laporan HPLC KA_dewi.docx

7/23/2019 laporan HPLC KA_dewi.docx

1/17

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS

Hight Performance Liquid Chromatograph

!HPLC"

A#i#ten $ %u &mi

'o(ongan)Ke(ompo* $ S ) &

Nama *e(ompo* $

A(+ertu# Kri#tian Si#,anto !-../01/0.2"

3,i Augu#nita !-../01/044"

5ran#i#ca 6unita 3,i 7u(andari !-../01//0."

Maria Krien#ia !-../01/18."

LA%ORATORIUM KIMIA ANALISIS

5AKULTAS 5ARMASI

UNI9&RSITAS KATOLIK 7I36A MAN3ALA SURA%A6A

-018


2/17

I: 3ASAR T&ORI

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair - cair yang dapat digunakan

baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan

teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam

kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar (hopkar, !""#$.Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap

komponen dalam sampel untuk selan%utnya diidentifikasi (kualitatif$ dan dihitung berapa

konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif$. Analisa kualitatif bertu%uan

untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analit dalam suatu sampel.

&edangkan analisa kuantitatif untuk mengetahui %umlah dan konsentrasi analit tersebut

dalam sampel (hopkar, !""#$.HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran

komponen (analit$. Prinsip ke%a HPLC adalah pemisahan setiap komponen dalam sampel

berdasarkan kepolarannya. 'ang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya

adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Contoh fasa diam

yang digunakan (pada kolom$ HPLC %enis fasa terbalik adalah P!), dimana adalah rantai

alkana C-!) atau C-). &ementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya

(gradien elusi$, hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran

analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan *aktu retensinya akan berbeda, hal ini

akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah (hopkar, !""#$.

omponen utama HPLC adalah +

eseroir pelarut + at pelarut yang dipakai polaritasnya dapat berariasi tergantung

dari senya*a yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bah*a tempat pelarut

tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada

dalam pelarut.

Pompa + digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase gerak dengan kecepatan

dan tekanan yang tetap.

n%ektor + saat sampel diin%eksikan ke dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak

mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. n%eksi dapat

menggunakan syringe.


3/17

olom kromatografi + kolom yang dipakai memiliki pan%ang !# / 01 cm dan diameter

2,1 / 1 mm yang diisi dengan fase stasioner berukuran 1-!# mikrometer dan terbuat

dari logam atau stainless steel.

3etektor + digunakan untuk mendeteksi sampel. 3etektor dibutuhkan untuk

mempunyai sensitiitas yang tinggi, linear untuk %angka konsentrasi tertentu dan

dapat mendekati eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi (Adnan,!""4$.

egunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan se%umlah senya*a organik, anorganik,

maupun senya*a biologis, penentuan molekul - molekul netral, ionic, maupun *itter ion, isolasi

dan pemurnian senya*a, pemisahan senya*a-senya*a yang strukturnya hampir sama, HPLC

merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif

maupun kuantitatif (Adnan,!""4$.

5at dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-

cair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan banyak digunakan dalam

industi farmasi dan pestisida. HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar

senya*a aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk - produk degradasi

dalam sediaan farmasi. eterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senya*a,

kecuali %ika HPLC dihubungkan dengan spektrometer massa (6&$. eterbatasan lainnya adalah

sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Adnan,!""4$.

Si#tem Pera(atan HPLC

nstrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas+ *adah fase gerak, pompa, alat untuk

memasukkan sampel (tempat in%eksi$, kolom, detektor, *adah penampung buangan fase gerak,

dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

3iagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini +


4/17

!. 7adah 8ase gerak dan 8ase gerak

7adah fase gerak harus bersih dan lembam (inert$. 7adah pelarut kosong ataupun

labu laboratorium dapat digunakan sebagai *adah fase gerak. 7adah ini biasanya dapat

menampung fase gerak antara ! sampai 0 liter pelarut. 8ase gerak atau eluen biasanya

terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan

dalam daya elusi dan resolusi. 3aya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas

keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. 9ntuk

fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak$, kemampuan elusi meningkat

dengan meningkatnya polaritas pelarut. &ementara untuk fase terbalik (fase diam kurang

polar daripada fase gerak$, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas

pelarut.

8ase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari

partikel-partikel kecil ini. &elain itu, adanya gas dalam fase gerak %uga harus dihilangkan,

sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor

sehingga akan mengacaukan analisis. :lusi dapat dilakukan dengan cara isokratik

(komposisi fase gerak tetap selama elusi$ atau dengan cara bergradien (komposisi fase

gerak berubah-ubah selama elusi$ yang analog dengan pemrograman suhu pada

kromatografi gas. :lusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran

yang kompleks terutama %ika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. 8ase gerak

yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran

larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. 9ntuk pemisahan

dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-

pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut

%enis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase

terbalik.

0. PompaPompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat

sebagaimana syarat *adah pelarut yakni+ pompa harus inert terhadap fase gerak. ;ahan

yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, ba%a tahan karat, Teflon, dan batu nilam.

Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 1### psi dan


5/17

mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir < mL=menit. 9ntuk tu%uan

preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan

kecepatan 0# mL=menit. Tu%uan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak

adalah untuk men%amin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,

reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 0 %enis pompa dalam HPLC yaitu+

pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe

pompa dengan aliran fase gerak yang konstan se%auh ini lebih umum dibandingkan

dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.


6/17

onsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya )#> atau lebih kecil dibanding

dengan kolom konensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase

gerak lebih lambat (!# -!## ?l=menit$.

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal

%ika digabung dengan spektrometer massa.

&ensitiitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya

%enis kolom ini sangat bermanfaat %ika %umlah sampel terbatas misal sampel klinis.

6eskipun demikian dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom

konensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. ebanyakan fase diam

pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimia*i, silika yang tidak

dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan diinil benen. Permukaan silika adalah

polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (&i-@H$.

&ilika dapat dimodifikasi secara kimia*i dengan menggunakan reagen-reagen seperti

klorosilan. eagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya

dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

@ktadesil silika (@3& atau C!)$ merupakan fase diam yang paling banyak

digunakan karena mampu memisahkan senya*a-senya*a dengan kepolaran yang rendah,

sedang, maupun tinggi. @ktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk

solut yang polar. &ilika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril$ lebih cocok sebagai

pengganti silika yang tidak dimodifikasi. &ilika yang tidak dimodifikasi akan

memberikan *aktu retensi yang berariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang

digunakan.

1. 3etektor HPLC

3etektor pada HPLC dikelompokkan men%adi 0 golongan yaitu+ detektor

uniersal (yang mampu mendeteksi at secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak

bersifat selektif$ seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa dan

golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan

selektif, seperti detektor 9B-Bis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

dealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut+


7/17

6empunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

6empunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar

yang sangat kecil.

&tabil dalam pengopersiannya.

6empunyai sel olume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaranpita.

&ignal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran

yang luas (kisaran dinamis linier$.

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

;eberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik

detektor seperti berikut +

3etektor &ensitifitas

(g=ml$

isaran

linier

arakteristik

Absorbansi Uv-vis

8otometer filter

&pektrofotometerspektrometerphoto-

diode array

1 !#-!#

1 !#-!#

D 0 !#-!#

!#2

!#1

!#1

&ensitiitas bagus, paling

sering digunakan, selektifterhadap gugus-gugus dan

struktur-struktur yang tidak

%enuh.

8luoresensi !#-!0 !#2 &ensitifitas sangat bagus,

selektif, Tidak peka terhadapperubahan suhu dan kecepatan

alir fase gerak.

ndeks bias 1 !#

-4

!#

2

Hampir bersifat uniersal akantetapi sensitiitasnya sedang.

&angat sensitif terhadap suhu,

dan tidak dapat digunakanpada elusi bergradien

Elektrokimia

onduktimetri

Amperometri

!#-)

!#-!0!#2

!#1Peka terhadap perubahan suhu

dan kecepatan alir fase gerak,

tidak dapat digunakan padaelusi bergradien. Hanya

mendeteksi solut-solut ionik.

&ensitifitas sangat bagus,selektif tetapi timbul masalah

dengan adanya kontaminasi

elektroda.

;&NIS HPLC


8/17

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (%ika fase diamnya lebih

polar dibanding dengan fase geraknya$ atau fase terbalik (%ika fase diamnya kurang non polar

dibanding dengan fase geraknya$. ;erdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC

dikelompokkan men%adi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. &elain klasifikasi di atas,

HPLC %uga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada

mekanisme sorpsi solut, dengan %enis-%enis HPLC sebagai berikut+

!. romatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi

kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya

menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina,

meskipun demikian sekitar "#> kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.

Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.

Eugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat

terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

0. romatografi fase terikatebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara

kimia*i atau fase terikat. &e%auh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah

hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau

dengan fenil. 8ase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (@3& atau

C!)$ dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. &ebagai fase gerak adalah

campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. 9ntuk solut yang

bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase

gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya

spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam men%adi lebih

lemah dibanding %ika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies

yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.


9/17

alkohol dan %uga pelarut organik. romatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi

puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.

enaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan

oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus

penukar ion pada resin.

2. romatografi Pasangan ion

romatografi pasangan ion %uga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-

sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.

&ampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berla*anan.

1. romatografi :ksklusi 9kuranromatografi ini disebut %uga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat

digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senya*a dengan berat molekul D 0###

dalton. 8ase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porussehingga solut dapat mele*ati porus (le*at diantara partikel$, atau berdifusi le*at fase

diam. 6olekul solut yang mempunyai ;6 yang %auh lebih besar, akan terelusi terlebih

dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul

yang %auh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan ;6 yang besar tidak mele*ati

porus, akan tetapi le*at diantara partikel fase diam. 3engan demikian, dalam pemisahan

dengan eksklusi ukuran ini tidak ter%adi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti

tipe kromatografi yang lain.

F. romatografi Afinitas

3alam kasus ini, pemisahan ter%adi karena interaksi-interaksi biokimia*i yang

sangat spesifik. 8ase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat

menyerap sampel %ika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu

pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi$.

romatografi %enis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enim$ dari campuran

yang sangat kompleks (iai, !""1$.

3&RI9ATISASI PA3A HPLC

3eriatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk

mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tu%uan utama penggunaan deriatisasi pada HPLC

adalah untuk+


10/17

!. 6eningkatkan deteksi

0. 6erubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak

kromatografi yang lebih baik

$ produk hasil deriatisasi harus stabil selama proses deriatisasi dan deteksi

serta sisa pereaksi untuk deriatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi (iai,

!""1$.

SI5AT %AHAN

!. Paracetamol = Asetaminofen

o C1?

o Pemerian

&erbuk hablur, putih, tidak berbau + rasa sedikit pahit

o elarutan

Larut dalam air mendidih dan dalam Ga@H !G mudah larut dalam etanol

0. ofeinum

o C14

o Pemerian

&erbuk putih atau bentuk %arum mengkilat putih, biasanya menggumpal tidak

berbau rasa pahit. Larutan bersifat netral terhadap kertas lakmus. ;entuk hidratnya

mekar di udara.


11/17

o elarutan

Agar sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar dalam

eter.

. 8ase gerak 6etanol + Air

11 + 21. 8ase gerak 6etanol + Air

21 + 11

II: ALAT %AHAN

Alat ;ahan

HPLC Paracetamol

Labu ukur 01 mL, 1 6l Coffein

Bekker glass 6ethanol for HPLC

;otol timbang 6ethanol for pa

Geraca analitik

Pipet olum

III: CARA K&R;A

Pembuatan paracetamol


12/17

Pembuatan campuran paracetamol dan coffein

Pipet paracetamol !01 l

ke dalam labu ukur 1 ml J coffein !01 l

ad kan

dengan methanol hingga tanda.

!. Pembuatan fase gerak;uat cammpuran methanol + air (21+11$

&aring dengan membrane filter

3egassing selama !1 menit

0. Pembuatan larutan u%iKLarutan standar paracetamol dalam methanol konsentrasi


13/17

B. HASIL P&N'AMATAN

Pembuatan fase gerak dan larutan yang dipakai dalam praktikum tidak dilakukan

praktikan karena bahan tersebut telah tersedia di laboratorium.

Hasil pengamatan pada perbandingan pelarut methanol + Air (21 + 11$

Tr A 0,40 cm 7a #,11 cm

Tr ; 2,## cm 7b #,2 cm

Tr 2,##-0,40 !,0) cm 7aJ7b #,"1

s

2.(Tr )

Wa+Wb

2X1,28

0,95

2,56

0,95

0,F

Hasil pengamatan pada perbandingan pelarut methanol + Air (F1 +


14/17

fasa diam dengan fasa geraknya. Teknik HPLC ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif

dan kualitatif. Analisis kuantitatif dapat dilihat dari pengukuran luas puncak=area dari analit

pada kromatogram yang dibandingkan dengan luas area standar dengan menggunakan kura

kalibrasi, pada percobaan kali ini digunakan dua deret larutan standar. Analisis kualitatif

dapat dilihat dari *aktu retensinya yang dibandingkan dengan standar.

Penggunaan %enis kromatografi fasa terbalik (reerse phase$ ini karena sampel yang

akan kita pisahkan bersifat polar, oleh karena itu dalam %enis kromatografi ini fasa gerak

yang digunakan memiliki sifat yang polar yaitu campuran antara air + methanol dengan

perbandingan 21+11 dan fasa diamnya bersifat nonpolar biasanya fasa diam yang memiliki

rantai alkil ) (C-)$ atau !) (C-!)$ dan dalam praktikum ini digunakan adalah oktadesilan

(@3&$ .

3alam melakukan analisis perlu diperhatikan setiap tahapnya agar kesalahan yang

ter%adi men%adi seminimal mungkin. &ampel u%i harus disaring dahulu dengan membran

PT8: agar tidak ter%adi penyumbatan dalam kolom dan menghilangkan udara atau gas dari

pelarutnya. arena %ika sampel masih ada gas yang terlarut dapat menyebabkan gangguan

pada sistem pengatur gradient dari eluennya.

3i dalam kolom HPLC komponen-komponen dipisahkan berdasarkan perbedaan

kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. &olut yang berinteraksi kurang kuat maka

akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut yang lebih kuat interaksinya. Prinsipnya

%uga dapat dikatakan sama dengan proses LT yakni like dissolve like, dimana senya*a

yang lebih polar akan keluar lebih dahulu keluar kolom karena mengikuti fase gerak yang

bersifat polar %uga. omponen tersebut selan%utnya keluar dari kolom dengan kecepatan

yang berbeda dan apabila puncak keluar saling berdekatan sehingga sulit untuk dibedakan

mana puncak parasetamol dan coffein maka fase gerak harus dibuat lebih polar.

Pengin%ekan pertama adalah campuran parasetamol-coffein dengan fase gerak air +

methanol (21+11$. ead out dari hasil analisis dengan HPLC adalah suatu kromatogram.

romatogram adalah grafik yang menghubungkan antara intensitas komponen yang diba*a

oleh fasa gerak terhadap *aktu retensi. ;anyaknya puncak menun%ukkan %umlah komponen,

sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi. 3ari hasil pengin%ekan pertama terlihat dua

peak yang muncul pada kromatogram dan diantara dua puncak tersebut terlihat %uga ada

puncak kecil yang nampak. 3ari hasil ini belum dipastikan secara %elas peak yang keluar


15/17

lebih dahulu merupakan peak dari paracetamol atau coffein. @leh karena itu, praktikan

melakukan pengin%ekan larutan standar paracetamol ke dalam kolom dengan kondisi fase

gerak yang sama. 3ari hasil kromatogram terlihat bah*apeakyang muncul memiliki *aktu

retensi 0,4). 7aktu retensi tersebut merupakan %angka *aktu yang terukur saat sampel

mele*ati kolom HPLC. Hasil tersebut memiliki kesamaan dengan kromatogram pertama

pada peak pertama. Hal ini menun%ukan bah*a peak yang yang muncul pertama pada

pengin%ekan campuran pertama adalah paracetamol. 3ari hasil tersebut %uga menun%ukan

bah*a memang benar paracetamol lebih polar dari coffein. Pada hasil kromatogram %uga

terlihat peak kecil yang sama seperti peak yang muncul di antara kedua peak pada

kromatogram campuran pertama tadi. 3ata tersebut menun%ukan bah*a peakkecil tersebut

hanya merupakan pengotor dan pengotor tersebut berasal dari sampel paracetamol. &etelah

pengin%ekan larutan standar parasetamol, praktikan tidak melakukan pengin%ekan larutan

standar coffein karena hanya terdapat dua peak pada kromatogram campuran dan sudah

dapat disimpulkan bah*apeakyang muncul terakhir adalah coffein.

3ari data kromtogram sampel didapatkan puncak dari kafein lebih kecil dari pada

puncak paracetamol karena kadar dari kafein dalam sampel lebih sedikit. 3ari data

kromatogram tersebut %uga menun%ukan bah*a pemisahan antara paracetamol dan coffein

terlihat sempit. Hal tersebut dapat terlihat %elas dari gambar yang ditun%ukan dan dari rasio

*aktu retensi yang sempit. @leh karena itu, praktikan mengubah fase gerak men%adi lebih

polar yakni air+ methanol (11+21$. &etelah sampel diukur, didapat kromatogram dari sampel.

3ari data kromatogram terlihat bah*a gambar pemisahan terlihat %elas dengan perbedaan

*aktu retensi kedua senya*a tersebut adalah !,0). 3an puncaknya semakin bergeser ke

kanan. 3ari kromatogram tersebut diperoleh harga s yakni 0,F. 3ibandingkan dengan

kromatogram campuran pertama didapat perbedaan *aktu retensi kedua senya*a adalah

#,)0 dan harga s adalah !,)0.

Pada dua fase gerak yang berbeda ini terlihat spektrum parasetamol dan coffein yang

berbeda, dapat terlihat mana pemisahan yang lebih baik antara campuran air + methanol

(21+11$ dan air + methanol (11+21$. Pan%ang gelombang yang digunakan adalah pan%ang

gelombang terpilih, bukan pan%ang gelombang maksimum. Pada praktikum ini pan%ang

gelombang yan g digunakan adalah 0F# nm. Pan%ang gelombang maksimum adalah pan%ang

gelombang tertinggi dari parasetamol maupun coffein, tetapi bila digunakan pan%ang


16/17

gelombang tersebut ada kemungkinan spektrum salah satu (parasetamol atau coffein$ tidak

nampak. &ehingga digunakan pan%ang gelombang terpilih, pan%ang gelobang ini tidak harus

maksimalnya dari pan%ang gelombang sampel. Pan%ang gelombang dipilih supaya kedua

sampel spektrumnya dapat teramati. s yang baik adalah M!,1. s yang didapat pada

percobaan sudah sesuai dengan harga s yang baik sehingga pemisahan dapat dikatakan

baik.

7aktu keluarnya spectrum pada campuran air + methanol (21+11$ adalah parasetamol

pada menit ->->coffein pada menit />0 &edangkan pada air + methanol (11+21$ parasetamol

keluar pada menit ke ->8>coffein keluar pada menit />.:Pemisahan lebih baik ter%adi pada

campuran air + methanol (11+21$ karena kura tidak berhimpitan, pada campuran air +

methanol (21+11$ kura berhimpitan. 9ntuk mendapatkan pemisahan yang baik adalah

dengan meningkatkan kepolaran fase gerak dimana dalam praktikum ini yang ditambahkan

olume fase geraknya adalah air. .

9I: K&SIMPULAN

Pada percobaan menggunakan instrument HPLC didapatkan puncak parasetamol

lebih besar dibandingkan dengan coffein. Pemisahan paracetamol dan coffein yang paling

bagus adalah pada perbandingan konsentrasi methanol + air (11+21$ dengan harga s 0,F.

9ntuk mendapatkan pemisahan yang baik maka diubah kondisi fase gerak ke arah polar

apabila pemisahan terlalu sempit (s kecil$.

9II: 3A5TAR PUSTAKA

Adnan, 6. !""4. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Andi @ffset+

'ogyakarta.

hopkar, &.6., !""#.Konsep Dasar Kimia Analitik. 9niersitas ndonesia + Nakarta.

iai, H. !""1.Asas Pemeriksaan Kimia. Penerbit 9 + Nakarta.


17/17

9III: Lampiran:

Documents

laporan HPLC KA_dewi.docx