KONFOKAALMIKROSKOOBI VALIDEERIMINEcens.ioc.ee/~pearu/theses/yrgo_bsc_2010.pdf · valguse peegeldamine teisele mikromeetrilisele avale (I). Kuna valgus läbib sama optilist teekonda,

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL

Matemaatika-loodusteaduskond

Füüsikainstituut

Ürgo Saaliste

KONFOKAALMIKROSKOOBI VALIDEERIMINE

MÜRA MÕÕTMISTEGA ÜHTLASEL VÄLJAL

Bakalaureusetöö

Tehniline füüsika

Juhendaja:

PhD Pearu Peterson

Kaasjuhendaja:

MSc David Schryer

Tallinn 2010

Deklareerin, et käesolev lõputöö on minu iseseisva töö tulemus.

Esitatud materjalide põhjal ei ole varem akadeemilist kraadi taotletud.

Kinnitan, et antud töö koostamisel olen kõikide teiste autorite seisukohtadele, probleemi-

püstitustele, kogutud arvandmetele jmt viidanud.

Töö autor Ürgo Saaliste

Töö vastab bakalaureusetööle esitatavatele nõuetele.

Juhendaja Pearu Peterson

SISUKORD

SISSEJUHATUS ........................................................................................................................ 5

1 KONFOKAALMIKROSKOOBI ÜLEVAADE ................................................................ 7

1.1 Konfokaalmikroskoobi idee ......................................................................................... 7

1.2 Tandem skaneeriv mikroskoop .................................................................................... 9

1.3 Ühepoolne tandem skaneeriv mikroskoop ................................................................. 10

1.4 Yokokawa ühepoolne tandem skaneeriv mikroskoop ............................................... 11

1.5 Laser skaneeriv konfokaalmikroskoop ...................................................................... 11

1.6 Fluorestsents .............................................................................................................. 12

1.7 Konfokaal-fluorestsentsmikroskoopia ....................................................................... 13

1.8 Akustiliselt häälestatav optiline filter ........................................................................ 14

2 MATERJALID JA METOODIKA .................................................................................. 16

2.1 Kasutatud riistvara ..................................................................................................... 16

2.2 Mõõtmiste kirjeldus ................................................................................................... 18

2.3 Analüüsimeetodid ...................................................................................................... 19

2.3.1 Python ................................................................................................................. 19

2.3.2 Korrelatsioon ...................................................................................................... 19

2.3.3 Histogrammide võrdlemine Poissoni jaotusega ................................................. 20

2.3.4 Genereeritud Poissoni jaotuse ja eksperimentaalse Poisson'i jaotuse vahe ........ 20

2.3.5 Footonite registreerimise gradiendi määramine ................................................. 21

2.3.6 Peeglite liikumise kiiruse hindamine veergude ja ridade lõikes ........................ 21

3 TULEMUSED JA ARUTELU ......................................................................................... 22

3.1 Pikslite vaheline korrelatsioon ................................................................................... 22

3.2 Histogrammide sobitamine Poisson'i jaotusega ......................................................... 22

3.3 Footonite registreerimise gradient ............................................................................. 27

3.4 Peeglite kiirus veergude ja ridade lõikes ................................................................... 28

3.5 Detektori valeloenduste arv ....................................................................................... 29

3

KOKKUVÕTE ......................................................................................................................... 30

RESÜMEE ............................................................................................................................... 31

KIRJANDUSE LOETELU....................................................................................................... 11

LISAD

Lisa 1 Autokorrellatsioonitabel

Lisa 2 2.5 µM värvaine lahuse katsete histogrammid Poisson'i jaotusega

Lisa 3 Destileeritud vee katsete histogrammid Poisson'i jaotusega

Lisa 4 Pimeda välja 10 µs katse histogramm Poisson'i jaotusega

Lisa 5 Erinevused Poisson'i massijaotusest, 1µM värvaine korral

Lisa 6 Erinevused Poisson'i massijaotusest, 2.5 µM värvaine korral

Lisa 7 Erinevused Poisson'i massijaotusest, destilleeritud vee korral

Lisa 8 Erinevused Poisson'i massijaotusest, 10 µs pimeda välja korral

Lisa 9 Dispersiooni ja aritmeetiline keskmine 2.5 µM värvaine korral

Lisa 10 Dispersiooni ja aritmeetiline keskmine detsilleeritud vee korral

Lisa 11 Poolringide suhted, 2 µs pikslimõõtmisajaga 1 µM lahusega




Lisa 15 Poolringide suhted, 2 µs pikslimõõtmisajaga 2.5 µM lahusega





Lisa 20 Ridade keskmised, 2 µs pikslimõõtmisajaga 1 µM lahusega


4




Lisa 25 Ridade keskmised, 2 µs pikslimõõtmisajaga 2.5 µM lahusega




Lisa 29 Veergude keskmised, 2 µs pikslimõõtmisajaga 1 µM lahusega





Lisa 34 Veergude keskmised, 2 µs pikslimõõtmisajaga 2.5 µM lahusega




5

SISSEJUHATUS

Konfokaalmikroskoop on optilise mikroskoopia üks tähtsamaid edusamme ning tänapäeva

rakubioloogia lahutamatu osa. Konfokaalmikroskoobi põhiline omadus on fookusest väljas

oleva valguse hülgamine ning õhukeste fokaaltasndite valimine preparaadis, saadavad pildid

on selged ning detailiderohked. Õhukeste fokaaltasandite tõttu on võimalik ka kolme-

mõõtmeliste piltide loomine preparaatidest, mis on olulised erinevate kudede ja rakkude

struktuuride uurimisel.

Olenemata olulistest edusammudest, eksisteerivad konfokaalmikroskoopidega tehtud piltides

valguse murdumisest ja registreerimisest tingitud moonutused. Eelnevalt on M. Laasmaa

magistritöös uuritud pildi parendamist dekonvolutsiooni teel, mis vähendab valguse

murdumisest tingitud moonutusi [1]. Selles töös keskendutakse valguse registreerimisest

tingitud müra uurimisele. Kuna konfokaalmikroskoopias rakendatakse paljusid erinevaid

ehituslikke detaile, siis eksisteerib mitmeid erinevaid müra allikaid - nii optilisi, elektroonseid

kui ka ehituslikke. Põhiline müra liik konfokaalmikroskoopides on Poisson'i müra.

Konfokaalmikroskoopias vaadeldakse preparaati punkt haaval. Selleks fokuseeritakse

laserkiir teatud punktile preparaadis ning registreeritakse sealt kiiranud footonid. Footonite

registreerimiseks kasutatakse erinevat tüüpi fotodetektoreid. Valguse kvantloomusest tingitult

käitub loetletud footonite arv Poisson'i protsessina, mille dispersioon on võrdne selle

keskmisega.

Töös uuritav laser-skaneeriv konfokaalmikroskoop konstrueeriti 2009. aastal P. Petersoni, M.

Laasamaa, D. Schryeri, A. Illaste ja M. Vendelini poolt. Mikroskoobi põhiline eesmärk on

metaboliitide rakusiseste diffusioonikoefitsentide määramine, kasutades rasterkujutise

korrelatsioonspektroskoopia meetodit. [2]

Antud töö eesmärk on tuvastada müra allikaid uuritavas mikroskoobis ning leida nendele

võimalikud lahendused. Mikroskoobi müra allikate iseloomu tundmine annab aluse

dekonvolutsiooni algoritmide kasutamiseks pildi kvaliteedi tõstmiseks. Pildi loomist võib

kirjeldada kui matemaatilist operatsiooni, kus tulemus on tõelise pildi ja moonutavate efektide

konvolutsioon. Dekonvolutsioon on seega selle pöördoperatsioon. Sõltuvalt müra iseloomust

tuleb valida sobivaim dekonvolutsiooni algoritm.

Töös teostati mõõtmisi kolmel ühtlasel väljal - pimedus, vesi ning fluorestseeruv lahus.

Mõõtmised seisnesid piltide loomises. Piltide töötlemiseks kasutati programeerimiskeelt

Python. Tulemused esitati erinevat tüüpi graafikute näol ning analüüsiti nende käitumist.

6

Töö esimese osas antakse lühiülevaade konfokaalmikroskoopide ajaloost, erinevate

konfokaalsüsteemide ehituste tüüpidest ning rakendusvõimalustest. Töö teises osas antakse

ülevaade töös uuritavast konfokaalmikroskoobist ning kirjeldatakse mõõtmiste tulemusena

saadud piltide erinevaid analüüsimeetodeid. Kolmandas osas analüüsitakse mõõtmistulemusi

ning tehkase nende põhjal müra iseloomu kohta järeldusi ning pakutakse välja võimalikke

lahendusvariante. Töö esimene osa ning teisest osast punktid 2.1 ja 2.3.1 on refereerivad ning

ülejäänud osad on autori iseseisva töö tulemus. Töö lõppu on lisatud kokkuvõte, võõrkeelne

resümee ning lisad.

Autor soovib tänada oma juhendajat Pearu Petersoni, kaasjuhendajat David Schryerit ning

oma elukaaslast Anna-Liisa Ikartit igakülgse abi ja nõuannete eest.

7

1 KONFOKAALMIKROSKOOBI ÜLEVAADE

1.1 Konfokaalmikroskoobi idee

Konfokaalmikroskoobi idee leiutaja Marvin Minsky ehitas esimese töötava prototüübi 1955.

aastal ning andis sisse patendiavalduse 1957. aastal. Soov jäädvustada bioloogilisi sündmusi

elavates kudedes (in vivo) viis leiutaja konfokaalprintsiibi väljatöötamiseni. Täpsemalt huvitas

teda kesknärvisüsteemi struktuur ja selle tööpõhimõte. Tolleagsete vahenditega oli võimalik

vaadelda ainult kindlat tüüpi üksikuid närvirakke ja neist väljuvaid kiudusid. Seda, kuidas

kesknärvisüsteemi rakud omavahel ühendatud on, ei olnud võimalik vaadelda. Nägemaks,

kuidas närvirakud omavahel seotud on, oli vaja vaadelda paksemaid preparaate kui

tavavalgusmikroskoobiga võimalik. Kuna kesknärvisüsteemi koes on närvirakud tihedalt

kokkupakitud, siis neid värvides saab halvasti läbipaistva preparaadi. See probleem ei olnud

veel ületamatu, kuna oli võimalik suurendada preparaati mineva valguse hulka. Suuremaks

probleemiks oli valguse hajumisest tingitud vähene signaal ja rohke müra. [3]

Minsky kasutas oma prototüübis (Joonis 1) valgusallikana tsirkooniumkaarlahenduslampi (B)

ning valguse suunamiseks kumerpeeglit (A). Punktvalguse tekitamiseks oli ette nähtud

esimene mikromeetriline ava (C) (pinhole). Avast läbi läinud valgus koondati objektiivi (D)

abil soovitud fokaaltasandile (E), mis asus preparaadis. Valgus, mis läbis preparaati,

fokuseeriti teise objektiiviga (F) järgmisele mikromeetrilisele avale. Seega mõlemas

mikromeetrilises avas on sama fookus – need on konfokaalsed. Teist mikromeetrilist ava

läbinud valgus jõudis fotokordistile (H), mis tekitas valguse intensiivusest sõltuva signaali.

Teine mikromeetriline ava oli ette nähtud selleks, et takistada valgusel, mis ei pärinenud

fokaaltasandilt, jõudmast fotokordistisse. Ainult fookuses olev valgus jõudis fotokordistisse.

[4]

Joonis 1. Konfokaalmikroskoobi prototüübi skeem Minsky järgi [3]:

(A) peegel valguse suunamiseks, (B) valgusallikas, (C, G)

mikromeetrilised avad, (D, F) objektiiv, (E) preparaat, (H) fotokordisti

A G

B C

H D E F

8

Konfokaalmeetodi puuduseks on võimalus vaadelda korraga ainult ühte punkti. Selleks, et

saada terviklik pilt, on vaja preparaati skaneerida rida haaval. Minsky poolt konstrueeritud

prototüübi korral püsis optiline mehhanism paigal ning liigutati alust, millele preparaat oli

kinnitatud. Meetod tagas selle, et skaneerimine toimus alati optilisel peateljel. Kasutati ainult

läätse keskosa, millega välditi objektiivi läätse defektidest tulenevaid moonutusi. Aluse

vertikaalseks liigutamiseks kasutati 60 Hz siinusvooluga solenoidi, horisontaalseks

liigutamiseks aga madalama sagedusega saehammasvooluga solenoidi. Pildi konstrueeri-

miseks kasutati pika püsivusega ostsilloskoopi, mis suutis pilti säilitada 10 sekundit – sama

kaua kulus ka pildi konstrueerimiseks. [3] Minsky konstrueeritud prototüübis kasutati 45-

kordse suurendusega objektiive, mille tulemusena saavutati lahutusvõime alla 1 µm [5, lk 88].

Minsky demonstreeris oma leiutist paljudele, kuid mikroskoobi pildi kehva kvaliteedi tõttu ei

pakkunud tema leiutis kellelegi erilist huvi. Pildi halb kvaliteet oli tingitud viletsast

ostsiloskoobi ekraanist millel pilti kuvati, mitte mikroskoobi enda resolutsioonist. 1955. aastal

ei olnud konfokaalprintsiibi potensiaali demostreerimiseks vajalikke tehnoloogiaid saadaval,

mistõttu ei leidnud see lahenus rakendust. [4]

Minsky poolt patendiametisse antud avalduses oli kirjeldatud veel ühte printsiipi (Joonis 2.),

mis on tänapäeva konfokaalmikroskoopidega väga sarnane. Erinevalt prototüübist oli seal

preparaadi taha paigutatud peegel (H), millelt preparaadi mingisse punkti koondatud ja

preparaati läbinud valgus tagasi peegeldub. Teine suur erinevus seisneb poolläbilaskva (half-

silvered) peegli (D) kasutamises. Poolläbilaskva peegli ülesanne on esimeset mikro-

meetrilisest avast (C) pärit valguse läbilaskmine ning preparaadi tagant peeglist tagasitulnud

valguse peegeldamine teisele mikromeetrilisele avale (I). Kuna valgus läbib sama optilist

teekonda, siis selle printsiibi puhul on vaja ainult ühte objektiivi (E) [5, lk 88].

A C

I

D B G

J

F E

H

Joonis 2. Konfokaalmikroskoobi skeem Minsky järgi [3]: (A) peegel valguse

suunamiseks, (B) valgusallikas, (C, I) mikromeetrilised avad, (D) poolläbilaskev

peegel, (E) objektiiv, (F) preparaat, (G) fokaaltasand, (H) peegel, (J) fotokordisti

9

1.2 Tandem skaneeriv mikroskoop

Minsky saavutustest sõltumatult leiutasid 1967. aastal M. Petran ja M. Hadravsky reaalajas

töötava konfokaalmikroskoobi (Joonis 3. (1)), millele anti nimetus tandem skaneeriv

mikroskoop (tandem scanning microscope-TSM). Valgusallikana kasutasid nad teleskoobi

abil koondatud päikesevalgust. Punktskaneerimine saavutati Nipkow’i ketta abil (Joonis 3.

(2)). Nipkow’i ketas on mehaaniline, geomeetriliselt töötav pildi skanneerimise vahend.

Sisuliselt on tegu mehaaniliselt pöörleva kettaga, millesse on puuritud sama diameetriga ning

ühtlaste vahedega mikromeetrilised augud, mis paiknevad aritmeetilistel spiraalidel. Ketta

mõlemad pooled on üksteise suhtes sümmeetrilised. Korraga toimub skannerimine umbes

tuhandes mikromeetrilises avas. Mikromeetrilise ava läbinud valgus koondatakse objektiivi

abil preparadis valitud tasandile. Preparaadist tagasipeegelnud valgus püütakse objektiivi

poolt kinni ning fokuseeritakse teisele mikromeetrilisele augule, mis paikneb esimesega

sümmeetriliselt. Teine mikromeetriline auk peatab fokaaltasandilt väljaspoolt pärineva

valguse.

Joonis 3. (1) Tandem skaneeriva mikroskoobi skeem [6]: (A) valgusallikas, (B)

Nipkow’i ketas, (C) peegel, (D) kiiremurdja, (E) objektiiv, (F) preparaat, (G)

okular või videokaamera, ( Z1, Z2, Zn) fokaaltasandid preparaadis. (2) Tandem

skaneeriva mikroskoobi Nipkow’i ketas [7, lk 116]: (A) vaatlemistsoon, (B)

valgustamistsoon

A

C

C D

E

F

G

A B

(1) (2)

C

B

10

Suure pöörlemiskiiruse tõttu (u 2000 p/min) on üksikute punktide skanneerimine silmale

märkamatu ning seega reaalajas okulaarist silmaga jälgitav. TSM võimaldab luua

kõrgresolutsioonilisi pilte poolläbipaistvatest kudedest, eriti hästi sobib see dünaamiliste

protsesside vaatlemiseks. [6, lk 184]

TSM ehituse suurim probleem seisneb selles, et valgustada tuleb küllaltki suurt

mikromeetriliste aukudega pinda, mistõttu enamik valgusest ei jõuagi preparaadile. 99 %

pealelangevast valgusest peatatakse ketta poolt, jättes preparaati valgustama umbes 1 %

esialgsest valgusest. Paratamatult eksisteerib kompromiss konfokaalsuses, kuna osa fookusest

väljas olevast valgusest naaseb vale mikromeetrilise ava kaudu. Mida rohkem punkte korraga

skanneeritakse, seda parem valgustatus saavutatakse, samas kaotatakse optilise läbilõike

paksuses. Õhukeste preparaatide korral seda probleemi ei esine, kuna ükski preparaadi kiht ei

ole piisavalt kaugel, et sealt tagasipeegeldunud kiir jõuaks järgmise mikromeetrilise avani.

Lisaks sellele on TSM ehituses veel üks nõrk koht – ketta mõlemad pooled peavad olema

identsed. Selle saavutamine vajab väga suurt mehhaanilist täpsust. [7, lk 118] Konfokaal-

mikroskoopide võidukäigu teerajajaks bioloogiliste preparaatide vaatlemises sai Alan Boyd,

kes hakkas TSM-i kasutama kõvade kudede nagu luu ja hambad pinnakihi all paiknevate

rakkude ja tühimike vaatlemiseks 1985. aastal [8, lk 6].

1.3 Ühepoolne tandem skaneeriv mikroskoop

1987. aastal leiutasid G. S. Kino ja G. Q. Xiao konfokaalmikroskoobi, mis kasutas Nipkow’i

ketast uudsel viisil ning rahuldas vajaduse ketta mõlema poole identsuse järele. Kino tüüpi

mikroskoobis läbib preparaadile langev ja preparaadilt tagasipeegeldunud valgus samu

mikromeetrilisi avasid ehk siis kasutatakse ainult ühte ketta poolt, millest tuleb ka nimi

ühepoolne tandem skaneeriv mikroskoop (one-sided tandem scanning microscope). Sellise

ehituse korral on suureks probleemiks kettalt tagasipeeglduv valgus. Isegi parima musta mati

kattega ketta korral peegelduks tagasi üle 1% valgusest, mis oleks oluliselt suurem

preparaadilt tagasipeegelduvast valgusest. Selle probleemi lahendamiseks kallutati Nipkow’i

ketast optilise telje suhtes paari kraadi võrra, et kettalt tagasipeegeldunud valgus oleks

suunatud optilisest teljest eemale, kus see kinni püütakse. Lisaks sellele polariseeritakse

sisendvalgus, mis peale Nipkow’i ketta läbimist veerand-laine plaadi poolt ringpolariseerituks

muudetakse. Preparaadilt tagasipeegeldunud valgus läbib vastupidise protsessi ning enne

okulaari või kaamerat on paigutatud veel üks polarisaator, mis peatab preparaadilt

mittepärineva valguse. Kino ja Xiao prototüübi Nipkow’i ketas koosnes 200 000

mikromeetrilisest august suurusega 25 µm. Ketta pöörlemiskiirus oli 2000 p/min, andes

11

skaneerimiskiiruseks 700 kaadrit sekundis. Seega ühe kaadri suurus oli 9524 pikslit.

Ruudukujulise kaadri korral oleks kaadri küljepikkus 97 pikslit [7, lk 118, 8, lk 6]

1.4 Yokokawa ühepoolne tandem skaneeriv mikroskoop

TSM-ide suurima probleemi, milleks oli nõrk preparaadi valgustatus, lahendas innvotaatiliselt

Jaapani firma Yokokawa Electric insener T. Tanaami 2002. aastal. Lahendus seisneb kahe

Nipkow’i ketta kasutamises. Laiendatud kiirega laserist pärit valgus koondatakse ülemisel

kettal, mis sisaldab 20 000 mikroläätse. Alumine ketas paikneb ülemise kettaga samal

optilisel teljel selliselt, et iga mikrolääts koondab valguse erinevale 50 µm diameetriga avale.

Kuna mikromeetriliste avade vahe on ainult 250 µm, siis ilma mikroläätsedeta läbiks ketast

ainult 4% langevast valgusest. Mikroläätsede abiga on efektiivsus tunduvalt suurem, ketast

läbib umbes 40% valgusest. Uuemad mudelid saavutavad efektiivuse kuni 70%. Kahe ketta

vahel paikneb kahevärvilise filtriga kuubik (dichromatic filter cube), mis suunab preparaadilt

pärit flourestsentsi detektorisse või siis okulaari. Filtri kahevärvilisus seisneb selles, et peegel

laseb teatud lainepikkuste vahemiku läbi ning ülejäänu peegeldab ära. [8, lk 231, 9]

1.5 Laser skaneeriv konfokaalmikroskoop

Peale Minsky prototüübi loomist tegelesid mitmed teadlased tema ideede edasiarendamisega

vastavalt tehnoloogilistele edusammudele, kuni arenes välja laser skaneeriv konfokaal-

Joonis 4. Yokokawa ühepoolne tandem skaneeriv mikroskoop [8, lk 231]: (A)

laserkiir, (B) mikroläätsed, (C) kaamera, (E) kiiremurdja, (F) mikromeetriline ava,

(G) objektiiv, (H) preparaat, (I) Nipkow'i ketas, (J) mikrolääts ketas

A

C

D

B

E

F

G

H

I

J

12

mikroskoop (laser scanning confocal microscope-LSCM). Esmakordselt rakendasid laserit

konfokaalmikroskoobi ehituses 1971. aastal P. Davidovits ja M. D. Egger. Tänapäeval

preparaadi skanneerimiseks kasutatava kahe võnkuva peegliga ehituse mõtles välja N. Åslund

1983. aastal. 1970-1980-ndatel aastatel toimusid ka suured arengud arvutite ja tarkvara vallas.

Lauaarvuti kasutusvõimalusi konfokaalmikroskoopias uurisid I. J. Cox’i ja C. J. R. Sheppard

1983. aastal. [8, lk 2, 9] Esimese LSCM prototüübi, milles kasutati kõiki eelnevalt mainitud

tehnilisi saavutusi, ehitasid J.G. White ja W.B. Amos 1986. aastal. Esmaskordselt esitlesid

nad seda 1987. aastal rahvusvahelisel analüütilise tsütoloogia sümpoosionil. Kuna

sümpoosionil esitatud piltide kvaliteet oli niivõrd hea, siis võeti LSCM vastu suure

entusiasmiga kõikjal maailmas, eriti Jaapanis ja Hollandis. Samal aastal, koostöös firmaga

Bio-Rad, ilmus ka esimene kaubanduslik variant nimega MRC 500. [10]

1.6 Fluorestsents

Fluorestsentsmikroskoopia on tänapäeval kõige kiiremini arenev mikroskoopia liik, nii

meditsiinilistes kui ka biolooglistes teadustes. See võimaldab preparaadis vaadelda ainuüksi

huvipakkuvaid struktuure ning filtreeda välja taust, jättes selle mustaks. Mõistmaks

fluorestsentsmikroskoopiat, on esmalt vaja tutvuda fluorestsentsi olemusega.

Fluorestsents on mõningate aatomite ja molekulide omadus neelata mingi lainepikkusega

valgust ning sellele järgnevalt kiirata pikema lainepikkusega valgust. Stokes'i nihkeks

nimetatakse seaduspära, mille kohaselt emiteeritav valgus on pikema lainepikkusega kui

neelatav valgus.

Esimesena kirjeldas fluorestsentsi inglise teadlane G. G. Stokes 1852. aastal, kes andis

nähtusele nime siniselt - valgelt fluorestseeruva minerali fluoriidi järgi. Mikroskoopias

puututi kokku fluorestsentsiga esmakordselt 20. sajandi alguses ultravioletmikroskoopias, kus

teda algselt peeti ebameeldivaks nähtuseks. Esimesed fluorestsentsmikroskoobid loodi 1911

ja 1913 saksa füüsikute O. Heimstädt'i ja H. Lehmann'i poolt. Need mikroskoobid olid

mõeldud autofluorestseeruvate bakterite, loomade ja taimede kudede vaatlemiseks. Mõni aeg

peale seda rakendas S. V. Provazek fluorestsentsmikroskoopi värvaine seostumise uurimiseks

fikseeritud kudes ja elusrakkudes. Alles 1940-ndatel aastatel leiutas A. Coons meetodi

antikehade märgistamiseks fluorestseeruvate värvidega ning lõi sellega immuuno-

fluorestsentsi valdkonna, mis tõi kaasa revolutsiooni rakubioloogias.

Molekule, mis on võimelised fluorestseeruma, nimetatakse fluorestseeruvateks sondideks,

fluorokroomideks või lihtsalt värvideks. Fluorokroome, mis on kokku liidetud suuremate

13

makromolekulidega nagu näiteks nukleiinhapped, lipiidid, ensüümid ja valgud, nimetatakse

fluorofoorideks.

Fluorokroomide võrdlemisel kasutatakse kolme põhilist parameetrit, milleks on: neelduvus

koefitsent (extinction coefficient), kvanttootlikus (quantum yield) ja fluorestsentsi eluiga.

Neeldumise koefitsent näitab, kui palju valgust neelab 1 M konsentratsiooniga lahus 1 cm

optilise teekonna läbimisel mingi kindla lainepikkuse juures. Enamasti on selleks

lainepikkuseks maksimaalselt neelatav valgus. Kõrge neelduvuskoefitsendiga fluoro-

kroomidel on suurem tõenäosus fluorestseeruda ning ka lühem emissiooni aeg. Kvanttootlikus

on dimensioonita suurus, mis näitab välja kiiratud ja neelatud footonite suhet - kui suure

tõenäosusega konkreetne ergastatud fluorokroom fluorestseerub. Fluorestsentsi eluiga on aeg,

mille molekul veedab ergastunud olekus enne tavaolekusse naasmist. See näitab, kui kaua on

aega, et koguda infot emissiooni spektrist. Ajal, mil fluorofoor on ergastatud olekus, võib ta

läbida ehituslikke muudatusi, saada mõjutusi teistelt molekulidelt ning diffundeeruda

keskkonnas. Fluorestsentsi intensiivuse langemine ajas ühtlase molekulide populatsiooni ning

lühikeste laserimpulsside korral on kirjeldatav valemiga (1).

0( )t

I t I e

, (1)

kus Io -esialgne fluorestsentsi intensiivsus, mõõdetud kohe peale esmast ergastamist,

I(t) -fluorestsentsi intensiivus ajahetkel t,

τ -fluorestsentsi eluiga [11].

1.7 Konfokaal-fluorestsentsmikroskoopia

Konfokaalprintsiip on eriti oluline fluorestsentsmikroskoopias, kuna see eemaldab peaegu

täielikult uitvalguse, mis ei pärine fokaaltasandilt. See tagab selgete ja hea resolutsiooniga

spetsiifiliste detailidega fluorestsentspiltide loomise (

Joonis 5.).

Konfokaalmikroskoopia võimaldab samas preparaadis vaadelda korraga kahte või enamat

erineva emisioonispektriga fluoreseeruva värviga markeeritud struktuuri. Üks viis on kasutada

värvaineid, mis ergastuvad samal lainepikkusel, ning tekkinud valgus lahutada filtrite abil ja

suunata erinevatesse detektoritesse. Tulemused on võimalik koondada üheks pildiks, andes

näiteks ühele pildile rohelise värvi ning teisele punases, paistavad kokku liidetud pildil

kattuvad osad kollasena. Korraga saab kasutada ka erinevatel lainepikkustel ergastuvaid

värve. Selleks tuleb kasutada kas ühte mitme lainepikkusega laserit või mitut erinevat laserit

14

korraga. Laserid on võimalik joondada ühele optilisele teljele kasutades pooläbilaskvaid

peegleid. Teine viis on mitme värvainega töödeldud preparaati mitu korda skaneerida,

kasutades erinevaid lainepikkuseid, ning tulemused hiljem kokku liita. [12]

Joonis 5. Õietolmuterade autofluorestsents: (1) tavalise

fluorestsentsmikroskoobiga tehtud pilt, (2) konfokaal mikroskoobiga tehtud

erineva fookussügavusega pildid kokku liidetuna [13]

1.8 Akustiliselt häälestatav optiline filter

Tänapäeva konfokaalsüsteemides ei ole mitme laseri kasutamine harukordne sündmus, kuna

eksisteerivad erinevate soovitavate omadustega fluorokroomid, mis vajavad ergastamiseks

erinevaid lainepikkusi. Fluorokroomide ergastamiseks vajaminev energia hulk kõigub suures

ulatuses. mistõttu on vajadus üldotstarbeliste ja mitmekülgsete filtrite järgi.

Akustiliselt häälestatav optiline filter (acusto-optic tunable filter - AOTF) on elektro-optiline

seade, mis on samaegselt võimeline moduleerima ühest või mitmest laserist pärit kiire

intensiivsust ja lainepikkust. Seda tüüpi seadmed kasutavad erilist kahe murdumisnäitajaga

kristalli, mille optilised omadused muutuvad koosmõjus akustilise lainega. Akustilise laine

sageduse muutusega kaasneb difraktsiooniliste omaduste muutus kristallis, võimaldades väga

kiiret lainepikkuste vahetamist, mis on sõltuvuses ainult akustilise laine siirde ajast üle

kristalli. Mikroskoopias rakendatavates AOTF-tes kasutatakse tavaliselt TeO2 või

anisotoopset SiO2 kristalli, mille külge on kinnitatud piesoelektriline muundur. Ostsilleeruva

(1) (2)

15

raadiosagedusliku elektrisignaali rakendamisel piesoelektrilisele muundurile tekitakse

kõrgsageduslik akustiline laine, mis levib kristalli. Vahelduv ultraheli akustiline laine

indutseerib perioodilise murdumisnäitja ümberjaotumise, mis kallutab osa langevast valgusest

kõrvale esimest järku kiireks. Mittepolariseeritud valguse korral kaheks esimest järku kiireks.

Kristallile rakendatava akustilise laine sageduse muutus tingib murdumisnäitaja varieerumise

perioodi muutuse ning seega muutub ka murtava valguse lainepikkus. Akustilise laine

ampiltuud määrab ära murtud kiire tugevuse. Nullindat järku ehk kristalli otse läbinud valgus

peatatakse kiire neelaja (beam stop) abil. AOTF võimaldab mikroskoobi kasutajal kontrollida

valguse tugevust ja/või lainepikkust piksli põhiselt, säilitades kiire skaneerimiskiiruse.

Kasutajal on võimalik preparaadi erinevatel aladel kasutada erinevaid valguse intensiivusi

ning lainepikkuseid. Kontroll valguse intensiivuse üle võimaldab aeglustada fluorestseeruvate

molekulide fotokeemilist lagunemist (photobleaching). Fluorestseeruvad molekulid

lagunevad valguse toimel aja jooksul ning seega vähendades ergastava valguse intensiivust on

võimalik neid kauem preparaadil säilitada. [14]

16

2 MATERJALID JA METOODIKA

2.1 Kasutatud riistvara

Töös kasutatud LSCM-is (Joonis 6.) on valgusallikatena kasutuses kaks laserit (A, B).

Laseritest pärit valgus joondatakse mikroskoobi optilise teljega, kasutades hõbepeeglit (C) ja

kahevärvilist peeglit (D). Lainepikkuse ja intensiivuse valimiseks on mikroskoobis kasutusel

AOTF (E). Nullindat järku kiir suunatakse kiireneelajasse (H), mis on sisuliselt musta värvi

sisepinnaga karbike. See toimib kui ideaalselt must keha. Esimest järku kiir suunatakse aga

peegli (G) abil läätsele (I). Lääts koondab kiire esimesele mikromeetrilisele avale (J).

Esimene mikromeetriline ava on ettenähtud puhta kahemõõtmelise Gauss'i jaotusega

laserkiire loomiseks. Mikromeetrilise ava läbinud valgus koondatakse läätse (K) abil taas

paralleelseks kiireks, kuid nüüd on see suurema diameetriga. Laserkiire läbimõõt piiratakse

2.2 mm peale kasutades selleks iirisdiafragmat (L) (saavutamaks maksimaalset resolutsiooni,

peab laserkiir katma objektiivi tagumise osa täielikult [15, lk 260]). 2.2 mm läbimõõduga kiir

suunatakse nüüd poolläbilaskva peegli (M) abil ostsilleeruvate peegliteni (N), mis tagavad

preparaadi kahemõõtmelise skaneerimise. Edasi suundub laserkiir skaneeriva läätseni (O), mis

tagab preparaadi tasapinnalise skaneerimise (tavalise kumerläätse puhul oleks fokaaltasand

hoopis kõverpind). Skaneerivast läätsest suundub laserkiir pöördmikroskoobi (inverted

microscope) toruläätsele (tube lens) (P), läbib selle ning peegeldub peeglilt (Q) objektiivi (R)

ja seejärel koondatakse preparaadile (S). Laserkiir ergastab fluorestseeruvaid molekule ning

ergastusele järgnenud emissioonvalgus suundub tagasi objektiivi. Objektiivi ja katteklaasi

vahel on vesi, suurendamaks objektiivi koondatava valguse hulka. Emmisioonvalgus liigub

ergastusvalguse tuldud teekonda mööda tagasi, kuni jõuab kahevärvilise peeglini (M), mille ta

erinevalt ergastusvalgusest läbib. Kuna kahevärvilise peegli efektiivus ei ole 100%, siis seda

läbinud valgust on vaja veel filtreerida. Selleks on kasutusel ratasfilter (Z). Filtri läbinud

valgus koondatakse läätse (T) abil teisele mikromeetrilisele avale. Uuritavas LSCM-is täidab

mikromeetrilise ava rolli detektori (V) diood. Mikroskoopi on võimalik kasutada ka preparaati

läbinud või preparaadilt peegeldunud valguse režiimis. Mikroskoop on paigutatud

pneumaatilisele vibratsiooni isoleerivale lauale [16], isoleerimaks seda väliskeskkonnast

tulevate vibratsioonide eest. Iga väiksemgi vibratsioon või põhjustada mikroskoobi optilisest

teljest kõrvalekaldeid ning seega laserkiire sattumist valesse skaneeritvasse punkti.

17

Joonis 6. Optiline teekond konfokaalmikroskoobis: (A) HeNe laser (lainepikkus: 632.8

nm, kiire diameeter: 0.8 mm, võimsus: 5 mW) [17], (B) diood-initsieeritud tahke faasi

laser (Diod-Pumped solid state laser) (lainepikkus: 473 nm, kiire diameeter: 1.5 mm,

võimsus: 35mW) [18], (C, F, G) SiO2 kattega hõbepeeglid (diameeter: 25.4 mm) [19],

(D) kahevärviline peegel (peegeldamisvahemik: 300 - 490 nm, läbilaskevahemik: 510

- 850 nm) [20], (E) AOTF (häälestatavate lainepikkuste vahemik: 450-700 nm) [21],

(H) kiireneelaja (neelatav lainepikkuste vahemik: 200 - 1500 nm, ava diameeter: 15.9

mm, maksimaalne keskmiselt neelatav energia: 75 W/cm2) [22], (I) asfääriline lääts

(töökaugus: 7.97 mm) [23], (J) mikromeetriline ava (ava läbimõõt: 25 µm) [24], (K)

ühe kumerusega lääts (töökaugus: 72.3 mm) [25] , (L) iirisdiafragma (diameeter: 1.0 -

12.0 mm) [26], (M) kahevärviline peegel (peegeldamisvahemik: 420 - 625 nm,

läbilaskevahemik 660 - 800 nm) [27], (N) ostsilleeruvad peeglid (lineaarsus 20

kraadise nurga jooksul: >99.9%, pöördemoment ampri kohta: 0.279·10-3

Nm/A) [28],

(O) F-theta skaneeriv lääts, (P) mikroskoobi torulääts, (Q) mikroskoobi peegel, (R)

objektiiv (suurendus: 60 korda, kasutamisviis: vesi immersioon, apertuurarv: 1.2,

töökaugus: 0.28 mm) [29], (S) preparaat, (Z) ratasfilter (vahemikläbilaske filtrid: 650 -

800 nm, 462 - 638 nm) [30, 31, 32], (T) akromaatiline tuubellääts (töökaugus: 499.9

mm) [33], (U) footonite loendaja (fotodioodi läbimõõt: 170 µm, registreeritavate

lainepikkuste vahemik: 400 - 1060 nm, kahe footoni registreerimise vaheline aeg: 32

ns, maksimaalne valeloenduste arv (dark count) sekundis: 250, maksimaalne

efektiivsus: 65%) [34]

B A

C D

E F

G

H

I J K L

M

N

O P

Q

R

S

T

U

Z

18

Konfokaalaparatuur paikneb valguskindlas kastis, väljaarvatud laserid ning detektor, mis

seisavad põhikastist eraldatult. Detektoril on omaette kast, mis on põhikastiga ühendatud vaid

mõne sentimeetri suuruse avaga, kust fokuseeritakse preparaadilt tulnud valgus läbi.

2.2 Mõõtmiste kirjeldus

Mõõtmised teostati kolmel ühtlasel väljal: pimedus, destilleeritud vesi ning fluorestseeruva

värviga (Dextran Alexa fluor 647, neelduvusmaksimum: 650 nm, emissioonmaksimum: 668

nm) segatud destilleeritud vesi. Mõõtmiste ajal oli toavalgustus välja lülitatud, vähendamaks

väliskeskonnast tulevat müra, välja arvatud pimeda välja katsete puhul. Kõikide mõõtmiste

puhul valiti mõõdetavaks alaks objektiivi vaatevälja keskel ruut, külje pikkusega 512 pikslit.

Kasutati ruudukujulisi piksleid külje pikkusega 0.0573µm. Mõõdetava ala külje pikkus oli

seega 29.36 µm. Saadud pildid olid halltoonides. Piksli väärtuste võimalik vahemik oli 0 kuni

255. 0 tähistades musta ning 255 valget. Iga registreeritud footon pikslis suurendas selle

väärtust ühe võrra. Pildid talletati TIFF formaadis. Mõõtmistel kasutati 632.8 nm laserit.

Pime väli seisnes selles, et laser oli välja lülitatud ning mikroskoop oli seadistatud okulaarist

vaatamisele, seega objektiivist sisenev valgus suunati okulaari ning detektorile langevad

footonid pärinesid ainult valguskindlast kastist. Ühe piksli mõõtmise ajaks oli valitud 10 µs;

ühe pildi tegemiseks kulus 5.243 sekundit. Katseajaks oli seadistatud 60 sekundit, mille

jooksul loodi 12 pilti. Katset korrati ka sisselülitatud toavalgusega. Mõlema katse ajal olid

ostsilleeruvad peeglid sisse lülitatud. Kuna selgus, et katses registreeritud footonite arv andis

liiga väikese statistilise populatsiooni, siis katset korrati pikema pikslimõõtmisajaga.

Pimeduse katse kordamisel kasutati 1000 µs pikslimõõtmisaega; ühe pildi tegemiseks kulus

265.195 s. Katse kestis 30 minutit, mille jooksul loodi 6 pilt. Katset korrati ilma

ostsilleeruvate peegliteta ning loodi samuti 6 pilti. Lisaks sellele teostati veel üks 1000 µs

pikslikogumisajaga lisapilt, kus paigutati detektori kasti ette klapp, kontrollimaks, kas kastis

eksisteerib valguslekkeid.

Destilleeritud vee välja katses kasutati 0.15 mm läbimõõdulist katteklaasi, millele oli

silikoonmäärdega kinnitatud plastikpiire destilleeritud vee hoidmiseks. Mikroskoop seadistati

digitaalsele vaatlusele (objektiivist sisenev valgus suunati konfokaalaparatuuri). Mõõtmised

teostati järgmiste pikslimõõtmisajaga: 2 µs, 4 µs, 8 µs, 16 µs ja 32 µs. Katse kestvused valiti

nii, et iga pikslimõõtmisajaga saaks 10 pilti.

Fluorestseeruvat värvi välja kasutades teostati katset kahe erineva konsentratsiooniga: 1 µM

ning 2.5 µM. Lahustiks kasutati destilleeritud vett. Katteklaasile pipeteeriti 50 µl lahust ning

seejärel reguleeriti preparaadi töölauda nii, et pipeteeritud veega kaetud ala oleks täpselt

19

objektiivi kohal. Fokaaltasand valiti klaasi pinnast umbes 15 µm kõrgemal kuna värvaine

kleepub klaasile ning seega on klaasi ja lahuse piirpinnal värvaine konsentratsioon oluliselt

kõrgem ning ebaühtlasem. Mõõtmised teostati järgmiste pikslimõõtmisaegadega: 2 µs, 4 µs, 8

µs, 16 µs ja 32 µs. Katse kestvused valiti nii, et iga piksliajaga saaks vähemalt 10 pilti.

Kõrgema konsentratsiooniga katse korral seati AOTF akustiline võimsus poole võrra

väiksemaks. et säilitada detektori lineaarsust.

2.3 Analüüsimeetodid

2.3.1 Python

Kõikide analüüsimeetodite läbiviimiseks kasutati üldotstarbelist kõrgetasemilist vabavaralist

programeerimiskeelt Python. Python loodi 1980. lõpus Guido van Rossum'i poolt. Pythoni

puhul on võimalik kasutada nii imperatiivset, funktsionaalset kui objekt-orienteeritud

programmeerimist. Python on skriptimiskeel, see tähendab, et programmid on koheselt

käivitatavad ja ei vaja kompileerimist. Töös on kasutatud 2008. aastal välja antud Python 2.6

versiooni koos lisamoodulitega, milleks olid numpy, PIL, matplotlib, scipy ning libTIFF. [35]

2.3.2 Korrelatsioon

Järjestikuste pikslite omavahelise sõltumatuse kontrollimiseks kasutati autokorrelatsiooni.

Diskreetse signaali puhul väljendatakse autokorrelatsiooni valemiga (2).

2

1

1( ) ( )( )

( )

n k

i i k

i

R k X X X Xn k

, (2)

kus k -nihutatud signaali kaugus,

X -piksli väärtus,

i -piksli indeks pildist moodustatud jadas,

X -piksliväärtuste artimeetiline keskimine,

-diskreetse protsessi pikkus,

-standarthälve, 1

1 n

i

i

X Xn

[36].

Korrelatsioonikoefitsendid leiti kuni 5 pikslise vahega diskreetide puhul. Ühe katse eri

ilmingute korrelatsioonikoefitsentidest võeti keskmised ning kujutati need joondiagrammina.

Korrelatsioonikoefitsente määrati ainult fluorestseeruva välja korral, kuna pimeda ning

20

destilleeritud vee välja puhul oli footonite statistiline populatsioon niivõrd harv, et pikslite

vahelist korrelatsiooni ei olnud võimalik näidata.

2.3.3 Histogrammide võrdlemine Poisson'i jaotusega

Kuna on teada, et footonite registreerimine on Poisson'i protsess, siis ideaalse

konfokaalaparatuuri korral peavad katsetest saadud histogrammid alluma täpselt Poisson'i

jaotusele. Seega iga kõrvalekalle näitab võimalike lisamüraallikate olemasolu.

Sama katse eri ilmingute maatrikskujul olevad pildid muudeti ühemõõtmeliseks jadaks ning

liideti kokku. Saadud jada väärtustest moodustati normeeritud histogramm. Lisaks sellele leiti

veel jada väärtuste aritmeetiline keskmine ning dispersioon. Jada aritmeetilise keskmise

alusel genereeriti Poisson'i tõenäosusjaotus, kasutades valemit (2), ning esitati joon-

diagrammina.

( , )!

n xx eP n x

n

, (2)

kus n -sündmus, mille esinemise tõenäosust otsitakse,

-sündmuste keskväärtus [37].

Ühe välja erinevate pikslimõõtmisaegadega saadud histogrammid ja joondiagrammid

koondati lõpuks kokku ühele graafikule (

Joonis 8.). Kuna sama footonite tihedust, kuid erinevat massijaotust esitasid 5 tulpa, siis

tsentreeriti need tulbad horisontaaltelje väärtuste ümber nii, et sama pikslimõõtmisajaga

tulpasid nihutati ühepalju kõigis horisontaaltelje punktides.

Erinevate pikslimõõtmisaegadega saadud histogrammide keskmiste ja variatsioonide

muutuste kvantitatiivseks hindamiseks koostati graafik, kus horisontaalteljel paiknesid ühe

välja erinevate pikslikogumisaegadega saadud histogrammide keskmised ning vertikaalteljel

asetsesid keskmise ja sellele keskmisele vastava variatsiooni vahe (Joonis 9.). Ideaalse

Poisson'i jaotuse korral oleks see vahe võrdne nulliga.

2.3.4 Genereeritud Poisson'i jaotuse ja eksperimentaalse Poisson'i

jaotuse vahe

Järgneva meetodi eesmärk on hinnata, kas erinevused Poisson'i jaotusest on sõltuvuses ainult

footonite statistilisest populatsioonist või on tõepoolest tegu mingi tundmatu müraallikaga.

Esmalt leiti ühe pikslimõõtmisaja erinevatest ilmingutest koostatud histogrammi ja Poisson'i

tõenäosusjatuse vahede absoluutväärtuste keskmine. Vastavalt konkreetse pikslikogumisaja

21

erinevate ilmingute koondjada keskmisele väärtusele genereeriti Poisson'i jaotusele alluvaid

numbreid. Need numbrid esitati normeeritud histogrammina. Normeeritud histogrammist

lahtutati Poisson'i tõenäosusjaotuse väärtused, vahedest võeti absoluutväärtused ning leiti

keskmine. Seda korrati mitme erineva arvuhulgaga, et näha, kuidas erinevus sõltub statistilise

populatsiooni suurusest, ning seejärel koondati tulemused ühel graafikule (Joonis 10.).

2.3.5 Footonite registreerimise gradiendi määramine

Konfokaalmikroskoobi skaneerimise ühtluse määramiseks leiti pildi keskelt pärineva 400-

pikslise diameetriga ringi keskmine gradient. Esmalt jagati ring selle tsentrit läbiva

horisontaalse telje suhtes pooleks ning leiti ülemises pooles ja alumises pooles paiknevate

pikslite keskmiste suhe. Seejärel hakati telge tsentri ümber pöörama 10-kraadiste nurkadena

päripäeva suunas ning leiti sama suhe. Tulemused koondati ühele graafikule. Kuna ühes pildis

registreeritud footonite arv andis enamikel juhtudel liiga väikese statistilise populatsiooni

(väljendus graafiku hüppelisuses), siis populatsiooni suurendamiseks võeti appi sama katse eri

ilmingud. Eri ilmingute samade koordinaatidega pikslite väärtused liideti kokku üheks pildiks.

Pimeduse katset korrati pikema pikslimõõtmisajaga.

2.3.6 Peeglite liikumise kiiruse hindamine veergude ja ridade lõikes

Skaneerivate peeglite liikumise kiirusest sõltub piksli mõõtmise ajaline kestus. Kui peegel

liigub skaneeritavate ridade mingis osas kiiremini, siis nendel aladel on registreeritud

footonite arv väiksem kui mujal. Kui aga peegel liigub aeglasemalt mingis osas, siis on

registreeritud footonite hulk suurem. Statistilise populatsiooni suurendamiseks liideti katse eri

ilmingute samade koordinaatidega pikslid kokku üheks pildiks. Saadud pildi veergudest võeti

keskmised ning kujutati tulpdiagrammina. Sama tehti ka ridadega. Tulpdiagrammile lisati

lineaarse interpolatsiooni tulemusena saadud joon, et tulemused oleks paremini nähtavad

(Joonis 12.).

22

3 TULEMUSED JA ARUTELU

3.1 Pikslite vaheline korrelatsioon

Kasutades alapunktis 2.3.2 kirjeldatud metoodikat, saadi kõikide värvaine katsete

pikslimõõtmisaegade kohta korrelatsioonigraafikud mis võeti kokku tabeliks (Lisa 1). 1 µM

kontsentratsiooniga värvaine korral saadi kahe järjestikuse piksli korrelatsioonikoefitsentideks

0.002, 0.002, 0.006, 0.011, 0.02 vastavalt pikslimõõtmisaegadele 2 µs, 4 µs, 8 µs, 16 µs ning

32 µs. 2.5 µM kontsentratsiooniga värvaine korral saadi kahe järjestikuse piksli

korrelatsioonikoefitsentideks 0, 0.001, 0.002, 0.005, 0.011 vastavalt pikslimõõtmisaegadele 2

µs, 4 µs, 8 µs, 16 µs ning 32 µs. Suurimat korrelatsiooni, mis esines 1 µM värvaine korral 32

µs pikslikogumisajaga illustreerib Joonis 7. Eelnevast on selgelt näha, et korrellatsioon

kasvab pikslimõõtmisaja ning laserkiire võimsuse suurendamisega. Graafikutelt on näha

dendentsi, et pikslimõõtmisaja tõstmisega suureneb korrelatsioonikoefitsent, mis võib olla

tingitud samade mõõdetavate molekulide difundeerumisest naaberpikslitesse.

Joonis 7. Autokorrellatsioonigraafik. Graafiku aluseks on 1 µM värvainega katse,

kasutades 32 µs pikslimõõtmisaega

3.2 Histogrammide sobitamine Poisson'i jaotusega

Punktis 2.3.3 kirjeldatud metoodikat kasutades loodi kõikidele mõõdetud väljadele

eksperimentaalse ja teoreetilise jaotuse võrdluse graafikud (Lisa 2, 3, 4). Graafikutelt on näha,

23

et mõõdetud tulemused on ligilähedased ideaalsele Poisson'i massijaotusele, kuid

eksisteerivad väikesed kõrvalekalded. Kõrvalekallete hindamiseks võeti eksperimentaalse ja

teoreetilise jaotuse hälvete absoluutväärtuste keskmine. Kõige suurem absoluutne keskmine

kõrvalkalle esines 1 µM värvaine lahuse korral 2 µs pikslikogumisaja juures (

Joonis 8. rohelised tulbad), milleks oli 0.001. 2.5 µM värvaine lahuse korral vastab sellele

0.0007. Suuremate pikslimõõtmisaegade puhul hakkvad tulemused samastuma.

Joonis 8. 1 µM värvaine lahusega erinevate pikslimõõtmisaegadega saadud

histogrammid ning hisogrammide keskmistel põhinevad Poisson'i massijaotused.

Graafikul kasutatud tähistused: (sinised tulbad ja roheline joon) 32 µs piksli-

kogumisajaga saadud piksliväärtuste massijaotus ning selle keskmisele vastav

Poisson'i jaotus, (punased tulbad ja helesinine joon) 16 µs pikslikogumisajaga

saadud piksliväärtuste massijaotus ning selle keskmisele vastav Poisson'i jaotus,

(lillad tulbad ja kollane joon) 8 µs pikslikogumisajaga saadud piksliväärtuste

massijaotus ning selle keskmisele vastav Poisson'i jaotus, (mustad tulbad ja sinine

joon) 4 µs pikslikogumisajaga saadud piksliväärtuste massijaotus ning selle

keskmisele vastav Poisson'i jaotus, (rohelised tulbad ja punane joon) 2 µs piksli-

kogumisajaga saadud piksliväärtuste massijaotus ning selle keskmisele vastav

Poisson'i jaotus. x tähistab Poisson'i massijaotuse väärtust antud footonite arvu

puhul.

Värvainega katsetes langeb absoluutne keskmine kõrvalekalle väheneb pikslimõõtmisaja

suurendamisega vastupidiselt destilleeritud vee katsele. See on tingitud asjaolust, et pimeda ja

destilleeritud vee välja korral on keskmine pikslis registreeritud väärtus sisuliselt null,

mistõttu dispersioon on olematu. Pikslimõõtmisaja tõstmisega suureneb dispersioon ning kuna

24

tegu on väikese statistilise populatsiooniga, siis suureneb ka viga. Värvainega katsete puhul

viga kahaneb, kuna registreeritud footonite statistiline populatsioon on suur ning tõuseb veelgi

pikslimõõtmisja suurendamisel.

Hindamaks, kas erinevused Poisson'i massijaotuse ja eksperimendi tulemusena saadud

histogrammide vahel on statistilised või on tingitud mingitest muudest teguritest, kasutati

punktis 2.3.4 kirjeldatud meetodit, mille tulemusena selgus, et kõikide katses saadud

aritmeetiliste keskmiste alusel genereeritud numbrijadad erinesid teoreetilisest jaotusest

vähem kui eksperimentaalselt saadud tulemused. Tulemusi iseloomustab hästi 10 µs

pikslikogumisajaga pimeda välja aritmeetilise keskmise alusel tehtud graafik Joonis 9.

Joonis 9. 10 µs pikslimõõtmisaja pimeda välja ja genereeritud massiivide erinevus

Poisson'i massijaotusest. Graafikul kasutatud tähistused: punane täpp on

eksperimentaalne keskmine absoluutne erinevus Poisson'i jaotusest, punased ristid

on 10 µs pimeda välja aritmeetilise keskmise alusel genereeritud Poisson'i

jaotusele alluvate erinevate pikkustega arvumassiivide keskmised absoluutsed

erinevused ideaalsest Poisson'i massijaotusest

Värvainega katsete korral olid erinevused 5 - 12 korda, destilleeritud vee korral 2.5 - 10 korda

ning pimeduse katses 7 korda. Aritmeetiliste keskmistega suurusjärgus 0.01 saadud graafikud

on hüppelised, millest tuleneb vee katse lai erinevuste vahemik. Graafikutelt (Lisa 5, 6, 7, 8)

ilmneb, et mõõdetud piltides esineb lisaks Poissoni'i mürale veel mingi tundmatu sekundaarne

komponent.

25

Histogrammide dispersiooni ja aritmeetilise keskmise muutuste uurimisel selgus, et

dispersiooni ja aritmeetiliste keskmise vahe suurenes pikemate pikslimõõtmisaegadega.

Värvainega teostatud katsete korral saadi parapoolse iseloomuga graafikud (Joonis 10. ja Lisa

9). Eriti kiiret dispersiooni kasvu näitas 1 µM värvaine lahus. Destileeritud vee katsete korral

saadi lineaarne graafik (Lisa 10). Kõigil juhtudel oli variatsioon aritmeetilisest keskmisest

väiksem.

Joonis 10. Dispersiooni ja aritmeetilise keskmise vahe kvantitatiivne hinnang

1 µM värvaine lahuse korral

Kuna dispersiooni kiire kasv võis olla tingitud detektori surnud intervallist (dead time), mille

ajal detektor footoneid ei registreerita, siis teostati lisakatse. Võrreldi piksli väärtuste

korrektsiooni võimalust ning tavalist footonite registreerimist 1µM värvaine korral erinevate

pikslikogumisaegadega. Piksli korrektsiooni võimalus teoreetiliselt kõrvaldab surnud aja

efekti. Selgus, et pikslite korrigeerimine suurendas dispersiooni veelgi (Joonis 11.) . Sellest

võib järeldada seda, et pikslite korrigeerimine suurendab oluliselt pildis juba olemasolevat

müra.

27

Joonis 11. Footonite korrigeerimise mõju mürale: (roheline joon siniste x-idega) 1µM

lahuse erinevate pikslikogumisaegadega saadud dispersiooni ja keskmise erinevuste

kvantitatiivne hinnang korrigeeritud piksliarvuga, (punane joon punaste x-idega) 1µM

lahuse erinevate pikslikogumisaegadega saadud dispersiooni ja keskmise erinevuste

kvantitatiivne hinnang korrigeerimata piksliarvuga

3.3 Footonite registreerimise gradient

Footonite registreerimise gradiendi määramiseks kasutati punktis 2.3.5 kirjeldatud

metoodikat. Värvaine lahustega katse puhul saadud graafikutel (Lisa 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19) on selgelt näha, et suhete erinevused ühest on kõige suuremad 20 ja 180 kraadi

juures. Näiteks 2.5 µM värvaine lahuse korral 32 µs pikslimõõtmisajaga esineb suurim

gradient 20 kraadi juures

28

(

Joonis 12.). See tähendab seda, et kui pilt horisontaalselt kaheks jaotada, siis on ülemises

pooles rohkem registreeritud footoneid kui alumises osas. Destilleeritud vee ja algselt

mõõdetud pimeda välja korral ei õnnestunud graafikult gradienti välja lugeda, kuna katsete

käigus oli registreeritud liiga vähe footoneid. Pimeda välja katset korrati 1000 µs

pikslimõõtmisajaga ning saadi piisavalt suur footonite populatsioon. Loodud graafik oli

endiselt äkiline ning gradient puudus. Sellest järeldub, et footonite registreerimise gradient on

tingitud optilistest põhjustest, milleks võivad olla nii peeglite ebaühtlane liikumine, kui ka

optika aberratsioonid.

29

Joonis 12. 2.5 µM värvaine lahuse korral 32 µs pikslimõõtmisajaga teostatud

mõõtmiste eri ilmingute summeeritud pildi keskelt lõigatud ringi poolte suhted

erinevate nurkade all, horisontaaltelje suhtes.

3.4 Peeglite kiirus veergude ja ridade lõikes

Peeglite suhtelise kiiruse leidmiseks kasutati punktis 2.3.6 kirjeldatud metoodikat. Ridade

summeeritud graafikutelt (Lisad 20-27) selgub, et rea lõikes keskmiselt registreeritud

footonite arv kasvab rea indeksi suurenemisel. Kõige paremini illustreerib footonite arvu

kasvamist ridade vältel 2.5 µM värvaine lahuse katse, 32 µs pikslimõõtmisajaga (Joonis 13.).

Veergude keskmiste graafikutelt (Lisa 27-36) on näha, et veeru lõikes keskmiselt

registreeritud footonite arv kahaneb veeru indeksi suurenemisel. Seda protsessi illustreerib

hästi 2.5 µM värvaine lahuse katse, 32µs pikslimõõtmisajaga (

Joonis 14.).

30

Saadud tulemustest järeldub, et footonite arvu registreerimiste muutused ridade ja veergude

vältel võivad olla põhjustatud nii ostsilleeruvatest peeglitest kui ka optikast. Konkreetset

põhjust teostatud analüüsi põhjal ei ole võimalik anda.

Joonis 13. Ridade aritmeetilised keskmised. Graafiku aluseks on 2.5 µM värvaine

lahuse katse 32µs pikslimõõtmisajaga

Joonis 14. Veergude aritmeetilised keskmised. Graafiku aluseks on 2.5 µM

värvaine lahuse katse 32µs pikslimõõtmisajaga

3.5 Detektori valeloenduste arv

1000 µs pikslikogumisajaga pimeda välja lisapildilt (toavalgus oli sisse lülitatud), kus

detektori kast oli klapiga blokeeritud, selgus et valeloenduste arv oli 2000 footonit sekundis.

See on 4 korda rohkem, kui tehnilistes spesifikatsioonides ette nähtud. Varasemalt mõõdetud

10 µs pikslikogumisajaga pimeda välja puhul, kus ei old detektori kasti ees klappi, saadi

valeloenduste arvuks 1450 footonit sekundis. Pimeda toa korral saadi sama tulemus. Ainus

erinevus 1000 µs ja 10 µs mõõtmiste vahel oli kuupäev, millal mõõtmised teostati. Seega

31

valeloenduste arv on ajas muutuv suurus. Üks võimalik faktor mis seda mõjutab, võib olla

toatemperatuur.

32

KOKKUVÕTE

Teostatud töö tulemusena leidis kinnitust, et uuritavas konfokaalmikroskoobis eksiteerib

tõepoolest valdavalt Poisson'i müra, mis on iseloomulik kõikidele konfokaalsüsteemidele.

Lisaks sellele leiti, et Poisson'i jaotusest eksiteerivad väikesed kõrvalded, mille põhjuseks

võivad olla detektori valeloenduste kõrge arv ning peeglite ebaühtlane liikumine.

Selgus ka tõsiasi, et detektori valeloenduste arv on ajas suhteliselt palju muutuv suurus.

Siinkohal teeks ettepaneku detektori valeloenduste uurimiseks. Katse võiks seisneda samuti

nagu antud töös pimeda välja mõõtmises, kuid pikema ajalise kestvusega. Pikslimõõtmisajaks

tuleks võtta 100 µs ning katset võiks teostada tunni aja jooksul ning saadud piltide keskmised

esitada ajalises järejestuses joondiagrammina. Katset tuleks teostada ka erinevate

ruumitemperatuuride juures.

Pildi gradiendi uurimisel selgus, et gradient esines vaid fluorestseeruva välja korral.

Destilleeritud vee välja korral saadi liiga vähe andmeid ning pimeda välja korral 1000 µs

pikslikogumisaja puhul puudus gradient. Gradiendi võimalikeks põhjusteks võivad olla

peeglite ebaühtlane liikumine ning optilised moonutused. Kuna pildi gradient on alati sama,

siis on võimalik mõõdetud pilte algoritmidega korrigeerida.

33

RESÜMEE

Title: Validation of confocal microscope through noise measurements of homogeneous field.

Author: Ürgo Saaliste

The thesis is written in Estonian.

The aim of this work was to study the noise characteristics of a confocal microscope to

provide an adequate basis for the use of deconvolution algorithms. Depending on the nature of

the noise one must select an appropriate deconvolution algorithm.

Measurements were carried out on three different homogeneous fields which were total

darkness, distilled water and fluorescence in solution. Data processing was later carried out

using a universal scripting language called Python.

The total darkness means that the laser was turned off and the microscope was set on eye-

piece so that no light from the objective goes to the confocal apparatus. Measurements were

carried out using the following pixel acquisition times: 10 µs and 1000 µs.

Florescent field was achieved by using 1 µM and a 2.5 µM dextran Alexa 647 dye solutions.

Distilled water was used as solvent. Measurements were carried out using the following pixel

acquisition times: 2 µs, 4 µs, 8 µs, 16 µs and 32 µs. Distilled water measurements were also

carried out with the same pixel acquisition times mentioned last.

Multiple pictures were acquired for each pixel acquisition time.

The first part of the thesis consists of 8 pages of literature review which describes the

development and the main principle of the confocal microscope. The second part of the thesis

consists of 5 pages and focuses on the different analysis techniques used in this work. In the

third part consisting of 6 pages, results are shown and discussed after which summary is

given. At the end of the thesis 37 references are given. There are also 37 appendixes. 13

figures and graphs in total are being used to illustrate main ideas of the thesis.

Five different analysis techniques were used in the work. First of all autocorrelation was used

to prove the independence of each pixel of the image, which was followed by creation of

normalized histograms from image data and comparing it to the Poisson mass distribution,

based on the mean of the histogram. From that it was concluded that the distribution was very

close to the theoretical distribution. To assess whether the changes were statistical in nature or

they were generated by an unknown source of noise, numerical arrays of different length,

34

which followed the Poisson distribution, were generated based on the means of the

histograms. Afterwards histograms were made and compared to the Poisson mass distribution.

The results were grouped together on different graphs. From the graphs it is easy to see that

the generated numbers always follow the Poisson distribution more accurately than the results

from the experiments, thus confirming the existence of unknown secondary noise.

Next photon registering gradient was measured. To measure the gradient, pictures from

different manifestations of the same experiment were summed together so that the pixels that

had the same indexes were added together. After that a 400 pixel diameter circle was cut out

of the middle of the picture. The circle was then cut in half horizontally and the ratio of the

upper and lower part was calculated. This was repeated with different angels up to 180

degrees after which the ratios were presented as a graph. It can be seen from the graphs that

there exists a gradient field under the direction of 20 degrees.

Finally, on average of all experiments were found and the means of average columns as well

as average rows were depicted on graphs. The graphs showed that less photons were

registered in the beginning of scanning lines and in the lines scanned earlier. An important

observation was made during experimentation: the dark count of the detector fluctuated in

time quite a lot. Suggestions were made to further analyze the dark count of the detector

within longer periods of time.

In conclusion it was stated that the topic needs further investigation because this work did not

give answers to origin of the unknown noise.

The author would like to thank his supervisor Pearu Peterson, co-supervisor David Schryer

and his partner Anna-Liisa Ikart for overall help and suggestions.

35

KIRJANDUSE LOETELU

1Laasmaa, M. The Analysis of Richardson-Lucy Deconvolution Algorithm with Application

to Microscope Images : magistritöö. Tallinna Tehnikaülikool, Tallinn, 2009

2 Vendelin, M., Birkedal, R. Anisotropic diffusion of fluorescently labeled ATP in rat

cardiomyocytes determined by raster image correlation spectroscopy. - Am J Physiol Cell

Physiol. 2008, 295, C1302 - C1315

3 Minsky, M. (1988) Memoir on Inventing the Confocal Scanning Microscope. - Scanning,

10, 128-138.

4 Paddock, S., W., Fellers, T., J., Davidson, M., W.

[WWW] http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html (01.05.10)

5 Confocal Microscopy And Multiphoton Excitation Microscopy: The Genesis of Live Cell

Imaging. (2006). / ed. B. R. Masters. Bellingham: The International Society for Optical

Engineering

6 Measuring the skin. (2004). / ed. P. G. Agache, P. Humbert. Berliin: Springer-Verlag

7 Optical imaging techniques in cell biology. (2007). / ed G. Cox. B. Raton: CRC Press

8 Handbook of biological confocal microscopy. (1995). 2nd

/ ed J. B. Pawley. New York:

Springer Science + Business Media

9 Yokogawa Electric Corporation kodulehekülg. [WWW]

http://www.yokogawa.com/scanner/principles/principle1.htm (04.05.10)

10 Amos, W., B., White, J., G. (2003). How the confocal laser scanning microscope entered

biological research. - Biology of the Cell. 95, 335-342. [Online] ScienceDirect. (05.05.10)

11 Herman, B., Frohlich, V., E., C., Lakowicz, J., R., Murphy, D., B., Spring, K., R.,

Davidson, M., W. [WWW]

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorescenceintro.html (01.06.10)

12 Singh, A., Gopinathan, K., P. (1998). Confocal microscopy: A powerful technique for

biological research. - Current Science. 70 (10), 841-851. [WWW]

http://eprints.iisc.ernet.in/1424/1/confocal.pdf (07.05.10)

36

13 Hollandi Nijmegen Radboud'i ülikooli virtuaalse klassiruumi bioloogia koduleht. [WWW]

http://www.vcbio.science.ru.nl/images/CLSM/CLSM-conventionalvsclsm_zoom.jpg

(07.06.10)

14 Claxton, N., S., Fellers, T., J., Davidson, M., W. Laser scanning confocal microscopy.

[WWW] http://www.olympusfluoview.com/theory/LSCMIntro.pdf (08.05.10)

15 Handbook of biomedical nonlinear optical microscopy. /ed. B. R. Masters, P. T. C. So.

New York: Oxfor university press, 2008.

16 Standa kodulehekülg. [WWW]

http://www.standa.lt/products/catalog/optical_tables?item=140 (08.05.10)

17 Surplus High-Tech Equipment kodulehekülg. [WWW]

http://www.surpluseq.com/vdirs/info/mghelneonlaser.pdf (09.05.10)

18 Shanghai Dream Lasers Technology Co., Ltd. kodulehekülg. [WWW]

http://www.dreamlasers.cn/products/laser/473nm%201-100mW.htm (09.05.10)

19 Thorlabs, Ltd. UK kodulehekülg. [WWW]

http://63.161.211.68/thorProduct.cfm?partNumber=PF10-03-P01-10 (09.05.10)

20 AHF analysentechnik AG kodulehkülg. [WWW]

http://www.ahf.de/art-HC_Strahlenteiler_BS_510;2906.html (10.05.10)

21 AA Opto Electronic kodulhekülg. [WWW]

http://opto.braggcell.com/uploads/files/AOTFnCVIS.pdf (30.05.10)


http://www.thorlabs.com/thorProduct.cfm?partNumber=BT500/M (30.05.10)


http://www.thorlabs.com/thorProduct.cfm?partNumber=C220TME-A (30.05.10)


http://www.thorlabs.com/NewGroupPage9.cfm?ObjectGroup_ID=1400 (01.06.10)


http://www.thorlabs.com/thorProduct.cfm?partNumber=LA1608-A (01.06.10)


http://www.thorlabs.com/thorProduct.cfm?partNumber=SM1D12C (01.06.10)

27 AHF analysentechnik AG kodulehkülg. [WWW]

37

http://www.ahf.de/art-Strahlenteiler_640_DCXR;2374.html (02.06.10)

28 Cambridge Technology kodulehekülg. [WWW]

http://www.cambridgetechnology.com/products/6200/6210.html (10.06.10)

29 Olympus Corporation kodulehekülg. [WWW]

http://microscope.olympus.com/uis2/UPLSAPO/60XW/# (02.06.10)


http://www.thorlabs.com/thorProduct.cfm?partNumber=FW102B (03.06.10)

31 Semrock Inc. kodulehekülg. [WWW]

http://www.semrock.com/Catalog/Detail.aspx?FilterPartID=685&CategoryID=27 (03.06.10)

32Semrock Inc. kodulehekülg. [WWW]

http://www.semrock.com/Catalog/Detail.aspx?FilterPartID=812&CategoryID=27 (03.06.10)


http://www.thorlabs.com/thorProduct.cfm?partNumber=AC254-500-A1-ML (02.06.10)

34PerkinElmer Inc. kodulehekülg. [WWW]

http://www.perkinelmer.co.uk/PDFS/downloads/dts_photodiodemodulesreceiverforanalytical

molecularapplications.pdf (10.06.10)

35 Python (programming language). [WWW]

http://en.wikipedia.org/wiki/Python_%28programming_language%29 (20.05.10)

36 Autocorrelation. [WWW] http://en.wikipedia.org/wiki/Autocorrelation (20.05.10)

37 Poisson distribution. [WWW] http://en.wikipedia.org/wiki/Poisson_distribution (20.05.10)

LISAD

Lisa 1 Autokorrellatsioonitabel

Konsentratsioon,

pikslimõõtmisaeg R(1) R(2) R(3) R(4) R(5)

1 µM, 2 µs 0.00166 -0.00002 0.00001 -0.00195 -0.00086

1 µM, 4 µs 0.00212 0.00086 0.00029 0.00017 -0.00012

1 µM, 8 µs 0.00587 0.00374 0.00212 0.00085 0.00037

1 µM, 16 µs 0.01102 0.00810 0.00475 0.00317 0.00129

1 µM, 32 µs 0.01980 0.01534 0.01002 0.00733 0.00534

2.5 µM, 2 µs 0.00024 -0.00062 0.00068 -0.00182 -0.00210

2.5 µM, 4 µs 0.00108 -0.00079 -0.00014 -0.00111 -0.00076

2.5 µM, 8 µs 0.00244 0.00115 0.00071 -0.00008 -0.00095

2.5 µM, 16 µs 0.00456 0.00357 0.00266 0.00174 0.00052

2.5 µM, 32 µs 0.01086 0.00795 0.00559 0.00374 0.00274

Lisa 2 2.5 µM värvaine lahuse katsete histogrammid Poisson'i jaotusega

Lisa 3 Destileeritud vee katsete histogrammid Poisson'i jaotusega

Lisa 4 Pimeda välja 10 µs katse histogramm Poisson'i jaotusega

Lisa 5 Erinevused Poisson'i massijaotusest, 1µM värvaine korral

Lisa 6 Erinevused Poisson'i massijaotusest, 2.5 µM värvaine korral

Lisa 7 Erinevused Poisson'i massijaotusest, destilleeritud vee korral

Lisa 8 Erinevused Poisson'i massijaotusest, 10 µs pimeda välja korral

Lisa 9 Dispersiooni ja aritmeetiline keskmine 2.5 µM värvaine korral

Lisa 10 Dispersiooni ja aritmeetiline keskmine detsilleeritud vee korral




























Documents

KONFOKAALMIKROSKOOBI VALIDEERIMINEcens.ioc.ee/~pearu/theses/yrgo_bsc_2010.pdf · valguse peegeldamine teisele mikromeetrilisele avale (I). Kuna valgus läbib sama optilist teekonda,