2 minuta sa 10ml 0,05M H2SO4 i porfiltrira. Filtratu se doda 1ml cc NH3 i 5ml vode i izmućka oprezno u levku za odvajanje sa 15ml etra pazeići da se ne stvori emulzija. Etarski sloj se filtrira preko anhidrovanog Na2SO4 u porcelansku posudu i etar otpari. Doda se 0,5ml pušljive HNO3 i upari do suva na vodenom kupatilu. Zatim se sipa 10ml acetona i u kapima alkoholni rastvor KOH. U prisustvu tropanskih alkaloida (hiosciamin, atropin, skopolamin), razvija se tamnožuta boja, koja se pojačava daljim dodatkom acetona.

Dokazivanje ergot-alkaloida u Secale cornutum:-Posredno dokazivanje:Postupak: 1g deoleirane ili sveže droge u prašku zaalkališe se sa 10ml rastvora amonijaka i ekstrahuje sa 20ml etra. Etarski ekstrakt se izmućka sa vodenim rastvorom vinske kiseline. U vodeno-kiseli ekstrakt se dodaje p-dimetilbenzaldehid: u prisustvu derivata lizergne kiseline (ergot-alkaloidi), javlja se plava boja.Takođe, etarski ekstrakt se može filtrirati i filtrat upariti do suva. Filtrat se rastvori u 5ml ccCH3COOH, koja sadrži kap raszblaženog rastvora FeCl3, prenese u peruvetu i pažljivo podlije sa nekoliko ml ccH2SO4. Na dodirnoj površini se javlja plavi prsten (dokazivanje ergotamina).

Dokazivanje kapsaicina u Capsici fructus:Postupak: 1g droge u prašku se prelije sa nekoliko kapi ccH2SO4, nakon čega se mnogi delići paprike oboje najpre tamno-plavo do crno-zeleno-plavo.

Dokazivanje morfinanskih alkaloida u Papaveris capita-Posredno dokazivanje (Ph. Eur. III, Ph. Jug. V-za određivanje opijuma):Postupak: 0,5g droge u prašku prokuva se sa 5ml vode i 5ml 5% razblažene HCl i filtrira. Filtratu se dodaju 2 kapi (0,25ml) 10% rastvora FeCl3. Razvija se crvena boja (mekonska kiselina), koja se gubi po dodatku 0,5ml razblažene HCl.-Direktno dokazivanje:Postupak: kada se crvenom rastvoru (posredno dokazivanje) doda zrnce kalijum-fericijanida, boja se domah menja u tamno-plavo, zbog prisustva morfina.

KVANTITATIVNA ANALIZA ALKALOIDA4

(praktični deo)

A) Volumetrijsko određivanje alkaloida u Stramonii folium prema Ph. Jug. IV (direktna titracija):

Postupak: 10g droge u prašku (sito 0,75) se promućka u tikvici sa brušenim čepom od 250ml sa 100g etra, doda 7ml NH4OH (r.o.) i snažno i često mućka 1h. Zatim se doda 15ml vode, mućka 3 minuta i ostavi da se talog slegne. Nakon toga se etarski ekstrakt procedi preko malo vate u tariranu tikvicu od 250ml sa brušenim čepom i meri (s obzirom da je odnos droge i rastvarača 1:10, odmerenoj količini ekstrakta odgovaraće deset puta manja količina droge).PRINCIP: oslobađanje vezanih alkaloida amonjium-hidroksidom kao jačom bazom i ekstrakcija alkaloid-baza etrom.Zatim se etarski ekstrakt destiliše dok etar gotovo ne ispari (2-3ml), ostatku doda 5ml 0,1M HCl, promućka i dalje zagreva na vodenom kupatilu, dok etar potpune ne otpari. Kiseli rastvor se filtrira, a tikvica ispere dva puta sa po 5ml 0,1M HCl, koji se svaki put filtrira preko istog filtar-papira u isti levak za odvajanje.PRINCIP: alkaloid-baze ekstrahovne etrom se radi prečišćavanja prevode u hidrosolubilne alkaloid-soli pomoću HCl.Sjedinjeni kiseli filtrati u levku za odvajanje se zatim alkalizuju sa NH4OH (r.o.) do pH 8,5 i ekstrahuju sa po 25ml, 15ml i 10ml hloroforma uz mućkanje po 1 minut (hloroformski sloj je sa donje strane). Nakon svakog odvajanja, hloroformski sloj se svaki put filtrira. Sjedinjeni hloroformski ekstrakt se destiluje, a ostatak suši u sušnici 30 minuta na 100-105oC.PRINCIP: dodatkom NH4OH, alkaloid-soli se ponovo prevode u alkaloid-baze radi prečišćavanja i ekstrahuju hloroformom.Kada se ostatak ohladi, rastvori se u 5ml koncentrovanog etanola, doda 20ml destilovane vode, 3 kapi metilensko-crvenog i titrira sa 0,05M HCl. Izolovane alkaloid-baze rastvaraju se u etanolu.

1ml 0,05M HCl odgovara 14,47mg hiosciamina, odnosno atropina.

IZRAČUNAVANJEodnos droga:etar (1:10) g% alkaloida= (b/a) x 100odmereno: g ekstraktautrošeno za titraciju : ml 0,05M HCl

a-količina droge u gb-količina alkaloida u g

B) Gravimetrijsko određivanje alkaloida u Theae folium ili Coffeae semen prema Ph. Jug. II:

5

Postupak: 6g droge u prašku (0,75) prelije se u tikvici od 150ml sa 60g etra i 2,5ml 10% NH 4OH, snažno mućka i ostavi da se slegne. 40g ekstrakta (4g droge) se procedi kroz malo vate u tariranu tikvicu. Ekstrakt se prelije u levak za odvajanje, a tikvica ispere sa malo etra i ovaj spoji sa ekstraktom.PRINCIP: oslobađanje vezanih alkaloida amonijum-hidroksidom kao jačom bazom i ekstrakcija alkaloid-baza etrom.Etarski ekstrakt u levku za odvajanje izmućka se snažno sa 15ml, a zatim još dva puta sa po 10ml mešavine koja se sastoji iz 1 dela 10% HCl i 9 delova vode.PRINCIP: alkaloid-baze ekstrahovane etrom se radi prečišćavanja prevode u hidrosolubilne alkaloid-soli pomoću HCl.Sjedinjenim ekstraktima se u drugom levku za odvajanje doda NH4OH do alkalne reakcije i izmućka prvo sa 20ml, a zatim još tri puta sa po 15ml etra i svaki put etarski ekstrakt procedi kroz malo vate u erlenmajer tikvicu u koju se stavi nekoliko kamenčića za ključanje i zajedno sa njima tarira.PRINCIP: dodatkom amonijum-hidroksida, alkaloid-soli se ponovo prevode u alkaloid-baze radi prečišćavanja i ekstrahuju etrom.Etar se predestiluje na vodenoj pari i tikvica suši 1h, a posle hlađenja meri.

Masa ostatka mora iznositi najmanje 0,04g, što odgovara najmanje 1% alkaloida.

IZRAČUNAVANJEodnos droga:etar (1:10) g% alkaloida= (b/a) x 100odmereno: g ekstrakta

masa ostatka : g

a-količina droge u gb-količina alkaloida u g

6

Vežba br. 4 i 5

MONOTERPENSKI, IRIDOIDNI ILI GORKI GLIKOZIDI(GORKE DROGE)

Aglikoni ove grupe glikozida su monoterpenska, biciklična jedinjenja. Nazivaju se iridoidima, jer predstavljaju derivate iridana (ciklopentan(c)piran), pri čemu osnovni skelet ima deset C atoma. Iridoidi obuhvataju nekoliko hemijski sličnih grupa jedinjenja: prave iridoide i sekoiridoide (retko se u biljkama javljaju slobodni, uglavnom u biljakma obrazuju glikozide), valepotrijate (ne obrazuju glikozide) i aminoderivate (alkaloidi koji nastaju zamenom piranskog kiseonika azotom).

O1

3

456

7

89

10

11

iridan

O

O O

O D-Glukoza

O

O

O

O

H

H

genciopikrozid

O

OHOH

HO

O

OH

OHO

OH

amarogentin

Glikozidi (najčešće glukozidi) nastaju vezivanjem šećera preko hidroksilne grupe na C1 aglikona. Kod određenih droga često dolazi do dimerizacije aglikonskih komponenata (centaurin kod kičice, Centaurii herba) ili acetilovanja šećernog dela molekula (amaro jedinjenja kod Gentianae radix).Pored ovih jednostavnih glikozida, pojedine droge (Gentianae radix) sadrže i specifične bifenilne derivate, pri čemu dolazi do esterifikacije alkoholne grupe glukoze. Ova jedinjenja u svom nazivu imaju prefiks amaro- (amarogentin). U korenu ih ima svega 0,025-0,05%, ali se njihova gorčina oseća i pri razblaženju od 1:58 miliona.Kao i većina glikozida, i gorki glikozidi su rastvoreni u ćelijskom soku i lokalizovani u vakuolama parenhimskih ćelija različitih organa biljaka. Smatra se da imaju ulogu u regulisanju odnosa biljaka koje ih sintetišu sa insektima i drugim životinjama, a zbog antimikrobnog delovanja imaju i ulogu fitoaleksina.Gorke droge se u oficinalnoj medicini koriste zbog svoje gorčine. U terapijskim dozama ne ispoljavaju nikakvo drugo fiziološko delovanje. Označene su kao gorka sredstva (amara pura ili tonica). Njihovi aktivni principi, gorki glikozidi i druge gorke materije, draže čulo ukusa (gustativne nerve) i refleksno dovode do pojačanog lučenja pljuvačke, želudačnog soka i enzima u digestivnom traktu, usled čega dolazi do povećanja apetita i boljeg varenja hrane. Zbog toga ove droge nisu samo sredstva za poboljšanje apetita, nego i tonici i roboransi jer jačaju organizam.

7

Vrednost gorkih droga određuje se organoleptički, tj. fiziološki (biološki), ispitivanjem ukusa odgovarajućih vodenih ekstrakata, a ne hemijskim metodama. Samim tim, vrednost se ne izražava u količini glikozida, jer ne postoji korelacija između gorčine i hemijske strukture gorkih materija, već gorčinom vodenog ekstrakta.Prema Ph. Jug. IV gorčina vodenog ekstrakta predstavlja propisano razblaženje dekokta droge, koje se mora osetiti izrazito gorkim.Prema Ph. Jug. V i Ph. Eur. III vrednost gorkih droga izražava se kao gorka vrednost, koja predstavlja recipročnu vrednost najvećeg razblaženja ekstrakta droge koji e još uvek oseća gorkim, a određuje se u odnosu na hinin hidrohlorid, čija gorka vrednost iznosi 200.000.

HETEROPOLISAHARIDI- SLUZNE DROGE

Heteropolisaharidi, heterogeni polisaharidi ili hidrokoloidi su prirodni sastojci (sluzi) ili eksudativni produkti koji nastaju posle oštećenja biljnog tkiva (gume). Takođe, neki autori u ovu grupu ubrajaju i pektine (delimično metilovani galakturonidi). Različite heksoze, pentoze i uronske kiseline se različito međusobno povezuju i grade linearne ili račvaste lance polisaharida. Ovi lanci se dodatno spajaju i formiraju sistem lamela. Neki heteropolisaharidi su, zbog prisustva uronskih kiselina, kiseli i mogu da nagrade soli sa katjonima (K, Ca i Mg-soli).Biljni heteropolisaharidi su makromolekuli koji se delimično rastvaraju u vodi (grade koloidne rastvore) ili upijaju vodu i bubre (grade gelove). Dodatkom alkohola u vodeni rastvor heteropolisaharida, dolazi do njihove precipitacije. Kuvanjem sa kiselinom, dolazi do hidrolize i oslobađanja monosaharida, koji se dalje mogu identifikovti različitim metodama (hromatografijom na papiru, tankom sloju adsorbensa ili HPLC tehnikom).Svi heteropolisaharidi daju viskozne vodene rastovre koji se nazivaju mucilaginosum. Koriste se eksterno i interno za oblaganje i zaštitusluznica i kože. koriste se i kao emulgatori, odnosno stabilizatori emulzija i drugih disperznih sistema, pa nalaze primenu u farmaceutskoj, kozmetičkoji prehrambenoj industriji.

8

ISPITIVANJE VREDNOSTI GORKIH DROGA (Ph. Jug. IV)(Praktični deo)

Za ispitivanja se pripremi dekokt droge (1:100), tako što se 1g droge u prašku (sito 0,75) kuva 30min. na vodenom kupatilu sa 100ml vode. Ekstrakt se profiltrira i razredi na način propisan u pojedinoj monografiji: Gentianae radix: propisano razblaženje iznosi 1:15.000, priprema se tako što se 1ml dekokta

droge (1:100) razredi pitkom vodom do 150ml Cantaurii herba: propisano razblaženje iznosi 1:1.000, priprema se tako što se 10ml dekokta

droge (1:100) razredi pitkom vodom do 100ml.Ispitivanje vrši istovremeno 5 osoba. Usta se najpe isperu pitkom vodom, a zatim se 10ml razređenog dekokta droge mućka 1min. u ustima, tako da tečnost dođe u dodir sa korenom jezika. Tečnost se zatim izbaci i usta isperu pitkom vodom. Razređeni dekokt mora da oseti izrazito gorkim najmanje 3 osobe. sledeće ispitivanje gorčine ista osoba može da izvrši posle najmanje 1h.

PRINCIP: Vrednost gorkih droga ispituje se na osnovu ukusa vodenog ekstrakta i izražava gorčinom. Gorčina predstavlja propisano razblaženje dekokta droge, koje se mora osetiti izrazito gorkim.

određivanje sastava gorkih droga u Gentianae radix i Centaurii herba putem TLC

Priprema ekstrakta: 1g droge u prašku (sito 0,75) se ekstrahuje 15min. sa 10ml metanola u vodenom kupatilu i nakon toga filtrira. Filtrat se upari na zapreminu od 1-1,5ml i 20l koristi za izvođenje tankoslojne hromatografije.Sistem za razvijanje: etil acetat : metanol : voda (77 : 15 : 8)Detekcija: vaniln-sumpornom kiselinom uz vizuelizaciju na temperaturi od 105-110oC, u vidljivom delu spektra.

ODREĐIVANJE VREDNOSTI SLUZINH DROGA (Ph. Eur. III, Ph. Jug. V)(Praktični deo)

U menzuru od 25ml (visine 5mm, podela 0,5ml) sa brušenim zatvaračem prenese se 1g Althaeae radix, Althaeae folium ili Malvae flos (neusitnjena ili usitnjena do stepena usitnjenosti propisanog u monografiji). Ukoliko nije drugačije propisano, droga se navlaži sa 1ml alkohola, doda 25ml vode i menzura zatvori. Svakih 10min., tokom prvih sat vremena, menzura se snažno mućka, a zatim ostavi da stoji narednih tri sata. Veći volumen tečnosti, zaostao u sloju droge, keo i čestice droge koje plivaju po površini, uklanjaju se 90min. posle početka ispitivanja, pažljivim okretanjem oko uzdužne ose. Nakon 4h očita se zapremina koju zauzimaju čestice droge, zajedno sa njihovim sluzavim omotačem Broj bubrenja predstavlja srednju vrednost tri paralelna određivanja.

Vrednost sluznih droga izražava se brojem bubrenja-zapremina, izražena u ml, koju zauzima 1g droge, uključujući i sluzavi sloj na njenoj površini, nakon 4h bubrenja u vodi.

Vežba br. 6, 7, 8

9

UGLJENI HIDRATI

Ugljeni hidrati su univerzalni sastojci svih živih organizama i jedna od tri grupe primarnih biomilekula koji predstavljaju izvor energije za ćeliju. Glukoza je prvi organski molekul koji nastaje procesom fotosinteze, a njenom transformacijom i polimerizacijom nastaju svi ostali ugljeni hidrati.Ugljeni hidrati u biljnom tkivu imaju gradivnu ulogu (celuloza), predstavljaju rezervoare energije (skrob), sastavni su delovi metabolita biljaka (nukleinskih kiselina, koenzima, glikozida) ili prekursori nekih drugih jedinjenja (alkaloida, sumpornih ili cijanogenih glikozida).

DOKAZIVANJE REDUKUJUĆIH ŠEĆERA NA OSNOVU PRISUSTVA SLOBODNE POLUACETALNE GRUPE (oksidacijom)

Oksidacijom aldehidne (poluacetalne) grupe aldoza nastaju jednobazne kiseline čiji se naziv gradi dodavanjem nastavka –onska (glukoza-glukonska kiselina). Oksidacijom primarne alkoholne grupe nastaju takođe jednobazne kiseline čiji se naziv gradi dodavanjem nastavka –uronska (glukoza-glukuronska kiselina), dok se istovremenom oksidacijom i aldehidne i primarne alkoholne grupe grade dvobazne kiseline koje dobijaju naziv dodatkom reči "šećerna" ili aldarna na početku imena aldoze (D-gluko šećerna kiselina).

C

O

OH

HCOH

HOCH

HCOH

HCOH

CH2OHCH2OH

HCOH

HCOH

HOCH

HCOH

CHO

COOH

HCOH

HCOH

HOCH

HCOH

CHO

D-glukoza D-glukonska kiselina D-glukuronska kiselina D-gluko-secerna kiselina

HCOH

HCOH

HOCH

HCOH

COOH

OH

O

C

CH2OH

HCOH

HCOH

HOCH

HCOH

H

O

C

D-glukoza

FELINGOVA REAKCIJA

+ 2

COOK

CHO

CHO

COONa

+H2O

Felingov reagens D-glukonska kiselina

HCOH

HOCH

HCOH

HCOH

COOH

+ 2

COONa

COOH

COOH

COOK

Cu + Cu2O

K,Na-tartarat

REAKCIJA SREBRNOG OGLEDALA

D-glukoza

C

O

HCOH

HOCH

HCOH

HCOH

CH2OH

H

+Ag2O

COOH

HCOH

HCOH

HOCH

HCOH

D-glukonska kiselina

+ 2 Ag

CH2OH

CH2OH

Dokazne reakcije na redukcione šećere vrše se zagrevanjem u prsustvu jona Cu2* i Ag*, pri čemu dolazi do oksidacije monosaharida i njihovog prelaska u odgovarajuće –onske kiseline. Ove

10

reakcije služe za kvalitativno i kvantitativno dokazivanje monosaharida u biološkom maerijalu zbog izdvajanja crvenkastog bakar(I)-oksida, odnosno Ag (Felingova-kvalitativno i kvantitativno, i reakcija srebrnog ogledala-kvalitativno).

UGLJENI HIDRATI U FARMACEUTSKOJ PRAKSI:

Monosaharidi: D-glukoza, D-fruktoza, D-sorbitol, D-manitol.Disaharidi: redukujući-maltoza i celobioza, i neredukujući-saharoza i trehaloza.Polisaharidi: skrob, dekstrini, ciklodekstrini, dekstrani, inulin.Heteropolisaharidi: prirodni sastojci (sluzi) ili eksudativni produkti koji nastaju posle oštećenja biljnog tkiva (gume). Neki autori u ovu grupu ubrajaju i pektine (delimično metilovani galakturonidi)

DOKAZIVANJE GLIKOZIDA

Različite klase sekundarnih biomolekula biljaka vezuju se za šećere glikozidnom vezom, obrazujući glikozide, i u tom obliku se nalaze u organizmu. Glikozidi su jedinjenja koja se pod uticajem enzima, kiselina ili baza, a neka i jednostavnim kuvanjem u vodi, razlažu na jedan ili više molekula šećera (glikon) i nešećerno jedinjenje (aglikon, genin ili genol). Glikozidi su rastvorljivi u vodi i polarnim rastvaračima, dok su aglikoni (nešećerna komponenta) liposolubilni i rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima (etar, hloroform).

GLIKOZID AGLIKON + GLIKON

Najveću grupu glikozida čine tzv. O-glikozidi, koji nastaju reakcijom između poluacetalne hidroksilne grupe šećera i hidroksilne, alkoholne ili fenolne grupe aglikona, uz izdvajanje molekula vode. Slobodna hidroksilna grupa šećera može da reaguje i sa sulfhidrilnom grupom (S-glikozidi) ili amino grupom aglikona (N-glikozidi). Sem njih, u prirodi postoje i C-glikozidi, koji su veoma otporni na dejstvo kiselina i enzima.Podela glikozida izvršena je na osnovu hemijske strukture aglikona (fenolni, flavonoidni, antrahinonski, sumporni, cijanogeni i kumarinski glikozidi) ili na osnovu farmakodinamskog delovanja (kardiotonični i gorki glikozidi).

KARDIOTONIČNI GLIKOZIDI

Aglikon kardiotoničnih glikozida je steroidne prirode, tj. derivat je sterana (ciklopentanoperhidrofenantrena), koji na položaju C-17 ima vezan jedan nezasićeni laktonski prsten. U zavisnosti od strukture ovog prstena, razlikuju se dva osnovna tipa kardiotoničnih glikozida:-kardenolidni tip: sa petočlanim laktonskim prstenom i jednom dvostrukom vezom (C23

kardenolidi)-digitoksin, digoksin, gitoksin (Digitalis sp.), oleandrin (Nerium oleander);-bufadienolidni tip: sa šestočlanim laktonskim prstenom i dve dvostruke veze (C24 kardenolidi)-helebrigenin (Helleborus sp., Ranunculaceae), scilarenin (Scilla maritma, Liliaceae).U sastav šećerne komponente, osim uobičajenih monosaharida (glukoza, ramnoza), ulaze i specifični šećeri (2-dezoksi- i 2,6-didezoksiheksoze), koji su prisutni samo u molekulima kardiotoničnih glikozida.

11

Enzim, H+, OH-

H2O

O

O

HO

OH

17

KARDENOLID BUFADIENOLID

OH

HO

O

O

CHO

CH2

CH3

D-DIGITOKSOZA

Kardiotonični glikozidi nemaju ni bazne ni kisele osobine, koje bi omogućavale njihovo lakše izolovanje stvaranjem soli. Sem toga, ova jedinjenja su osetljiva prema kiselinama, bazama i određenim enzimima, pa se zbog toga njihovo razdvajanje od balastnih materija u drogi i međusobno odvajanje zasniva na fizičkim svojstvima, odnosno rastvorljivosti koja je različita u pojedinim rastvaračima koji se ne mešaju.Za kvalitativno dokazivanje kardiotoničnih glikozida koriste se pre svega bojene reakcije, od kojih su mnoge zajedničke za fitosterole. Neke bojene reakcije kardiotoničnih glikozida daju funkcionalne grupe aglikonske komponente ili specifični šećeri i zato su one pogodne za razlikovanje ovih, od drugih steroida. Dokazivanje kardiotoničnih glikozida zasniva se na dokazivanju nezasićenog petočlanog laktonskog prstena (Baljetova reakcija) i specifičnih 2-dezoksi- i 2,6-didezoksišećera (Keller-Kiliani reakcija).

CIJANOGENI GLIKOZIDI

Cijanogeni glikozidi su sekundarni biomolekuli biljaka koji se hidrolizom razlažu na jedan ili više molekula šećera i nestabilan aglikon cijanhidrin (hidroksinitril), koji se dalje razlaže na cijanovodonik (HCN) i jedan aldehid ili keton. Cijanogeni glikozidi i odgovarajući litički enzimi smešteni su u biljnom tkivu u odvojenim delovima ćelija, a do kontakta glikozida i enzima dolazi tek posle povrede tkiva u prisustvu vode.U semenu gorkog badema (Amygdalae amarae semen) nalazi se amigdalin (amigdalozid), a u proklijalom semenu lana (Lini semen) je prisutan linamarin (linamarozid). Cijanogeni glikozidi javljaju se i u semenu različitog koštuničavog voća porodice Rosaceae (breskva, kajsija, šljiva, trešnja, dunja).

CH3

C

CH3

CN

O glukoza

LINAMARIN(LINAMAROZID)

linaza, H+

H2Oglukoza +

OH

CN

CH3

C

CH3

ACETON-CIJANHIDRIN

CH3

C

CH3

O + HCN

ACETON

SUMPORNI GLIKOZIDI

12

Sumporni ili senevolni glikozidi su sekundarni biomolekuli biljaka ljutog ukusa, koja pod uticajem enzima (mirozinaza) lako hidrolizuju na šećernu komponentu (glikon) i nestabilno sumporno jedinjenje (aglikon), koje se dalje lako razlaže na kalijum-hidrogen-sulfat (KHSO4, neorganski deo aglikona) i izosulfocijanat (organski deo aglikona). Izosulfocijanati (izotiocijanati) su estri izosulfocijanske (izotiocijanske) kiseline i nekog alifatičnog ili aromatičnog alkohola.U semenu crne slačice (Sinapis nigrae semen) nalazi se sinigrin (sinigrozid), koji hidrolizom daje isparljivi alilizotiocijanat, zbog čega je ova droga ljutog ukusa kada se žvaće. Seme bele slačice (Sinapis albae semen) sadrži sinalbin (sinalbozid), koji hidrolizom daje neisparljivi p-hidroksibenzilizotiocijanat, zbog čega ova droga nema ljuti ukus.Kod belog luka (Alii sativi bulbus) su u drogi prisutna sumporna jedinjenja, derivati cisteina. U neoštećenoj biljci se nalazi aliin (S-alil-L-cistein-sulfoksid). Prilikom i najmanjeg oštećenja dolazi do hidrolize aliina pod dejstvom enzima aliinaze na mlečnu kiselinu i 2-propenil-sulfinsku kiselinu. Ova kiselina se trenutno dimerizuje i gradi alicin (dialiltiosulfinat). Iz alicina nastaje dialildisulfid, najvažnije isparljivo jedinjenje belog luka, od kojeg potiče karakteristična aroma.

OH

NH2

COOHALIIN

aliinaza, H+

H2O

COOH

CH OH

CH3

MLECNA KISELINA

+SOH

2-PROPENSULFINSKAKISELINA

-H2O

SS

ALICIN

S

FENOLNI GLIKOZIDI

Kod ovog tipa glikozida kao aglikoni se mogu pojaviti jednostavni fenoli i fenolkarbonske kiseline (odnosno njihovi derivati). Često se u biljkama mogu naći jednostavni fenoli, kao što su katehol i floroglucinol, ali je najčešći hidrohinon. Hidrohinon u obliku glikozida javlja se kod biljaka porodica Ericaceae i Rosaceae.U listu planike (Uvae ursi folium) najčešće se fenoli javljaju u formi glikozida, vezani za šećere, od kojih su najpoznatiji arbutin (arbutozid) i metilarbutin (metilarbutozid). Oni se hidrolizom razlažu na glukozu i hidrohinon (arbutin), odnosno glukozu i metilhidrohinon (metilarbutin).

OH

O glukoza

glukoza

OH

OH

H (enzim)

H2O

+

+

(ARBUTIN)ARBUTOZID HIDROHINON

O

OCH3

glukoza

+

H2O

H (enzim)

OCH3

OH

+ glukoza

(METILARBUTIN)METILARBUTOZID METILHIDROHINON

13

FLAVONOIDNI GLIKOZIDI

Kao aglikonska komponenta ovih glikozida javlja se molekul flavonoida (flavus-žut), u čijoj osnovi se nalazi benzo--piron (hromon). Flavonoidi predstavljaju najveću grupu biljnih polifenola, (C6-C3-C6) i u prirodi se javljaju kao slobodni ili u formi glikozida. Sva flavonoidna jedinjenja su derivati 2-fenil-hromona, dok su izoflavonoidi derivati 3-fenil-hromona. U zavisnosti od stepena oksidacije, derivati 2-fenil-hromona se dele na flavone, flavonole, flavanone i dihidroflavonole. To su biljni pigmenti, zbog šećera rastvorljivi u vodi, pa se nalaze u ćeiljskom soku vakuola epidermalnih i ćelija mezofila.

O

O O

O

2-FENIL HROMON 3-FENIL HROMON

O

OHO

OHFLAVONI FLAVONOLI

OH

HO O

O

FLAVANONIOH

HO

O

O O

O

HO

OHDIHIDROFLAVONOLI

OH

OH

KUMARINSKI GLIKOZIDI

Ovaj tip glikozida hidrolizom daje kumarinsku (o-hidroksi-cis-cimetnu) ili kumarnu (o-hidroksi-trans-cimetnu) kiselinu, koje prelaze u kumarin (benzo--piron).Hemijski posmatrano, aglikoni ovih glikozida mogu biti podeljeni na jednostavne-u biljkama porodica Asteraceae i Fabaceae, i na heterociklične kumarine (furano- i piranokumarini)-u biljkama porodica Rutaceae i Apiaceae. Slobodni ili u obliku glikozida, lokalizovani su u svim nadzemnim i podzemnim organima biljaka.

O

COOH

glukoza

MELILOTOZID

-glukoza

COOH

OH

KUMARNA KISELINA(nestabilna)

UV-svetlost

OHCOOH

KUMARINSKA KISELINA(stabilna)

-H2O

KUMARIN

O O

14

ANTRAHINONSKI GLIKOZIDI (laksantno delovanje)

Aglikoni antrahinonskih glikozida su derivati antracena, koji se međusobno razlikuju po stepenu oksidacije C-9 i C-10 atoma (antroni, antranoli, antrahinoni), ali su svi hidroksilovani na C-1 i C-8. Ovakva jedinjenja, dodatno supstituisana u okviru aromatičnih prstenova A i C nazivaju se 1,8-dihidroksiantrahinoni, tj. emodinski ili laksantni antrahinoni. Njihovi redukovani oblici, antroni, su prva jedinjenja koja se sintetišu u biljkama, kao i njihovi tautomerni oblici antranoli, a u biljci naknadno dolazi do oksidaciju. Raznovrsnost antrahinona je povećana specifičnim reakcijama i sposobnošću dimerizacije stvaranja homo- ili heterodiantrona. Do ovakvih procesa može doći već u biljci ili tokom prerade droge (u procesu sušenja, Sennae folium). Droge sadrže malu količinu slobodnih aglikona i to u obliku antrahinona, jer su redukovani oblici nestabilni. Češće se javljaju vezani za šećere, pa se mogu javiti u obliku antronskih, diantronskih ili antrahinonskih glikozida.

OHO

O

O

O2

ANTRAHINON

ANTRON ANTRANOL

O

O

DIANTRON

10

x 2

O

O

OHOH ONa ONa

O

O

+ H2O

NaOH

HCl

FENOLI FENOLATI

(ZUTI, LIPOSOLUBILNI) (CRVENI, HIDROSOLUBILNI)

1,8-dihidroksiantrahinoni su žuti, liposolubilni. Sa bazama grade crvene, hidrosolubilne fenolate (Borntregerova reakcija), dok kiseline (npr. HCl) istiskuju slobodne antrahinone (fenole) iz njihovih soli.Ovakav tip glikozida je ograničeno rasprostranjen u biljkama porodica Liliaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae i Fabaceae.

15

DOKAZIVANJE GLIKOZIDA(praktični deo)

Dokazivanje kardiotoničnih glikozida u Oleandri folium i Digitalis folium Postupak: 1g droge u prašku pomeša se u tikvici sa 15ml razblaženog etanola (r.o.) i zagreva na vodenom kupatilu na temperaturi od 60oC uz povratni hladnjak 30 min. Kad se smesa ohladi, profiltrira se.PRINCIP: kardiotonični glikozidi, kao polarna jedinjenja, ekstrahuju se razblaženim etanolom.Filtratu se doda 50ml vode i 5ml Pb-acetata (r.o.), dobro promućka i smesa poonovo filtrira. Filtrat se podeli u dve epruvete i koristi za dalja ispitivanja.PRINCIP: taloženje balastnih materija Pb-acetatom.

a) 10ml filtrata se pomeša sa 2ml rastvora Na2HPO4 i smesa ponovo filtrira. Kada se 5ml filtrata pomeša sa 5ml Na-pikrata (r.o.), oboji se narandžasto usled prisustva nezasićenog petočlanog laktonskog prstena. Reakciju daju svi kardiotonični glikozidi i aglikoni s petočlanim nezasićenim laktonskim prstenom na C-17 (digitoksin i svi glikozidi sa ovim aglikonom), pri čemu se obrazuje narandžasta boja (Baljetova reakcija).

b) 30ml filtrata se ekstrahuje u levku za odvajanje dva puta sa po 10ml hloroforma. Sloj hloroforma se filtrira i upari na vodenoj pari do suva. Ostatku se doda 1-2ml petroletra, koji se pažljivo odlije od ostatka, a zatim preostali petroletar ukloni strujom vazduha. Ostatak se rastvori u 2ml glacijalne CH3COOH i rastvor prenese u suvu epruvetu. Kada se tečnost pažljivo podlije sa 1ml FeCl3/H2SO4 reagensa (r.o.), dodirna površina se sa gornje strane oboji plavo-zeleno zbog prisustva digitoksoze (Keller-Kiliani reakcija), a sa donje strane smeđe-crveno (digitoksin i drugi aglikoni). Reakcija u kojoj se dobija plava boja je karakteristična za 2,6-dezoksi šećere i glikozide koji ih sadrže. Stabilnost plave boje zavisi od temperature i svetlosti i menja se u plavo-zelenu i zelenu.

Dokazivanje cijanogenih glikozida u Lini semen Postupak: 1g droge se usitni u tarioniku i prelije vodom. Žitka kaša se prebaci u erlenmajer, koji se brzo zatvori plutanim zapušačem u čiji je prorez sa donje strane uvučena pikronatrijumova hartija, koja ne sme da dodiruje ni zidove suda ni kašu. Posle kraćeg vremena, hartija će se obojiti crveno.PRINCIP: u semenu lana linamarin i enzim linaza su kompartmentizovani, tj. nalaze se u različitim ćelijskim organelama. Posle povrede tkiva, u prisustvu vode, linaza dolazi u kontakt sa glikozidom i razlaže ga. Hidrolizom oslobođeni HCN (cijanovodonik) isparava i sa Na-pikratom daje crveno obojeni izopurpurat.

Dokazivanje sumpornih glikozida u Alii sativi bulbus Postupak: oko 0,5g droge usitni se u tarioniku i prelije vodom. Žitka kaša se prenese u erlenmajer i brzo zatvori plutanim zapušačem u čiji je prorez sa donje strane uvučena Pb-acetatna hartija, koja ne sme da dodiruje ni zidove suda ni kašu. Posle kraćeg vremena Pb-acetatna hartija će pocrneti.PRINCIP: u lukovici belog luka sumporni glikozid aliin i enzim aliinaza su kompartmentizovani. Posle povrede tkiva, u prisustvu vode, aliinaza dolazi u kontakt sa aliinom, koji se razlaže na mlečnu kiselinu i 2-propenil-sulfinsku kiselinu. 2-propenil-sulfinska kiselina se dimerizuje u alicin (dialiltiosulfinat). Iz alicina nastaje isparljivi dialildisulfid, koji dolazi u kontakt sa Pb-acetatom i boji ga crno, usled obrazovanja PbS.

Dokazivanje fenolnih glikozida u Uvae ursi folium Postupak: 0,1g droge u prašku (sito 0,75) se kuva 1 min. sa 5ml vode i smesa filtrira. Kada se u 1ml filtrata doda nekoliko kapi FeCl3, tečnost se oboji smeđe-crveno.*zbog prisutnih pirogalnih tanina, tečnost se brzo oboji tamno-plavo.PRINCIP: fenolni glikozidi se sa FeCl3 boje crveno.

16

Dokazivanje antrahinonskih glikozida u Frangulae cortex i Sennae folium Postupak a): 0,2g droge u prašku (sito 0,75) se prokuva sa 3ml razblažene HCl (kisela hidroliza). Kada se ohladi, izmućka se sa 10ml benzena, sloj benzena odlije i filtrira (preuzimanje aglikona benzenom). Kada se 5ml žutog benzenskog ekstrakta izmućka sa smešom od 2ml vode i 1ml KOH, vodeni sloj se oboji crveno (Borntregerova reakcija)-ukupni antrahinoni.Postupak b): 0,2g droge u prašku (sito 0,75) se prokuva sa smešom od 5ml vode i 5 kapi KOH (bazna hidroliza i prevođenje žutih antrahinona u crvene fenolate). Kad se ohladi, filtrira se i filtrat zakiseli razblaženom HCl i izmućka sa 10ml benzena (HCl istiskuje antrahinone iz njihovih soli). Kad se 5ml benzenskog ekstrakta izmućka sa smešom od 2ml vode i 1ml KOH, vodeni sloj se oboji crveno (Borntregerova reakcija)-ukupni antrahinoni.Postupak c): 1g droge u prašku (sito 0,75) se izmućka sa 5ml benzena i filtrira (ekstrakcija slobodnih antrahinona). Benzenski ekstrakt je žut, a kad se promućka sa 1ml NH4OH, vodeni sloj se oboji crveno (Borntregerova reakcija)-slobodni antrahinoni.PRINCIP: žuti, liposolubilni antrahinonski aglikoni sa bazama grade hidrosolubilne, crveno obojene fenolate-Borntregerova reakcija.

Dokazivanje flavonoidnih glikozida u Betulae folium Postupak: 0,2g droge u prašku (sito 0,75) se prokuva u 5ml 70% metanola i filtrira. Filtratu se doda na vrh kašike opiljaka Mg i nekoliko kapi ccHCl, pri čemu se razvija crvena boja.PRINCIP: flavonoidi se u kiseloj sredini u prisustvu elementarnog Mg ili Zn redukuju do crvenih antocijanidina (cijanidinska ili Šinoda reakcija).

Dokazivanje kumarinskih glikozida u Foeniculi fructus Postupak: 0,2g droge u prašku (sito 0,75) se izmućka sa 5ml 70% metanola i filtrira. Filtratu se doda nekoliko kapi 1M NaOH. Rastvor u UV svetlosti fluorescira žuto-zeleno.PRINCIP: u UV svetlosti, u baznoj sredini, kumarini fluoresciraju žuto-zeleno.

Postupak (DAB 10): 0,5g droge u prašku (0,75) se snažno mućka 1min sa 4ml metanola (cc) i filtrira. U 0,2ml filtrata doda se 0,2ml cc sumporne kiseline. U prisustvu derivata -pirona rastvor se boji limun-žuto (usled obrazovanja oksonijum soli). U prisustvu furanokumarina, a odsustvu derivata -pirona rastvor se boji zelenkasto braon (ukoliko su prisutni i derivati -pirona, dobijaju se prelazne boje rastvora.)

DOKAZIVANJE SLOBODNIH REDUKUJUĆIH ŠEĆERA

a) dobijanje 5% dekokta Rosae caninae fructus: 0,5g izdrobljene droge, odvojene od pojedinačnih orašica, se prokuva u 50ml vode i filtrira.

b) 0,1g droge u prašku (sito 0,75) se kuva 1 min. sa 5ml vode i kada se ohladi, smesa filtrira i prebaci u levak za odvajanje, u koji se doda 5ml dietil-etra. Vodeni sloj se odvoji i koristi za dalja ispitivanja.

Postupak: 2ml Fehlingovog reagensa (rastvor Fehling I i Fehling II u odnosu 1:1) se izmeša sa 0,5ml filtrata i zagreva do pojave crvenog taloga, koji stajanjem pocrni.

HEMIJSKA IDENTIFIKACIJA SKROBA

Postupak:a) Pripremi se suspenzija sa 1g droge u 50ml vode, zagreje do ključanja, ostavi 1min da ključa i

ohladi. Formira se retka opalescentna sluz.b) U 1ml sluzi dobijene u ispitivanju za identifikaciju (a) dodaje se 0,05ml joda (r.o.). Nastaje

tamnoplava boja, koja zagrevanjem nestaje, a hlađenjem se ponovo pojavljuje.

17

Vežba br. 9

DOKAZIVANJE I ODREĐIVANJE TANINA

Tanini su složena, bezazotna, polifenolna (derivati fenola i fenolkarbonskih kiselina) biljna jedinjenja oporog ukusa. Rastvaraju se u vodi i polarnim (etanol, aceton, etil acetat), a ne rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima (petroletar, hloroform). Vodeni rastvori tanina su koloidni.Najvažnije svojstvo tanina je da talože belančevine, sa kojima u vodi grade nerastvorljive kopmlekse. Na tome se zasniva njihov opor (adstringentan) ukus, sposobnost da štave sirovu životinjsku kožu (štavne materije) i farmakološko delovanje.Tanini grade stabilne komplekse i sa jonima teških metala i sa alkaloidima (jedna od reakcija za dokazivanje alkaloida).Međutim, pošto se u biljkama nalazi veliki broj jedinjenja fenolskog karaktera koja daju opšte reakcije na tanine, a samo pojedina imaju tipične osobine tanina, od brojnih predloženih reakcija samo je mali broj onih koje daju sigurne dokaze o prisustvu tanina u biljnom materijalu.Soli nekih metala lako daju taloge, a drugih bojene reakcije, odnosno i taložne i bojene reakcije sa taninima kao derivatima fenola (odnosno polifenolnim jedinjenjima) zbog prisustva fenolskih grupa. Soli olova daju taloge, soli gvožđa bojenu reakciju i talog. AlOH i KHCO3 (kalijum bihromat) daju takođe taloge sa taninima. Međutim, naveden reakcije nisu specifične. Sa solima gvožđa reaguju svi fenoli, a sa solima olova daju taloge i druga jedinjenja u biljnim ekstraktima (pektini, belančevine, neke biljne boje, itd.). Ipak, ove rakcije mogu poslužiti za preliminarno dokazivanje tanina.

Podela tanina:1. GALNI, PIROGALNI ILI HIDROLIZUJUĆI TANINI - estri monosaharida i galne kiseline ili

njenih derivata (depsidi, C-C vezani dimeri i trimeri (2-2') i etri). ovi tanini su nestabilni i razlažu se pod uticajem enzima tanaze, kiselina ili baza, a neki i jednostavnim kuvanjemu vodi na monosaharide i molekule galne kiseline ili njenih derivata.

ELAGNI TANINI predstavljaju posebnu grupu galnih tanina. To su estri monosaharida i heksahidroksidifenske kiseline. U biljnim ekstraktima, u kiseloj sredini, posle hidrolize elagnih tanina, heksahidroksidifenska kiselina se spontano prevodi u elagnu kiselinu (dilakton).

2. KATEHINSKI, KONDENZOVANI, FLOBATANINI ILI POLIMERI ANTOCIJANIDINA: C-C polimeri katehina i leukoantocijanidina. Katehini su derivati flavan-3-ola. Leukoantocijanidini su derivati flavan-3,4-diola i nazivaju se i monomerni proantocijanidini. Katehinski tanini se ne razlažu pod uticajem enzima, kiselina ili baza, ili kuvanjem u vodi. Nasuprot tome, na vazduhu, u prisustvu enzima oksidaza i kiselina, nego se i dalje polimerizuju.

3. MEŠOVITI TANINI: smeša galotanina i katehinskih tanina.4. PSEUDOTANINI ili TANIINI U ŠIREM SMISLU: depsidi fenolkarbonskih kiselina sa drugim

fenolkarbonskim ili hidroksikarbonskim kiselinama. Imaju veoma slabo izražen taninski karakter. Tu spadaju rozmarinska, hlorogenska kiselina i druga srodna jedinejnja (tzv. tanin usnatica).

Dokazivanje tanina

Dokazivanje tanina u ekstraktima droga vrši se organoleptički, na osnovu oporog ukusa i hemijskim reakcijama (opštim taložnim-dokazivanje prisustva tanina i specifičnim taložnim i bojenim reakcijama-razlikovanje galnih od katehinskih tanina). a izvođenje reakcija koriste se bistri, ohlađeni, 0,5 ili 1% dekokti.

18

Kvantitativno određivanje tanina

Određivanje tanina vrši se:

gravimetrijski

- sa hromiranom kožom u prahu (Ph. Jug. IV)

PRINCIP: tanini se određuju iz razlike suvog ostatka ukupnog vodenog ekstrakta droge i suvog ostatka ekstrakta obrađenog kožnim prahom.

- sa cink acetatom (Ph. Jug. II)

PRINCIP: tanini se iz vodenog ekstrakta talože rastvorom amonijačnog cink acetata kao cink-tanati. Ispran, osušen i izmeren talog se žari do cink oksida. Razlika u masi daje količinu tanina.

kolorimetrijski

PRINCIP: tanini se iz vodenog ekstrakta talože rastvorom amonijačnog cink acetata kao cink-tanat. Talog se rastvara u smeši sumporne kiseline i vode. Izaziva se bojena reakcija smešom natrijum karbonata i volfram-fosfatne kiseline. Apsorbancija dobijenog rastvora izmeri se na 550nm. Poredbeni rastvor predstavlja rastvor tanina, natrijum karbonata i volfram-fosforne kiseline u vodi.

19

Praktični deo

DOKAZIVANJE TANINA(Kvalitativna analiza tanina)

POSTUPAK ekstrakcije: 0,5g sprašene droge (sito 0,75) nakvasi se etanolom i zagreva sa 100ml destilovane vode 30min na 90oC. Dokazne reakcije izvode se sa profiltriranim, ohlađenim dekoktom.

Opšte taložne reakcije (dokazivanje prisustva tanina) kod Quercus cortex, Theae folium, Uvae ursi folium, Filicis (maris) rhizoma i Juniperi fructus

REAKTIVI TANINIgalni katehinski mešoviti

želatin (1%) + + +Pb(CH3COO)2 ili Zn(CH3COO)2 + + +Pb(CH3COO)2/ CH3COOH + - ±

-proba sa želatinom: Nekoliko ml ispitivanog bistrog ekstrakta droge pomeša se uz dokapljavanje sa rastvorom želatina u epruveti i posmatra da li nastaje zamućenje.Osetljivost reakcije – pojedini tanini imaju različitu osetljivost pri stvaranju taloga sa želatinom. Tanin

iz plodova daju zamućenje već u razblaženim rastvorima, oni iz kore su manje osetljivi, a najmanje su

osetljivi tanini iz smrče. Osetljivost želatinske reakcije zavisi i od pH rastvora tanina. Za većinu tanina

optimalna pH vrednost je oko 4.

-proba olovo-acetatom: Bazni olovo-acetat taloži sve tanine i fenolna netaninska jedinjenja. Neutralni olovo-acetat daje sa svim taninma taloge. Filtrat ovih taloga daje kod većine tanina žutu boju sa NaOH (talog se filtrira i pokuša da se rastvori u 10ml 5% KOH).

- proba sa sirćetnom kiselinom i olovo-acetatom: sirćetna kiselina sprečava taloženje tanina pomoću olovo-acetat. Galotanini se u rastvoru sirćetne kiseline potpuno ili delimično talože olovo-acetatom.POSTUPAK: u 5ml 0,4% ekstrakta taninske droge sipa se najper 10ml 10% CH3COOH, a zatim i 5ml 10% Pb(CH3COO)2.

Specifične bojene i taložne reakcije (razlikovanje galnih od katehinskih tanina) kod Quercus cortex, Theae folium, Uvae ursi folium, Filicis (maris) rhizoma i Juniperi fructus

REAKTIVI TANINIgalni katehinski mešoviti

FeCl3 ili FeNH4(SO4)3 (1%) plavo zeleno plavo-zelenoFormaldehid/HCl - talog talogbromna voda - talog talog

20

- proba gvožđem: Katehinski tanini (sa izuzetkom tanina prisutnih kod porodice Mimosaceae) daju sa gvožđem zelenu boju, a galotanini i Mimosa-tanini plavo-ljubičastu boju. Fenolne, netaninske materije, daju reakciju sa gvožđem kao i tanini, kada se nalaze zajedno u biološkom materijalu.POSTUPAK: Nekoliko ml 0,4% dekokta taninske droge pomeša se sa nekoliko kapi 1% rastvora FeCl3 (ne preporučuje se za upotrebu, jer je ovaj rastvor veoma kiseo) ili FeNH4(SO4)3 – feri-alaun. Rastvor tanina treba da bude neutralan. Jake kiseline sprečavaju i ometaju reakciju, a slabe izazivaju pojavu zelene boje, dok slabo-bazni rastvori daju plavo-ljubičasto obojenje.

- formaldehidna (tanoformna) proba: služi za ispitivanje i galnih i katehinskih tanina.POSTUPAK: Pomeša se 50ml 0,4% dekokta taninske droge u erlenmajeru sa 5ml ccHCl i 10ml 40% formaldehida i zagreva 30min uz povratni hladnjak. posmatra se da li za vreme kuvanja nastaje talog. Zatim se ohladi i filtrira. 10ml filtrata pomeša se sa 1ml 1% rastvora FeNH4(SO4)3 i bez mešanja doda 5g čvrstog Na-acetata. Posmatra se da li nastaje jako plavo-ljubičasto obojenje. Pri ovom postupku talože se katehinski tanini (talog tanoforma-kondenzacioni produkt katehinskih tanina i formaldehida), dok galotanini potpuno ili delimično ostaju u rastvoru i dokazuju se pomoću FeNH4(SO4)3 (feri-alaun). Filtrat taloga tanoforma daje kod većine tanina žutu boju sa NaOH (talog se filtrira i pokuša da se rastvori u 10ml 5% KOH).

-proba bromnom vodom: Katehinski tanini talože se odmah bromnom vodom (zasićen rastvor broma u vodi).POSTUPAK: U čašu se sipa nekoliko ml 0,4% dekokta taninske droge, malo sirćetne kiseline i onda u kapima zasićena bromna voda. Nastajanje taloga može se pojaviti i posle dužeg stajanja.

Aglutinacija eritrocita

POSTUPAK: 1g (ili 0,5g) droge zagreva se sa 100ml fiziološkog rastvora u ključalom vodenom kupatilu tokom 15min. Posle hlađenja se filtrira i ohlađeni filtrat upotrebi za ispitivanje.U 4ml ekstrakta doda se 2ml 2% suspenzije eritrocita, promućka i ostavi da stoji 1h, pa zatim filtrira. Na filtru zaostaju aglutinirani eritrociti.Kontrola (poredbeni rastvor): 4ml fiziološkog rastvora i 2ml suspenzije eritrocita-filtriranjem eritrociti prolaze korz filtar-papir.

21

Vežba br. 10

ANTRAHINONSKI GLIKOZIDI (laksantno delovanje)

Aglikoni antrahinonskih glikozida su derivati antracena. Međusobno se razlikuju po stepenu oksidacije C-9 i C-10 atoma (antroni, antranoli, antrahinoni), ali su svi hidroksilovani na C-1 i C-8. Ovakva jedinjenja, dodatno supstituisana u okviru aromatičnih prstenova A i C nazivaju se 1,8-dihidroksiantrahinoni, tj. emodinski ili laksantni antrahinoni. Njihovi redukovani oblici, antroni, su prva jedinjenja koja se sintetišu u biljkama, kao i njihovi tautomerni oblici antranoli, a u biljci naknadno dolazi do oksidacije. Raznovrsnost antrahinona je povećana specifičnim reakcijama i sposobnošću dimerizacije, tj. stvaranja homo- ili heterodiantrona. Do ovakvih procesa može doći već u biljci ili tokom perade droge (u procesu sušenja, Sennae folium). Droge sadrže malu količinu slobodnih aglikona i to u obliku antrahinona, jer su redukovani oblici nestabilni. Češće se javljaju vezani za šećere, pa se mogu javiti u obliku antronskih, diantronskih ili antrahinonskih glikozida. Šećeri se povezuju za aglikon preko hidroksilne grupe na C-8 i/ili C-6, a nekada se šećer povezuje direktno za C-10 antrona i tada nastaju stabilni C-glikozidi (aloinski tip glikozida).

OHO

O

O

O2

ANTRAHINON

ANTRON ANTRANOL

O

O

DIANTRON

10

x 2

O

O

OHOH ONa ONa

O

O

+ H2O

NaOH

HCl

FENOLI FENOLATI

(ZUTI, LIPOSOLUBILNI) (CRVENI, HIDROSOLUBILNI)

22

KVANTITATIVNA ANALIZA ANTRAHINONSKIH DROGA(Praktični deo)

određivanje sadržaja antrahinonskih glikozida u Frangulae cortex (Ph. Jug. IV)

0,25g droge u prašku (sito 0,75) se u tikvici okruglog dna pomeša sa 25ml 70% metanola, odmeri i zagreva na vodenoj pari uz povratni hladnjak. Kada se ohladi, dopuni se do prvobitne mase i filtrira.

PRINCIP: ekstrakcija antrahinonskih glikozida metanolom.

5ml filtrata se pomeša u levku za odvajanje sa 50ml destilovane vode i 0,15ml ccHCl, i dva puta izmućka sa po 20ml etra. Vodeni sloj se prenese u normalni sud od 100ml. Spojene etarske frakcije se ispiraju destilovanom vodom, i ovom vodom sud dopuni do oznake.

PRINCIP: uklanjanje balastnih materija etrom.

40ml ovog rastvora se neutrališe u tikvici okruglog dna od 250ml pomoću vrlo razblaženog rastvora Na2CO3 (r.o.) do pH 7-8 (uz univerzalni indikator), doda 20ml smese od 2 dela koncentrovanog rastvora FeCl3 (1+1) i 3 dela destilovane vode i zagreva 20min. uz povratni hladnjak i češće mućkanje u ključalom vodenom kupatilu.

PRINCIP: oksidacija antrona do antrahinona pomoću Fe3+ jona.

Zatim se doda 3ml ccHCl i ponovo zagreva 20min. uz češće mućkanje, da se nastali talog rastvori. PRINCIP: kisela hidroliza antrahinonskih glikozida.

Kada se ohladi, smesa se izmućka u levku za odvajanje tri puta sa po 25ml etra. PRINCIP: ekstrakcija antrahinonskih aglikona etrom.

Sjedinjeni etarski ekstrakti se ispiraju dva puta sa po 15ml destilovane vode i u normalnom sudu od 100ml dopune etrom do oznake.20ml etarskog ekstrakta se pažljivo upari do suva (preko Na2SO4 anh.), ostatak rastvori u 10ml 1M NaOH (r.o.) i ako je potrebno filtrira.

PRINCIP: prevođenje 1,8-dihidroksiantrahinona u crveno obojene fenolate.

Rastvor za poređenje: 10mg 1,8-dihidroksiantrahinona se rastvori u normalnom sudu od 25ml u etru i dopuni do oznake (osnovni rastvor). 5ml ovog rastvora se prenese u normalni sud od 100ml i dopuni etrom do oznake (ishodišni rastvor). 5ml ishodišnog rastvora se pažljivo upari do suva (preko Na2SO4

anh.) i ostatak rastvori u 10ml 1M NaOH.

Apsorbancija rastvora se meri na 520nm uz destilovanu vodu kao slepu probu.

IZRAČUNAVANJE:x = --------------- x 100

x -procenat antrahinonskog glikozidaA -apsorbancija analiziranog rastvoraA1 -apsorbancija poredbenog rastvoraa -masa droge u gramima na 100ml ekstraktaa1 -masa 1,8-dihidroksiantrahinona u gramima u 100ml rastvora.

1 delu 1,8-dihidroksiantrahinona odgovaraju 2,402 dela anhidrovanog glukofrangulina A.

23

(A x a1)

(A1 x a)

Vežba br. 11, 12

ANALIZA ETARSKIH ULJA

Droge u kojima su glavni sastojci isparljivi mirisni principi-etarska ulja, nazivaju se aromatičnim drogama. Etarska ulja dobijaju se iz različitih biljnih organa (Cinnamomi cortex, Menthae piperitae folium, Lavandulae flos, Citri pericarpium, Foeniculi fructus, Calami rhizoma, Petroselini radix) destilacijom pomoću vodene pare,ekstrakcijom ili ceđenjem.

Etarska ulja su sekundarni biomolekuli biljaka definisani kao kompleksne mešavine lipofilnih, tečnih, mirisnih i isparljivih komponenti lociranih u sekretornim strukturama aromatičnih biljaka. Do sada je opisano oko 3000 različitih komponenti prisutnih u etarskim uljima, svrstanih u pet klasa:

terpenoidi, alifatične isparljive komponente (dugolančani ugljovodonici i njihovi oksi derivati), odgovorne

za tzv. voćne mirise, aromatične isparljive komponente (derivati benzoeve kiseline, fenilpropanoidi i kumarini)

veoma intenzivnog mirisa, supstance koje sadrže azot (indolski derivati i alifatični amini), neprijatnog mirisa na ribu, i supstance koje sadrže sumpor (izosulfocijanati i organski disulfidi), nosioci jakih, neprijatnih

mirisa.

Dominantne i ekonomski najznačajnije komponente etarskih ulja kod većine aromatičnih biljaka su jedinjenja iz klase terpenoida, uglavnom odgovorna za karakteristične mirise etarskih ulja, pa i samih biljaka.Ova frakcija etarskih ulja dalje se deli na dve klase terpena: mono- (C10) i seskviterpene (C15), koji se međusobno razlikuju po isparljivosti, odnosno tački ključanja (monoterpeni t.k.=140-180oC, seskviterpeni t.k.>200oC). Obe klase terpenoida mogu postojati u cikličnoj, acikličnoj i bicikličnoj formi, a unutar svake grupe kao ugljovodonici (zasićeni i nezasićeni), alkoholi, aldehidi, fenoli, ketoni, oksidi i estri. Pored toga, mogu se javljati i u veoma kompleksnim oblicima kao iridoidi, glikozidi ili seskviterpenski laktoni. Sa porastom molske mase i broja funkcionalnih grupa raste i tačka ključanja terpenoidnih jedinjenja, pa se u isparljivim frakcijama uglavnom nalaze niži monoterpeni i jednostavniji seskviterpeni, dok se polioksidovani seskviterpeni i diterpeni nalaze u teže isparljivim frakcijama i smolama. Za sada je identifikovano nekoliko stotina monoterpena sa tridesetak osnovnih struktura, dok je broj identifikovanih seskviterpena nekoliko hiljada, sa oko 200 osnovnih struktura.

Različite komponente etarskih ulja ispoljavaju raznovrsne farmakološke aktivnosti koje opravdavaju njihovu primenu u fitoterapiji. Zbog ispoljene snažne antimikrobne delatnosti, isparljive mono- i seskviterpenske komponente etarskih ulja pokazale su se veoma prikladnim za inhalaciju pri tretmanu infekcija respiratornog trakta. Pored antimikrobnih svojstava, utvrđeno je da etarska ulja deluju i blago sedativno na CNS i deluju blago relaksirajuće pri nervnoj napetosti, uklanjaju migrenu, ublažavaju bolove artritisa i zapaljivih procesa. Takođe, terpenski sastojci etarskih ulja deluju na enzimske sisteme koji omogućuju elektronski transport, translokaciju protona i oksidativnu fosforilaciju zbog lipofilnosti i uticaja funkcionalnih grupa na aktivnost enzima. Različitim in vivo i in vitro testovima utvrđeno je da su na njihovo delovanje mnogo osetljivije enzimske strukture, delom povezane sa ćelijskom membranom, nego izolovani enzimski sistemi. Oksidovani terpeni etarskih ulja, zbog svog izraženog lipofilnog karaktera (timol, mentol, limonen, 1,8-cineol), veoma lako se apsorbuju nakon dermalne primene, a ujedno pospešuju i penetraciju različitih supstanci kroz kožu. Mirisne komponente etarskih ulja stimulišu olfaktorne receptore sluzokože nosa, inicirajući nervni impuls koji dovodi do niza

24

sekundarnih efekata: aktivacije respiratornih organa, stimulacije rada srca i pospešivanja cirkulacije, opuštanja glatke muskulature. Alternativni vid lečenja poznat kao "aromaterapija" primenjuje se od davnina, ali je ispitivanjima ovakvog tipa dobio i zvaničnu potvrdu. Takođe, nekoliko etarskih ulja (Aetheroleum Menthae piperitae, Thymi aetheroleum) predstavljaju i oficinalne droge mnogih farmakopeja. Međutim, iako su etarska ulja i njihove komponente uglavnom netoksični, pojedina jedinjenja mogu izazvati neželjene efekte ukoliko se koriste u većim količinama. Eugenol i metil havikol (estragol) su citotoksični i znatno smanuju sadržaj glutationa u hepatocitima; alilbenzeni su psihoaktivni; pulegon je nefrotoksik i aboritiv; miristicin spada u grupu halucinogena; tujoni i kamfor dovode do epileptičkih konvulzija, hipersalivacije i znojenja, a takođe mogu izazvati i hiperfleksiju i hipotoniju. Prilikom upotrebe etarskih ulja, prvenstveno u aromaterapiji, ali i pri drugim primenama, bi se zbog toga moralo voditi računa prvenstveno o tome koji će se hemotip određene vrste upotrebiti, a takođe i o hemijskom sastavu, odnosno sadržaju komponenti koje ispoljavaju neželjeni efekat.

Osobine etarskih ulja

To su aromatične, lako pokretljive tečnosti koje isparavaju. Neka etarska ulja su na sobnoj temperaturi čvrsta, ali zagrevanjem prelaze u tečno stanje.U vodi se slabo rastvaraju, a lako u apsolutnom etanolu, hloroformu, etru, masnim uljima, benzinu, benzenu, petroletru, ccCH3COOH i ugljen-disulfidu. Etarska ulja se različito rastvaraju u etanolu razlličitih koncentracija. Deterpenizovana etarska ulja se lakše rastvaraju u razblaženom etanolu. Njihova reakcija se ispituje vodom navlaženom lakmus hartijom.

25

OPŠTA ISPITIVANJA ETARSKIH ULJA(FIZIČKE I HEMIJSKE KONSTANTE ETARSKIH ULJA)

Farmakopeje obično koriste preliminarna ispitivanja etarskih ulja radi utvrđivanja grubih falsifikata. Za tu svrhu primenjuje se određivanje tačke očvršćivanja pojedinih etarskih ulja, temperatura ključanja, specifična gustina i rastvorljivost u etanolu različite koncentracije.Međutim, veoma često falsifikati ne menjaju fizičko-hemijske vrednosti etarskog ulja. To je slučaj kada je etarskom ulju dodano ulje drugog porekla ili jeftinije, pa čak i sintetske supstance. Zbog toga, za ocenu vrednosti etarskih ulja, ispitivanje čulima ima posebnu važnost. Na fizičko-hemijske konstante i njihove različite vrednosti, utiče, pored falsifikata, i poreklo droge od koje je dobijeno. Zbog toga se i određuju ove konstante, da bi se utvrdila vrednost pojedinih etarskih ulja u vezi sa zahtevima farmakopeje.

Relativna gustina ( )

Relativna gustina () predstavlja odnos mase određene zapremine etarskog ulja i mase iste zapremine vode pri temperaturi 20C. Vrednosti propisane u farmakopeji su granice unutar kojih mora da iznosi relativna gustina etarskog ulja, a izražene su na tri decimale. Vrednosti p, p1, p2 i p3 izražene su u grammima na četiri decimale.Relativna gustina (specifična masa, specifična težina) je merilo za kvalitet i čistoću etarskih ulja i određuje se pomoću piknometra. Vrednosti relativnih gustina () kreću se između 0,696 i 1,188 na 15oC, ali su uopšte uzev manje od 1,000. Na osnovu ove vrednosti može se ponekad zaključiti o hemiijskom sastavu etarskog ulja: ispod 0,900 ukazuje na veće količine terpena ili alifatičnih jedinjenja, a iznad 1,000 upućuje na sastav s aromatičnim sastojcima.POSTUPAK: Izmeren piknometar za neisparljive ili isparljive tečnosti (p) napuni se nešto iznad oznake u u bočnoj cevčici etarskim uljem i ostavi 30min u posudi s vodom pri temperaturi od 20oC. Zatim se zapremina tečnosti dovede do oznake, piknometar obriše i posle 30min meri (p2). Posle merenja, piknometar se isprazni, očisti, ispere vodom i na isti način odredi masa piknometra s vodom (p1).Relativna gustina se izračunava po formuli:

=

Indeks refrakcije

Indeks refrakcije (prelamanja) etarskih ulja je u granicama od 1,43 do 1,61.Vrednosti propisane u farmakopeji izražene su na tri decimale, a odnose se, ako nije drugačije propisano, na talasnu dužinu D-linije spektra natrijumove lampe i temperaturu od 20 ± 0,5oC. Indeks refrakcije koji se odnosi na talasnu dužinu D-linije spektra natrijumove lampe i temperaturu od 20oC, obeležava se sa D20.POSTUPAK : Refraktometar sa mogućnošću očitavanja na 0,001 se baždari, ako nije drugačije propisano, vodom za baždarenje (redestilisana voda sa D20 = 1,333), a zatim meri indeks refrakcije etarskog ulja. Merenje se ponovi najmanje tri puta, a srednja vrednost zaokruži na tri decimale.

Temperatura kjlučanja

26

To je temperaturni interval u okviru koga etarsko ulje može da predestiliše. Na osnovu ove vrednosti mogu da se izvedu izvesni zaključci u pogledu sastava (pod uslovom da u ulju nema sastojaka sa kiseonikom, ili da se, ukoliko su prisutni, uklone. Temperaturni interval od 150-190oC ukazuje na monoterpene, od 250-280oC na seskviterpene, a iznad 300oC na politerpene. Za razdvajanje pojedinih sastojaka koristi se frakciona destilacija, a u novije vreme i GC-MS.

Ugao skretanja

Ugao skretanja je karakteristično svojstvo etarskih ulja. Većina ulja skreće ravan polarizacije levo ili desno. Ova veličina, međutim ,ne pruža podatke o sastavu ulja. Ipak, ova veličina se određuje jer postoje izvesne granične vrednosti ove konstante, koje navode farmakopeje i druga slična literatura.Ugao skretanja koji se odnosi na D-liniju natrijumovog spektra i temperaturu od 20o C označava se sa D20.

Ispitivanje mirisa i ukusa etarskih ulja (Ph. Jug. V)

POSTUPAK: Tri kapi etarskog ulja doda se u 5ml 90% (V/V) etanola i izmeša staklenim štapićem sa 10g sprašene saharoze. Miris i ukus moraju da odgovaraju biljci, odnosno odgovarajućem delu biljke, iz kojeg je dobijeno etarsko ulje.

Određivanje ostatka posle isparavanja etarskog ulja (Ph. Jug. V)

POSTUPAK: Posuda za uparavanje se izmeri posle 1h zagrevanja na vodenom kupatilu i hlađenja u eksikatoru. U ovu posudu se odmeri 5g etarskog ulja (ukoliko nije drugačije propisano). Etarsko ulje se zagreva na ključalom vodenom kupatilu tokom propisanog vremena, u atmosferi bez strujanja vazduha. Posle hlađenja u eksikatoru, posuda sa uljem se izmeri. Tokom ispitivanja, nivo vode u kupatilu mora da bude održavan do nivoa od oko 50mm ispod gornje ploče.Ostatak posle isparavanja etarskog ulja predstavlja maseni udeo, izražen u procentima, nakon uparavanja na vodenom kupatilu, pod odgovarajućim uslovima.Aparatura se sastoji od:-vodenog kupatila sa otvorima promera 70mm,-posude za uparavanje od vatrostalnog stakla,-eksikatora.

Ispitivanje prisustva vode u etarskim uljima (Ph. Jug. V)

Pomeša se 10 kapi etarskog ulja sa 1ml ugljen-disulfida (!!!) ili ccCH3COOH. Stajanjem rastvor ostaje bistar.

I spitivanje prisustva stranih estara u etarskim uljima (Ph. Jug. V)

1ml etarskog ulja zagreva se 2 minuta na vodenom kupatilu sa 3ml sveže pripremljenog rastvora KOH u alkoholu. Tokom 30min i kasnijim dodatnim hlađenjem, ne sme da dođe do pojave kristala.

27

Ispitivanje prisustva masnih ulja i usmoljenih etarskih ulja u etarskim uljima (Ph. Jug. V)

Kap etarskog ulja nanese se na filtar-hartiju i ostavi da isparava. Posle 24h, na papiru ne sme da ostane prozirna ili masna mrlja.

Određivanje rastvorljivosti etarskih ulja u etanolu različitih koncentracija (Ph. Jug. V)

U menzuru sa brušenim zatvaračem, zapremine 25 ili 30ml, prenese se 0,5 ili 1ml etarskog ulja. Ispitivanje se izvodi u uslovima konstantne temperature ulja od 200,2oc. Iz birete čija je zapremina najmanje 20ml, u količinama od 0,1ml, dodaje se alkohol, koncentracije koju propisuje odgovarajuća monografija. Uz povremeno snažno mućkanje, alkohol se dodaje do potpunog rastvaranja. Zatim se nastavi dodavanje alkohola u količinama od 0,5ml do ukupno utrošenih 20ml. Očita se zapremina alkohola utrošenog za dobijanje bistrog rastvora. Ako dođe do zamućenja ili opalescencije rastvora, pre nego što se utroši svih 20ml alkohola, zabeleži se i zapremina alkohola koja dovodi do nastanka i nestanka zamućenja ili opalescencije.Ako se bistar rastvor ne dobije ni dodatkom svih 20ml alkohola propisane koncentracije, ispitivanje se ponavlja upotrebom alkohola sledeće, veće koncentracije.

Etarsko ulje se "rastvara u n volumena alkohola određene koncentracije t", kada bistri rastvor dobijen dodatkom n ml alkohola ostaje bistar u poređenju sa nerazblaženim etarskim uljem.

Etarsko ulje se "rastvara u n volumena alkohola određene koncentracije t i zamuti se daljim dodavanjem alkohola", kada bistri rastvor dobijen dodatkom n ml alkohola postaje zamućen dodatkom n1 ml (n1 je manje od 20ml) i ostaje zamućen daljim dodavanjem svih 20 ml alkohola iste koncentracije.

Etarsko ulje se "rastvara u n volumena alkohola određene koncentracije t uz zamućenje između n1 i n2 volumena", kada bistri rastvor dobijen dodatkom n ml alkohola postaje zamućen dodatkom n1 ml (n1 je manje od 20ml) i ostaje zamućen do dodatka n2 ml alkohola iste koncentracije (n2 je manje od 20), kada dolazi do ponovnog bistrenja rastvora.

Etarsko ulje se "rastvara se opalescencijom", kada alkoholni rastvor poseduje plavičastu nijansu, koja odgovara opalescenciji sveže pripremljenog poredbenog rastvora (0,5ml rastvora srebro-nitrata pomeša se sa 0,05ml azotne kiseline, doda 50ml rastvora koji sadrži 12mg/l natrijum-hlorida, izmeša i ostavi da stoji zaštićeno od svetlosti 5min).

Dokazivanje etanola kao falsifikata etarskih ulja

U suvu epruvetu sipa se 1ml etarskog ulja i zatvori komadićem pamučne vate u koju se prethodno stavi nekoliko kristalića fuksina. Kada se zagreva na vodenoj pari, pamučna vata ne sme da se oboji crveno.

TEST ZA PROAZULENE

Postupak: 1g droge u prašku mućka se 2min. sa 10ml hloroforma. Nakon filtracije, uzorak se na vodenom kupatilu upari na zapreminu od 1ml i, nakon dodatka 5ml rastvora p-dimetilbenzaldehida zagreva na vodenom kupatilu 5min. Nakon što se uzorak ohladi, izmućka se sa 10ml petroletra. Donja faza se u prisustvu proazulena oboji u plavo-zeleno.

DOKAZIVANJE MASNOG ULJA IZ SEMENA (RICINI OLEUM)

28

Masno, kao i riblje ulje spada u grupu lekovitih masnih ulja (LIPIDI-masne materije, trigliceridi). Ricinusovo ulje se dobija hladnim ceđenjem zrelog i osušenog semena. Pre upotrebe se prokuva, čime se vrši inaktivacija toksičnog albumina ricina.

POSTUPAK : Na 2ml ccHNO3 oprezno se nalije 2ml ulja (suncokretovo, ricinusovo), doda 2ml rezorcinol-benzena (r.o.) i snažno promućka. U roku od 10sek sloj benzena se oboji ljubičasto.

Vežba br. 13

29

ODREĐIVANJE FLAVONOIDA

Flavonoidi predstavljaju najveću grupu biljnih polifenola, (C6-C3-C6) i u prirodi se javljaju kao slobodni ili u formi glikozida. U zavisnosti od stepena oksidacije C-2, C-3 i C-4 atoma, derivati 2-fenil-hromona se dele na flavone, flavanole, flavanone i dihidroflavonole.Do sada je izolovano preko 3000 jedinjenja ove grupe, koja je široko rasprostranjena u biljnom svetu, ali se najveća raznovrsnost flavonoidnih glikozida javlja kod predstavnika porodice Asteraceae (preko 30 različitih tipova). To su biljni pigmenti, zbog šećera rastvorljivi u vodi, pa se nalaze u ćeiljskom soku vakuola epidermalnih i ćelija mezofila. Odgovorni su za boju cvetova, plodova i listova biljaka (žuta ili bela, dok crvena, plava i razne nijanse ljubičaste potiču od antocijana).Veoma često se flavonoidni aglikoni u obliku eksudata nalaze na površini listova i cvetova (u vidu praškaste prevlake ili izmešani sa kutikulom), dok su glikozidi uglavnom skoncentrisani u epidermalnim ćelijama. Smatra se da ovakva lokalizacija štiti biljku od štetnih efekata UV zračenja. Zaštitna uloga flavonoida ogleda se i u njihovoj antimikrobnoj aktivnosti, a za biljku u kojoj nastaju su značajni i kao sastavni delovi enzimskih sistema, neophodnih za obavljanje metaboličkih procesa.

O

O O

O

2-FENIL HROMON 3-FENIL HROMON

O

OHO

OHFLAVONI FLAVONOLI

OH

HO O

O

FLAVANONIOH

HO

O

O O

O

HO

OHDIHIDROFLAVONOLI

OH

OH

ODREĐIVANJE FLAVONOIDA

30

(Praktični deo)

Spektrofotometrijsko određivanje flavonoida u Crataegi folium et flores (DAB 10)

POSTUPAK: 600,0 mg (0,6g) droge u prašku (sito 0,75) prelije se sa 20ml acetona u balonu okruglog dna od 100ml, doda 1ml 0,5% rastvora urotropina (metenamin, heksametilentetramin) i 2ml 25% HCl i zagreva do ključanja 30min uz povratni hladnjak. Posle hlađenja, smesa se procedi preko malo vate u normalni sud od 100ml. Ostatak droge i vata se kuvaju još dva puta po 10min sa po 20ml acetona uz povratni hladnjak. Ohlađeni ekstrakti se zatim procede preko malo vate natopljene acetonom u isti normalni sud i sadržaj dopuni acetonom do 100ml.PRINCIP: kisela hidroliza flavonoidnih glikozida. Urotropin se dodaje da spreči oksidaciju eventualno prisutnih leukoantocijanidina u antocijanidine, koji sa AlCl3 daju plave helate (reakciona smeša bi umesto žuto, bila obojena zeleno).

20ml ovog rastvora se u levku za odvajanje pomeša sa 20ml vode i izmućka jednom sa 15ml i tri puta sa po 10ml etilacetata. Spojeni etilacetatni ekstrakti se u levku za odvajanje isperu dva puta sa po 50ml vode, prebace unormalni sud od 50ml i sadržaj dopuni do oznake etilacetatom.PRINCIP: preuzimanje flavonoidnih aglikona etilacetatom.

10ml ovog rastvora prebaci se u normalni sud od 25ml, doda 1ml AlCl3-reagensa i dopuni do oznake 5% rastvorom sirćetne kiseline u metanolu (ispitivani rastvor).Istovremeno se 10ml ovog rastvora razblaži do 25ml 5% rastvorom sirćetne kiseline u metanolu (slepa proba).Apsorbancija ispitivanog rastvora meri se posle 30min na 430nm u odnosu na slepu probu.PRINCIP: flavonoidni aglikoni sa AlCl3 grade intenzivno žuto obojene helate, čija apsorbancija meri na 430nm.

Izračunavanje: sadržaj flavonoida izražen je u μg kvercetina /g droge

y = 0,2559x + 0,3345

R2 = 0,9963

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3

C [g/ml]

Abs

Kalibraciona kriva standardnog rastvora kvercetina

Vežba br. 14

31

ISPITIVANJE ANTOCIJANSKIH DROGA

Polifenoli (acetogenini) biogenetski nastaju iz poliketo-metilenskih prekursora ili iz poliketo nizova koji se kombinuju sa fenilpropanima. Značajnu grupu polifenola heterociklične strukture sa kiseonikom kao heteroatomom čine flavonoidi i antocijani. To su biljni pigmenti koji se nalaze najčešće u cvetnim delovima biljaka, kao i u plodovima voća.

ANTOCIJANI

Kao i flavonoidi, i antocijani se u prirodi javljaju najčešće u formi glikozida, a njihovom hidrolizom se dobijaju obojeni aglikoni antocijanidini. U prirodi se nalaze u cvetnim delovima biljaka i plodovima voća, gde čine spektar boja u intervalu crveno-ljubičasto-plavo. Ova raznolikost boja se javlja kao posledica različite pH vrednosti sredine i koncentracije mineralnih soli u ćelijskoj tečnosti biljnog tkiva.Po hemijskom sastavu, antocijani su supstituisani derivati antocijanidina benzopirilijum strukture. Zajednička karakteristika svih antocijanidina je da obavezno sadrže hidroksilne grupe u položajima C-3, C-5 i C-7, a njihove međusobne razlike uslovljava broj i položaj hidroksi- ili metoksi- grupa u 2-fenil prstenu (B).Prisustvo benzopirilijum structure u molekulu antocijana uslovljava njihovo amfoterno ponašanje (struktura i boja antocijana zavise od pH sredine).

ISPITIVANJE ANTOCIJANA

32

Promena boje antocijana u zavisnosti od pH sredine ( Rhoeados flos , Malvae flos , Violae flos )

5g droge u prašku prelije se sa 30ml vode i sadržaj zagreva uz blago ključanje 15min, pri čemu se ekstrahuju biljni pigmenti. Ekstrakt se profiltrira u menzuru i zapremina dovede do 70ml. Iz ovako pripremljenog ekstrakta se u obeležene epruvete (18) odmeri po 2ml rastvora, a zatim se u epruvete pojedinačno dodaju odgovarajući puferski rastvori (tab. 1).

Broj epruvete

0.1M HCl(ml)

0.15M KH2PO4

(ml)

0.15M Na2HPO4

(ml)

0.15M K3PO4

(ml)

10% NaOH(ml)

pH

1 9.5 0.5 - - - 2.12 0.5 9.5 - - - 3.63 - 10.0 - - - 4.74 - 9.5 0.5 - - 5.65 - 9.0 1.0 - - 5.96 - 2.0 - - 6.27 - 3.0 - - 6.58 - 4.0 - - 6.69 - 5.0 - - 6.8

10 - 6.0 - - 7.011 - 7.0 - - 7.212 - 8.0 - - 7.413 - 9.0 - - 7.714 - - 5.5 - 8.015 - - 5.0 - 9.816 - - 7.0 - 10.717 - 3.0 7.0 - 11.218 - - - 10.0 14.0

pH vrednost varira u intervalu od 2.1 do 14.0, što uslovljava promenu boje antocijana. Crvena boja se javlja u epruvetama sa pH od 2.1 –6.8 (epruvete br. 1-9), što ukazuje da se antocijani javljaju u obliku katjona. Epruveta sa pH=7 (br. 10) pokazuje ljubičastu boju, koja je karakteristična za osnovnu boju antocijana. Plavo-zelena boja se javlja u epruveti sa pH=14 (br. 18), i karakteristična je za antocijane u anjonskom obliku.

Reverzibilna promena boje (i strukture) antocijana usled promene pH

U epruvetu br. 16, u kojoj je sredina alkalna pa su antocijani plavo-zelene boje, dokapava se razblažena HCl (1:1) do pH 2-3, pri čemu se boja rastvora menja u crvenu.

FeCl3-test

Prisustvo slobodnih fenolnih grupa kod antocijana dokazuje se bojenom reakcijom sa gvožđe(III)-hloridom. U epruvetu sa vodenim ekstraktom (1-2ml) doda se rastvor FeCl3 u metanolu (1ml). Pri tome nastaje ljubičasto obojeni kompleks.

Vežba 15

33

DOKAZIVANJE SAPONINA I ODREĐIVANJE VREDNOSTI SAPONINSKIH DROGA

Saponini (saponozidi) su glikozidna jedinjenja koja hidrolitičkim razlaganjem daju jedan ili najčešće više šećera ili uronskih kiselina (glikon) i aglikon, koji se naziva sapogenin (sapogenol).Sapoonini se prema aglikonu (sapogeninnu) dele na tri grupe:

1. triterpenske - imaju pentaciklični triterpenski aglikon sa 30 C-atoma (dikotiledone biljke; Cucurbitaceae, Ginseng vrste),

2. steroidne - imaju steroidni agikon sa 27 C-atoma i predstavljaju derivate ciklopentanoperhidrofenantrena sa bočnim nizom tipa spirostana (monokotiledone biljke; Liliaceae, Amaryllidaceae), i

3. aminske steroidne saponozide (steroidni glukoalkaloidi), kod kojih se azot nalazi u heterociklusu (Solanum-alkaloidi).

Saponini u vodi dajući koloidne ili semikoloidne rastvore. Iz grupe glikozidnih jedinjenja kao posebna grupa se izdvajaju zbog tri karakteristike:

1. površinski aktivne materije, koje smanjuju napon na dodirnoj površini dve faze koje se ne mešaju. Usled smanjenja površinskog napona, saponini vrše hemolizu eritrocita. U ćelijama se vezuju za sterole koji se nalaze u membranama i povećavaju permeabilnost membrana.

2. vodeni rastvori saponinskih droga mućkanjem obilno pene,3. kod ove grupe glikozidnih jedinjenja specifičan je i način na koji se ostvaruje veza između

šećera i aglikona: pored uobičajene etarske (glikozidne) veze, šećeri mogu da se povezuju i estarski sa molekulom aglikona.

I DOKAZIVANJE SAPONINA

Dekokt saponinske droge:-mućkanjem daje obilnu i postojanu penu,-in vitro izaziva hemolizu,-truje laboratorijske ribice i kišne gliste.Saponini sa se koncentrovanom H2SO4 boje crveno.

II ODREĐIVANJE VREDNOSTI SAPONINSKIH DROGA

Ocena vrednosti saponinskih droga vrši se:-određivanjem broja pene (Ph. Jug. II)-određivanjem hemolitičkog delovanja (Ph. Jug. IV),-određivanjem ribljeg indeksa.Broj pene označava razblaženje dekokta saponinske droge, koji, pod određenim uslovima (posle mućkanja od 15sek. u epruveti promera 13mm i posle stajanja od 15min.) daju visinu pene od 1cm.

DOKAZIVANJE SAPONINA I ODREĐIVANJE VREDNOSTI SAPONINSKIH DROGA(Praktični deo)

34

Dokazivanje saponina u Hippocastani semen, Ononidis radix, Primulae radix, Saponariae radix i Hederae folium :

POSTUPAK: dokazati prisustvo saponina stvaranjem postojane pene mućkanjem u epruveti 0,25% dekokta droge.

Dokazivanje saponina u saponinskim drogama (Ph. Eur. III, Ph. Jug. V):

POSTUPAK: sprašena droga se pomeša sa 0,05ml ccH2SO4. Čestice praška se boje narandžasto-žuto, a zatim postepeno ružičasto-crveno.

Određivanje hemolitičkog delovanja saponinskih droga (Ph. Jug. IV):

Određivanje vrednosti saponinskih droga zasniva se na njihovom hemolitičkom delovanju (HD), a

vrednost se izražava u saponinskim jedinicama (s.j.) na 1g droge.

Jedna saponinska jedinica (s.j.) odgovara hemolitičkom delovanju 1mg saponin-standarda.

POSTUPAK:

1. Izrada ekstrakta saponinske droge

Propisana količina sprašene droge (tabela) pomeša se sa 100ml rastvora pufera, izmeri i zagreva na vodenoj pari. Kad temperatura dostigne 90oC, zagreva se pri istoj temperaturi još 30min, ohladi, DOPUNI VODOM NA PRETHODNU MASU i procedi.

DROGA BROJ SITA MASA (g)Herniariae herba 0,75 0,25Primulae radix 0,75 0,10Quillaiae cortex 0,75 0,20Saponariae radix 0,75 0,20Senegae radix 0,75 0,10

2. Prethodno ispitivanje

U četiri epruvete odmeri se po 0,25, 0,50, 0,75 i 1ml ekstrakta droge. U prve tri epruvete se doda rastvor pufera do 1ml, a zatim u sve četiri po 1ml suspenzije eritrocita i odmah pažljivo promeša (da bi se izbeglo stvaranje pene). Mešanje se ponovi posle 15min i posle jednog sata. Tri sata nakon poslednjeg mešanja zabeleži se epruveta u kojoj je hemoliza eritrocita potpuna.

35