LuanVan PhuongHa Langnhachkiem Net

GVHD:PGS.TS Nguyễn Đức Lượng Chương II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: Nguyễn Thị Phương Hà 3

Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ Sinh học - ĐH Mở TPHCM - 2009:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Chương I

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khi nhu cầu sống của con người ngày càng được cải thiện thì nhu cầu

ăn uống cũng ngày càng cao, không những về số lượng mà cả về chất

lượng, không những ăn no mà phải ăn ngon. Vì vậy việc có những sản

phẩm thực phẩm vừa đáp ứng được thị hiếu, vừa đáp ứng dinh dưỡng và

độ an toàn về các mối nguy đem đến từ vi sinh vật là vấn đề cần thiết.

Trong những năm gần đây với xu thế đổi mới và hội nhập, nền kinh tế

nước ta ngày càng phát triển, thu nhập quốc dân ngày càng tăng cao. Góp

phần làm nên đều này là ngành công nghiệp thực phẩm, trong đó quan

trọng là lĩnh vực rượu bia - nước giải khát. Đặc biệt không thể không nhắc

đến là ngành công nghiệp sản xuất bia .

Bia là loại nước uống có độ cồn thấp được sản xuất bằng quá trình lên men

đường trong môi trường lỏng và nó không được chưng cất sau khi lên men. Đặc

trưng của bia là hương và vị đắng của hoa houblon, bọt mịn xốp. Ngoài khả

năng giải khát, nó còn giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều vitamin( chủ yếu là

vitamin nhóm B như B1, B2, PP…) và cung cấp một lượng lớn năng lượng cho

cơ thể, đặc biệt lượng CO2 hòa tan trong bia có tác dụng giải nhiệt nhanh, hỗ trợ

tiêu hóa. Nhờ những ưu điểm này bia đã được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các

nước trên thế giới với sản lượng ngày một tăng.

Ở nước ta ngày nay, sản phẩm bia không chỉ phong phú về nhãn hiệu

như SaiGon, Heneiken, Zorok, Tiger… mà còn đa dạng về chủng loại như

bia tươi, bia hơi, bia ly… nhìn chung dù ở hình thức hay chủng loại nào thì

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Softwarehttp://www.foxitsoftware.com For evaluation only.



mỗi loại bia đều gây nên sự chú ý khác nhau đối với người thưởng thức.

Tuy đã hội nhập nhưng Đất nước ta vẫn còn là nước đang phát triển do đó

tầng lớp công nhân, nhân viên và các tầng lớp trung bình vẫn chiếm đại đa

số dân cư vì vậy mà các nhãn hiệu bia chai, bia tươi sản xuất trong nước

vẫn có điều kiện đứng vững và ngày càng khẳng định vị thế. Ngoài tác dụng

góp vui mang lại sự thoải mái, sảng khoái cho người sử dụng thì đây còn là

dòng sản phẩm có giá cả rất hợp lý, phải chăng với người lao động cũng

như tầng lớp công nhân.

Trước tình hình các sản phẩm thực phẩm bị ảnh hưởng của vấn đề vệ

sinh an toàn thực phẩm, người tiêu dùng có tâm lý lo ngại khi sử dụng các

sản phẩm được sản suất trong nước thì sản phẩm bia tươi cũng không

tránh khỏi sự ngờ vực này.

Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng nhiễm vi

sinh vật ở các sản phẩm bia tươi” trong phạm vi bài báo cáo này chúng

tôi sẽ tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh như tổng số vi khuẩn hiếu khí ,

xác định sự nhiễm Coliform và Escherichia coli của các sản phẩm bia tươi

đang có mặt trên thị trường thành phố như C, B, D, A… nhằm mục đích

khảo sát độ an toàn của từng sản phẩm và đưa ra nhận xét tổng quan về

khả năng vệ sinh an toàn đối với các sản phẩm bia tươi trên thị trường

thành phố ngày nay.




Chương II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. BIA VÀ CÁC SẢN PHẨM BIA.

1.1 Khái niệm bia:

Bia là một loại nước uống chứa cồn được sản xuất bằng quá trình lên men của

đường trong môi trường lỏng và nó không được chưng cất sau khi lên men. Nói

một cách khác, bia là loại nước giải khát có độ cồn thấp, bọt mịn xốp và có hương

vị đặc trưng của hoa houblon. Đặc biệt CO2 hòa tan trong bia có tác dụng giải nhiệt

nhanh, hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa. Ngoài ra trong bia còn chứa một lượng

vitamin khá phong phú (chủ yếu là vitamin nhóm B như vitamin B1, B2, PP…).

Nhờ những ưu điểm này, bia được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế

giới với sản lượng ngày càng tăng. Đối với nước ta, bia đã trở thành loại đồ

uống quen thuộc với sản lượng ngày càng tăng và đã trở thành ngành công

nghiệp mũi nhọn trong ngành công nghiệp nước ta.

Quá trình sản xuất bia được gọi là nấu bia. Do các thành phần sử dụng để

sản xuất bia có khác biệt tùy theo từng khu vực, các đặc trưng của bia như

hương vị và màu sắc cũng thay đổi rất khác nhau. [16]

1.2. Lịch sử phát triển ngành sản xuất bia:

Sản xuất bia là một ngành công nghiệp thực phẩm có bước phát triển nhanh

chóng mặc dù trải qua nhiều thăng trầm của thời gian, công nghệ - kĩ thuật và nhận

thức của cộng đồng. Xét về nguồn gốc, bia có xuất xứ từ các sản phẩm Nông

nghiệp. Các chứng cứ cho thấy rằng bia được pha chế tại xung quanh vùng Lưỡng

Hà khoảng 6000 đến 7000 năm trước. Người Ai Cập cổ đại đó ủ rượu, bia bằng các




loại ngũ cốc của họ (lúa miến), việc này cũng được thưc hiện trong những bộ lạc

người châu Phi.. Từ thế kỷ thứ 10 trong giai đoạn này việc sử dụng thảo dược rất

phổ biến và người Đức đó sử dụng Houblon trong sản xuất bia sau đó Houblon

được phổ biến toàn Châu âu. Ban đầu việc sử dụng Houblon bị chống đối kịch liệt

nhưng những lợi ích mà Houblon mang lại cho sản phẩm bia như hương thơm và

nhất là khả năng kháng khuẩn của chúng đã làm cho chúng dần dần được chấp nhận

rộng rãi. Đến khoảng thế kỉ 17 những loại bia không sử dụng Houblon hoàn toàn

biến mất thế vào đó là sự đa dạng của các sản phẩm bia, tùy thuộc vào vùng nguyên

liệu và điều kiện khí hậu mà cho ra những loại bia có nét đặc trưng riêng. Nguyên

liệu chủ yếu để sản xuất bia là lúa đại mạch tuy nhiên cũng có thế thay thế bởi

nguyên liệu khác như yến mạch, lúa mì, gạo…Trong thời gian này việc đánh thuế

của một số địa phương trên sản phẩm bia là rất cao và bia chỉ được bán trong những

quán rượu. Năm 1516 một đạo luật ra đời tại Reinheitsgebot nhằm bảo hộ cho sản

phẩm bia của Đức có tên “Luật độ thuần khiết của sản phẩm bia Đức”, các chỉ tiêu

về Đại mạch, Houblon và nước để sản xuất bia được nêu ra cụ thể. Nấm men cũng

được đưa vào danh sách khi chúng có nguồn gốc rõ ràng (định danh).

Đến thế kỉ 18 thì có những chuyển biến lớn trong ngành sản xuất bia với sự

phát triển của ngành sinh hóa và vi trùng học. Trong thời gian này bia thường được

chứa nhiều tháng trong những thùng lớn trước khi đem đi tiêu thụ. Đây là biện pháp

kéo dài thời gian ủ chín (lên men phụ) nhằm khắc phục nhược điểm của việc lên

men bằng chủng nấm men Brettanomyces là chủng tạo ra acid béo và ester ethyl với

mức độ cao vượt ngưỡng cho phép gấp 10 lần mặc dù nồng độ cồn do chủng này

tạo ra cao hơn so với các chủng khác. Bên cạnh đó việc áp dụng cơ giới hóa vào sản

xuất đó không ngừng nâng cao sản lượng bia sản xuất lên rất nhiều.

Tổng sản lượng bia toàn thế giới năm 1910 là 100 triệu hl, đến năm 1995 là

1190 triệu hl và đến năm 2003 đạt 1444 triệu hl. Nhìn chung sản lượng bia trên thế

giới tăng trưởng nhanh nhưng lại phân bố không đều giữa các châu lục, tập trung ở

Châu Âu và Châu Mỹ. Bên cạnh đó sản lượng bia ở những khu vực khác trong

những năm gần đây cũng tăng trưởng khá nhanh, đặc biệt là các nước Châu Á, đó

đứng thứ 3 trên thế giới sau Châu Âu và Châu Mỹ. Hiện nay ở Châu Á, Trung




Hình 2.1: Mức tiêu thụ bình quân đầu người qua các năm

Quốc là nước thị trường rộng lớn nhất và là thị trường đang phát triển mạnh nhất,

tiếp theo là Nhật Bản nhưng ở mức độ vừa phải từ những năm 1990 trở lại đây.

Ở Việt Nam, ngành công nghiệp sản xuất bia có lịch sử hơn 100 năm.

Xưởng sản xuất bia đầu tiên được đặt tên là xưởng sản xuất bia Chợ Lớn, do

một người Pháp tên là Victor Larue mở vào năm 1875, là tiền thân của nhà

máy bia Sài Gòn, nay là Tổng công ty Bia Rượu Nước giải khát Sài Gòn. Ở

miền Bắc, vào năm 1889, một người Pháp tên là Hommel đó mở xưởng bia ở

Làng Đại Yên, Ngọc Hà, sau trở thành nhà máy bia Hà Nội, nay là Tổng công

ty Bia Rượu Nước giải khát Hà Nội. Trong quá trình hình thành và phát triển,

ngành sản xuất bia đó đạt mức tăng trưởng cao vào những năm của thời kỳ mở

cửa. Cùng với quá trình hội nhập, ngành sản xuất bia phát triển về quy mô và

trình độ công nghệ, trở thành một ngành công nghiệp có thế mạnh khi Việt Nam

gia nhập tổ chức WTO.

Việc đầu tư xây dựng các nhà máy bia được triển khai mạnh mẽ từ những

năm 1990 trở lại đây. Số các nhà máy bia là 469 vào năm 1998 với các quy

mô khác nhau từ 100.000 lít/năm đến 100 triệu lít/năm. Mức tiêu thụ bình

quân đầu người tăng lên nhanh chóng trong vòng 10 năm qua từ mức dưới 10

lít/người năm vào năm 1997 đó đạt mức 18 lít/người.năm vào năm 2006.

Theo số liệu thống kê của Bộ Công nghiệp (nay là Bộ Công Thương) tổng

sản lượng bia của Việt Nam qua 5 năm gần đây thể hiện trong hình 1 .2. Mặc

dù, đến năm 2005 số cơ sở sản xuất chỉ còn 329, nhưng quy mô của các doanh

nghiệp đó tăng lên. Số liệu thống kê cho thấy trong ngành sản xuất bia có 3




Hình 2.2 : Sản lượng bia cả nước qua các năm

doanh nghiệp có sản lượng trên 100 triệu lít/năm là Sabeco (năng lực sản xuất trên

300 triệu lít/năm), Habeco (trên 200 triệu lít/năm) và công ty liên doanh nhà máy

bia Việt Nam (trên 100 triệu lít/năm). Có 15 doanh nghiệp bia có công suất lớn

hơn 15 triệu lít và 19 doanh nghiệp có sản lượng sản xuất thực tế trên 20 triệu

lít. Khoảng 268 cơ sở còn lại có năng lực sản xuất trên dưới 1 triệu lít/năm.

Theo lộ trình phát triển dự kiến đến năm 2010 cả nước sẽ sản xuất

khoảng 2,5 – 3 tỷ lít bia và mức tiêu thụ bình quân đầu người khoảng 28-30

lít/người/năm. Với tốc độ phát triển nhanh hiện nay, nhiều nhà máy bia mô lớn

đang được đầu tư và cũng kéo theo nhiều vấn đề quan trọng về sử dụng nguồn

nguyên liệu, khoa học kĩ thuật và các phuơng pháp di truyền, lai tạo giống nấm

men cho hiệu quả sản xuất cao và chất lượng bia tốt hơn.[2]

1.3. Tính chất chung của bia

Bia thông thường có những thành phần cơ bản sau đây

1.3.1 Chất hòa tan (chất trích ly)

Chiếm 3,5 ÷ 5,0% trọng lượng bia.

Chất hòa tan (chất trích ly) trong bia tuy chiếm một hàm lượng không lớn,

song do sự phong phú về thành phần hóa học mà có tính chất quyết định đến chất

lượng của bia. Cụ thể trong chất hòa tan (chất trích ly) của bia sẽ gồm có:




1.3.1.1 Hydrat cacbon : Chiếm 80 ÷ 85% chất hòa tan trong bia. Trong số

này, riêng maltose và maltotriose chiếm khoảng 60 ÷ 70%, còn lại là các đường

khác như glucose, saccarose, pentose, arabinose, xylose,…

1.3.1.2 Protein : Chiếm 6 ÷ 9% chất hòa tan trong bia (khoảng 700 mg/l các

chất chứa Nitơ). Trong đó:

- 140 mg/l protein có phân tử lượng cao.

- 120 mg/l protein có phân tử lượng trung bình.

- 440 mg/l protein có phân tử lượng thấp.

1.3.1.3 Glyceryl :

Chiếm 3 ÷ 5%, là sản phẩm phụ hình thành khi lên men (khoảng 1200 ÷ 1600

mg/l).

1.3.1.4 Các chất tro:

Chiếm 3 ÷ 4% trọng lượng chất hòa tan, tức khoảng 1,4 ÷ 1,8g/l. Trong đó

30% là photphat, còn lại là clorit, silicat, các cation như K+, Na+, Ca+, Mg2+,…

1.3.1.5 Các chất đắng – tanin (chát) – màu:

- Hàm lượng chất đắng (đơn vị EBC): Khoảng 15 ÷ 20 mg/l theo izo – α –

acid và α - acid đắng.

- Khoảng 150 mg/l tanin. Trong đó 2/3 từ malt; 1/3 từ hoa houblon.

- Hàm lượng các chất màu:

+ 50 ÷ 70 mg/l antocyanuagen.

+ 10 ÷ 12 mg/l catechine.

+ 10 ÷ 40 mg/l tannoide.

1.3.1.6 Các acid hữu cơ:

Chiếm 0,7 ÷ 1,0% trọng lượng chất hòa tan của bia tức khoảng 300 ÷ 400

mg/l, trong đó:

+ 50 ÷ 70 mg/l pyruvat.

+ 170 ÷ 220 mg/l citrate

+ 30 ÷ 110 mg/l malat.

+ 30 ÷ 100 D - và L - lactate.

1.3.1.7 Các vitamin:




Tuy hàm lượng rất nhỏ song cũng khá đa dạng: B1, B2, B6, biotin, nocotinamit,

acid pantotenoic.

Với các sản phẩm bia, vị có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng. Vị tùy thuộc

vào các nguyên liệu đầu vào như: malt, hoa houblon, nước, nấm men và các quá

trình công nghệ tạo nên malt và bia. Yếu tố O2 gây ảnh hưởng mạnh nhất lên tính

ổn định của vị bia. Các quá trình oxy hóa sẽ làm ảnh hưởng tới các tính chất sau: độ

ổn định hóa - lý, sự nhạy cảm với nhiệt độ, màu sắc, vị đắng, độ ổn định của vị, thời

gian sử dụng. Giới hạn gây hại của O2 đối với bia như sau:

§ < 0,6 mg O2/l: Đối với các loại bia nhạy cảm.

§ ≥ 1,0 mg O2/l: Bắt đầu gây hại ở nhiệt độ cao.

§ ≥ 2,0 mg O2/l: Gây hại rõ ràng trong thời gian ngắn.

1.3.2 Các chất dễ bay hơi

- Etanol: 3,4 ÷ 4,5% trọng lượng bia.

- Acid carbonic: 0,35 ÷ 0,55% trọng lượng bia.

- Nước: 90 ÷ 92% trọng lượng bia.[1][5][6]

1.4. Vai trò của bia:

Bia là một loại thức uống mát, bổ với vị đắng dễ chịu và hương thơm đặc

trưng, độ cồn thấp. Với bia, khi sử dụng đúng mức sẽ mang đến cho con người sự

sảng khoái, dễ chịu và tăng sức đề kháng cho cơ thể.

Hàm lượng nước: có thể chiếm 90% trong bia, với hàm lượng nước nâng cao,

bia sẽ giúp giải khát tốt cho người sử dụng, khi uống vào CO2 trong bia sẽ thoát ra

cho ta cảm giác mát lạnh ở lưỡi.

Chất khoáng: trong bia có khoảng hơn 30 loại chất khoáng mà chủ yếu được

trích ly từ malt như: Mg, P, K…Ngoài ra bia còn chứa một lượng thấp của Na và Ca

giúp giảm nhanh cơn khát.

Vitamin: bia chứa hầu hết các vitamin nhóm B (B2, B6, PP), một ít nhóm A, D

và E, các vitamin kể trên là cần thiết đối với con người.

Polyphenol: có khoảng 150mg/l bia. Nó giúp chống lại các nguy cơ về bệnh

tim mạch và ung thư.




Bia đen porter Zywiec Bia vàng Hoavener

Hình2.3 : Bia Lager

Cacbon dioxit (CO2): ngoài việc làm cho bia có cảm giác thơm ngon, nó còn

làm tăng khả năng bài tiết nước tiểu, tăng khả năng tiêu hóa của cơ thể.

Năng lượng: 1 lít bia khi uống sẽ cung cấp cho con người một lượng từ 500 –

600 calori.[1][5][6]

1.5 Phân loại bia:

1.5.1 Phân loại theo tính chất

Có nhiều loại bia khác nhau, mỗi loại bia được coi là thuộc về một kiểu bia cụ

thể nào đó. Yếu tố chính để xác định loại bia là men bia sử dụng trong quá trình lên

men. Phần lớn kiểu bia thuộc về một trong hai họ lớn: ale- sử dụng lên men nồi

hoặc lager- sử dụng lên men chìm. Bia có đặc trưng pha trộn của cả ale va lager

được coi là bia lai. Đồ uống chứa cồn sản xuất từ việc lên men đường thu được từ

các nguồn không phải là ngũ cốc, nói chung không được gọi là “bia”, mặc dù chúng

cũng được sản xuất bằng cùng một phản ứng sinh học gốc men bia. Mật ong lên

men được gọi la rượu mật ong, nước táo lên men được gọi là rượu táo, nước lê lên

men được gọi là rượu lê, còn nước nho lên men được gọi là rượu vang.

Ale: Ale là bất kỳ loại bia nào được sản xuất bằng lên men nổi, và nó thông

thường được lên men ở nhiệt độ cao hơn so với bia lager (15-230C). Các men bia

ale ở nhiệt độ này tạo ra một lượng đáng kể ester, các hương liệu thứ cấp và các sản

phẩm tạo mùi khác, và kết quả là bia tạo ra có mùi vị của hoa hay quả tương tự. Các

khác biệt về kiểu giữa các loại ale là nhiều hơn so với các loại lager, và nhiều loại

bia ale rất khó để phân loại chúng.[15]

Lager: Lager là loại bia được

tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới.

Chúng có nguồn gốc từ vùng Trung

Âu. Men bia lager là loại lên men

chìm, thông thường được lên men ở

nhiệt độ 7-120C (45-550F), và sau đó

được lên men thứ cấp lâu ở 0-40C

(30-400F). Trong giai đoạn lên men thứ cấp, lager được làm trong và chín. Các điều




kiện lạnh cũng kiềm chế việc sản xuất tự nhiên các ester và các phụ phẩm khác, tạo

hương vị “khô và lạnh hơn” của bia.[15]

Loại bia hỗn hợp: Kiểu bia lai hay bia hỗn hợp sử dụng các nguyên liệu và

công nghệ hiện đại hoặc bổ sung càc khía cạnh truyền thống của sản xuất bia. Mặc

dù có một số biến thái giữa các nguồn khác nhau, nhưng nói chung bia hỗn hợp có

thể là:

• Bia rau quả là hỗn hợp với một số loại phụ gia từ hoa quả có thể lên

men trong quá trình lên men, tạo ra chất lượng hài hòa một cách rõ nét.

• Bia thảo mộc và bia gia vị bổ sung các chất chiết ra từ rễ, hạt, lá, hoa

hay quả thảo mộc hoặc các loại cây gia vị thay vì bổ sung hoa bia.

• Các loại bia tồn trữ trong các thùng gỗ là các loại bia truyền thống hay

thực nghiệm đưởc lưu trữ trong các thùng gỗ hoặc được tiếp xúc với gỗ

trong một khoảng thời gian. Thông thường, thùng gỗ hay các miếng gô

đầu tiên được xử lý bằng một số loại rượu mạnh hay các đồ uống chứa

cồn.

• Bia hun khói là bất kỳ loại bia nào mà mạch nha của nó đã được hun

khói. Thông thường các loại bia này có mùi và hương vị của khói. Điển

hình của kiểu bia truyền thống này là bia Rauchbiers.

• Bia đặc biệt là cách gọi chung để chỉ các loại bia được sản xuất mà sử

dụng các nguồn đường, hạt ngũ cốc và tinh bột có thể lên men không

thông dụng.[15]

1.5.2 Phân loại theo hình thức

Trên thị trường có 3 loại bia chủ yếu: Bia tươi, bia chai/lon, bia hơi.

• Bia tươi: là sản phẩm lên men có bão hòa CO2 tự nhiên, bia tươi có qua

quá trình thanh trùng nhưng ở nhiệt độ thấp hơn so với nhiệt độ thanh

trùng và thời gian ngắn hơn so với bia chai/lon. Bia tươi có màu sắc,

hương vị nguyên thủy của sản phẩm sau lên men. Bia tươi không bảo

quản được lâu.




• Bia chai/lon: là bia có qua quá trình thanh trùng ở nhiệt độ cao và thời

gian dài, chất lượng bia tương đối do có sử dụng thế liệu nhưng không

nhiều (70% malt, 30% gạo). Bia chai/lon bảo quản được lâu.

• Bia hơi: là bia không qua quá trình thanh trùng, chất lượng bia thấp hơn

so với bia tươi và chai/lon, do sử dụng nhiều thế liệu và lượng CO2 phải

nạp từ bên ngoài vào.

2. PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN BIA.

2.1 Làm trong bia:

Trong quá trình lên men phụ và tàng trữ, bia đã được lam trong một cách tự

nhiên nhưng chưa đạt đến mức độ cần thiết. Màu đục của bia được lý giải bằng sự

hiện diện của nấm men, của các hạt phân tán cơ học, của các hạt dạng keo, của phức

chất protein- polyphenol, của nhựa đắng và của nhiều loại hạt li ti khác. Tất cả các

cấu tử này sẽ góp phần làm giảm độ bền của bia nếu chúng cứ tồn tại trong đó. Vì

vậy muốn làm tăng độ bền của bia, với mục đích là tăng thời gian bảo quản khi

chúng lưu hành trên thị trường, cần phải lại bỏ tất cả những cấu tử gây đục cho bia,

bằng phương pháp nhân tạo. Có hai giải pháp để lam trong bia: lọc và ly tâm.

Nguyên tắc lọc bia được xây dựng trên hai quá trình:

− Giữ chặt bằng lực cơ học tất cả các hạt có kích thước lón hơn kích

thước lỗ hổng của vật liệu học.

− Hấp phụ các hạt có kích thước bé hơn, thậm chí các hạt hòa tan dạng

keo và các hạt hòa tan phân tử. Độ trong tinh thể của bia đạt được là nhờ có quá

trình thứ hai này. Hiệu quả của quá trình hấp phụ, phụ thuộc trước hết vào bản chất

của chất hấp phụ và chất bị hấp phụ, sau đó là thời điểm trong quá trình lọc.

Hình 2.4 : một số loại bia lon trên thị trường




Trong công nghiệp sản xuất bia, những loại vật liệu lọc được sử dụng rộng rãi

nhất gồm có:

− Xelluloza trộn với bột axbetit rồi ép chặt thành bánh hình tròn (hoặc

hình chữ nhật hoặc hình vuông). Vì độ dày của các bánh khá lớn, cho nên trong

thuật ngữ chuyên ngành, chúng được gọi là khối lọc.

− Sợi xelluloza dệt và ép thành tấm, khi tiến hành lọc bia phải phủ bột

diatomit. Vì độ dày của các tấm này bé, hơn nữa chúng lại bền và rất dai, cho nên

trong thuật ngữ chuyên ngành chúng được gọi là tấm lọc.

− Cả hai loại vật liệu lọc đều có thể sử dụng nhiều lần. Đối với khối lọc,

sau mỗi lần tái sử dụng, ta phải bổ sung thêm một lượng mới.Khối lọc đã qua sử

dụng, có khả năng hấp phụ mạnh hơn khối lọc mới, và xếp thứ ba là diatomit. Tuy

khả năng hấp phụ thấp hơn nhưng hiện nay, loại vật liệu trợ lọc này được dùng

nhiều hơn cả. Lý do la bia lọc bằng diatomit không hề bị thay đổi về chất lượng và

có độ bền sinh học cao.

Trong quá trình lọc có thể xảy ra hiện tượng giảm nồng độ chất hòa tan của

bia. Do một phần các hạt dạng keo bị loại ra ngoài cho nên độ nhớt của bia sau khi

lọc sẽ bị giảm và khả năng tạo bọt của nó cũng bị giảm. Vì lẽ đó, ý tưởng lọc bia hai

lần để bia đạt được độ trong tinh thể có thể thực hiện được nhưng hậu quả là làm

giảm chỉ tiêu cảm quan khác của nó.

Lọc bia luôn luôn dẫn đến sự hao phí về khối lượng và hao phí CO2, mặc dầu

quá trình đó được thực hiện trong một hệ thống hoàn toàn kín. Sự hao phí CO2 có

thể giảm bớt được bằng cách trước lúc lọc, bia được làm lạnh đến OoC. Gỉai pháp

này có một điểm rất hay là tạo trước cho bia điều kiện gây đục ở nhiệt độ thấp, có

như vậy sau này hiện tượng sẽ không bị lặp lại.

Ly tâm là phương pháp thứ hai thường được sử dụng trong sản xuất để làm

trong bia. Việc tách các hạt phân tán ra khỏi pha lỏng, hoàn toàn mang tính chất cơ

học. Chính vì vậy mà sự thay đổi về thành phần và tính chất của bia sau khi ly tâm

là hầu như không đáng kể. Ngoài ra, giải pháp ly tâm còn có một ưu điểm nữa là sự

thuận tiện về mặt cơ khí khi làm việc. Bên cạnh những ưu điểm, giải pháp này cũng

có một số nhược điểm nhỏ ta cần phải lưu ý. Đó là, trong khi ly tâm, nhiệt độ của




bia có thể sẽ tăng lên. Theo một số ít tác giả thì bia sau khi ly tâm sẽ có tính khử

yếu hơn so với bia lọc. Vì những lý do đó, làm lạnh bia trước lúc ly tâm là công

việc bắt buộc phải làm.[3][4]

2.2 Bão hòa CO2:

Nhằm làm tăng chất lượng cảm quan, chống kết tủa và là môi trường tốt để

bảo quản bia. Bổ sung lượng CO2 bị thất thoát trong quá trình lọc bia.Tạo mọi điều

kiện thích hợp về nhiệt độ, áp suất, để tiến hành bão hoà CO2.

Phương pháp bão hoà CO2: Hạ nhiệt độ trong absort xuống 20C bằng cách mở van

tác nhân lạnh. Dịch bia sau khi lọc được bơm vào absort không được quá vạch vì

dịch bia sẽ bị trào ra ngoài khi áp suất cao. Mở van CO2 từ bình chứa vào trực tiếp

và được dẫn vào trong absort xuống đáy thiết bị qua thiết bị phân tán thành những

phân tử nhỏ khuếch tán đều trong bia. Nạp CO2 khi áp suất lên gần 5 kg/ cm2 thì

ngưng lại.

Chú ý:

Trước khi nạp CO2 vào ta phải xả áp suất trong absort gần 0 kg/ cm2 và đóng

lại rồi mới bắt đầu nạp CO2. Sau 30 phút mở van xả áp suất, loại bỏ bớt CO2 do CO2

không hấp thụ hoàn toàn trong bia. Khi áp suất trong bình còn 1 – 2 kg/ cm2 thì tiến

hành nạp CO2 lại trong thời gian nhất định, số lần nạp từ 2 đến 3 lần.[3][4]

2.3 Chiết chai:

Chiết chai là một khâu quan trọng, có thể ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng

bia. Đó cũng là một cách bảo quản, tránh tuyệt đối sự tiếp xúc giữa bia với không

khí nhằm tăng tính bền vững của bia. Chiết chai được tiến hành dưới áp suất dư của

CO2 và nhiệt độ từ 0 – 10C. Khoảng không trong thùng bock, chai hay lon trước khi

chiết cần được thông với khoảng không CO2 trên mặt thùng chứa bia, nhờ áp suất

trong chai lúc chưa có bia đã cân bằng với áp suất CO2 trong thùng chứa bia được

gọi là phương pháp chiết đẳng áp. Khi đó mới bắt đầu chiết bia vào, bia sẽ chiếm

chỗ của CO2 và một ít không khí trong thùng bock, chai hay lon. Lượng CO2 và

không khí nàyse4 thoát ra và do sự chênh lệch áp suất sẽ về khoảng trống bên trên




thùng chứa bia. Với nguyên tắc chiết rót bia đẳng áp trong hệ thống hoàn toàn kín,

sẽ đảm bảo sự giảm thiểu tổn thất CO2, cũng như sự giảm thiểu O2 xâm nhập vào

trong bia, nhờ vậy giữ ổn định chất lượng bia tốt hơn.[3][4]

2.4 Thanh trùng bia:

Trong bia thành phẩm, sản xuất theo các phương pháp thông thường luôn luôn

chứa các tế bào còn sống, bao gồm nấm men thuần chủng và các vi sinh vật lạ khác.

Một số vi sinh vật ngoại lai như vi khuẩn axetic, một số nấm sợi, vi khuẩn thuộc

nhóm E.coli và nhiều loại khác không thể phát triển được ở trong bia. Nguyên nhân

là vì trong đó không có oxy, lại có hàm lượng ethanol đáng kể, các chất đắng và pH

cũng tương đối thấp. Nấm men, kể cả nấm men giống và một số loài nấm men dại,

vi khuẩn lactic thuộc nhóm Sarcina và một số khác dễ dàng phát triển trong bia.

Xử lý nhiệt là một trong những giải pháp quan trọng nhất để diệt vi sinh vật.

nội dung này được chia làm hai cấp: tiệt trùng và thanh trùng. Tiệt trùng là nâng

nhiệt độ lên đến 1000C – 1200C, còn thanh trùng chỉ ở 60 – 800C.

Thời gian cần thiết để diệt các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào nhiệt độ. Khả

năng chịu nhiệt của các loài vi sinh vật khác nhau cũng khác nhau, và khả năng đó

dao động trong những khoảng khá rộng. Ngoại trừ một số, còn đa số nấm men đều

bị diệt ở nhiệt độ 620C- 630C trong vòng 2 phút, ở nhiệt độ đó, phải kéo dài tới 15-

20 phút nhiều loại vi khuẩn mới bị tiêu diệt. Còn vi khuẩn chịu nhiệt thì với thời

gian đó mà ở nhiệt độ 1000C chúng vẫn không chết. Bào tử của nấm men và nấm

mốc kém chịu nhiệt hơn so với bào tử của vi khuẩn. Chúng bị diệt ở 800C, còn bào

tử của vi khuẩn, nhiều trường hợp phải ở nhiệt độ 1200C trong 30 phút may ra mới

diệt được chúng.

Thanh trùng bia sẽ dẫn đến sự thay đổi bất lợi cho hương, vị và màu sắc của

sản phẩm. Ngay sau khi thanh trùng, những sự thay đổi đó rất khó nhận ra, nhưng

sau một thời gian bảo quản thì chúng mới lộ rõ. Một trong những nguyên nhân dẫn

đến sự thay đổi đó là sự tạo thành melanoid.




Thanh trùng bia cũng có thể dẫn đến vẩn đục dạng keo cho sản phẩm. vấn đề

này phụ thuộc vào thành phần protein của bia, nhiệt độ và thời gian đun nóng.

Protein cao phân tử là những thủ phạm chính gây ra vẩn đục dạng keo trong giai

đoạn thanh trùng. Ở một múc độ nào đó, các hợp chất polyphenol ngưng tụ cũng

góp phần vào việc làm hỏng bia.

Để loại trừ, hoặc làm giảm bớt các hậu quả âm tính đến chất lượng sản phẩm

do quá trình thanh trùng gây ra, thì bia phải được sản xuất theo một chế độ công

nghệ đặc biệt nghiêm ngặt. Điều cần thiết trước hết là ở giai đoạn sản xuất dịch

đường, quá trình đường hóa và thủy phân phải đạt ở múc sâu và hoàn toàn. Lên men

chính, lên men phụ và tàng trữ phải tiến hành ở nhiệt độ thấp và phải kéo dài thời

gian đủ mức cần thiết. lọc bia hai lần và làm lạnh sâu đến 00C trước đó, tiến hành

trong hệ thống kín tránh tiếp xúc với oxy là những giải pháp bắt buộc phải thực

hiện. Ngoài những vấn đề nêu trên, bia cần phải được làm ổn định thành phần bằng

cách xử lý với các chất hấp phụ, các chất kết lắng, các chế phẩm enzym proteaza và

các chất chống oxy hóa.

Thực hiện được các giải pháp trên đây, sự thay đổi chất lượng của bia trong

giai đoạn thanh trùng sẽ giảm xuống mức thấp nhất.

Có hai phương pháp thanh trùng bia: thanh trùng cả khối và thanh trùng trong

bao bì.

Thanh trùng cả khối lại có hai phương án: chiết chai ở nhiệt độ cao và chiết

chai sau khi đã làm lạnh. Trong cả hai phương án này thì thiết bị trao đổi nhiệt

thông dụng nhất vẫn là máy tấm bản.[3][4]

3. CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN BIA

3.1 Acid carbonic bị giảm

Lượng Acid carbonic bị mất sẽ phụ thuộc vào thời gian bảo quản. Nó liên quan

đến độ kín, khít của vật liệu chứa bia. Theo viện Niitop thì dùng đệm bằng

polyphenol – etylen có thể giữ được aciad carbonic nhiều hơn 13,45% so với các

phương pháp đóng nút thông thường.

3.2 Bia bị đục




Bia hỏng chủ yếu là khi bị đục. Hiện tượng này do nhiều nguyên nhân và đặc

trưng cho độ bền vững của bia. Thời gian mà bia có khả năng giữ được vị, độ trong

suốt, độ bọt gọi là độ bền vững của bia. Bia bị đục có thể do những nguyên nhân

sau:

Vẩn đục do kết tủa nguội xảy ra khi làm lạnh bia đến nhiệt độ thấp (10C), nếu

ta nâng nhiệt độ lên cao hơn bia sẽ hết đục. Có hiện tượng này do có sự chuyển về

dạng không hòa tan ở nhiệt độ thấp của một số phân tử bậc cao như protein, chất

chát và nhựa hoa houblon.

Vẩn đục do kết tủa protein, dextrin: do hàm lượng protein trong đại mạch quá

cao, quá trình nấu, tàng trữ, lọc không bảo đảm kỹ thuật.

Vẩn đục do kết tủa kim loại: do bia tiếp xúc với kim loại như Pb, Fe. Cu.

Protein kết hợp với kim loại, bị biến tính gây kết tủa. Hiện tượng đục bia này gây

bất lợi về mặt cảm quan, màu bia bị xám, mùi vị có pha lẫn mùi vị kim loại.

Vẩn đục do hoạt động của vi khuẩn: xảy ra khi trong bia còn lẫn tạp trùng. Để

khắc phục còn phải chú ý đến khâu vệ sinh, sát trùng thiết bị, phân xưởng sản xuất.

Để ngăn chặn hiện tượng đục trong bia cần nghiêm chỉnh chấp hành đúng quy

chế kỹ thuật đã xác định trong toàn bộ quy trình sản xuất.

3.3 Bia bị chua

Độ acid trong bia thay đổi bình thường từ 1,8 – 5,5 ml kiềm trong 100 ml bia.

Độ acid tăng lên trong mọi nhiệt độ bảo quản, và bia có thể bị hỏng ngay cả khi đạt

tới độ acid giới hạn quy định theo tiêu chuẩn.

Ngoài ra, mùi vị bia có thể thay đổi trong quá trình bảo quản: bia bị nhạt, có vị

chua và đắng, vị lên men, không còn mùi thơm. Hiện tượng thay đổi mùi vị sinh

cặn, mất acid carbonic xảy ra ở nhiệt độ cao hơn là nhiệt độ thấp.

4. NHỮNG VI SINH VẬT NHIỄM VÀO BIA TRONG QUÁ

TRÌNH SẢN XUẤT VÀ BẢO QUẢN.

4.1 Vi sinh vật gây ngộ độc:

4.1.1 Coliforms:




Coliforms và Faecal Coliforms được xem là vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh,

bởi vì số lượng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của

các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số

lượng Coliforms cao trong thực phẩm thì khả năng hiện diện các vi sinh vật khác

cũng rất lớn. Tuy vậy, mối liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật

gây bệnh còn đang được tranh cãi về cơ sở khoa học, cho đến nay mối liên hệ này

vẫn không được sự thống nhất trong các hội đồng khoa học.[11]

4.1.2 Escherichia coli:

Escherichia coli là một trong những vi sinh vật phổ biến nhất của môi trường.

Nhiều người không coi E. coli là vi sinh vật gây bệnh cho thực phẩm song những

nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng của chúng thật sự có khả năng gây bệnh

lây lan qua thực phẩm rất nghiêm trọng. Chúng là vi sinh vật hiếu khí phổ biến

trong đường tiêu hóa của người và các loài động vật máu nóng.Các dòng E. coli gây

bệnh khi chúng xâm nhiễm vào người qua con đường thực phẩm có thể gây nên các

rối loạn đường tiêu hóa, gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em và nhiễm huyết ở trẻ sơ sinh,

các biểu hiện lâm sàng biến động có thể từ nhẹ đến rât1 nặng, có thể đe dọa đến

mạng sống của con người phụ thuộc vào liều lượng, dòng gây nhiễm và khả năng

đáp ứng của từng người.[11]

4.1.3 Nấm men – nấm mốc:

Đây là nhóm vi sinh vật có nhân thật, thuộc nhóm dị dưỡng, chúng cần nguồn

carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài, chúng rất đa dạng

về chủng loài. Hầu hết nấm mốc và nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí

bắt buộc, một số khác có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Là vi sinh ưa

mát, nhiệt độ thích hợp từ 20- 280C, một số khác ưa lạnh hay ưa nóng. Thông

thường chỉ có nấm mốc gây ra độc tố làm trúng độc. Người ăn phải nấm mốc có thể

bị khối u trong gan, gây ra ung thư gan, tácđộng lên thận làm suy thoái thận.[11]

4.1.4 Staphylococcus aureus:

Staphylococcus aureus là VSV có khả năng sản sinh một số loại độc tố đường

ruột bền nhiệt, không bị phân huỷ khi đun ở 1000C trong khoảng 30 phút.

Staphylococcus aureus không có khả năng cạnh tranh cao so với các vi khuẩn gây




hỏng thực phẩm khác nhưng khi không có đối thủ cạnh tranh, chẳng hạn trong thực

phẩm muối hoặc chế biến, chúng có thể sinh sôi và tạo ra độc tố bền nhiệt. Khi vi

sinh vật này xâm nhiễm vào trong thực phẩm, chúng tiết độc tố vào trong sản phẩm

và gây độc. Khi con người tiêu thụ loại thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4-6 giờ ủ

bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mữa, các triệu chứng

này kéo dài từ 6-8 giờ. Các nguồn lây nhiễm vào thực phẩm chủ yêu từ các khâu

chế biến. Trong tự nhiên các vi sinh vật này thường tình thấy trên da, mũi, tóc hay

lông của các loài động vật máu nóng.[11]

4.1.5 Clostridium perfringens:

Quan niệm về sự ngộ độc thực phẩm do Clostridium perfringens gây ra đã có

những thay đổi trong những năm gần đây. Theo những quan niệm trước đây cho

rằng các dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có

thể gây ngộ độ thực phẩm. Nhưng trong những năm gây đây các dòng nhạy cảm với

nhiệt, không làm tan máu cũng được tìm thấy trong các vụ ngộ độc do vi sinh vật

này gây nên.Vì các bào tử của C. perfringens kháng nhiệt nên chúng thường sống

sót qua quá trình nấu chín. Tuy nhiên cũng phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với

nhiệt. Nếu những bào tử sống sót, khi gặp điều kiện thích hợp chúng sẽ nẩy mầm và

nhân lên. Khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn có thể làm cho các

dòng kháng nhiệt tồn tại vì thế chúng sẽ gây tái nhiễm sau khi bảo quản. Các triệu

chứng của ngộ độc do độc tố của vi sinh vật này gây ra là đau thắt vùng bụng, tiêu

chảy, đôi khi nôn mửa xuất hiện sau 8-20 giờ khi ăn một lượng lớn tế bào sống

Clostridium perfringens. Thời gian ủ bệnh là 12- 24 giờ.[11]

4.2 Vi sinh vật gây hư hỏng bia:

4.2.1 Pectinatus cerevisiiphilus - Pectinatus frisingensis:

Pectinatus cerevisiiphilus thường được nói đến như là loại vi khuẩn làm hư

bia. Loại vi khuẩn kị khí hình chiếc lá này lần đầu tiên được mô tả bởi Lee năm

1978 trong chai bia được trữ ở 300C. Và từ đó nó thường được phát hiện trong các

mẫu bia bị mất hương vị. Tuy nhiên, theo nghiên cứu phân loại mới đây thì có loại:

vi khuẩn kị khí, gram âm, hình que xuất hiện ở các nhà máy bia và đó là 1 chủng

mới của Pectinatus, Pectinatus frisingensis.Một chủng mới cần môi trường phát




triển khác và có khả năng bài tiết nhiều hơn trong quá trình lên men. Khi phát triển

trong dịch bia thì hai chủng này bài tiết ra một lượng đáng kể các acid béo dễ bay

hơi, chủ yếu là propionate và acetace, kết quả là làm hư hương vị.[14]

4.2.2 Lactobacillus brevis:

Lactobacillus brevis là loại vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn lên men axit lactic,

gram dương, không sinh bào tử. Nó có thể được tìm thấy trong nhiều mơi trường

khác nhau và trong thực phẩm lên men như dưa chua, rượu vang..Nó cũng là một

trong những nguyên nhân phổ biến gây hư hỏng cho bia. L. brevis là một loại

Lactobacillus đặc biệt, nó được coi là loài chuyên sản xuất polysaccharide thực vật.

Quá trình trao đổi chất của L. brevis tạo ra axit lactic và ethanol.

4.2.3 Megasphaera cerevisiae:

Megasphaera cerevisiae là vi khuẩn gram âm, kị khí bắt buộc, gây đục và làm

mất hương vị trong cà phê và bia. Có bảy chủng M. cerevisiae đã được phân lập. M.

cerevisia thường nhạy cảm với pH thấp (≤4,1) và bị ức chế trong môi trường có độ

cồn trên 2,8% (w/v). Tuy nhiên, theo quan sát cho thấy thì nó có thể phát triển trong

bia với độ cồn lên tới 3,8% (w/v) (Haikara and Lounatmaa, 1987; Lawrence, 1988) . [13]




Chương III

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. NGUYÊN VẬT LIỆU

1.1 Dụng cụ

• Erlen 50 ml, 100 ml

• Đèn cồn

• Ống đong

• Bình định mức 50 ml, 100 ml

• Gòn không thấm

• Gòn thấm nước

• Bình xịt cồn 70o

• Bình nước cất

• Pipette thuỷ tinh 1 ml, 5 ml, 10 ml

• Micropipette 1000 µm

• Đầu tip 100 – 1000 µl

• Petri thuỷ tinh

• Ống nghiệm

• Một số vật dụng khác

1.2 Thiết bị

• Autolave ( TOMY SS – 352)

• Cân điện tử (ADAM AQT – 200)

• Máy ảnh (CANON IXUS 8515)




• Máy đo pH( HANNA – HI 8424)

• Kính hiển vi quang học( OLYMPUS CH30)

• Tủ sấy dụng cụ (MEMMERT)

• Tủ hút ( ASTEC MONNAIR)

• Tủ lạnh ( LG GR - T582GV)

• Tủ ấm ( SHEL LAT)

1.3 Sử lý dụng cụ

Dụng cụ thuỷ tinh: được rửa bằng nước javel sau khi sử dụng, ngâm cồn 70o

khoảng 6 – 8 giờ. Vô trùng bằng cách hấp khử trùng hơi nước với Autolave ( 121o ở

1 atm trong 30 phút). Bao gói cẩn thận và sấy khô ở 110o trong 15 phút, bảo quản

trong tủ chứa dụng cụ.

Dụng cụ nhựa: được sử lý bằng nước javel, rửa sạch và ngâm trong cồn 70o

khoảng 6 – 8 giờ. Vô trùng băng phương pháp đun sôi Pasteur, để khô tụ nhiên, bao

gói cẩn thận và bảo quản.

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu bia tươi có mặt trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh : B, C, D, A

Hình 3.1 : Các loại bia khảo sát

2.2 Phương pháp chọn mẫu

Thời gian: 4 -5 giờ chiều

Địa điểm: mẫu bia được thu thập từ các điểm bán lẻ trong quận Tân Bình

• Khu công nghiệp Tân Bình

• Đường Lũy Bán Bích




• Đường Phạm Văn Bạch

• Đường Cách mạng tháng tám

2.3 Phương pháp bảo quản mẫu và giữ mẫu

• Mẫu bia được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-4oC tước khi đưa vào kiểm

nghiệm.

• Đưa mẫu về 20oC trước khi lấy mẫu phân tích.

• Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy khuấy đồng nhất.

2.4 Số lượng mẫu: 40 mẫu ( mỗi loại 10 mẫu)

2.5 Nội dung nghiên cứu

2.5.1 Mục tiêu tổng quát

Khảo sát khả năng bị nhiễm vi sinh vật của bia tươi trên thị trường Thành phố

Hồ Chí Minh, từ đó có nhận định chung về độ an toàn của các sản phẩm bia tươi

này.

2.5.2 Các chỉ tiêu khảo sát

• Định lượng vi sinh vật trong mẫu bằng phương pháp nuôi cấy

• Xác định vi khuẩn E. coli bằng các phản ứng sinh hóa cơ bản.

• Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí

2.5.3 Các phương pháp phân tích

2.5.3.1 Kĩ thuật định lượng vi sinh vật

Tất cả các phương pháp định lượng vi khuẩn trong mẫu bằng phương pháp

nuôi cấy đều yêu cầu các tế bào phải được tách rời nhau, qua quá trình nuôi cấy các

tế bào này phát triển thành các dòng riêng biệt. Tất các qui trình định lượng bằng

phương pháp nuôi cấy nhằm chọn lọc một hay nhiều nhóm vi khuẩn nhất định nào

đó, mức độ chọn lọc phụ thuộc và từng qui trình qui trình cụ thể.

Để xác định tổng số vi sinh vật trong mẫu phải chọn qui trình giảm tối thiểu

khả năng chọn lọc. Nhưng dù mức độ chọn lọc ở mức tối thiểu cũng chỉ định lượng

được số lượng vi sinh vật có thể nuôi cấy. Còn một số lượng lớn vi sinh vật khác

không thể phát triển được trong quá trình nuôi cấy thì không thể định lượng được

bằng phương pháp này.




a. Phương pháp đếm khuẩn lạc

Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa được sử dụng rộng rãi để định lượng vi

sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn, nhưng pháp này có những khuyết điểm và đã có

những cách nhìn nhậnkhác nhau về mặt khoa học. Khuyết điểm của phương pháp

này nằm trong sự lạm dụng để biểu đạt sai các kết quả. Tất cả mọi người đều mắc

sai lầm khi nhận ra rằng phương pháp này không thể dùng để thu được kết quả tổng

số vi sinh vật.

Phương pháp đếm khuẩn lạc sử dụng nhiều loại môi trường và các điều kiện

nuôi cấy khác nhau. Agar là chất thường được dùng để làm đặc các môi trường nuôi

cấy vì hầu hếr các vi sinh vật đều mất các gen tổng hợp enzym phân giải agar. Các

mẫu đã được pha loãng để trãi lên bề mặt môi trường agar (phương pháp trãi) hay

khuyết tán vào trong nôi trường trước khi làm đặc (phương pháp đổ đĩa). Một vấn

đề cần phải cân nhắc là các vi sinh vật cần xác định có thể tồn tại và phát triển trong

môi trường agar hay không. Một số vi sinh vật có thể bị chết khi trãi trên bề mặt

môi trường trong qui trình cấy trải bề mặt. Một số loài vi khuẩn khác không thể

sống trong điều kiện nhiệt độ duy trì trạng thái lỏng của agar trong qui trình đổ đĩa.

Bởi vì agar chỉ là tác nhân làm rắn môi trường nuôi cấy trong qui trình định lượng

vi sinh vật vì thế trong một số trường hợp agar có thể được thay thế bằng các tác

nhân làm rắn khác. Trong một số trường hợp các vi sinh vật có các nhu cầu dinh

dưỡng đặc biệt khác, các chất như silicagel có thể được thay thế để làm rắn môi

trường. Như ng vì chuẩn bị môi trường silicagel khó khăn hơn chuẩn bị môi trường

agar nên chỉ dùng môi trường silicagel khi không thể thay thế được môi trường

agar.

Phương pháp ống cuộn được dùng để định lượng các vi sinh vật kỵ khí bắt

buộc. Đây là một phương pháp cải biên của phương pháp đổ đĩa. Các đĩa hay các

ống sau khi cấy vi khuẩn được ủ trong điều kiện nhiệt độ đặc biệt trong một thới

gian nhất định để cho sinh vật phát triển thành các khuẩn lạc có thể nhìn thấy bằng

mắt trường, số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sẽđược đếm. Số lượng khuẩn lạc

sẽ được gán cho số tế bào đơn lẻ trong mẫu ban đầu. Để số lượng khuẩn lạc phản

ánh được số lượng tế bào vi khuẩn, mẫu phải được phân tán đều vào trong môi




trường hay trên bề mặt môi trtường rắn. Những đĩa có quá nhiều khuẩn lạc xuất

hiện thì không thể cho số lượng đếm chính xác bởi vì chúng có thể chồng lấp lên

nhau. Những đĩa có quá ít khuẩn lạc cũng phải bỏ đi vì theo nguyên tắc của xác

suất.

Những vấn đề chính yếu cần xem xét trong qui trình đếm khuẩn lạc là thành

phần môi trường, điều kiện và thời gian nuôi ủ. Môi trường để định lượng các vi

sinh vật dị dưỡng không thể cố định nitơ phải chứa các nguồn nitơ, carbon,

phosphate dễ sử dụng và các cation, anion cần thiết như sắt, mangie, calci, natri, clo

và sulphate. Thành phần của các hàm lượng không nhất định, chúng đặt thù cho

từng loại môi trường và từng loại mẫu nhất định để có thể nhận được số lượng vi

sinh vật mục tiêu cao nhất. Như vậy môi trường nuôi cấy phải có các thành phần

dinh dưỡng phù hợp với từng yêu cầu của loài vi sinh vật, bao gồm cả các nhân tố

cần thiết khác cho sự phát triển của một hệ vi sinh vật nhất định. Mục đích chung

của môi trường là hàm lượng dinh dưỡng phải cao hơn các thành phần có trong các

mẫu đang phân tích. Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại môi trường đếm tổng số

vi sinh vật phải đủ cao, và độc tính của môi trường đối với sinh vật ở mức thấp

nhất.

Để nâng cao hiệu quả của qui trình định lượng vi sinh vật bằng phương pháp

đếm khuẩn lạc, các điều kiện cần phải điều chỉnh sao cho chỉ có các thành viên vi

sinh vật cần phát hiện theo định nghĩa được đếm. Các môi trường đếm đĩa được

chọn lọc hay phân biệt với các thành viên vi sinh vật khác. Qui trình đếm đĩa chọn

lọc được thiết kế cho thích hợp với sự phát triển của vi sinh vật mong muốn. Sự

phát triển của các nhóm vi sinh vật khác được loại bỏ bởi các thành phần của môi

trường hay điều kiện nuôi ủ. Môi trường phân biệt là môi trường không loại bỏ các

nhóm vi sinh vật không mong muốn mà ngược lại cho phép chúng phát triển cũng

trên môi trường đó nhưng có thể biệt phân biệt các nhóm vi sinh vật mong muốn

với các nhóm khác bằng các đặc điểm nhận dạng.

Môi trường cũng có thể được thiết lập để chọn lọc các loài nấm mốc. Mặt dù kỹ

thuật đếm khuẩn lạc không phải là phương pháp được chọn cho việc xác định số

lượng nấm mốc trong các mẫu thực phẩm và trong môi trường. Bởi vì kỹ thuật này




chỉ thích hợp cho việc định lượng các loài vi sinh vật không có sợi hay bào tử. Dĩ

nhiên phương pháp đếm khuẩn lạc cũng thích hợp cho việc định lựơng các loài nấm

men. Vì số lượng của vi khuẩn luôn nhiều hơn số lượng của nấm mốc nên để ngăn

cản sự phát triển của vi khuẩn trong các khuẩn lạc của nấm mốc, các tác nhân ức

chế vi khuẩn được thêm vào trong các môi trường nuôi cấy. Các thuốc nhuộm

bengal rose và các kháng sinh như streptomycine, neomycine thường được sử dụng

là những tác nhân ức chế vi khuẩn. Một biện pháp đơn giản để ức chế sự phát triển

của vi khuẩn là hạ thấp pH của môi trường nuôi cấy xuống khoảng 4,5 - 5,5. Hầu

hết các nấm mốc đều không bị tác động khi phát triển trong khoảng pH này nhưng

khi đó vi khuẩn bị ức chế.

Môi trường chọn được xác lập công thức để ức chế sự phát triển của nhóm vi

sinh vật và cho phép một nhóm vi sinh vật khác phát triển. Ví dụ môi trường

Saubouraud Dextrose Agar được dùng để định lượng nấm mốc dựa trên nguyên tắc

pH thấp và nguồn carbohydrate. Bổ sung vào môi trường các chất kháng sinh khác

như peniciline hay methyl blue là những tác nhân ức chế vi khuần gram âm. Các vi

sinh vật kháng kháng sinh cũng có thể được định lượng trên môi trường bằng cách

thêm vào đó một liều lượng kháng sinh.

Môi trường phân biệt được thiết lập dựa trên nhiều cách. Các thuốc thử được

thêm vào trong môi trường để cho phép nhận ra các sự khác biệt của những vi sinh

vật mong muốn. Có thể thêm thuốc thử vào môi trường sau khi nuôi cấy để nhận ra

các loài vi sinh vật đặc trưng cần tìm. Chìa khoá nâng cao khả năng phân biệt của

môi trường là qui trình nuôi cấy để cho phép môi trường phân biệt một cách tốt nhất

với vi sinh vật cần định lượng và các vi sinh vật khác có trong mẫu.

Môi trường Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là những môi

trường được sử dụng rộng rãi trong việc phân tích vi sinh vật trong nước. Những

môi trường này bao gồm tính chọn lọc và tính phân biệt. Chúng chọn lọc cho sự

phát triển của các vi khuẩn gram âm bởi trong đó có thêm vào các tác nhân ức chế

các vi khuẩn gram dương. Môi trường này có thể phân biệt các vi khuẩn có thể sử

dụng lactose bởi sự hình thành các khuẩn lạc có thể phân biệt bằng màu sắc. Trên

môi trường EMB, vi khuẩn thuộc nhóm coliforms là nhóm gram âm tạo nên những




khuẩn lạc có màu tím ánh kim. Định lượng số lượng coliform bằng cách đếm số

lượng khuẩn lạc có các đặc điểm này. Cách này thường xuyên được sử dụng trong

việc phân biệt các vi sinh vật chỉ thị trong nước và trong thực phẩm.

Với kỹ thuật đến khuẩn lạc, các mẫu cần phân tích phải được pha loãng thành

chuổi pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để

cấy vào các môi trường đã chọn phù hợp với các đối tượng cần xác định. Mổi khuẩn

lạc được hình thành được gán cho một đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu-colony

forming units). Kỹ thuật thường qua các bước như sau:

Dung dịch pha loãng: một số dung dịch dùng để pha loãng có thể làm chết tế

bào như: nước muối, nước cất. Các dung dịch pha loãng không được dùng ngay khi

lấy ra từ tủ lạnh có thể gây sốc và làm cho vi sinh vật không thể phát triển được.

Dung dịch pepton water là dung dịch pha loãng được sử dụng nhiều nhất và được

xem là dung dịch pha loãng cho tất cả các loại mẫu. Nếu trong mẫu còn có một ít

các chất khử trùng thì phải thêm vào dung dịch pha loãng tác nhân giảm thiểu khả

năng khử trùng của chúng, ví dụ: nếu trong mẫu còn dư lượng của các hợp chất

amonium (NH4-) thì có thể thêm vào đó Tween 80 hay lecithin. Ngược lại nếu trong

mẫu có chứa các hợp chất chlorin hay iodin thì cần thêm vào đó các muối như

sodium thiosulphate.

Chuẩn bị các chuổi pha loãng mẫu

Bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào trong ống nghiệm có nắp đậy.

Nếu sử dụng các ống nghiệm có nắp không đóng chặt được thì phải khử trùng ống

nghiệm, sau đó bơm dung dịch pha loãng vào, các thao tác này phải được thực hiện

một cách vô trùng. Phân phối dung dịch pha loãng vào các ống sau khi khử trùng

còn có ý nghĩa đảm bảo thể tích dung dịch pha loãng không bị mất do quá trình khử

trùng. Các thao tác pha loãng tuỳ thuộc vào từng loại mẫu.

Cụ thể như sau:

- Nếu pha loãng các mẫu là chất lỏng, trước khi pha loãng mẫu phải được lắc

kỹ, cắm đầu pippette sâu vào trong mẫu khoảng 1 phút hút ra 1ml, cho vào trong

ống chứa dung dịch pha loãng đầu tiên, lắc kỹ ống nghiệm chứa mẫu, bỏ pippette

vừa sử dụng, dùng một pippette mới thực hiện lại thao tác như trên với các độ pha




loãng tiếp theo. Cứ tiếp tục như vậy cho đến khi đạt được độ pha loãng mong muốn.

Mỗi độ pha loãng chỉ được phép sử dụng 1 pippette. Các ống nghiệm chứa các độ

pha loãng khác nhau phải được đánh dấu để tránh nhầm lẫn.

- Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng, các thao tác được tiến hành như sau: cân

10 g mẫu vào trong các bao dập mẫu hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml dung

dịch pha loãng và đồng nhất mẫu, phải đảm bảo sao cho vi khuẩn phân tán đều vào

trong dung dịch. Sau khi mẫu và dung dịch pha loãng được đồng nhất ta được dung

dịch pha loãng 1/10. Các độ pha loãng sau được tiến hành tương tự như phần pha

loãng mẫu lỏng. Các ống nghiệm chứa các độ pha loãng khác nhau phải được đánh

dấu để tránh nhầm lẫn.

Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa

Các môi trường agar được đun chảy trong các chai hay trong các ống nghiệm

có thể tích phù hợp. Được làm mát trong các bể điều nhiệt ở 45 0C. Hút 1ml mỗi

dung dịch pha loãng cho vào trong đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng thường

được cấy vào hai đĩa petri hay nhiều hơn. Cũng sữ dụng các pippette sạch cho mỗi

độ pha loãng. Chỉ chọn cấy vào đĩa petri những độ pha loãng có mật độ vi sinh vật

phù hợp, thường trong khoảng 25-300 tế bào/ml. Đỗ vào mỗi đĩa đã cấy 10-15ml

môi trường đã được đun chảy và làm nguội, lắc đĩa theo chiều và ngược chiều kim

đồng hồ khoảng 5-6 lần, đặc đĩa lên mặt phẳng ngang và đợi cho đến khi môi

trường trong đĩa đông đặc. Lật ngược đĩa và ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian

xác định.[10]

b. Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh bằng kỹ thuật MPN (Most

Probable Number):

Phương pháp MPN là phương pháp có thể thay thế phương pháp đếm khuẩn

lạc để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu, phương pháp này được dựa trên

nguyên tắc xác suất thống kê sự phân phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng

khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần trong các môi

trường lỏng đã được chọn, thông thường phải cấy lặp lại từ 3-10 lần tại mỗi nồng độ

pha loãng. Các độ pha loãng được tiến hành sao cho trong các lần lặp lại có một số

lần cho dầu hiệu dương tính và một số lần cho dấu hiệu âm tính. Số lần lặp lại cho




dấu hiệu dương tính và âm tính được ghi nhận để đối chiếu với bảng thống kê sẽ

được giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu. Qui trình MPN cho giá trị số

lượng vi sinh vật trong mẫu có ý nghĩa thống kê theo xác suất phân bố vi sinh vật

trong mẫu khi sử dụng một số lần lặp lại, vì thế khoảng tin cậy là rất lớn. Phương

pháp MPN để định lượng vi sinh vật cho đến nay đã có nhiều cải tiến cho phép tiến

hành qui trình dễ dàng và tốn ít sức lao động hơn và cho giá trị chính xác cao hơn.

Chọn nồng độ pha loãng sao cho trong các lần lặp lại có một số lần cho kết quả

dương tính và một số lần cho kết quả âm tính , sự lựa chọn này rất quan trọng.

Trong nhiều trường hợp qui trình MPN được thiết lập sao cho gia tăng số lượng lần

lặp cho kết quả dương tính bằng tín hiệu phát triển của vi sinh vật. Trong một số

trường hợp khác, qui trình được thiết lập có nhiều thử nghiệm khẳng định sau khi

các lần lặp lại ở các độ pha loãng cho tín hiệu phát triển của vi sinh vật như phát

hiện protein hay một emzym nào đó. Các thử nghiệm sau này cho kết quả dương

tính thì các lần lặp lại ban đầu mới được khẳng định là dương tính. Cũng giống như

qui trình đếm khuẩn lạc, qui trình MPN cũng được sử dụng các môi trường chọn

lọc, không chọn lọc hay môi trường phân biệt.

Phương pháp MPN cũng được dùng để định lượng virus đường ruột. Trong

phương pháp này, một chuỗi pha loãng của mẫu cần kiểm tra được cho vào trong

các ống nghiệm chứa tế bào chủ thích hợp được nuôi cấy. Sau khi ủ, các ống

nghiệm được kiểm tra hiệu ứng cytopathic (CPE), đó là các biểu hiện làm chết tế

bào bị xâm nhiễm. Số lượng virus trong mẫu cũng nhận được từ bảng MPN bằng sự

tham chiếu số lượng các ông nuôi cấy cho hiệu ứng CPE dương tính.

Số lượng của virus cũng có thể được định lượng bằng chỉ số TCID 50 (Tissue

culture infectious dose 50%). Nồng độ pha loãng thấp nhất có sự hiện diện của virus

đó là nộng độ có tỉ số CPE là 50% trong các ống nghiệm.

Cũng giống như qui trình đếm đĩa, trong phương pháp MPN, môi trường và

nồng độ nuôi cấy cũng được điều chỉnh để chọn lọc cho một nhóm vi sinh vật hay

phân biệt các nhóm vi sinh vật này với các nhóm vi sinh vật khác với các đặc điểm

mong muốn, rỏ ràng rằng sự kết hợp giữa điều kiện nuôi cấy và môi trường cũng có

thể định lượng những nhóm vi sinh vật đặc biệt nào đó theo định nghĩa cụ thể. Mỗi




qui trình phải được chọn lọc một cách cụ thể và cẩn thận để có thể thu được kết quả

một cách chính xác.

Theo quan điểm của C.H. Collins và Patricia M. Lyne thực chất con số MPN

biểu diển số lượng vi sinh vật trong mẫu là số lượng trung bình sau các lần lặp lại.

Nếu số lượng vi sinh vật trong mẫu lớn thì sự khác biệt của các mẫu giữa các lần

lặp lại là nhỏ, kết quả riêng lẻ của tất cả các lần lặp gần với kết quả trung bình. Nều

số lượng vi sinh vật trong mẫu nhỏ, sự khác biệt này sẽ lớn. Nều trong một mẫu

chất lỏng chứa 100 vi sinh vật/100 ml, thì trong 10 ml mẫu sẽ chứa trung bình 10 tế

bào. Dĩ nhiên có một số phần mẫu nhiều hơn 10 tế bào, thậm chí có những phần

mẫu có thể chứa 20 tế bào trong 10ml mẫu và một số phần mẫu chứa ít hơn. Nếu tất

cả các phần mẫu trên được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp, các vi

sinh vật trong mẫu sẽ phát triển và cho tín hiệu dương tính.

Tương tự như vậy, 1ml sẽ chứa trung bình 1 tế bào vi sinh vật, như vậy có

những lần lấy sẽ có 2 hay 3 tế bào và có những lần lấy sẽ không có tế bào nào. Nếu

các lần hút này được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp sẽ thu được

những ống nghiệm cho kết quả dương tính và những ống cho kết quả âm tính.

Nếu hút 0,1ml thì sau 10 lần hút mới có khả năng nhận được 1 lần hút có 1 tế

bào, như vậy hầu hết các lần nuôi cấy khi lấy 0,1ml thì đều cho kết quả âm tính.

Có thể tính toán con số chắc chắn số lượng vi sinh vật trong trong 100ml mẫu

bằng sự kết hợp các kết quả nhận được từ các chuổi cấy như trên. Bảng giá trị MPN

khi sử dụng hệ thống cấy với các dãy 5 ống 10ml, 5 ống 1ml và 5 ống 0.1ml đã

được tính sẵn và dùng cho phân tích các mẫu nước hay các mẫu đã pha loãng. Cho

đến nay có rất nhiều bảng giá trị MPN được sử dụng với độ chính xác và các

khoảng tin cậy khác nhau và được sử dụng cho các mục đích khác nhau.

Phương pháp MPN được dùng chủ yếu để phân tích Coliforms và các vi sinh

vật khác khi chúng phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng cho các tín hiệu dễ

dàng nhận dạng như sinh hơi, làm đục môi trường chọn lọc, thay đổi pH môi trường

… Ví dụ nấm men và nấm mốc trong nước trái cây hay rau quả, vi sinh vật kỵ khí

hay các bào tử Clostridia.[10]

2.5.3.2 các phản ứng sinh hóa trong xác định vi khuẩn E. coli




a.Thử nghiệm khả năng sinh indol:

Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của vi khuẩn có thể tạo indol trong môi trường

canh trypton.

Cơ sở sinh hoá:Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hoá bởi một số vi

sinh vật nhất định tạo nên các hợp chất indol hay các dẫn xuất của chúng như: indol,

skatol (methyl indol) và indolacetic. Một số enzym nội bào được gọi chung là

trytophanase tham gia trong quá trình tạo thành sản phẩm indol trong hoạt động

thuỷ giải tryptophane.

Các hợp chất trung gian trong quá trình thuỷ giải tryptophan là acid

indolepyruvic, từ đó indol được hình thành trong quá trình khử amin, hình thành

skatol là quá trình khử carboxyl của acid indol acetic. Quá trình thuỷ giải

tryptophan do Enzym tryptophanase xúc tác phản ứng khử amin bởi sự tấn công vào

phân tử tryptophan ở vị trí mạch nhánh và tách nhân thơm ra khỏi phân tử

tryptophan hình thành indol.

Sự tách amin từ tryptophane là một dạng phản ứng khử. Qua quá trình này

nhóm amin được tách ra và chuyển thành NH3, quá trình khử giải phóng một phần

năng lượng được sử dụng cho hoạt động tăng trưởng của vi sinh vật. Đồng thời quá

trình này còn tạo thành acid pyruvic, cơ chất tham gia vào chu trình Krebs’ để tiếp

tục thu năng lượng.

Phát hiện indol và các dẫn xuất của chúng trong môi trường nuôi cấy bằng

thuốc thử Kovac’s hay Ehrlich’s. Cơ chất chính tham gia phát hiện indol trong môi

trường nuôi cấy là p-dimethylaminobenzaldehyde (DMAB). Chất này phản ứng với

indol tạo thành một phức hợp màu đỏ. Phản ứng này là do nhân pyrrol của indol

phản ứng với nhóm aldehyde của DMAB qua hai giai đoạn để tạo thành nhân

quinone có màu đỏ, phản ứng như sau:

Phương pháp thử: Vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường canh

trypton khoảng 24 - 48 giờ. Nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn nhằm kéo indol lên

bề mặt một trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s hay Erhlich. Quan sát sau vài

phút, phản ứng dương tính nếu trên bề mặt môi trường có vòng màu đó xuất hiện.




Ngược lại nếu không có sự xuất hiện của màu đỏ hồng được coi là phản ứng âm

tính.

Thuốc thử

- Thuốc thử Erhlich: Hoà tan 4g p-dimethylaminobenzaldehyde trong hỗn hợp

gồm 80 ml acid HCl đậm đặc và 380 ml ethanol tuyệt đối. Dung dịch sau khi pha có

màu vàng nâu.

- Thuốc thử Kovac’s hoà tan 5 g p-dimethylaminobenzaldehyde trong hỗn hợp

gồm 75 ml amyl alcohol và 25 ml H2SO4 đậm đặc.[10]

b. Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP):

Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung

tính acetylmethylcarbimol (acetoin) trong quá trình lên men glucose.

Cơ sở sinh hoá: Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản

phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Quá trình

phân huỷ glucose trong tế bào vi sinh vật tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic,

từ đây có thể chia vi sinh vật thành hai nhóm theo hai cong đường chuyển hoá

pyruvic khác nhau như sau: Nhóm trao đổi không tạo thành 2,3-butanediol, ví dụ

như E.coli được gọi là nhóm VP âm tính (VP-); nhóm thứ hai quá trình trao đổi này

tạo thành sản phẩm trung gian là 2,3-butanediol, ví dụ như Klebsiella, được gọi là

nhóm VP dương (VP+). Tuy nhiên thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện

acetoin (acetylmethylcarbimol, AMC) một tiền chất của 2,3-butanediol.

Phân tử acetoin được tạo thành do quá trình khử nhóm carboxyl của acid

pyruvic, phản ứng như sau:

2 Pyruvate " acetoin + 2CO2

Vì acetoin là một sản phẩm trung gian trong bước tạo thành 2,3-butanediol nên

trong môi trường nuôi cấy tích lũy một lượng rất ít tiền chất này. Để acetoin tích lũy

nhiều, dễ dàng cho việc phát hiện, vi sinh vật phải nuôi trong điều kiện hiếu khí.

Quá trình chuyển hoá giữa acetoin và 2,3-butanediol là một quá trình thuận nghịch.

Để phát hiện acetion trong môi trường nuôi cấy 1-napthol được sử dụng như một

thuốc thử phát hiện trong môi trường kiềm mạnh được tạo ra do KOH 40% hay

NaOH 40% được cho vào môi trường thử nghiệm.




Trong các thành phần tham gia phản ứng để tạo phức chất có màu đỏ hồng có

hợp chất guanidine, ví dụ arginine NH:C(NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2)-COOH, chất

này hiện diện trong pepton được sử dụng trong môi trường nuôi cấy.

Phương pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật vào trong môi trường canh glucose

phosphate (MR-VP broth), ủ ở nhiệt độ 370C trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào

canh khuẩn sau nuôi cấy 3ml dung dịch 1-napthol 5% trong cồn, bổ sung thêm 3ml

dung dịch KOH hay NaOH 40%, lắc mạnh. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút.

Phản ứng VP dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản

ứng VP âm tính khi không có sự chuyển màu này.[10]

c. Thử nghiệm methyl red (MR):

Nguyên tắc: Thử nghiệm methyl red nhằm xác định khả năng của vi sinh vật

sản xuất và duy trì các sản phẩm acid bền trong môi trường từ trong quá trình lên

men glucose.

Cơ sở sinh hoá: Thử nghiệm methyl red trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH là

methyl red để nhận biết lượng ion H+ có trong môi trường sau khi vi sinh vật lên

men glucose. Hàm lượng ion H+ có trong môi trường thụ thuộc vào tỉ lệ CO2 và H2,

hàm lượng các chất này lại tuỳ thuộc vào con đường chuyển hoá của từng loài vi

sinh vật.

Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm phản ứng

MR thường được xác định trong khoảng 18-24 giờ. Tuy nhiên các vi sinh vật này

đều tạo acid trong môi trường ngay từ khi chúng bắt đều phát triển. Khi kéo dài thời

gian nuôi cấy các vi sinh vật có phản ứng MR dương tính sẽ tích luỹ acid trong môi

trường ngày càng nhiều hơn, độ pH trong môi trường ngày càng giảm.

Đối với các vi sinh vật cho phản ứng MR âm tính, ngay ban đầu một lượng

acid được hình thành trong môi trường, nhưng kéo dài thời gian muôi cấy vi sinh

vật này tiếp tục chuyển hoá các sản phẩm acid bằng các phản ứng như decarboxyl

tạo nên các sản phẩm trung tính như acetoin (acetyl methylcarbinol) và kết quả là

làm cho pH trong môi trường chuyển dần về phía trung tính.

Trong một số trường hợp khác vi sinh vật cũng sản sinh acid trong môi trường

nhưng các acid này cho hàm lượng ion H+ thấp như acid lactic, acid acetic, acid




formic … bởi vì các acid này có xu hướng chuyển về trung tính do hiện tượng tạo

thành các carbonate và tạo thành các sản phẩm như CO2 và các hợp chất amonium

trong môi trường các sản phẩm này làm tăng pH trong môi trường.

Thử nghiệm MR phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy để xác định sự khác

nhau trong các con đường chuyển hoá glucose. Thử nghiệm này thường được tiến

hành trong thời gian khoảng 2-5 ngày ở 370C.

Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose

phosphate (MR-VP broth) ủ trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử

methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml ml cồn và cho nước vào để đạt thể

tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi trường chguyển sang màu đỏ. Phản ứng

âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng.[10]

d. Thử nghiệm citrate:

Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là

nguồn carbon duy nhất.

Cơ sở sinh hoá: Năng lượng cung cấp cho vi sinh vật khi trong môi trường

không có nguồn nguyên liệu sử dụng cho quá trình lên men hay tạo các sản phẩm

lactic bằng cách sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất. Trong thường, sự

trao đổi chất citrate bao gồm các bước kết hợp acetyl-CoA để tạo thành

oxalacacetate để cho chúng đi vào chu trình Kreb. Con đường đồng hoá citrate ở

các vi khuẩn thường rất nhanh qua chu trình tricarboxylic acid hay con đường lên

men citrate. Ơ vi khuẩn sự tách citrate bao gồm một hệ thống enzym không có sự

tham gia của enzym acetyl –CoA, enzym này được được gọi là citratase (citrate

axaloacetat – lyase) hay citate demolase. Enzym này đòi hỏi một cation có hoát trị 2

cho hoạt động của chúng, thông thường các cation này là magne ( Mg2+) hay

mangan (Mn2+).

Bước đầu tiên vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate. Đây là hai

sản phẩm trung gian trong quá trình đồng hoá citrate, còn sản phẩm nhận được từ

quá trình này phụ thuộc vào pH của môi trường. Nếu pH kiềm thì trong môi trường

sẽ nhận được nhiều acetate và formate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactate và




CO2. pH trên 7,0 không có sản phẩm lactate trong môi trường và sản phẩm nhận

được như sau:

Citrate " CO2 + Formic acid + 2 Acetic acide

Ở pH acid acetyl methycarbinol (acetoin) và latate là sản phẩm chính của quá

trình sử dụng citate.

Môi trường sử dụng cho quá trình lên men citrate còn chứa muối vô cơ

amonium. Một vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate là nguồn carbon duy nhất

cũng có thể sử dụng ammonium như là nguồn nitơ duy nhất, amonium bị phân huỷ

để tạo thành amonia, chất này sẽ làm kiềm môi trường nuôi cấy.

Deffner và Franke thành lập công thức cho môi trường citrate cho các vi sinh

vật đường ruột, sản phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy như sau:

4 Citrate " 7 acetate + 5 CO2 + formate + Succinate

Sự sử dụng các acid hữu cơ ở dạng muối của chúng như là nguồn carbon tạo

nên các carbonate hay bicarbonate kiềm tính.

Để sử dụng cho việc thử nghiệm citrate, có thể sử dụng môi trường Simmon

citrate agar hay môi trường lỏng Koser. Nên cấy một lượng vi sinh vật vừa phải,

nếu cấy với mật độ quá dày có thể gây nên hiện tượng dương tính giả. Sau khi cấy,

ủ ở nhiệt độ 30-37oC, quan sát sự phát triển của vi sinh vật và sự chuyển sang kiềm

của môi trường.

Các chủng vi sinh vật đối chứng: Đối chứng dương: P. rettgeri; đối chứng âm:

S.epidermidis.[10]

2.6 Tiến hành thí nghiệm

2.6.1 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí

2.6.1.1 Môi trường, hoá chất, dụng cu, thiết bị:

+ Môi trường plate count agar (PCA)

+ Dung dịch nước muối sinh lý 8.5‰ (9ml/ ống)

+ Dụng cụ mở nắp chai bia

+ Bông thấm nước

+ Pipet (1ml ; 2ml ; 5ml; 10ml)

+ Đĩa pétri, que cấy.




+ Ca inox

+ Mẫu thí nghiệm.

+ Cồn 700

+ Bật lửa gaz, Đèn cồn

+ Băng keo

+ Bút dạ quang

+ Giá đỡ

+ Ông bóp cao su

+ Tủ ấm

2.6.1.2 Tiến hành:

Tất cả các thao tác đều được tiến hành trước ngọn đèn cồn.

+ Pha loãng mẫu theo thang bậc 10 bằng nước muối sinh lý (hút 1ml mẫu cho vào

ống nghiệm chứa 9ml dd nước muối sinh lý)

+ Tay trái cầm dụng cụ (chứa mẫu thí nghiệm) nghiêng 1 góc 450 so với mặt bàn

(sát cạnh ngọn đèn cồn).

+ Tay phải nhẹ nhàng mở nút.

+ Hơ miệng dụng cụ qua ngọn đèn cồn.

+ Tay phải rút pipet có gắn ống bóp cao su xuyên qua ngọn đèn lấy 1 ml mẫu thí

nghiệm.

+ Tay trái hé mở nắp đĩa pétri (đã ghi chú loại mẫu thí nghiệm).

+ Tay phải cho mẫu vào giữa hộp.

+ Rót vào mỗi hộp 12-15 ml môi trường PCA đã đóng ống.

+ Đảo trộn đều dung dịch mẫu thí nghiệm và môi trường bằng cách xoay theo

chiều kim đồng hồ và ngược lại (3 vòng/ chiều).

+ Để thạch đông tự nhiên trên mặt ngang.

+ Dán hộp bằng băng keo.

+ Lật sấp các hộp pétri và đặt vào tủ ấm ở t0 = 30-37 0C / 24-48 giờ.

2.6.1.3 Xử lý số liệu :

+ Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa bằng cách chia hộp petri ra 1/4, sau đó đếm khuẩn

lạc mọc trên đĩa.




+ Đối với các mẫu thí nghiệm được cấy ở các nồng độ nguyên (không pha loãng)

thì kết quả được tính bằng số trung bình cộng số khuẩn lạc trên hai đĩa và làm

tròn số.

+ Đối với các mẫu thí nghiệm được cấy ở các nồng độ khác nhau thì chọn các đĩa

có số chuẩn lạc từ 15 - 300 để tính.

+ Kết quả trong trường hợp này được tính theo công thức :

N = Σ c

(n1 + 0.1 n2) x d

Trong đó :

N = Σ vi khuẩn hiếu khí / ml mẫu thí nghiệm.

c = Số khuẩn lạc đếm được trên hộp thạch.

n1, n2 = Số hộp ở 2 độ pha loãng liên tiếp đã chọn để đọc kết quả.

d = Hệ số pha loãng đã chọn.[7][8]

2.6.2 Xác định Coliforms và E.coli :

2.6.2.1 Môi trường, hoá chất,

+ Môi trường: Brilliant green broth

EMB

Trytone Broth 1%, MR-VP broth , Simmons Citrate Agar.

+ Hoá chất : Dung dịch α. Napthol 5%

Thuốc thử Kovacs

Dung dịch KOH 40%

Thuốc thử Methyl red

+ Xử lý mẫu (pha loãng mẫu):

- Dùng pipet lấy 10 ml mẫu thí nghiệm cho vào chai chứa 90 ml dung dịch nước

muối sinh lý 8.5‰, lắc đều mẫu trong 2 phút ta được nồng độ pha loãng 10-1

- Dùng Pipet lấy 1 ml mẫu cho vào 9 ml dung dịch nước muối sinh lý 8.5‰ ta

được nồng độ pha loãng 10-2.

- Tiếp tục pha loãng cho đến khi mẫu không còn khả năng dương tính (Dựa vào

kết quả các lần trước)




2.6.2.2 Tiến hành :

a) Bước 1:

+ Dùng Pipet vô trùng lấy 1ml mẫu vào 10 ml môi trường BGBL, mỗi nồng độ

cấy 3 ống.

+ Ủ ở nhiệt độ 37 0C trong 48 giờ.

+ Đọc kết quả :

• Ống (+): môi trường bị đục, đổi màu, sinh hơi trong ống Durham.

• Ống (-): môi trường không bị đổi màu, không sinh hơi trong ống Durham.

+ Ghi lại số ống (+).

+ Tra bảng MPN để có được chỉ số Coliforms.[7][8][9]

b) Bước 2: Xác định E.coli.

+ Lấy một vòng que cấy vi khuẩn từ ống Brilliant green broth (+) cho vào ống

EC, mỗi nồng độ cấy 3 ống.

+ Ủ ở nhiệt độ 44,50C ± 0,50C trong 24 giờ.

+ Đọc kết quả :

• Ống (+): môi trường bị đục, đổi màu, sinh hơi trong ống Durham.

• Ống (-): môi trường không bị đổi màu, không sinh hơi trong ống Durham.

+ Tiếp tục lấy một vòng que cấy vi khuẩn từ ống EC (+), sau đó cấy ria lên môi

trường EMB, mỗi nồng độ cấy 2 đĩa.

+ Ủ ở nhiệt độ 37 0C trong 24 giờ.

+ Đọc kết quả: khuẩn lạc sinh ánh kim, tròn, bờ đều, mặt phẳng hoặc lồi: nghi

ngờ là E.coli.

• Thử phản ứng sinh hóa IMViC:

v Phản ứng Indol:

+ Cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ này lên môi trường Nutrient agar ( ủ ở 370C

trong 24 giờ)

+ Cấy chuyển tiếp sang môi trường canh trypton ( ủ ở 370C trong 48 giờ)

Chỉ số MNP x nồng độ dãy giữa Tổng số Coliforms =

100 ml mẫu




+ Nhỏ vào môi trường đã nuôi cấy 3- 5 giọt Kovacs.

+ Đọc kết quả:

• Môi trường chuyển màu đỏ: phản ứng (+)

• Môi trường chuyển màu vàng : phản ứng (-)

v Phản ứng Methyl red:

+ Lấy một vòng que cấy khuẩn lạc từ môi trường Nutrient agar cho vào ống

nghiệm chứa 5ml môi trường MR-VP.

+ Ủ ở 370C trong 24- 48 giờ.

+ Thêm 5 giọt thuốc thử Methyl red, lắc đều.


• Môi trường chuyển màu đỏ: phản ứng (+)

• Môi trường chuyển màu vàng : phản ứng (-)

v Phản ứng Voges - Proskauer (VP):

+ Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc từ môi trường Nutrient agar cho vào ống

nghiệm có chứa 5 ml môi trường MP-VP.

+ Ủ ở 370C trong 24 - 48 giờ.

+ Nhỏ thêm:

0,6 ml dung dịch α. Napthol

0,2 ml dung dịch KOH 40%

+ Lắc đều, để yên 5 -10 phút.


• Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường là dương tính(+)

• Bề mặt môi trường không đổi màu là âm tính (-)

v Phản ứng trên môi trường Citrat:

+ Cấy ria tiếp khuẩn lạc trên môi trường Nutrient agar sang môi trường thạch

nghiêng Simmons citrat.

+ Ủ ở 370C trong 18- 24 giờ.


• Màu môi trường chuyển sang xanh dương: phản ứng dương tính(+)




• Không đổi màu: phản ứng âm tính (-).[7][8][9]

Nhận định kết quả của mẫu thí nghiệm. Mẫu dương tính đối với E.coli khi:

- Phản ứng Indol: (+)

- Phản ứng Methyl red: (+)

- Phản ứng Voges - Proskauer : (-)

- Phản ứng Citrat : (-)

2.7 Xử lý số liệu:

Các số liệu trong quá trình thí nghiệm được xử lý bằng excel và các công cụ

hỗ trợ, đảm bảo tính chính xác và phù hợp thực nghiệm . Tuy nhiên sơ xuất là

không tránh khỏi.




Chương IV

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1. KẾT QUẢ KIỂM TRA SAU 1 NGÀY BẢO QUẢN:

Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra mẫu bia tươi A ( 10 chai)

Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra mẫu bia tươi B (10 chai)




Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra mẫu bia tươi C ( 10 chai)

Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra mẫu bia tươi D (10 chai)

Hầu hết các sản phẩm khảo sát đều được giữ lạnh tốt trong ngày đầu sản xuất

kèm theo đó là quá trình lọc sau khi lên men cũng hạn chế sự phát triển của VSV

trong các mẫu kiểm nghiệm.




Qua kết quả kiểm nghiệm cho thấy 4 loại bia tươi đều đạt tiêu chuẩn vệ sinh

sau 1 ngày bảo quản.

2. KẾT QUẢ KIỂM TRA SAU 5 NGÀY BẢO QUẢN

Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra bia tươi A (10 chai )

Bảng4.6: Kết quả kiểm tra bia tươi B (10 chai)




Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra bia tươi C (10 chai )

Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra bia tươi D (10 chai)

Bảng 4.9: Kết quả xét nghiệm chung của 4 loại bia sau 5 ngày bảo quản




Nhận xét:

Trong 40 mẫu được kiểm tra trong 4 loại bia tươi thì có 35/40 mẫu đạt

(87,5%) và 5/40 mẫu không đạt (12,5%). Bia tươi B tỷ lệ đạt cao nhất là 100%, kế

đến là bia tươi C có tỷ lệ đạt là 90%, bia tươi A và D có tỷ lệ đạt thấp nhất 80%.

Các mẫu không đạt là do chỉ tiêu Coliforms và E.coli vượt quá giới hạn cho phép.

Nguyên nhân có thể là do:

• Tuy nhà máy có trang bị hệ thống lọc có chất trợ lọc nhưng không thể

tách loại hết các tế bào VSV.

• Hầu hết các nhà máy sản xuất bia tươi chỉ trang bị hệ thống chiết chai

thủ công nên ở vị trí các vòi chiết, bàn chiết và vệ sinh công nhân cũng là yếu tố

gây nhiễm khuẩn cho sản phẩm.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

A B C D

Đạt

Không đạt

Hình 4.1 : Biểu đồ so sánh khả năng bảo quản của 4 loại bia tươi sau 5 ngày.




• Trước khi chiết chai, chai nhựa được sử lý bằng sút và nước nhưng

phải có một khoảng thời gian ngắn để rót bia vào chai và đóng nấp nên lúc này có

khả năng nhiễm VSV cao nhất.

Bảng 4.10: Tỷ lệ nhiễm vi sinh vật vượt quá giới hạn cho phép của 4 loại

bia tươi sau 5 ngày bảo quản

Nhận xét:

Qua biểu đồ trên cho thấy sau 5 ngày bảo quản, bia tươi D có tỷ lệ nhiễm

vi sinh vật vượt quá giới hạn cao nhất (Coliforms 20%, E.coli 10%), kế đến là bia

tươi A (Coliforms 10%, E.coli 10%), bia tươi C không bị nhiễm E.coli, nhưng

Coliforms cũng vượt quá giới hạn cho phép (10%), bia tuơi B không có mẫu nào

nhiễm vi sinh vật vượt giới hạn cho phép.

0%

5%

10%

15%

20%

A B C D

Coliforms

E.coli

Hình 4.2 : Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm VSV

vượt giới hạn cho phép của mẫu sau 5 ngày bảo quản




3. KẾT QUẢ KIỂM TRA SAU 10 NGÀY BẢO QUẢN

Bảng 4.11: Kết quả kiểm tra mẫu bia tươi A (10 chai )

Bảng 4.12: Kết quả kiểm tra mẫu bia tươi B (10 chai)

Bảng 4.13: Kết quả kiểm tra mẫu bia tươi C (10 chai)




Bảng 4.14: Kết quả kiểm tra mẫu bia tươi D (10 chai)

Bảng 4.15: Kết quả xét nghiệm chung của 4 loại bia sau 10 ngày bảo quản




Nhận xét:

Sau 10 ngày bảo quản, có sự tác động của thời gian vận chuyển từ nơi sản xuất

đến các đại lý bán hàng, nhiệt độ bảo quản, và tác động cơ học làm thay đổi tính

chất của một số hợp chất có trong bia, chính các yếu tố này làm cho hệ VSV có

trong bia phát triển tốt hơn, do đó số lượng cũng tăng nhiều hơn.

Trong 40 mẫu được kiểm tra trong 4 loại bia tươi thì có 11/40 mẫu đạt

(27,5%) và 29/40 mẫu không đạt (72,5%). Bia tuơi B tỷ lệ đạt cao nhất là 40%, kế

đến là bia tươi C và bia tươi A có tỷ lệ đạt là 30%, bia tươi D có tỷ lệ đạt thấp nhất

10%.

Bảng 4.16: Tỷ lệ nhiễm vi sinh vật vượt quá giới hạn cho phép của 4 loại bia tươi

sau 10 ngày bảo quản

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

A B C D

Đạt

Không đạt

Hình 4.3 :Biểu đồ so sánh khả năng bảo quản của 4 loại bia sau 10 ngày




Nhận xét:

Qua biểu đồ trên cho thấy sau 10 ngày bảo quản, bia tươi D có tỷ lệ

nhiễm vi sinh vật vượt quá giới hạn cao nhất (TSVKHK 50%,Coliforms 90%, E.coli

60%), kế đến là bia tươi A (TSVKHK 40%, Coliforms 70%, E.coli 50%), bia tươi C

(TSVKHK 40%, Coliforms 70%, E.coli 30%), bia tuơi B có tỷ lệ nhiễm vi sinh vật

vượt giới hạn cho phép thấp nhất.

Như vậy, mức độ nhiễm vi sinh vật trong bia ngày càng cao về những

ngày cuối của hạn sử dụng, nguyên nhân có thể do:

• Tại các nhà máy sản xuất bia tươi, hệ thống lọc và tách chiết bia còn

hạn chế về kĩ thuật, một số nhà máy còn lọc khung bản, lao động thủ

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

A B C D

TSVKHK

Coliforms

E.coli

Hình 4.4 : Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm VSV

vượt quá giới hạn cho phép của mẫu sau 10 ngày bảo quản




công, vệ sinh sức khỏe nhân công chưa được chú trọng nên đây cũng là

nguồn lây nhiễm cần khắc phục.

• Quá trình sản xuất bia và vận chuyển dối với dòng sản phẩm bia tươi

chưa được chu đáo do đó có ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm.

• Tại các đại lý phân phối sản phẩm quá trình bảo quả sản phẩm chưa

đúng yêu cầu, các hệ thống bảo quản chưa hợp vệ sinh.

• Vì bia tươi là sản phẩm bia không qua thanh trùng nên có thời gian bảo

quản ngắn, chai nhựa tái sử dụng nên không đảm bảo.

• Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên cho thấy vệ sinh an toàn đối với dòng bia

tươi chỉ là tương đối, so sánh tất cả các mẫu thử đều nhiễm VSV. Yếu

tố này phụ thuộc nhiều vào phương thức sản xuất và quản lý của nhà

máy.

4. NHẬN XÉT CHUNG

Kết quả kiểm tra vi sinh của 4 loại bia tươi sau 10 ngày bảo quản cho thấy, bia

tươi B được bảo quản khá tốt vì ít bị nhiễm vi sinh vật nhất, kế đến là bia tươi C, A

khả năng bảo quản tương đối, nhưng tỷ lệ nhiễm vi sinh vẫn ở mức cao. Khả năng

nhiễm vi sinh đối với bia tươi D quá cao, cần có phương pháp cải thiện chất lượng

vệ sinh an toàn thực phẩm để sản phẩm được bảo quản tốt hơn.

Qua kết quả kiểm tra trên, ta nhận thấy tùy theo thời gian bảo quản mà mức độ

nhiễm khuẩn khác nhau, mức độ càng cao về những ngày cuối của hạn sử dụng, tỷ

lệ không đạt theo chỉ tiêu Coliform cao hơn 2 chỉ tiêu còn lại, một vài sản phẩm đã

bị hỏng trước thời hạn sử dụng, chứng tỏ tình hình vệ sinh trong các sản phẩm bia

tươi vẫn chưa được tốt.




Chương V

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN:

Trước tình hình các sản phẩm thực phẩm bị ảnh hưởng của vấn đề vệ

sinh an toàn thực phẩm, người tiêu dùng có tâm lý lo ngại khi sử dụng các

sản phẩm được sản suất trong nước thì sản phẩm bia tươi cũng không

tránh khỏi sự ngờ vực này.

Vì thời gian thực hiện đề tài quá ngắn nên tôi chỉ tiến hành kiểm tra các

chỉ tiêu vi sinh như tổng số vi khuẩn hiếu khí , Coliform và Escherichia coli

của các sản phẩm bia tươi đang có mặt trên thị trường thành phố như C, B,

D, A… nhằm mục đích khảo sát độ an toàn của từng sản phẩm và đưa ra

nhận xét tổng quan về khả năng vệ sinh an toàn đối với các sản phẩm bia

tươi trên thị trường thành phố ngày nay.

Tuy nhiên theo kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 4 nhãn hiệu bia tươi với 40

mẫu kiểm tra chúng tôi đưa ra kết luận như sau:

Ø Sau 1 ngày bảo quản:

Bốn loại bia tươi: A, B, C, D đều đạt tiêu chuẩn vệ sinh.


Bia tươi A : 8/10 mẫu đạt (tỷ lệ 80%)

1/10 mẫu vượt quá giới hạn cho phép đối

với Coliforms (tỷ lệ 10%)


với E.coli (tỷ lệ 10%)

Bia tươi B : 10/10 mẫu đạt (tỷ lệ 100%)

Bia tươi C: 9/10 mẫu đạt (tỷ lệ 90%)



Bia tươi D : 8/10 mẫu đạt (tỷ lệ 80%)









Bia tươi A : 3/10 mẫu đạt (tỷ lệ 30%)


với TSVKHK (tỷ lệ 40%)





Bia tươi B : 4/10 mẫu đạt (tỷ lệ 40%)







Bia tươi C : 3/10 mẫu đạt (tỷ lệ 30%)







Bia tươi D : 1/10 mẫu đạt (tỷ lệ 10%)










Trong 4 loại bia đã kiểm tra thì sản phẩm bia tươi B là có khả năng bảo

quản tốt và tỷ lệ nhiễm vi sinh thấp, so với bia tươi D thì khả năng nhiễm

VSV khá cao, bên cạnh đó một vài mẫu của sản phẩm này còn thấy hiện

tượng kết tủa sau vài ngày bảo quản.

2. KIẾN NGHỊ:

Từ những kêt quả trên cho thấy rằng mức độ an toàn của dòng sản

phẩm này trên thị trường Thành phố là không cao. Tuy bia tươi là sản phẩm

gần gũi đối với người lao động tuy nhiên do mức độ ảnh hưởng của VSV

mà có thể gây hại đến sức khỏe người tiêu dùng nếu sử dụng các sản

phẩm cận hay hết hạn sử dụng.

Nhìn chung bia tươi cũng mang lại nguồn kinh tế rất lớn cho Quốc

gia, với nguồn thu nhập của một bộ phận dân số nước ta ngày nay thì bia

hơi vẫn là sản phẩm tiêu dùng phù hợp với túi tiền. Chính vì vậy, các nhà

máy sản xuất cần phải có những chiến lược thích hợp, đặc biệt là chất

lượng và vệ sinh an toàn đối với sản phẩm của nhà máy mình. Bên cạnh đó

nhà nước cũng cần qan tâm hơn đến chất lượng dòng sản phẩm bia tươi

này để đảm bảo quyền lợi và sức khỏe của người tiêu dùng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. Tài liệu Tiếng Việt:




1. Bùi Ái (2005), Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực

phẩm ,NXB Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh.

2. Bộ Công thương, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Tài liệu hướng dẫn sản

xuất sạch hơn Ngành sản xuất bia, Cơ quan biên soạn Hợp phần

sản xuất sạch hơn trong công nghiệp

3. Hoàng Đình Hòa( 2002), Công nghệ sản xuất malt và đại mạch, NXB

Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội

4. Nguyễn Khánh Hoàng, Bài giảng Công nghệ sản xuất đồ uống, Viện

Công nghệ sinh học và Thực phẩm.

5. Khoa Hóa thực phẩm và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách

Khoa Hà Nội(1996), Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản

xuất thực phẩm, NXB Giáo dục.

6. Nguyễn Đức Lượng( 2006),Công nghệ vi sinh tập 3 Thực phẩm lên

men truyền thống, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

7. Nguyễn Đức Lượng ( chủ biên)(2003), Thí nghiệm Công nghệ sinh

học Tập 2 Thí nghiệm vi sinh vật học,NXB Đại Học Quốc Gia TP.

HCM.

8. Tô Minh Châu, Khoa Công nghệ sinh học, Đại học Mở Thành phố

Hồ Chí Minh, Kiểm tra vệ sinh chất lượng sản phẩm.

9. Khoa Công nghệ sinh học, Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh,

Giáo trình thực hành KCS.

10. Thạc sĩ Nguyễn Tiến Dũng, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí

Minh, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Phương pháp kiểm

nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm.

11. Mai Nguyệt Thu Hồng (chủ biên), Trường Đại học Mở Thành phố

Hồ Chí Minh, Khoa Công nghệ sinh học – Bộ môn vi sinh, Giám

định vi sinh vật.

B. Tài liệu Tiếng Anh:

12. K. Sakamoto, W.N. Konings / International Journal of Food Microbiology 89 (2003) 105–124, Review article Beer spoilage




bacteria and hop resistance, Received 4 September 2002; accepted 15 March 2003

13. R. Satokari et al. / International Journal of Food Microbiology 45 (1998) 119- 127, Detection of beer spoilage bacteria Megasphaera and Pectinatus by polymerase chain reaction and colorimetric microplate hybridization, Received 19 May 1998; received in revised form 3 September 1998; accepted 18 September 1998

14. International Journal of Food Microbiolog) 35 ( 1997) 29- 39, Physiology and development of Pectinatus cerevisiiphilus and Pectinatus fiisingensis, two strict anaerobic beer spoilage bacteria, Received 3 July 1996: revised I I October 1996; accepted I7 October 1996 C. Tài liệu internet:

15. http://vi.wikipedia.org/wiki/Bia_(đồ_uống) 16. http://vozforums.com/showpost.php?p=2221291&postcount=75


Documents

LuanVan PhuongHa Langnhachkiem Net