UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA

E.A.P. DE ZOOTECNIA

UNIV

ERSI

DAD

NAC

IONA

L DE H

UANCAVELICA - FACULTAD DE CIENCIAS D E IN

GENIERIA

ESTABLECIMIENTO DE LINEAS CELULARES SOMATICAS Y FETALES EN ALPACAS Vicugna pacos

Ing. LEANDRA LANDEO JURADO

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA

INTRODUCCIÓN

Permiten estudiar y caracterizar los procesos de desarrollo celular.

Criopreservar material genético de especies en peligro de extinciónproducción de embriones transgénicos.

producción de células donantes para Transferencia Nuclear.

LIMITANTES DE LA TRANSFERENCIA NUCLEAR

•Uso células en cultivo primario

•Uso de células inestables

•Desconocimiento del comportamiento celular /pasaje

•Desconocimiento del tipo celular

ESTABLECIMIENTO DE LINEAS CELULARES

MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL LA OBTENCION DE CULTIVOS PRIMARIOS

MATERIALES UTILIZADOS EN EL LA OBTENCION DE LINEAS CELULARES

ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS FETALES

Feto de 130 días de gestación Obtención de muestras Obtención de explante

Transferir los explantes Cultivo celularEstufa de cultivo celular5 % CO2

ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS SOMATICAS

OBTENCIÓN DE MUESTRA TRANSPORTE DE MUESTRA

CULTIVO POR EXPLANTE OBTENCION DE FIBROBLASTOS5% DE CO2

Evaluación de confluencia celular

Tripsinizacion de células confluentes

ESTABLECIMIENTO DE LINEAS CELULARES SOMATICAS Y FETALES DE ALPACAS

células confluentesPrimer pasaje celular

Evaluación de confluencia celular

Cultivo celular por 74 horas5% CO2

DP=Log (n/no) x 3.33

MEDIO DE CRIOPRESERVACIÓN

10% Dimetil sulfóxido (DMSO)

10% Suero Fetal Bovino (FCS)

10% Sultafo de Gentamicina

70% DMEM

18h a -20° C

DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD POST-DESCONGELACIÓN

% células viables = células viables (sin colorear) X 100 células viables+ células muertas (coloreadas)

50 ul de solución celular

50 ul de trypan azul

Baño Maria 37 ° C10-15 Minutos

%CV= 70 X 100 70+ 40CV=63.6

En el presente trabajo de investigación se evaluaron el % de confluencia, “Doubling de la población” (DP) y la Viabilidad de células post descongelación.

DISTRIBUCIÓN DEL EXPERIMENTO

Yij = μ + Ti + eij

Los componentes del modelo son:

Yij = observaciones (% viabilidad post-descongelación).μ = media general.Ti = efecto del los tratamientos (células somáticas y fetales)eij = error asociado a cada observación.

Las diferencias estadísticas de los experimentos de viabilidad post-descongelación fueron comparados utilizando análisis de varianza (ANVA) después de la transformación arcsen de los datos. Se utilizaron la prueba de Duncan para contrastar la diferencia entre promedios.

ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS A PARTIR DE CÉLULAS FETALES

- Feto macho de alpaca

-Cultivo celular a los 4 días de haber establecido el cultivo.

-70 % de adherencia celular.

-Células confluentes a los 7 días de haber establecido el cultivo celular.

-100% de confluencia celular

RESULTADOS:

OBTENCION DE LINEAS CELULARES A PARTIR DE CÉLULAS FETALES

Confluencia a los 3 días de haber establecido el cultivo celular.

CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21

N° Pasajes

Célu

las/

ml

Serie1

Figura 3a: Curva de crecimiento de líneas celulares fetales de alpacas.

COMPORTAMIENTO DEL CRECIMIENTO CELULAR

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21

N° Pasajes

Célu

las/

ml

Serie1

Figura 3b: Barras comparativas de división celular en cada pasaje celular de células fetales de alpacas

ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS PRIMARIOS A PARTIR DE CÉLULAS SOMATICAS DE ALPACA ADULTA

-Alpaca macho de 2 años de edad.

-Cultivo celular a los 7 días de haber establecido el cultivo.

-100 % de adherencia celular.

- Células confluentes a los 14 días de haber establecido el cultivo celular.

- 100% de confluencia celular

OBTENCION DE LINEAS CELULARES

CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR DE CELULAS SOMATICAS

0100000200000300000400000500000600000700000800000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

N° Pasajes

N° C

élul

as/m

l

Serie1

Figura 5a: Comportamiento de la curva de crecimiento de líneas celulares somáticas.

COMPORTAMIENTO DEL CRECIMIENTO CELULAR EN CELULAS SOMATICAS

0100000200000300000400000500000600000700000800000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

N° pasajes

N° C

élul

as/m

l

Serie1

Figura 5b: Barras comparativas de división celular en cada pasaje celular de células somáticas

DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE CONFLUENCIA CELULAR DE CELULAS ADULTAS Y FETALES

Cuadro 2. Porcentaje de confluencia de células somáticas y fetales

TIPO DE TEJIDO

Confluencia% Días

Células Fetales 100 7

Células somáticas 100 14

Líneas fetales 100 3

Líneas somáticas 100 3

COMPORTAMIENTO DE CONFLUENCIA (100%)

02468

10121416

CP. CélulasFetales

CP. Célulassomáticas

Líneas fetales Líneassomáticas

TIPO CELULARTI

EMPO

(DIA

S)

Días

Figura 6. Comportamiento de confluencia en cultivos primarios y líneas celulares de células somáticas y fetales.

DETERMINACION DEL “DOUBLING” DE LA POBLACION (PD)

Cuadro 3 “Doubling” de la población celular de líneas celulares procedentes de células fetales y somáticas

TIPO DE TEJIDO DP (Promedio) N° pasaje Celular

Líneas Fetales 0.41 9

Líneas somáticas 0.16 5

VIABILIDAD POST DESCONGELACION DE LINEAS CELULARES PROCEDENTES DE FETO Y CELULAS ADULTAS

Cuadro 4. Promedio y desviación estándar el porcentaje de viabilidad post descongelación

TIPO DE TEJIDO Viabilidad (promedio) % Desviación estándar

Líneas Fetales 95.1 ±3.47

Líneas somáticas 96.5 ± 3.32

CONCLUSIONES

 1.Fue posible establecer líneas celulares de alpacas como base para ensayo de Transferencia Nuclear y Transgénesis. 

2.Se obtuvo cultivos primarios de células somáticas y fetales en alpacas a partir de muestras de piel.

3.El % de confluencia de células somáticas fue de 100% a los 14 días de haber establecido el cultivo primario, de igual manera se determinó que las células fetales de alpacas logran 100% de confluencia a los 7 días de establecido el cultivo primario.

4.Se determinó la tasa de división de la población de líneas de fibroblastos procedentes de células adultas con un promedio de 0.16 DP y 0.41 DP para las líneas de fibroblastos fetales.

5.Se evaluó el % de viabilidad post descongelación de líneas de fibroblastos procedentes de células adultas con un promedio de 96.5 y 95.1 de viabilidad post-descongelación para las líneas de fibroblastos fetales. No encontrando diferencias significativas entre las líneas de fibroblastos fetales y somáticas.