UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE HONDURAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS
ESCUELA DE MICROBIOLOGIA
Laboratorio de Gentica Prctica #7: Induccin del Profago por
radiacin ultravioleta
Integrantes: Alex Ortega Colindres Mnica Fnez Castillo Bryan
Rodrguez Segura 20061010528 20070000267 20091003270
Instructor: David Zelaya
Seccin: Lunes 2:00 5:00 pm
Ciudad Universitaria, Viernes 4 de Mayo de 2012.
Objetivos
Observar la entrada en ciclo ltico de un fago lisogenico
insertado enforma de profago mediante la induccin con luz
ultravioleta.
Materiales
5 placas de agar soya tripticasa (TSA) Campana de seguridad
provista de lmpara ultravioleta (longitud fr inda 240-265 nm)
Cultivo de escherichia coli W3104 (cepa lisogenica para el fago ^)
y E. coli C600 (cepa indicadora sensible al fago ^), en caldo
nutritivo incubados 37 C durante 18 nhoras.
Introduccin
Un profago es un fago (virales) genoma insertado e integrado en
el cromosoma bacteriano ADN circular. Un profago, tambin conocido
como un fago temperado, es cualquier virus en el ciclo lisognico,
sino que est integrado en el cromosoma del husped o existe como una
extracromosmico plsmido . Tcnicamente, un virus puede ser llamado
un profago slo mientras que el ADN viral permanece incorporado en
el ADN del husped. Esta es una forma latente de un bacterifago , en
el que los genes virales se incorporan en el bacteriana cromosoma
sin causar perturbacin de la bacteriana celular . Tras la deteccin
de dao de la clula husped, tal como luz UV o ciertos productos
qumicos, el profago se escinde del cromosoma bacteriano en un
proceso llamado induccin profago. Despus de la induccin, la
replicacin viral comienza a travs del ciclo ltico . En el ciclo
ltico, el virus se apodera maquinaria reproductiva de la clula. La
clula puede llenar con nuevos virus hasta que lisis o rfagas, o
puede liberar los nuevos virus uno a la vez en un proceso
endocittica inversa. El perodo desde la infeccin hasta la lisis que
se denomina el perodo de latencia. Un virus despus de un ciclo
ltico se llama un virus virulento. Prophages son importantes
agentes de transferencia horizontal de genes , y se consideran
parte de la mobilome . La induccin del fago El gen regulador del
circuito de fago es uno de los circuitos ms entendidos a nivel
mecnico. Este circuito incluye varios comportamientos normativos de
inters. Una clula infectada se somete a una decisin entre dos
caminos alternativos, los lticos y lisognico vas. Si este ltimo es
seguido, el estado lisognico se establece y mantiene. Mientras que
este estado es muy estable, se puede cambiar a la va ltica en el
proceso de induccin profago, que ocurre cuando la respuesta del
husped SOS se desencadena por dao en el DNA. [1]
Procedimiento
Encienda la lmpara de luz UV 30 minutos antes de comenzar el
ensayo con el fin de q se estabilice la intensidad de la emisin.
Marque las 5 placas de TSA numerndolas de 1 al 5 Haga una seal en
la base de cada plato donde se realiza la siembra del cultivo d e
E.coli C600 Inocule en cada una de las placas de la cepa C600 con
una asa de siembra estril. Para ello realice una estra, sin daar la
superficie del agar de lado a lado le da placa. Efectu estas
operaciones cerca de la llama del mechero de gas. Inocule en cada
una de las placas la cepa w3104 con una asa de siembra estril. Para
ello realice una estra que cruce con la anterior cepa C600 de forma
perpendicular y de lado a lado de la placa. Efectu estas
operaciones cerca de la llama del mechero. Irradie las placas
inoculadas con luz UV. Para ello introduzca las placas cerradas en
el interior de la campana con luz UV. La luz debe incidir
verticalmente sobre las placas bralas el tiempo necesario para que
se irradie la superficie inoculada. Trabaje con rapidez y evite en
todo momento la exposicin prolongada de las manos y los brazos ala
luz UV y no mire nunca el foco emisor directamente. Los periodos de
irradiacin son: 1. Placa 1: control sin irradiar. 2. Placa 2: 2
segundos. 3. Placa 3: 5 segundos. 4. Placa 4 : 10 segundos. 5.
Placa 5: 15 segundos. Incube las placas a 37 C durante toda la
noche.
Articulo
Respuesta SOS en E. Coli. Test de induccin de genes SOS como
ensayo de mutagenicidad Se presentan las particularidades de la
respuesta SOS en clulas de E. coli y se realiza una descripcin de
los tipos de daos que inducen dicha respuesta. Se tratan adems los
aspectos relacionados con la regulacin del circuito RecA/Lex A, as
como de la seal inductora de la respuesta. Se resumen, de acuerdo
con la bibliografa actualizada del tema, las funciones de los
principales productos gnicos de esta respuesta, en particular, RecA
y UmuC y D, durante la restauracin de la replicacin y se discute un
modelo que explica el fenmeno de la mutagnesis SOS en E. coli. Se
hacen algunas consideraciones evolutivas de la mutagnesis SOS en
bacterias de acuerdo con el modelo cairsiano de evolucin. Se
explican las particularidades de los tests de induccin de genes
SOS, as como su utilidad, tanto en la evaluacin de efectos
genotxicos como en la prospeccin y estudio de mecanismos de accin
de sustancias antimutagnicas, radioprotectoras, o ambas.
Descriptores DeCS: RESPUESTA SOS (GENETICA); REGULACION BACTERIANA
DE LA EXPRESION GENICA; ESCHERICHIA COLI/ gentica; PROTEINA REC A/
gentica; PROTEINAS BACTERIANAS/ gentica; MUTAGENESIS/ gentica;
REPLICACION DEL ADN; ADN BACTERIANO. En las bacterias, la respuesta
celular a agentes que daan su cromosoma o bloquean su replicacin se
conoce como respuesta SOS, la que constituye una respuesta de
emergencia celular a partir de la cual se inducen ms de 20
productos gnicos (sfiA, sfiB, uvrA, uvrB, uvrC, recA, umuC, umuD,
polA, dinD, entre otros), y donde la expresin, la regulacin y la
modulacin de dichos genes es mediada por el circuito recA/lexA. La
protena lexA es el represor comn a todos los genes SOS, incluido el
recA; este ltimo es uno de los productos gnicos ms importantes en
las bacterias, involucrado en otras funciones vitales como
recombinacin, induccin de profagos bacterianos, induccin de
filamentos celulares, entre otras.1 Una gran variedad de agentes
daantes pueden inducir la respuesta SOS. Los trabajos actuales
concuerdan en que la protena RecA puede ser activada por algn
intermediario comn al metabolismo del ADN. Estudios "in vitro" han
demostrado que la protena RecA es activada en presencia de
cofactores polinucleotdicos y cofactores mononucleotdicos como ATP
y dATP, entre otros.
Se ha comprobado adems, que regiones de simple cadena generadas
por la ADN polimerasa III al sobrepasar el sitio daado en el ADN
activan la protena RecA. Estas regiones son incrementadas por la
actividad exonucleasa del complejo RecBC o generadas por la
reparacin de la escinucleasa UvrABC. Una vez activada RecA,
auxiliada por las protenas SSB, sta puede promover el autoclivaje
de LexA y de represores de varios profagos de E. coli, resultando
en la expresin de los genes SOS.2 Sin embargo, estudios recientes
han sugerido la existencia de rutas de regulacin alternativas a
LexA para genes SOS, las cuales son igualmente dependientes de la
activacin de recA. 3 Restauracin de la replicacin y mutagnesis SOS
La funcin de restauracin de la replicacin por RecA es quizs la ms
importante y compleja de sus funciones para garantizar la
supervivencia celular. Todas las evidencias experimentales
sostienen la idea de que una amplia gama de rutas de reparacin,
estrechamente relacionadas y reguladas por el circuito RecA/LexA,
son inducidas para restaurar la replicacin del ADN. Un hecho que
sostiene esta tesis es que el represor LexA tiene diferente
afinidad por los promotores de los genes SOS (uvr, rec, umu, din,
entre otros) involucrados en la reparacin del ADN;4 lo que sugiere
que la protena RecA no slo desreprime estos genes sino que debe
modular coordinadamente la expresin de stos en dependencia de las
necesidades celulares. La recuperacin celular es entonces producto
de la accin conjunta de un grupo de protenas controladas por el
circuito RecA/LexA, las cuales forman un complejo enzimtico capaz
de replicar el ADN, aun en condiciones muy daadas.5 Una funcin
regulatoria importante de la protena RecA, es la de promover el
autoclivaje de la protena UmuD a un producto UmuD'. Resultados
obtenidos por Peat y colaboradores2 sugieren que parte de este paso
de activacin es un cambio conformacional de la regin N-terminal
luego del autoclivaje, el cual permite que UmuD' establezca
diferentes interacciones con el complejo RecA-filamento de ADN, lo
que no es posible para UmuD. Esto ha sido demostrado en protenas
homlogas como LexA y la protena cI del fago l . El modelo del
mutosoma RecA-UmuC/D' explica la unin de la ADN polimerasa III con
el sitio daado.6 Se ha visto que RecA altera la conformacin del
molde de ADN distorsionado, lo hace ms accesible a la ADN
polimerasa III e inhibe la actividad editora de esta, mientras
UmuC/D' facilita el alargamiento de la cadena con el anclaje de la
polimerasa, evitando su disociacin del molde y favoreciendo su
reasociacin. Dadas estas evidencias experimentales, la mutagnesis
SOS puede ser explicada en 2 pasos fundamentales:
1. La ADN polimerasa III incorpora nucletidos en una cadena
lesionada, pero no puede continuar la sntesis. 2. La formacin del
mutosoma UmuC/D'-RecA debe permitir a la ADN polimerasa III,
continuar la sntesis una vez pasada la lesin.7 La mutagnesis SOS se
considera un estado especializado diferenciado para cambio gentico,
donde ste ocurre no slo como consecuencia de la reparacin del dao,
sino adems por un incremento del nivel de mutacin en las zonas no
daadas del ADN. Esto condicion la polmica sobre la idea de
"Evolucin inducible" la cual fue la precursora inmediata de
controversias alrededor de la mutacin adaptativa, que tom fuerzas
cuando en 1988, Cairns y sus colegas8 presentan la tesis de que las
mutaciones ocurren con mayor frecuencia cuando el organismo est
bajo presin selectiva para esa mutacin, en aparente contradiccin
con la preexistente, donde las mutaciones surgen al azar y sin
buscar una utilidad. En esta propuesta, el ambiente no slo
selecciona entre variantes preexistentes, sino que tambin interacta
con el organismo para generar variacin sobre la cual acta la
seleccin. Este fenmeno de mutagnesis bajo seleccin ha sido llamado
mutacin inducida por seleccin, mutacin adaptativa, entre otros.9
Segn esta hiptesis, el ambiente interacta con dichos procesos de
diversas formas, condicionando una retroalimentacin entre los
generadores de diversidad gentica y el ambiente que selecciona
entre las variantes. La eficiencia de estos lazos de
retroalimentacin debe ser refinada por medio de muchos ciclos de
seleccin, resultando el nivel de mutacin de un arreglo entre
fidelidad, economa y necesidad ocasional de generar variacin. La
variacin locus-especfica sensible al ambiente, ofrece una salida a
este arreglo. En este sentido, la seleccin natural acta ms all de
alelos particulares, favoreciendo la generacin de alelos con una
alta probabilidad de pasar las pruebas de la seleccin ambiental.9
La rpida evolucin de las bacterias a la resistencia a antibiticos y
la evolucin clonal en la oncognesis involucran cambios genticos
concertados que pueden incluir aspectos de mutacin promovida por
seleccin. Test de induccin de genes SOS como ensayo de
mutagenicidad a corto plazo Se considera que la mayor parte de los
eventos mutacionales en las bacterias estn relacionados con la
mutagnesis SOS.6 Por ende, los ensayos que miden el nivel de
induccin de genes SOS son un buen estimador del potencial mutagnico
del inductor. Dichos ensayos resultan atractivos por su
sensibilidad, sencillez y por la ventaja adicional de producir
resultados en unas pocas
horas, y de evaluar un nmero grande de muestras de forma
semiautomtica.10 El primer ensayo de induccin de genes SOS para la
evaluacin de efecto mutagnico, se conoce como SOS Chromotest,11 el
cual utiliza una cepa (PQ-37), construida por transduccin
especializada utilizando el fago Mu (Ap, lac) cts,12 en el cual
fueron incorporados los genes estructurales del opern lactosa de E.
coli sin su promotor, para formar un fago de transduccin
especializada Mu-Lac, el cual transporta adems el gen de la
blactamasa, para resistencia a ampicilina. Al ocurrir la integracin
dentro del gen SOS en la direccin de la transcripcin, los genes
estructurales del opern lactosa se sitan de forma tal que slo se
expresan a partir del promotor de este gen. Esta cepa es portadora
de la fusin SfiA:: Mu (Ap,lac) cts, que condiciona que los genes
lacZ y lacY estn bajo el control gentico del opern SfiA de forma
que la actividad especfica b -galactosidasa sea un indicador de las
funciones SOS. Dicho ensayo ha sido validado por estudios
comparativos con el test de Ames, empleando una gama amplia de
mutgenos conocidos,11 y actualmente es uno de los tests "in vitro"
a corto plazo ms utilizados para la deteccin de dao primario al DNA
en muestras ambientales.13 Tambin se emplea el test Rec-Lac14 por
las facilidades que brindan las fusiones con este gen referente a
niveles de expresin de la fusin y por el producto gnico en s, lo
cual puede resultar una informacin de mucho valor. En general, los
tests de induccin de genes SOS, han mostrado probada utilidad en la
deteccin de efectos mutagnicos tanto de agentes qumicos15 como
fsicos.16,17 Dichos ensayos han sido usados adems, para el estudio
y prospeccin de inhibidores de DNA girasas como quinolonas,18
actividad oxidativa ambiental14 y anti-mutagenicidad.19
Actualmente, el test de induccin de genes SOS cuenta con una batera
de cepas de E. coli que portan fusiones del fago Mu(Ap,lac)cts (u
otros fagos) con otros genes SOS como umu, din, rec, uvr.
Escherichia coliLa Escherichia coli (pronunciado /eske'rikia
'koli/), tambin conocida por la abreviacin de su nombre, E. coli,
es quizs el organismo procariota ms estudiado por el ser humano. Se
trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los
intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo
puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo.
Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich,
bacterilogo alemn, quien la denomin Bacterium coli. Posteriormente
la taxonoma le adjudic el nombre de Escherichia coli, en honor a su
descubridor. sta y otras bacterias son necesarias para el
funcionamiento correcto del proceso digestivo, adems de producir
las vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la
tincin de Gram (gramnegativo), es anaerobio facultativo, mvil por
flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es
capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es
++--. La Escherichia coli, en su hbitat natural, vive en los
intestinos de la mayor parte de los mamferos sanos. Es el principal
organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo. En
individuos sanos, es decir, si la bacteria no adquiere elementos
genticos que codifican factores virulentos, la bacteria acta como
un comensal formando parte de la flora intestinal y ayudando as a
la absorcin de nutrientes. En humanos, la Escherichia coli coloniza
el tracto gastrointestinal de un neonato adhirindose a las
mucosidades del intestino grueso en el plazo de 48 horas despus de
la primera comida. Escherichia coli O157:H7 La Escherichia coli
O157:H7 es una de las cientos de cepas de la Escherichia coli.
Aunque la mayora de las cepas son inocuas y viven en los intestinos
de los seres humanos y animales saludables, esta cepa produce una
potente toxina y puede ocasionar enfermedades graves como el
sndrome urmico hemoltico. La Escherichia coli O157:H7 fue
reconocida inicialmente como causa de enfermedad en 1982 durante un
brote de diarrea aguda con sangre en EE. UU. Se determin que el
brote se deba a hamburguesas contaminadas. Desde entonces, la
mayora de las infecciones han provenido de comer carne de vacuno
picada insuficientemente cocinada. El escritor Robin Cook escribi
una novela sobre el tema titulada Toxina. En 1996, cerca de Seattle
se produjo un brote a causa de esta bacteria, que se encontr en
botellas de zumo de manzana de la marca Odwalla. Muchas personas,
entre ellas bebs y nios, murieron despus de tomar este zumo. La
bacteria entr en las botellas porque las manzanas que se
exprimieron contenan excrementos de venados de la zona y no hubo
ningn tipo de pasteurizacin. Se diferencia de las otras Escherichia
coli en que no fermenta el sorbitol, no crece a 44 C y no produce
-glucoronidasa. La combinacin de letras y nmeros en el nombre de la
bacteria se refiere a los marcadores antignicos especficos que se
encuentran en su superficie y la distingue de otros tipos de
Escherichia coli:
El antgeno somtico O, proveniente del lipopolisacrido de la
pared celular; El antgeno flagelar H, compuesto por 75
polisacridos.
Concluciones
Las bacterias infectadas por fagos portan la informacin gentica
correspondiente al fago, a travs de mltiples divisiones
bacterianas, o sea, el genoma del fago es replicado al mismo tiempo
que ocurre la replicacin del genoma bacteriano. concluimos que
durante el estado lisogenico el fago no se replica sino q su genoma
viral esta integrado en el cromosoma de la bacteria y se transmite
en forma de profago. los fagos pueden multipliarse en la celula
bacteriana hospedare de dos maneras distintas: mediante un ciclo
ltico, durante el cual el fago puede replicarse activamente y
termina lisando la celula o mediante u ciclo lisogenico, durante el
cual el genoma del fago se inserta en el cromosama bacteriano en
forma de profago.
Bibliografa
1. Litle JW. Auto-digestion of LexA and phage l repressors. Proc
Natl Acad Sci USA 1984;81:1375-9. 2. Peat TS, Frank EG, McDonald
JP, Levine AS, Woodgate R, Hendrickson WA. Structure of the UmuD'
protein and its regulation in response to DNA damage. Nature
1996;380:727-30.
3. Asad L MBO, Almeida CEB de, Silva AB de, Asad NR, Leitao AC.
Hydrogen peroxide induces the repair of UVdamaged DNA in
Escherichia coli: a lexA-independent but uvrA-and recA dependent
mechanism. Current Microbiol 1994;29:291-4.
4. Vericat JA, Guerrero R, Barbe J. Inhibition of the SOS
response of Escherichia coli by the Ada protein. J Bacteriol
1988;170(3):1354-9.
