M0023 Obecna Mikrobiologie Distancni Text III

Projekt OP RLZ Opatření 3.2-0309

Tento projekt je spolufinancován evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Dokument byl vytvořen s finanční podporou Evropské unie a České republiky. Obsah tohoto dokumentu je plně v zodpovědnosti příjemce grantu a nelze jej v žádném případě považovat za oficiální stanovisko Evropské unie a České republiky.

Obecná mikrobiologie III - Genetika mikroorganizmů a nebuněčné formy života Distanční text

© 2007

Obecná mikrobiologie III - Genetika mikroorganizmů a nebuněčné formy života

24. října 2007 Strana 2/65

Obsah 1. Základní pojmy z genetiky mikroorganizmů ............................................................... 4

1.1 Základní pojmy z genetiky mikroorganizmů ............................................................. 4 1.2 Kontrolní otázky......................................................................................................... 6

2. Chromozomy mikroorganizmů, jejich replikace a vyjádření genetické informace . 8 2.1 Struktura nukleových kyselin..................................................................................... 8 2.2 Kontrolní otázky....................................................................................................... 11 2.3 Chromozom mikroorganizmů .................................................................................. 11 2.4 Kontrolní otázky....................................................................................................... 13 2.5 Realizace genetické informace................................................................................. 13 2.6 Kontrolní otázky....................................................................................................... 15

3. Extrachromozomální dědičnost mikroorganizmů ..................................................... 16 3.1 Plazmidy bakterií...................................................................................................... 16 3.2 Kontrolní otázky....................................................................................................... 17 3.3 Extrachromozomální dědičnost kvasinek................................................................. 18

Plazmidy kvasinek .......................................................................................................... 18 Mitochondriální dědičnost .............................................................................................. 18

3.4 Kontrolní otázky....................................................................................................... 18 4. Mutace mikroorganizmů.............................................................................................. 19

4.1 Mutace...................................................................................................................... 19 Fenotypový projev mutací .............................................................................................. 22 Oprava mutace ................................................................................................................ 23

4.2 Kontrolní otázky....................................................................................................... 24 4.3 Mutageny.................................................................................................................. 24 4.4 Kontrolní otázky....................................................................................................... 25 4.5 Transpozice .............................................................................................................. 25 4.6 Kontrolní otázky....................................................................................................... 25

5. Změny genotypu mikroorganizmů způsobené výměnou genetického materiálu.... 27 5.1 Rekombinace u eukaryotických mikroorganizmů.................................................... 27 5.2 Kontrolní otázky....................................................................................................... 28 5.3 Rekombinace u bakterií............................................................................................ 28

Transformace .................................................................................................................. 29 Transdukce...................................................................................................................... 30 Konjugace ....................................................................................................................... 32

5.4 Kontrolní otázky....................................................................................................... 33 6. Viry a jejich základní vlastnosti .................................................................................. 34

6.1 Obecná charakteristika virů...................................................................................... 34 6.2 Kontrolní otázky....................................................................................................... 35



6.3 Klasifikace virů ........................................................................................................ 35 6.4 Kontrolní otázky....................................................................................................... 36

7. Morfologie virů ............................................................................................................. 37 7.1 Tvar a velikost virů .................................................................................................. 37 7.2 Kontrolní otázky....................................................................................................... 38 7.3 Chemické složení virů .............................................................................................. 38 7.4 Kontrolní otázky....................................................................................................... 39 7.5 Struktura virů............................................................................................................ 39 7.6 Kontrolní otázky....................................................................................................... 42

8. Reprodukční cyklus virů I ........................................................................................... 43 8.1 Životní cyklus virů ................................................................................................... 43 8.2 Kontrolní otázky....................................................................................................... 45 8.3 Živočišné viry a jejich reprodukce ........................................................................... 45

Viry s genomovou dvouřetězcovou (±)DNA.................................................................. 46 Viry s jednořetězcovou DNA ......................................................................................... 47 Viry s dvouřetězcovou (±)RNA...................................................................................... 47 Viry s jednořetězcovou (+)RNA..................................................................................... 47 Viry s jednořetězcovou (-)RNA...................................................................................... 48 Viry s (+)RNA přepisovanou do DNA........................................................................... 49

8.4 Kontrolní otázky....................................................................................................... 50 8.5 Viry bakterií a jejich reprodukce.............................................................................. 51

Virulentní a temperované bakteriofágy .......................................................................... 54 8.6 Kontrolní otázky....................................................................................................... 56 8.7 Rostlinné viry a viry hub.......................................................................................... 56

Rostlinné viry.................................................................................................................. 56 Viry hub (mykoviry)....................................................................................................... 57

8.8 Kontrolní otázky....................................................................................................... 57 9. Reprodukční cyklus virů II.......................................................................................... 59

9.1 Studium bakteriofága ............................................................................................... 59 9.2 Kontrolní otázky....................................................................................................... 60

10. Ostatní nebuněčné struktury považované za živé a patogeneze virových nákaz.... 61 10.1 Viroidy, pseudoviry a satelitní virové částice .......................................................... 61 10.2 Priony ....................................................................................................................... 61 10.3 Kontrolní otázky....................................................................................................... 62 10.4 Patogeneze virových nákaz ...................................................................................... 62 10.5 Kontrolní otázky....................................................................................................... 64



1. Základní pojmy z genetiky mikroorganizmů

Popis lekce:

V této lekci vyučující vysvětlí základní genetické pojmy – genom, gen, chromozom, extrachromozomální dědičnost, alela, homozygot a heterozygot, rozdíly mezi haploidní a diploidní buňkou, vztah mezi genotypem a fenotypem.

Klíčová slova:

gen, genom, genotyp, fenotyp, chromozom, extrachromozomální dědičnost, plazmid

Délka lekce:

75 minut

Výklad:

1.1 Základní pojmy z genetiky mikroorganizmů

Souhrn biologických znaků, které jsou v procesu reprodukce předávány na potomstvo, se označuje jako dědičnost. Ta zajišťuje kontinuitu biologického druhu. Studiem jevů dědičnosti a proměnlivosti se zabývá genetika.

Přestože se mikroorganizmy řídí stejnými zákony dědičnosti jako vyšší organizmy, v některých ohledech se od nich odlišují. Liší se především svou větší proměnlivostí, která je způsobena hlavně tím, že většina mikroorganizmů se rozmnožuje vegetativně v haploidní fázi, kdežto tělo vyšších organizmů se skládá z diploidních buněk a haploidní jádro mají pouze gamety. Proto se u mikroorganizmů projevují i recesivní změny genetického materiálu.

Mikroorganizmy jsou pro studium genetických zákonitostí velmi vhodným objektem, pokusy s nimi jsou časově nenáročné, protože mikroorganizmy mají krátkou generační dobu, která vede k rychlé selekci některých mutantů. Od vyšších organizmů se mikroorganizmy liší také tím, že chromozomy eukaryotických mikroorganizmů mají mnohem menší rozměry, a proto je nelze bezpečně rozlišit pomocí elektronového mikroskopu. Jejich počet se zjišťuje pouze z výsledků genetických analýz.

Rychlé rozmnožování mikroorganizmů, možnost získání velkého počtu jedinců za poměrně jednoduchých a dobře opakovatelných podmínek i možnost jednoduchého zjištění zmutovaných jedinců vytvořily z mikroorganizmů vhodné modelové organizmy pro genetické studie a umožnily získat základní poznatky o dědičnosti, platné i u vyšších organizmů včetně člověka.

Dědičné znaky organizmů se dědí jako vlohy – geny – pro tyto znaky. Na potomstvo jsou tedy přenášeny geny. Gen je základní jednotkou dědičnosti a je dán úsekem na DNA, který udává složení jedné molekuly bílkoviny nebo RNA, nebo má regulační funkci. Soubor všech genů organizmu se označuje jako genom.

Každý gen se může vyskytovat v různým formách, alelách, tj. ve standardní alele (tj.



v původní funkční formě) nebo v pozměněné formě, tedy ve zmutované alele. Diploidní jádro eukaryotické buňky má dvě sady chromozomů, takže každý gen se zde vyskytuje dvakrát. Chromozomy obsahující identické geny se označují jako homologické. Jestliže jsou alely určitého genu na obou homologických chromozomech totožné, říkáme, že tento gen je v homozygotním stavu. Gen, který je na homologických chromozomech v odlišných alelách, je v heterozygotním stavu. U prokaryotických organizmů obsahuje jádro pouze jednu molekulu DNA, geny v jejich jádře jsou tedy pouze v jedné kopii.

Geny jsou na chromozomu seřazeny lineárně, což umožňuje sestavení genetické mapy. Každý gen daného druhu má na chromozomu specifické místo označované jako lokus. U bakterií jsou geny pro jednotlivé enzymy určité metabolické dráhy umístěny vedle sebe a nazývají se cistrony.

Vlastnosti daného jedince jsou dány celkovým genetickým vybavením, souhrnem všech genů, které představují genetickou informaci – genotyp. Projev genotypu je závislý na podmínkách vnějšího prostředí. Projev genotypu za daných vnějších podmínek se označuje jako fenotyp. Fenotyp je tedy odrazem genotypu v určitých podmínkách vnějšího prostředí. Daný genotyp se různých podmínkách může projevit různě. Pokud je změna podmínek tak intenzívní, že vede k nápadně odlišnému fenotypu, hovoříme o modifikaci, která se projeví u převážné části mikrobiální populace a jedná se o proces reverzibilní. Po odstranění podmínek vyvolávajících změnu se populace vrací do „normálního“ stavu v poměrně krátké době.

U eukaryotických organizmů může být fenotypový projev genu v heterozygotním stavu stejný jako fenotyp jedné alely, která je dominantní. Druhá alela je recesivní – neprojevuje se. Fenotyp také může být intermediární mezi oběma alelami, pak jde o tzv. semidominanci. Fenotypové vyjádření jednotlivých genů závisí také na ostatních genech genomu, na genetickém pozadí. Jestliže se gen A nemůže fenotypově projevit v přítomnosti genu B, říkáme, že gen A je ke genu B hypostatický. Gen B je epistatický ke genu A, neboť potlačuje jeho fenotypové vyjádření. Pro epistatické geny se také používá termín supresory (supresorové geny).

U prokaryotických buněk je genetická informace soustředěna především do jedné molekuly DNA prokaryotického chromozomu, který představuje genom prokaryotické buňky. Ten nese informace o životně důležitých činnostech buňky. Vedle chromozomu může prokaryotická buňka obsahovat extrachromozomální genetický materiál, plazmidy, které nesou informaci pro buňku postradatelnou.

Eukaryotické mikroorganizmy mají podobně jako prokaryotické převážnou část informací soustředěnou v jaderné DNA (chromozomech). Část informací je uložena také v mitochondriích nebo v plazmidech.

Pro viry slouží jako genetický materiál buď DNA nebo RNA, které jsou uloženy v bílkovinných obalech.

Mikroorganizmy jsou velmi vhodným objektem pro nejrůznější genetické studie, a proto byly mnohé z nich zvoleny jako modelové organizmy, na kterých lze zobecnit např. procesy replikace, transkripce a translace i pro vyšší organizmy. Mezi modelové mikroorganizmy lze zařadit bakterii Escherichia coli (obr. 1.1) nebo kvasinku Saccharomyces cerevisiae. Mikroorganizmy jsou výhodné zejména z toho důvodu, že se mohou rychle rozmnožovat, dále tím, že jsou tvořeny pouze jednou buňkou a jejich jádra mohou být haploidní. Proto u nich lze bezprostředně detekovat výskyt recesivních mutací, které se u diploidních buněk ihned neprojevují.



A B

Obr. 1.1: Bakterie Escherichia coli. (A) Snímek z elektronového mikroskopu, (B) růst bakterií na Petriho misce.

Escherichia coli je nejprostudovanějším organizmem vůbec, genom této bakterie byl jako první kompletně sekvencován. Tato bakterie se také nejvíce používala a používá pro fyziologické, biochemické a genetické výzkumy. Druhým významným modelovým mikroorganizmem je Saccharomyces cerevisiae (obr. 1.2). Tato kvasinka je prvním eukaryotickým organizmem, u kterého byla zjištěna celá sekvence nukleotidů v genomové DNA. Zároveň tento mikroorganizmus může existovat v haploidním stavu, což umožňuje snadnou přípravu nejrůznějších mutantních kmenů. Haploidní formy kvasinek lze křížit, získávat tak diploidní kultury, jejichž sporulací získané haploidní potomstvo lze podrobovat klasické genetické analýze. Saccharomyces cerevisiae obsahuje přirozený jaderný plazmid, který se stal základem pro přípravu kvasinkových vektorů, používaných v genovém inženýrství. Význam této kvasinky jako modelového organizmu vzrostl dále poté, co se ukázalo, že řada jejích životních dějů má analogii v obdobných procesech v savčí buňce.

Obr. 1.2: Saccharomyces cerevisiae, snímek z elektronového mikroskopu.

1.2 Kontrolní otázky

• Jaký je rozdíl mezi diploidní a haploidní buňkou?

• Vysvětlete následující pojmy: gen, alela, genom, genotyp, fenotyp.



• Jaké jsou rozdíly mezi dominantní a recesivní alelou a mezi epistatickým a hypostatickým genem?

• Mohou mít mikroorganizmy genetickou informaci lokalizovanou i mimo chromozomy? Vysvětlete.

• Proč jsou mikroorganizmy výhodnými modelovými organizmy pro genetické studie? Které znáte modelové mikroorganizmy?



2. Chromozomy mikroorganizmů, jejich replikace a vyjádření genetické informace

Popis lekce:

V této lekci vyučující popíše primární, sekundární a terciární strukturu nukleových kyselin a funkční a strukturní rozdíly mezi DNA a RNA. Dále potom charakterizuje chromozomy bakterií, virů a eukaryotické chromozomy. Poté bude studentům objasněn princip replikace deoxyribonukleové kyseliny a exprese genetické informace v buňkách.

Klíčová slova:

nukleová kyselina, DNA, RNA, šroubovice, dusíkaté báze, chromozom, replikace, transkripce, translace

Délka lekce:

60 minut

Výklad:

2.1 Struktura nukleových kyselin

Nositelem dědičnosti mikroorganizmů a některých virů je dvouřetězcová DNA. Genetická informace je dána pořadím purinových a pyrimidinových bází v molekule nukleové kyseliny. Přenos genetické informace z mateřské buňky do dceřiné je při vegetativním rozmnožování dán semikonzervativní replikací DNA, která spočívá v tom, že se podle jednoho řetězce DNA syntetizuje doplňkový řetězec na principu párování bází (A-T, G-C). Tím vznikají z jedné molekuly DNA dvě molekuly o zcela stejném pořadí bází jako měla původní molekula. Každá z těchto nových molekul má tedy jeden řetězec původní a jeden nově syntetizovaný.

Nukleové kyseliny jsou vedle proteinů druhým základním biologickým polymerem. Zatímco proteiny řídí biochemické reakce a tak přímo vykonávají jednotlivé životní funkce, nukleové kyseliny obsahují ve své struktuře zakódovanou informaci pro syntézu těchto proteinů. Nukleové kyseliny jsou lineární polymery nukleotidů, což jsou sloučeniny jedné z pěti heterocyklických dusíkatých bází, cukru ribózy a fosforečné kyseliny. Hlavní řetězec tvoří alternující cukr a fosfát spojené esterickými vazbami Báze jsou deriváty buď purinu (adenin, guanin) nebo pyrimidinu (cytozin, tymin, uracil). V přírodě se kromě nukleových kyselin vyskytují v kofaktorech enzymů, ve sloučeninách účastnících se energetického metabolizmu a v neživé přírodě v dehtech a podobných materiálech vzniklých degradací tkání. Jejich sloučeniny s ribózou se nazývají nukleozidy. Ty se označují zkratkami z velkých počátečních písmen názvů, tedy A, G, C, T, U.

Řetězec nukleových kyselin je orientovaný, má 5´ a 3´ konec, které se chemicky liší charakterem atomu uhlíku, na němž je koncová -OH skupina. Je zvykem zapisovat pořadí



bází v nukleových kyselinách od 5´ konce k 3´ konci: 5´-GTACT-3´.

Známe dva typy nukleových kyselin: ribonukleovou kyselinu (RNA) a deoxyribonukleovou kyselinu (DNA). RNA obsahuje ribózu a na ní vázané báze adenin, guanin, cytozin a uracil. DNA obsahuje 2´-deoxyribózu a báze adenin, guanin, cytozin a tymin. Nositelem genetické informace bývá obvykle DNA, RNA má pomocné funkce při její expresi.

Molekuly DNA mají na rozdíl od molekul proteinů a RNA téměř vždy stejnou a charakteristickou sekundární strukturu, nezávislou na sekvenci bází. Je to pravotočivá dvoušroubovice (obr. 2.1) typu B. Je ze dvou protistojných řetězců, které jsou antiparalelní, t.j. jeden probíhá od 5´ k 3´ a druhý naopak a oba se vinou kolem sebe. Jejich báze jsou v rovinách kolmých na osu, schované uvnitř struktury.

Obr. 2.1: Struktura molekuly DNA.

Vinutí řetězců vytváří na povrchu dvoušroubovice dvě rýhy nebo žlábky: široký žlábek a úzký žlábek. Struktura molekuly DNA je téměř všude stejná, nezávislá na typu přítomných jednotek (bází). Na povrchu dvoušroubovice je vystaven hydrofilní hlavní řetězec, rozpoznávaný replikačními a reparačními enzymy, které kontrolují integritu DNA, zatímco báze, které nesou genetickou informaci, jsou schované uvnitř, chráněné před reaktivními látkami. Přesné přečtení této informace ovšem vyžaduje rozplést dvoušroubovici, což je energeticky velmi náročné a pro zachování informace riskantní.

Báze ze dvou protistojných řetězců jsou uvnitř dvoušroubovice ve stabilních párech, jejichž rozměry jsou přibližně stejné: A se páruje s T a G s C. To umožňuje zachovat pravidelnou strukturu. Báze se v páru k sobě vážou vodíkovými můstky (obr, 2.2) pomocí vhodně umístěných donorových a akceptorových atomů. Říkáme, že báze A a T resp. G a C jsou komplementární, protože se jejich skupiny komplementují (doplňují) pro vytvoření H-můstků, které stabilizují pár. Párování bází vodíkovými můstky udržuje celou dvoušroubovicovou strukturu; navíc se stabilizačně mohou uplatňovat (méně významně) i hydrofobní interakce heterocyklických kruhů v patrech nad sebou. Tato stabilizace dvoušroubovicové struktury je mocným mechanizmem, který řídí všechny procesy, jichž se nukleové kyseliny účastní a je na ní založena i velká část molekulárně-biologických metod. A



se páruje s T dvěma H-můstky, G s C třemi. A s C a G s T se nepárují, protože donorové a akceptorové atomy k sobě nepasují.

Obr. 2.2: Komplementární párování bází v molekulách DNA.

Při teplotě obvykle mezi 85 a 95oC oba řetězce DNA od sebe oddělí - DNA denaturuje. Na rozdíl od bílkovin je denaturace DNA díky velmi pravidelné struktuře reverzibilní; za vhodných podmínek se komplementární řetězce zase najdou a přesně spojí komplementárními bázemi při tzv. renaturaci. Protože síla vazby mezi G a C (3 můstky) je větší než mezi A a T (2 můstky), záleží teplota denaturace DNA Tm na obsahu GC. Podle Tm se tak dá zjišťovat obsah GC. Ve většině nukleových kyselin se obsah basí blíží hodnotám náhodného zastoupení (t.j. každá base tvoří 1/4), které umožňuje dosáhnout nejvyššího informačního obsahu.

Schopnost nukleových kyselin najít za vhodné teploty v roztoku komplementární sekvenci se dá využít i pro párování denaturované DNA se syntetickými oligonukleotidy, které nesou sekvenci komplementární k části DNA, nebo pro tvorbu párů dvou různorodých DNA s částečně komplementárními sekvencemi a dokonce i pro tvorbu komplexů DNA-RNA. Spárováním cizorodých řetězců do dvoušroubovice vznikají tzv. heteroduplexy. Protože obecně vznikají hybridy nukleových kyselin, nazývá se tento proces hybridizace (obr. 2.3). Tato reakce má obrovskou schopnost rozlišovat dokonale komplementární sekvence od částečně komplementárních.

Obr. 2.3: Denaturace a renaturace (hybridizace) DNA.



Jednořetězcová DNA a RNA tvoří rozmanité sekundární struktury právě podle obsahu bází, které se spolu ve vhodných sekvencích spojují H-můstky do krátkých dvoušroubovic a tvoří různé smyčky, vlásenky (obr. 2.4) nebo křížové struktury.

Obr. 2.4: Tvorba vlásenky u jednořetězcových molekul nukleových kyselin.


• Které jsou stavební kameny nukleových kyselin?

• Jaké jsou rozdíly mezi molekulami DNA a RNA?

• Popište pravidlo komplementárního párování bází v molekulách nukleových kyselin.

• Popište dvoušroubovici molekuly DNA.

• Charakterizujte princip hybridizace. Jaký má tento děj význam? Na čem závisí teplota tání molekuly DNA?

• Mohou jednořetězcové molekuly nukleových kyselin vytvářet sekundární struktury?

2.3 Chromozom mikroorganizmů

Genetický materiál prokaryotické buňky není soustředěn do pravého jádra, tedy útvaru, který je diferencován jako samostatná organela. Jádro bakteriální buňky (nukleoid, bakteriální chromozom) není od cytoplazmy ohraničeno membránou. Zaujímá asi 15 % objemu buňky, ale váhově činí jen asi 3 % sušiny. Morfologicky nemá jádro stálý tvar a představuje jednu molekulu dvoušroubovicové DNA, neobsahuje histony (jako eukaryotické jádro), avšak na molekulu DNA jsou navázány 4 druhy proteinů „histonům podobných“ (histone-like) a jádro tak vytváří kompaktní komplex vyššího řádu. Bakteriální chromozom je napojen na vnitřní stranu cytoplazmatické membrány většinou prostřednictvím mesozomu.

In vivo je ale struktura dlouhých molekul DNA často určena proteiny, které ji obalují. U bakterií i jiných prokaryot bývají molekuly DNA kruhové a superspiralizované. Mají asi o 5 % závitů méně (neboli 1 negativní závit navíc na každých 200 bází) než odpovídá normální struktuře B. Specifické enzymy gyrázy vytvářejí superspiralizaci tak, že přeruší oba řetězce kruhové DNA, protočí jeden proti směru přirozeného vinutí a zase řetězce spojí a to tak dlouho, dokud není vytvořeno odpovídající napětí.

Tato negativní superspiralizace má zřejmě usnadnit energeticky náročné rozpletení dvoušroubovice v okamžicích, kdy je třeba sekvenci bází, tedy genetickou informaci, přesně



přečíst, jako při replikaci, transkripci a rekombinaci. Uvnitř buňky jsou i superspiralizované molekuly drženy proteiny v pokud možno kruhovém stavu, což vede k napětí asi 40 kJ/mol, které stačí k rozpletení 10-12ti AT párů. Po vyizolování DNA a odstranění proteinů dostaneme pak molekulu s odpovídajícím počtem levotočivých závitů vyššího řádu, která má nikoli kruhový, ale spíš zkroucený uzlíkovitý tvar.

V jádře bakterií je uložena genetická informace buňky. Instrukce pro stavbu a činnost buňky je rozdělena do funkčních jednotek, genů. Nerostoucí bakteriální buňka má pouze jedno jádro, je tedy haploidní (obsahuje daný gen v jedné alele) a nedělí se mitózou. V buňce, která roste, je ve stejné době uskutečňován jak vlastní růst buňky, tak i replikace chromozomu. Protože replikace chromozomu předbíhá dělení buňky, může buňka obsahovat i 4 chromozomy. Je-li dělení buněk poškozeno nebo zpomaleno, avšak replikace DNA není změněna, vznikají vláknité vícejaderné buňky.

Chromozom eukaryotických mikroorganizmů, tj. kvasinek a mikromycet, má charakteristickou strukturu eukaryotického chromozomu. Eukaryotická DNA má daleko složitější vyšší struktury, velmi charakteristické a jednotné v celé této obrovské skupině organizmů (obr. 2.5).

Obr. 2.5: Úrovně kondenzace eukaryotického chromozomu.

Dvoušroubovice DNA je navinuta na proteinová tělíska z 8mi molekul bazických proteinů histonů, Molekula DNA spolu s histony vytváří tzv. nukleozomy. Asi 150bp je na tělísku v necelých dvou otáčkách a 50bp v mezeře. Vlákno je podobné korálkům na šňůrce, asi 10nm široké a DNA v něm délkově kondenzuje 6x. 10 nm vlákno se hustě šroubovitě stáčí do tzv. solenoidu (vlákno 30 nm široké, kondenzace 40x) a ten se napojuje na nehistonové proteiny,



které jej složí do smyček vlákna 300 nm (kondenzace 1000x). V tomto stavu existuje DNA in vivo v interfázi; při mitotické kondenzaci chromozomů se zkrátí 300 nm vlákno složitým způsobem ještě asi 10x.


• Popište bakteriální chromozom.

• Uveďte úrovně kondenzace bakteriálního chromozomu.

• V čem se odlišují chromozomy bakterií a kvasinek?

2.5 Realizace genetické informace

Realizace genetické informace (exprese genu) v buňce spočívá v tom, že se podle jednoho řetězce DNA syntetizují na principu párování bází ribonukleové kyseliny. Na rozdíl od DNA se však adenin páruje s uracilem a cukernou složkou je ribóza. Syntéza RNA se označuje jako přepis genetické informace – transkripce (obr. 2.6).

Obr. 2.6: Realizace genetické informace v buňkách.

Složení všech bílkovin v buňce, tj. pořadí jednotlivých aminokyselin v bílkovinách, je dáno pořadím bází v příslušných molekulách mediátorové (informační) RNA (obr. 2.7), která se označuje jako mRNA. Pořadí aminokyselin je v mRNA zakódováno tak, že určitá trojice bází znamená určitou aminokyselinu (tzv. tripletový kód). Protože ze čtyř bází je možno vytvořit 64 kombinací po třech bázích a aminokyselin je jen 20, jsou některé aminokyseliny kódovány několika triplety (kodony) a navíc tři triplety (UAG, UAA, UGA) neznamenají žádnou aminokyselinu a nazývají se nesmyslné (terminační) kodony.



Obr. 2.7: Struktura typické prokaryotické mRNA.

Syntéza bílkovin probíhá tak, že molekula mRNA prochází ribozomy a podle ní jsou prostřednictvím transferových RNA (tRNA) seřazovány jednotlivé aminokyseliny. Každá aminokyselina má alespoň jednu specifickou tRNA, která má ve své molekule určité místo, kam se váže daná aminokyselina.

Obr. 2.8: Struktura molekuly tRNA.

Vodíkovými můstky mezi některými bázemi je řetězec tRNA v určitých místech propojen tak, že vytváří prostorový útvar s několika nepárovými úseky ve tvaru kliček (obr. 2.8). Na vrcholu jedné kličky je tzv. antikodon, což jsou doplňkové báze ke kodonu dané aminokyseliny. Jednotlivé tRNA se napojují antikodonem na kodon mRNA v ribozomu, a tím přenášejí svou aminokyselinu na správné místo při syntéze bílkoviny. Tím tRNA převádějí pořadí bází v mRNA na pořadí aminokyselin v bílkovině a překládají tak genetickou informaci. Hovoříme proto o překladu genetické informace neboli translaci. Konce jednotlivých bílkovin jsou vyznačeny terminačními kodony.

DNA eukaryot obsahuje v genu kódujícím určitou bílkovinu také úseky bez kódovací funkce. Úseky DNA, které nemají kódovací funkci, se nazývají introny a úseky s kódovací funkcí jsou exony (obr. 2.9). V eukaryotických buňkách je přítomen systém enzymů, který rozpozná přepis intronů do mRNA a z mRNA jej vyřízne. Zbylé exony jsou pak spojeny, aby mohly sloužit v ribozomech jako předloha pro syntézu příslušné bílkoviny. DNA prokaryot introny neobsahuje a prokaryotní buňky také nemají vyvinutý enzymový systém pro vyříznutí přepisů



intronů z mRNA.

Obr. 2.9: Srovnání prokaryotického a eukaryotického genu.

Životnost mRNA v buňce je velmi nízká, u bakterií do deseti minut, u kvasinek kolem 20 minut. To znamená, že mRNA se v buňce neustále syntetizují a odbourávají, takže se v buňce rychle odstraní ta mRNA, podle níž by se tvořily nepotřebné bílkoviny.


• Jaký je tok genetické informace v buňkách mikroorganizmů?

• Popište transkripci a translaci.

• Jaká je sekundární struktura molekuly tRNA? Jakou má funkci?

• Ve kterých buněčných útvarech probíhá syntéza proteinů u prokaryotických a eukaryotických mikroorganizmů?

• Uveďte rozdíly mezi geny prokaryotických a eukaryotických organizmů.



3. Extrachromozomální dědičnost mikroorganizmů

Popis lekce:

V úvodu lekce vyučující vysvětlí význam extrachromozomální genetické informace pro buňku, následně popíše strukturu plazmidů, rozdíly mezi plazmidy bakterií a kvasinek.

Klíčová slova:

extrachromozomální dědičnost, plazmid, konjugativní plazmid,

Délka lekce:

45 minut

Výklad:

3.1 Plazmidy bakterií

Některé vlastnosti mikroorganizmů jsou ovládány geny, jež nejsou součástí chromozomální DNA. Jde o geny, které jsou součástí plazmidové DNA bakterií nebo kvasinek a mitochondriální DNA eukaryotických mikroorganizmů. Pro mimochromozomální geny je charakteristické, že ovládají vlastnosti, které nejsou pro život buňky nezbytně nutné.

Jako plazmid se u mikroorganizmů označuje samostatný replikon tvořený dvoušroubovicovou DNA (obr. 3.1). Plazmidy nesou informace, které buňka může postrádat, tzn. že nenesou informace o základních životních funkcích buňky (např. dělení buňky). Pokud však buňka plazmidy obsahuje, vykazuje specifický fenotypový projev (např. získání rezistence k antibiotiku).

Membrána Peptidoglykan

Plazmid Chromozom Ribozom

Obr. 3.1: Lokalizace plazmidů v buňce bakterií.

Plazmidy mají podstatně menší velikost než chromozomální DNA. Plazmid daného typu se může v buňce vyskytovat pouze v jedné kopii (plazmid jednokopiový) nebo je v buňce přítomno více kopií téhož plazmidu (plazmid vícekopiový). Pokud buňka obsahuje geneticky stejné nebo příbuzné plazmidy, vstupují do vztahu, který se označuje jako kompatibilita nebo



inkompatibilita. Kompatibilní jsou ty plazmidy, které se v buňce mohou vyskytovat současně a do potomstva jsou předávány jako relativně stálá složka genomu. Inkompatibilní plazmidy se nemohou vyskytovat současně v jedné buňce. Přenos těchto plazmidů do potomstva není homogenní.

Plazmidy zpravidla nesou jen několik genů, maximálně několik desítek genů. Zpravidla kódují jednu nebo i více vlastností bakteriální buňky. Plazmidy mohou buňce udělovat určité fyziologické vlastnosti navíc, jež v konkrétní situaci mohou buňku zvýhodňovat nebo mohou být rozhodující z hlediska jejich ekologického uplatnění, např. schopnost využívat neobvyklých živin nebo být rezistentní vůči antibiotikům.

Další charakteristickou vlastností některých plazmidů je schopnost začlenit se jednoduchým crossing-overem do chromozomu hostitelské buňky. Do dceřiných buněk se potom přenáší takový plazmid jako integrální součást chromozomu po řadu generací. Potom hovoříme o integrovaném stavu plazmidu. Z integrovaného stavu může plazmid přecházet zpět do volného stavu (autonomní stav). Plazmidy vyznačující se touto vlastností se označují jako plazmidy epizomální. Některé plazmidy mohou být do jiných buněk přenášeny konjugací, tzv. konjugativní plazmidy. Pokud plazmid tuto vlastnost nemá (nekonjugativní plazmid), je možné jej do recipientní buňky přenést jiným způsobem (transformací nebo transdukcí). Pro všechny konjugativní plazmidy je společná existence genů zodpovědných za přenos plazmidové DNA do buňky. Fenotypovým projevem těchto genů je syntéza pili, které umožňují vazbu donorové a recipientní buňky.

Rozdělení plazmidů je prováděno na základě určitého významného znaku nebo souboru znaků projevujících se ve fenotypu. Obvykle jsou uváděny tyto skupiny:

• plazmidy konjugativní

• R plazmidy – plazmidy rezistentní, které nesou informaci o rezistenci k antibakteriálním látkám včetně antibiotik. Jeden plazmid může nést informaci k více látkám, takže vznikají polyrezistentní kmeny.

• Col plazmidy – nesou informaci o syntéze antibakteriálních kolicinů některých zástupců čeledi Enterobacteriaceae. Kmeny syntetizující koliciny se označují jako kolicinogenní.

• kryptické plazmidy – jejich fenotypový projev není dosud znám.


• Kde jsou v bakteriální buňce lokalizovány plazmidy?

• V kolika kopiích se mohou v buňkách bakteriích vyskytovat plazmidy?

• Jaká je funkce plazmidů?

• Které typy bakteriálních plazmidů znáte?



3.3 Extrachromozomální dědičnost kvasinek

Plazmidy kvasinek

Nízkomolekulární dvouřetězcová DNA kruhové struktury byla zjištěna u některých kvasinek, např. Saccharomyces cerevisiae nebo Schizosaccharomyces pombe.

Nejlépe byl prostudován plazmid S. cerevisiae, nazývaný podle délky své molekuly DNA 2 μm DNA. Vyskytuje se v jádře v 60 – 100 kopiích na diploidní buňku. Replikace tohoto plazmidu probíhá obdobným způsobem jako replikace chromozomální DNA a vyžaduje také stejné enzymy. Zahájení replikace plazmidu 2 μm probíhá synchronně s replikací DNA chromozomální. Plazmid 2 μm, podobně jako další kvasinkové plazmidy, se využívá v genovém inženýrství pro klonování (pomnožení) a expresi živočišných genů v buňkách S. cerevisiae.

Mitochondriální dědičnost

Mitochondriální dědičnost byla nejlépe prostudována u kvasinek. Jejími hlavními znaky jsou mitotická segregace a nemendelovské segregační poměry při meióze.

Nejčastější mitochondriální mutací u kvasinek je ztráta schopnosti dýchání, tj. schopnosti spotřebovávat plynný kyslík a využívat necukerné zdroje energie. Takové mutanty získávají energii pouze zkvašováním cukrů a rozmnožují se i na cukerných médiích pomaleji než standardní kmeny (tvoří menší kolonie). Respiračně deficitní mutanty kvasinek mají negativní význam v kvasném průmyslu, neboť jsou méně výkonné (také anaerobní glykolýza je u nich pomalejší než u standardních typů).


• Které mimochromozomální elementy mohou nést genetickou informaci u kvasinek?

• Kde je lokalizován kvasinkový plazmid 2 μm?

• Pro které funkce nese geny mitochondriový genofor?



4. Mutace mikroorganizmů

Popis lekce:

V této lekci vyučující vysvětlí termín mutace a dále objasní rozdíl mezi spontánními a indukovanými mutacemi, jejich frekvenci, následně pak rozdělí mutace na základě několika kritérií. Rovněž část lekce bude věnována faktorům, které nejčastěji způsobují mutace. Poslední část lekce bude věnována transpozonům.

Klíčová slova:

mutace, mutagen, spontánní a indukovaná mutace, delece, inzerce, substituce, transpozice, auxotrofní mutant

Délka lekce:

180 minut

Výklad:

4.1 Mutace

Genetická informace kódovaná v DNA (případně RNA) není absolutně stabilním jevem. Přežití mikroorganizmů v daném prostředí je umožněno vedle dědičnosti i jejich proměnlivostí. Proměnlivost je však možná pouze v určitých mezích. Změna genotypu u mikroorganizmů může být uskutečňována dvěma mechanizmy – mutací nebo rekombinací.

Mutace je náhlá změna genotypu, které podléhá pouze nepatrná část mikrobiální populace a postihuje malou část genotypu buňky. Rekombinací se může dosáhnout větší změny genotypu. U eukaryotických buněk vzniká splynutím samčí a samičí gamety zygota, v níž se kombinuje genetická informace obou rodičů. U bakterií je přenos genetické informace rekombinací rozdílný a informace přenesená z donorové buňky do recipientní představuje opět pouze malou část genotypu. U prokaryotických organizmů se rozlišují tři způsoby přenosu genetické informace z donorové do recipientní buňky – transformace, konjugace a transdukce.

Mutace je možno definovat jako kvalitativní nebo kvantitativní změnu v genetické informaci daného organizmu. Na molekulární úrovni lze mutaci vysvětlit jako trvalou změnu v pořadí bází v DNA (nebo RNA některých virů).

Vzhledem k tomu, že DNA buňky při dělení bakterií přechází do obou dceřiných buněk, je možno vzniklou mutaci u haploidních organizmů zjistit hned v následující generaci. U diploidních organizmů se projeví v určité části po meióze po oplodnění.

U mikroorganizmů rozeznáváme spontánní (samovolné) mutace, tj. mutace vznikající bez známých vnějších příčin samovolně nebo mutace indukované, které vznikly po působení určitého chemického nebo fyzikálního faktoru (mutagenu) na DNA. Spontánní mutace vznikají pravděpodobně chybou při replikaci DNA nebo působením skrytého vlivu prostředí



(znečištění kultivačního média, metabolity, kosmické záření apod.). Rychlost vzniku spontánních mutací, frekvence mutace, je u mikroorganizmů poměrně nízká (10-7 – 10-10 na buňku a generační dobu). V případě indukovaných mutací je frekvence podstatně vyšší. Molekulární princip vzniku spontánních i indukovaných mutací je stejný.

Podle rozsahu změny genetického materiálu lze mutace rozdělit do 3 skupin – mutace genové, chromozomové a genomové.

Při genových mutacích dochází ke změně velmi malého úseku DNA, obvykle změnou jednoho páru bází (bodové mutace) (obr. 4.1). Ke změně dochází většinou pouze na jednom řetězci, což se při replikaci projeví napojením jiné báze. Při bodových mutacích může nastat tzv. tranzice (výměna purinové báze za jinou purinovou bázi nebo pyrimidinové za jinou pyrimidinovou bází) nebo transverze (výměna purinové báze za pyrimidinovou a naopak).

Změna tranzicí je obvykle vyvolána některými mutagenními činidly, především analogy bází (purinových i pyrimidinových), hydroxylaminem a alkylačními činidly, která mohou způsobovat i transverze.

Další příčinou bodových mutací jsou inzerce nebo delece, vsunutí nové báze nebo ztráta jedné báze z řetězce DNA (obr. 4.1). Inzerce a delece jsou způsobeny tzv. interkalačními činidly, která účinkují za replikace DNA a mají největší účinek na extrachromozomální DNA. Tranzice a transverze vedou ke změně smyslu kódu, zatímco inzerce a delece mění také smysl čtení kódu.

V důsledku bodových mutací dochází k takové chybě, že vznikají mutace s chybným smyslem (missense mutace), kdy kodon kóduje jinou aminokyselinu, což vede ke vzniku bílkoviny, která má jinou funkci (v důsledku jiného aminokyselinového složení). Mohou také vznikat mutace beze smyslu (nonsense mutace), kdy mutací vznikne kodon nekódující žádnou aminokyselinu. U těchto mutací je zastavena syntéza bílkoviny na tomto kodonu, takže vznikne krátký peptidický řetězec. Nesmyslné mutace tak vedou ke ztrátě dané vlastnosti.

Mutanty vzniklé inzercí nebo delecí se fenotypově chovají podobně jako nonsense-mutanty, neboť se podle jejich mRNA syntetizuje bílkovina, která má úplně jiné pořadí aminokyselin, než je tomu u standardního, tj. nezmutovaného typu.



Divoký typ (normální fenotyp)

Inzerce a deleceDelece způsobující mutaci s chybným smyslem

SubstituceBez efektu na sekvenci aminokyselin

Nesmyslná mutace

Nesmyslná mutace

Mutace s chybným smyslem

Delece 3 nukleotidů –čtecí rámec nezměněn

Obr. 4.1: Typy genových mutací.

Chromozomové mutace jsou takové, u nichž se změna DNA týká jejího delšího úseku než u bodových mutací, obvykle několika genů (obr. 4.2). Mechanizmus vzniku spočívá ve zlomu jednoho nebo více chromozomů a jejich chybným spojením. Chromozomové mutace jsou známy pouze u eukaryotických organizmů. Těchto mutací je několik typů a mezi nejvýznamnější patří: koncová deficience (ztráta na koncové části chromozomu), interkalární delece (ztráta na vnitřní části chromozomu), inverze (převrácení části chromozomu), translokace (přemístění části chromozomu na jiný chromozom), duplikace (zdvojení totožné části chromozomu). Hlavní účinek těchto mutací spočívá v tom, že působí rušivě při meióze ve stadiu párování chromozomů, čímž se snižuje sporulační schopnost a vznikají neživotné spóry. Frekvence chromozomových mutací se zvyšuje činidly způsobujícími zlomy chromozomů, tj. rentgenovým nebo γ-zářením a v menší míře také ultrafialovým světlem.

A B C D E původní stav A B C koncová deficienceA B E interkalární delece A B E D C inverze A B C D E K L M translokace A B C B C D E duplikace A B C C B D E duplikace A B C C B B C D E triplikace

Obr. 4.2: Schéma chromozomových mutací. Písmena označují jednotlivé geny.

Genomové mutace se vyskytují pouze u eukaryot a spočívají ve změně počtu chromozomů.



Tento jev vede ke vzniku polyploidních nebo aneuploidních buněk. Aneuploidii je možné definovat jako ztrátu nebo nadbytečnou přítomnost jednotlivých chromozomů (vedle normální sady). Nejčastějším typem je ztráta jednoho chromozomu (monozomie) nebo přítomnost tří homologických chromozomů (trizomie). Polyploidie znamená přítomnost více úplných chromozomových sad (3, 4, 5 nebo 6, tzn. tri- tetra-, penta-, hexaploidní buňky). Jádra mikroorganizmů o vyšší ploiditě jsou nestabilní a rozpadají se při mitóze na dvě jádra o polovičním počtu chromozomových sad.

Genomové mutace jsou poměrně rozšířeny u kvasinek, u nichž vedou ke zvětšení jejich velikosti a zvyšují stabilitu jejich vlastností. Naproti tomu však polyploidní kvasinky velmi málo sporulují.

Pokud mutantní mikroorganizmus vznikl bodovou mutací, může se vrátit zpět (revertovat) na původní divoký typ. Reverzí se tedy obnovuje původní pořadí nukleotidů. Obnovení původního stavu lze dosáhnout tranzicí nebo transverzí. Zpětnou mutací se může také vytvořit jiný triplet, který kóduje stejnou aminokyselinu, potom hovoříme o operační reverzi. Dojde-li při zpětné mutaci k vytvoření kodonu pro jinou aminokyselinu, která obnovuje biologickou funkci proteinu jde o intragenovou supresi (supresorové mutace). O intragenové supresi hovoříme i v případě, kdy je inzercí včleněn nukleotid, který byl odstraněn delecí (obnoví se správné čtení kódu).

Fenotypový projev mutací

Mutace mají za následek změnu v sekvenci nukleotidů v molekule DNA. Produktem genu je bílkovinný řetězec, proto se bude změna genu odrážet v pořadí aminokyselin peptidického řetězce. Tyto změny se projeví tak, že nasyntetizovaná bílkovina bude částečně nebo úplně inaktivní v důsledku změněného katalytického místa. Pozměněná bílkovina může být také citlivější na faktory vnějšího prostředí nebo si zachová původní aktivitu, jestliže nedojde k podstatným změnám aminokyselin. Bílkoviny, které tvoři komplex, mohou mít pozměněné alosterické funkce.

Mutanty se obvykle dělí podle toho, který gen byl mutací zasažen:

• morfologické mutanty, které je možné detekovat mikroskopicky – mutované buňky mají např. výrazně protáhlý tvar. Mutací se rovněž mění i tvar a struktura kolonií, např. změna mukózních kolonií (M) na hladké (S) až drsné (R).

• fyziologické mutanty lišící se od divokých typů citlivostí k antibiotikům, teplotě, bakteriofágům, ve schopnosti konjugace, sporulace nebo u kvasinek změnou párovacího typu.

• biochemické mutanty, pro něž je charakteristická změna metabolické dráhy, např. ztráta schopnosti syntetizovat některé důležité faktory (auxotrofní mutanty).

Toto rozdělení je ovšem subjektivní, protože jak změny morfologické, tak i fyziologické jsou ve své podstatě odrazem změn biochemických. Vzniklý fenotyp je výsledkem vyvolané změny metabolizmu.

Auxotrofní mutant je takový organizmus, který mutací ztratil schopnost syntetizovat růstový faktor (vitamin, aminokyselinu, puriny nebo pyrimidiny). Tito mutanti rostou pouze na kompletních půdách, obsahujících látku, kterou sami nejsou schopni syntetizovat. Např.



auxotrofní mutant k leucinu (označen leu-) poroste jen v prostředí obsahujícím leucin. Auxotrofní mutanty se izolují z divokých, prototrofních kmenů, které rostou na tzv. minimálních syntetických půdách, protože buňky jsou schopny syntetizovat růstové faktory. Prototrof samozřejmě roste i na půdách kompletních. Těchto vlastností se využívá při izolaci auxotrofních mutantů. Po vystavení účinku mutagenu je suspenze buněk vyseta na pevné kompletní médium, kde porostou kolonie prototrofů i auxotrofů. Potom pomocí „razítka“ přeočkujeme na půdu minimální, na které vyrostou jen prototrofní buňky. Porovnáním umístění kolonií na miskách s oběma půdami můžeme identifikovat auxotrofní mutanty. Nahromadění auxotrofních mutantů pomocí penicilinu je metoda používaná u bakterií citlivých k penicilinu. Penicilin účinkuje pouze na množící se buňky, tzn., že při naočkování prototrofních a auxotrofních buněk do minimální půdy budou přežívat pouze auxotrofní mutanty (obr. 4.3).

Obr. 4.3: Schéma penicilinové metody izolace auxotrofních mutantů.

Mikroorganizmy rezistentní k antibiotikům vznikají mutacemi genů na chromozomu nebo plazmidech divokých kmenů citlivých k danému antibiotiku. Mutace na rezistenci k antibiotiku mohou vznikat spontánně a detekce mutantů se pak provádí na selektivní půdě obsahující určité antibiotikum. K mutaci došlo již před navozením kontaktu buňky s antibiotikem. Mutace k vysokým koncentracím antibiotika vzniká buď v několika stupních (např. k penicilinu) nebo v jednom stupni (např. ke streptomycinu).

Oprava mutace

Podobně jako u jiných organizmů jsou i u mikroorganizmů přítomny opravné mechanizmy, reparační systémy, které mohou vzniklé dimery pyrimidinů odstraňovat. U bakterií a kvasinek zřejmě funguje několik takových systémů. Některé z nich nepracují přesně, a proto vedou ke vzniku mutací. K opravným systémům patří fotoreaktivace a reparace bez účasti viditelného světla.

Fotoreparace (fotoreaktivace – oprava za světla) spočívá v tom, že intenzívní viditelné světlo aktivuje v buňkách enzym (fotoreaktivační enzym), který rozštěpí kovalentní vazby



mezi dimery a vrátí DNA do původního stavu.

Reparace bez účasti viditelného světla funguje za světla i za tmy. Zahrnuje několik opravných procesů, které se vzájemně liší přesností opravy. Nejpřesněji pracuje tzv. excizní oprava, která se uplatňuje pouze u buněk, u nichž právě nedochází k replikaci DNA.


• Jakými mechanizmy může docházet ke změně genetické informace?

• Vyjmenujte typy mutací a charakterizujte je.

• Jaké jsou rozdíly mezi spontánními a indukovanými mutacemi? Co způsobuje tyto mutace?

• Jakým způsobem se u mikroorganizmů mohou projevovat mutace?

• Vysvětlete princip izolace auxotrofních mutantů.

• Popište, jak může docházet k opravám mutací u mikroorganizmů.

4.3 Mutageny

Indukované mutace jsou vyvolány chemickými nebo fyzikálními faktory. Mutageny nevyvolávají specifické mutace, ale mutace v různých místech molekuly DNA. Indukují tedy mutace v různých genech.

Chemické mutageny způsobují změny ve struktuře DNA chromozomů přímým nebo nepřímým zásahem. V mikrobiologii jsou nejčastěji využívány:

• analogy bází, které se díky své struktuře mohou zabudovat do nové molekuly DNA, což vede ke změně její struktury,

• kyselina dusitá vyvolává oxidativní deaminaci bází,

• hydroxylamin vyvolává tranzice ve směru CG → AT, protože reaguje výhradně s cytozinem,

• alkylační činidla (yperit, dimetylsulfonan) začleňují do bází alkylovou skupinu, a proto dochází k tautomerii bází a tedy i k tranzici,

• akridinová barviva (zvláště proflavin) vyvolávají deleci nebo inzerci jednoho nebo více nukleotidů v DNA. U eukaryotických mikroorganizmů jsou těmito látkami vyvolávány i změny v mitochondriální DNA.

Z fyzikálních mutagenů je nejčastěji využíváno ionizující záření (rentgenové záření, γ-záření, protony, neutrony a elektrony, ultrafialové záření o vlnové délce 250 – 270 nm), ultrazvuk nebo tepelný šok. Ionizující záření vyvolává změny v bázích nebo způsobuje zlomy molekuly DNA. Předpokládá se, že v přítomnosti O2 mohou ionizujícím zářením vznikat peroxidové radikály, které mají vliv na tvorbu zlomů chromozomů. UV světlo o vlnové délce 265 nm je nejvíce absorbováno DNA. Mechanizmus účinku UV světla spočívá v tvorbě kovalentních vazeb mezi sousedními pyrimidinovými bázemi na jednom řetězci



DNA (obr. 4.4). Vytvořené dimery brání průběhu replikace DNA a jsou pro buňku letální.

Obr. 4.4: Poškození molekuly DNA účinky UV záření.


• Které znáte chemické mutageny? Jak působí na buňku mikroorganizmů?

• Které znáte fyzikální mutageny? Popište poškození molekuly DNA v důsledku působení UV záření.

4.5 Transpozice

Některé poměrně krátké úseky DNA se často přemisťují, a to buď mezi různými místy chromozomální DNA nebo mezi plazmidem a chromozomem nebo mezi různými plazmidy. Takové „skákací“ úseky se nazývají transpozony. U bakterií patří mezi transpozony např. některé geny zodpovědné za rezistenci k určitému antibiotiku nebo skupina takových genů, neboť někdy jsou součástí plazmidu, jindy součástí chromozomu. Od epizomů i ostatních plazmidů se však liší tím, že se nemohou replikovat samy, neboť neobsahují úsek zajišťující autonomní replikaci. Mohou se tedy replikovat pouze jako součást chromozomu nebo některého plazmidu.

U kvasinek byly nejlépe prostudovány transpozony nazývané Ty1 a Ty2, zjištěné u Saccharomyces cerevisiae. Jejich zapojení na nové místo chromozomu se děje syntézou DNA pomocí reverzní transkriptázy. Tyto retrotranspozony se napojují přednostně v genech pro tRNA a v promotorech různých genů. Vsunutí částice Ty do genu má za následek poškození funkce genu a projevuje se tedy fenotypově jako mutace. U regulačních mutantů je příčinou změny regulace přítomnost transpozonu Ty v promotoru příslušného strukturního genu.


• Stručně popište mechanizmus transpozice.

• Jaké znáte transpozony u bakterií a jaké u kvasinek?





5. Změny genotypu mikroorganizmů způsobené výměnou genetického materiálu

Popis lekce:

V této lekci vyučující popíše mechanizmy rekombinace u prokaryot a eukaryot. Zaměří se na meiózu eukaryot a potom charakterizuje jednotlivé typy rekombinace u bakterií, tj. konjugaci, transformaci a transdukci.

Klíčová slova:

rekombinace, mitóza, meióza, konjugace, transformace, transdukce, bakteriofág

Délka lekce:

90 minut

Výklad:

5.1 Rekombinace u eukaryotických mikroorganizmů

Kromě mutací způsobuje změnu genotypu také výměna genetického materiálu, která je umožněna tzv. rekombinacemi; probíhá jednak při pohlavním rozmnožování, při tzv. parasexuálních cyklech plísní, dále při přenosu genetického materiálu pomocí speciálních přenašečů (vektorů) a velmi vzácně i při mitotickém dělení jádra.

Jádro kvasinek obsahuje 17 chromozomů a 3 fragmenty. Chromozomy jsou metacentrické a na rozdíl od bakterií mohou být funkčně příbuzné geny lokalizovány na různých chromozomech.

Buňky Saccharomyces cerevisiae je možno udržovat v haploidní nebo diploidní fázi životního cyklu. Při pohlavním rozmnožování splývají dvě haploidní buňky do diploidní zygoty. Pohlavní rozmnožování je největším zdrojem proměnlivosti u eukaryotických mikroorganizmů. Křížením dvou jedinců lišících se ve dvou genech vznikají spory o dvou různých genotypech, přičemž dva jsou rodičovského typu.

Meióza je charakteristická redukčním dělením a párováním homologních chromozomů, synapsí probíhající před redukčním dělením (obr. 5.1). Při synapsi je každý chromozom již podélně rozdělen na dvě chromatidy spojené centromerou. Během redukčního dělení jeden chromozom z daného páru putuje k jednomu pólu jádra a druhý ke druhému pólu zcela nezávisle na tom, od kterého z rodičů pocházel. V tomto případě se uplatňuje volná kombinovatelnost platící pouze pro geny umístěné na nehomologních chromozomech. Při synapsi však může docházet k překřížení (crossing-overu) chromatid různých centromer. To vede k výměně úseku chromozomů, důsledkem čehož je vznik rekombinovaných genotypů. Potom bude mít každá spora jiný genotyp a jsou označovány jako tetratypové (TT). V závislosti na zmenšující se vzdálenosti genů od centromery klesá i frekvence TT, ale zůstává zachován součet rodičovských a rekombinovaných genotypů (AB + ab = Ab + aB).



Meióza I Meióza II

Mitóza

Obr. 5.1: Rozdíly mezi mitózou a meiózou.

Rekombinovaný genotyp vzniká i tehdy, jsou-li oba studované geny na témže chromozomu. Charakteristické pro toto křížení je, že součet spor rodičovských genotypů je vyšší než součet genotypů rekombinovaných. Frekvence rekombinací je určována z počtu tetratypů a vzdálenosti mezi danými znaky jako polovina procenta tetratypů.

Ke stanovení štěpných poměrů křížení u mikroorganizmů je využívána tzv. tetrádová analýza. Ta však předpokládá vytváření 4 spor ve vřecku. Z tohoto důvodu je pohlavní rozmnožování z genetického hlediska prostudováno jen u některých askomycet, např. u S. cerevisiae nebo Schizosaccharomyces pombe. Jde o mikroorganizmy, v jejichž asku jsou vytvářeny vždy 4 spory. Tetrádovou analýzou je možné zjistit vazbu genů, vazbu mezi genem a centromerou apod.


• Vysvětlete obecně princip rekombinace.

• Jakým způsobem dochází k výměně genetického materiálu u kvasinek?

• Popište mechanizmus redukčního dělení a uveďte rozdíly oproti mitóze.

• Vysvětlete pojem crossing-over.

• K čemu slouží tetrádová analýza?

5.3 Rekombinace u bakterií

U prokaryotických organizmů neexistuje sexuální proces v pravém slova smyslu, protože u nich nedochází k úplné fúzi buněk, ale z donorové buňky se přenáší pouze část jejího



genetického materiálu do buňky recipientní. Původní genom se označuje jako endogenot a přenášená část DNA donorové buňky jako exogenot. Proto nemůže vzniknout zygota, ale neúplná zygota, merozygota. Merozygota není stabilním stavem, krátce po jejím vytvoření dochází ke crossing-overu mezi homologickými úseky endogenota a exogenota za vzniku rekombinantního chromozomu s následným vyštěpením rekombinantní buňky (rekombinanta). U bakterií byly dosud popsány tři typy rekombinací: transformace, transdukce a konjugace.

Transformace

Transformace je proces přenosu genů z donorové do recipientní buňky bez mezibuněčného kontaktu (obr. 5.2). Rekombinantní buňka se označuje jako transformant. Podle typu přijaté DNA jsou transformanti rekombinantní, kdy se přenáší fragment chromozomální DNA donora rekombinující s homologními úseky původního chromozomu, nebo plazmidoví – přenos neporušeného plazmidu, který se v recipientní buňce replikuje jako samostatný replikon.

Obr. 5.2: Transformace u bakterií.

Chromozomální DNA donora a recipienta musí být homologní s přibližně stejnou sekvencí nukleotidů. Rekombinantní transformanti tedy vznikají přenosem DNA kmenů stejného nebo velice příbuzného druhu, aby mohlo dojít ke crossing-overu mezi homologními úseky DNA. Přenos plazmidové DNA je možné uskutečnit mezi různými druhy nebo i různými rody bakterií (obr. 5.3).



Obr. 5.3: Schéma přenosu rezistence ke streptomycinu transformací.

Pro uskutečnění transformace musí být recipientní buňky ve stavu kompetence. Kompetencí se označuje schopnost buňky přijmout cizorodou DNA. Kompetence závisí na fyziologickém stavu buňky a jde v podstatě o přizpůsobení buněčné stěny a cytoplazmatické membrány propustit fragmenty DNA donorové buňky. Je největší ve střední části logaritmické fáze růstu. Stav kompetence lze zvýšit i úpravou povrchu buněk (např. působením CaCl2).

Transdukce

Transdukcí se označuje přenos DNA z donorové buňky do recipientní za účasti bakteriofága (obr. 5.4). Fág obvykle nepřenáší celý chromozom, ale pouze fragment DNA. Fág uskutečňující přenos se nazývá transdukující fág.



Obr. 5.4: Mechanizmus transdukce.

Rozlišujeme dva typy transdukce – nespecifická, při níž je přenášen libovolný fragment DNA donora a specifická, kdy jsou přenášeny pouze určité geny. V obou případech jsou transdukující fágy defektní, protože jejich genom není tvořen výhradně fágovou DNA a ztrácejí schopnost lyzovat buňku hostitele. Přenos znaků transdukcí byl popsán u mnoha bakterií, např. Escherichia, Salmonella, Bacillus, Staphylococcus aj. Buňka, která přijala DNA přenesenou bakteriofágem se označuje jako transduktant a může být trojího typu (obr. 5.5):

• transduktant rekombinantní – přenesený fragment chromozomální DNA rekombinuje s odpovídajícím úsekem DNA recipientní buňky.

• transduktant abortivní – po přenesení fragmentu chromozomální DNA nedochází k rekombinaci a zůstává v buňce bez následné replikace. Při dělení buňky přechází fragment pouze do 1 dceřiné buňky.

• transduktanti plazmidoví – vznikají po přenesení plazmidu do recipientní buňky.



Obr. 5.5: Schématické znázornění vzniku různých typů transduktantů.

Při nespecifické transdukci může při reprodukci fága v donorové buňce (B+) dojít k tomu, že se do kapsidu místo fágové DNA uzavře fragment bakteriálního chromozomu nebo plazmid. Po lyzi infikované buňky tak získáme směs netransdukujících fágů (obsahujících fágovou DNA) a transdukujících defektních fágů (obsahujících fragment chromozomální DNA nebo plazmid). Po infekci recipientní buňky (B-) netransdukujícím fágem dojde po proběhnutí reprodukčního cyklu k její lyzi. Po infekci transdukujícími částicemi proniká do recipientní buňky přenesený fragment DNA, který může rekombinovat s homologními úseky DNA. Fenotypově se potom recipientní buňka změní na B+.

Konjugace

Přenos genetického materiálu cestou přímého kontaktu mezi oběma buňkami se označuje jako konjugace. Recipientní buňka, která přijala DNA z donorové buňky, se nazývá transkonjugant. Podobně jako u jiných přenosů DNA jsou možné tři typu transkonjugantů:

• rekombinantní transkonjuganti – přenesený fragment DNA nekombinuje s odpovídajícím úsekem chromozomu.

• plazmidoví transkonjuganti – přenesený konjugativní plazmid se replikuje v recipientní buňce jako samostatný replikon.

• abortivní transkonjuganti – přenesená DNA se nereplikuje. Získaný znak se po několika generacích „vytrácí“.

Aby mohla být konjugace uskutečněna, musí být konjugační buňky „opačné polarity“. Ta je dána specifickým faktorem – fertilitním faktorem (F faktor). F faktor je cirkulární dvouřetězcová DNA s autonomní replikací. Jde tedy o konjugativní plazmid, který nese specifické geny zodpovědné za proces konjugace a také geny determinující specifické struktury povrchu buňky (např. pili), které jsou nezbytné pro konjugaci. Pili umožňují



vzájemný kontakt mezi buňkami a sexuální pili jsou potom zodpovědné za vlastní přenos DNA prostřednictvím konjugačního můstku.

Buňky nesoucí fertilitní faktor jsou označovány jako F+ a vystupují jako buňky donorové. Buňka recipientní bez F faktoru se označuje jako F-. Konjugaci je možné uskutečnit pouze mezi buňkami F+ a F-. Při konjugaci je F faktor přenášen do recipientních buněk s frekvencí blízké 100 %. Tyto buňky potom vystupují v úloze donorů. Získáním F faktoru získávají recipientní buňky pouze znaky nesené na plazmidu. Nejsou tedy přenášeny znaky lokalizované na chromozomu.

Přenos F plazmidu. V donorové buňce je nejprve jeden řetězec F plazmidu naštěpen endonukleázou na specifickém místě. Lineární řetězec potom svým 5´koncem konjugačním můstkem vstupuje do recipientní buňky. Podle něj se buňce syntetizuje komplementární řetězec. Druhý řetězec původního plazmidu zůstává v donorové buňce a slouží jako matrice pro syntézu komplementárního řetězce (obr. 58). Přenos F plazmidu probíhá velmi rychle.

Plazmid F se může v buňce vyskytovat v buňce ve stavu volném nebo integrovaném. Buňka, která má plazmid v integrovaném stavu a vykazuje stejné vlastnosti, jako když je plazmid ve stavu autonomním. F plazmid se může začlenit na různých místech chromozomu jednoduchým crossing-overem. Tyto buňky se označují jako Hfr buňky (high frequency of recombination).


• Vysvětlete následující pojmy: endogenot, exogenot, merozygota.

• Jaký je princip transformace? Uveďte příklady.

• V jakém stavu musí být buňka, aby mohla přijmout cizorodou DNA?

• Stručně popište mechanizmus transdukce.

• Které dva typy transdukce rozlišujeme? Uveďte příklady.

• Jaké typy transduktantů mohou vznikat?

• Vysvětlete termín konjugace.

• Vysvětlete pojmy fertilitní faktor a Hfr buňky.



6. Viry a jejich základní vlastnosti

Popis lekce:

V této lekci vyučující charakterizuje viry jako nebuněčné formy života a srovná je s ostatními živými organizmy. Následně vyučující provede klasifikaci virů na základě několika různých kritérií (strukturních a tvarových, druhu nukleové kyseliny, napadajících organizmů apod.).

Klíčová slova:

nebuněčné formy života, viry, viriony, DNA viry, RNA viry, bakteriofágy, fytoviry, mykoviry, cyanofágy, provirus

Délka lekce:

60 minut

Výklad:

6.1 Obecná charakteristika virů

Viry jsou nukleoproteinové částice, které nesou určitou genetickou informaci, avšak nemají vlastní enzymové vybavení pro zajištění základních životních funkcí. Jsou považovány za jednoduché biologické jednotky s vlastnostmi živé hmoty. Představují nebuněčné formy, které postrádají některé životně důležité systémy, zejména proteosyntetický aparát. Virově specifické bílkoviny jsou tak syntetizovány prostřednictvím příslušných systémů hostitelských buněk. Proto viry nemohou žít samostatně (autonomně), ale jenom jako vnitrobuněční paraziti. Tento parazitizmus probíhá na genetické a biochemické úrovni, neboť v hostitelské buňce přejímá virový genom informační a řídící funkce potřebné pro tvorbu nových virionů. Přizpůsobivost virů k vnějším podmínkám probíhá u virů jako vnitrobuněčných parazitů také přes hostitelský organizmus.

Viry jsou schopny infikovat vhodnou hostitelskou buňku, tj. přenést tam svou nukleovou kyselinu a využít hostitelova enzymového systému pro svou replikaci. Většina virů poškozuje, případně i ničí hostitelskou buňku nebo ovlivňuje její kontrolní mechanizmy. Některé viry mohou v hostitelské buňce zůstávat v latentním stavu. Jejich genetický materiál se stává součástí genetického materiálu hostitelské buňky jako tzv. provirus.

Jako genomová nukleová kyselina může být přítomna buď DNA, nebo RNA (nejsou přítomny oba typy nukleových kyselin), a to jednak jako jednořetězcová nebo dvouřetězcová. Některé živočišné viry a velká část virů rostlin obsahuje fragmentovanou RNA.

Rovněž rozmnožování virů je odlišné od množení buněčných organizmů v tom, že se neděje binárním dělením, ale syntézou jednotlivých složek (bílkovin, nukleových kyselin) na vrub sloučenin hostitelské buňky. Postupným spojováním těchto složek jsou v procesu množení virů sestavovány nové virové částice – viriony. Viry se tak vyskytují ve dvou fázích: v extracelulární fázi, která se nazývá virion (tzn. virová částice), a v intracelulární (replikační) fázi, která spočívá v replikaci virové nukleové kyseliny uvnitř hostitelské buňky.



Podobně jako hostitelské organizmy, vyznačují se i viry proměnlivostí a schopností vývoje. Tyto procesy však u virů probíhají zpravidla rychleji. Jako příklad lze uvést virus chřipky, u něhož dochází každoročně k částečným změnám v antigenní struktuře, která se tak během 10 – 15 let zcela obmění.

Specifické viry napadají určité živočišné buňky a vyvolávají specifická onemocnění hostitele, jiné napadají rostlinné buňky (fytoviry). Bakteriofágy (fágy) napadají buňky určitých druhů bakterií, mykoviry napadají buňky hub (např. plísní). V posledních letech byly zjištěny i viry napadající sinice (cyanofágy), zelené řasy nebo prvoky. Některé viry mohou střídat hostitele (např. virus vztekliny), jiné mohou být původci určitého typu rakovinných nádorů.


• Charakterizujte viry jako nebuněčné formy života.

• Charakterizujte termín provirus.

• Stručně popište rozmnožování virů.

• Které organizmy mohou viry napadat?

6.3 Klasifikace virů

Viry představují velmi heterogenní skupinu mikroorganizmů. Projevuje se to nejen šíří hostitelů od bakterií, sinic, řas až po rostliny, obratlovce, ale i jejich velkou strukturální variabilitou a reprodukční strategií. Od nejjednodušších kubických virů (Picornaviridae) až po velké složené viry (Poxviridae), stejně variabilní je i struktura jejich genomu.

Existence velkého počtu virových druhů schopných infikovat všechny známé buněčné organizmy si vyžádala jejich systematické rozčlenění. Jako obecná kritéria pro tvorbu systému virů byly přijaty následující vlastnosti virů: typ a organizace virového genomu, replikační strategie viru a struktura virionu.

Základní jednotkou systému virů je druh. Společné vlastnosti v rámci druhu zahrnují: uspořádání genomu, sekvenční homologii (hybridizační vlastnosti), sérologickou příbuznost, vektorový přenos, hostitelský okruh, patogenitu, tkáňový tropizmus a geografické rozšíření. Kritéria pro nižší jednotky nejsou jednotná.

Nejčastěji se viry rozdělují podle typu nukleové kyseliny (obr. 6.1), a to na DNA viry a RNA viry. Pro charakteristiku a klasifikaci virů je důležité, zda virová mRNA syntetizovaná v hostitelské buňce má stejnou komplementární sekvenci nukleotidů s genomovou nukleovou kyselinou virové částice. Řetězce virové mRNA se potom označují jako pozitivní (+), kdežto komplementární matriční řetězce DNA nebo RNA jsou negativní (-).



DNA viry RNA viry

Obr. 6.1: Příklady některých virů.

Dalším kritériem pro dělení virů je skupina organizmů, které mohou napadat (viz kapitola 6.1). Viry můžeme rozdělovat také podle jejich velikosti nebo morfologických vlastností (kapitola o morfologii virů).


• Podle čeho rozdělujeme viry do skupin?

• Jaká je základní taxonomická jednotka systému virů?



7. Morfologie virů

Popis lekce:

V této lekci vyučující popíše tvar virů a srovná jejich velikost s ostatními živými organizmy. Dále pak charakterizuje strukturu virů, včetně jejich chemického složení a vyjmenuje zástupce virů s různými morfologickými strukturami, popíše nukleokapsid, kapsidy s binární a kubickou symetrií a také vnější obal, popř. plášť virů.

Klíčová slova:

virus, virion, kapsid, nukleokapsid, protein, nukleová kyselina, obal, symetrie kapsidu

Délka lekce:

90 minut

Výklad:

7.1 Tvar a velikost virů

Tvar a velikost virů jsou značné rozdílné (obr. 7.1). Většina živočišných virů má kulovitý, případně oválný tvar, odvozený od ikozaedru (dvacetistěnu). Jen některé viry mají podobu cihly (poxviry) nebo náboje (rabdoviry).

Lidská jaterníbuňka

Virus tabákovémozaiky

Obr. 7.1: Tvar a velikost virů.

Podle velikosti se viry rozlišují na malé o průměru 18 – 20 nm (pikornaviry, parvoviry), středně velké dosahují 70 – 100 nm (adenoviry, retroviry) a velké, jejichž průměrná velikost



se pohybuje mezi 150 – 300 nm (paramyxoviry, poxviry).

Rostlinné viry jsou převážně tyčinkovitého tvaru o délce 160 – 2000 nm. Bakteriofágy mohou být podle tvaru bičíkaté, bezbičíkaté nebo vláknité. Bičíkaté a bezbičíkaté fágy obsahují tzv. hlavovou část tvořenou mnohostěnem. U bičíkatých forem je k hlavové části připojen bičík, na jehož konci je často bazální destička s několika jemnými výběžky. Vláknité fágy mají tvar tyčinek.


• Jaký je tvar virů?

• Jak jsou viry velké?

• Jaký tvar mohou mít bakteriofágy?

7.3 Chemické složení virů

Základními složkami virů jsou nukleové kyseliny a proteiny. Některé složitější viry, především obalené, obsahují v menší míře také sloučeniny lipidické a sacharidové povahy.

Nukleové kyseliny jsou u virů, na rozdíl od buněčných organizmů, rozmanitější. Funkci genomu mohou u virů plnit jak DNA, tak i RNA. Jejich molekuly mohou být dvou- nebo jednořetězcové, kruhové či lineární, případně fragmentované.

Dvouřetězcová (±)DNA (dsDNA) se vyskytuje u četných živočišných virů a bakteriofágů, kdežto u rostlinných virů bývá výjimečně. K zvláštnostem lineární formy dvouřetězcové DNA patří přítomnost některých anomálních bází (např. oxymetylcytozin) nebo přemisťování (permutace) genů. Kruhová dvouřetězcová DNA představuje kovalentně uzavřenou molekulu. U některých virů tvoří tzv. superzávitnici. Rozdílnost obou forem DNA se projevuje také v tom, že lineární forma snadněji proniká do hostitelské buňky, zatímco kruhová se rychleji replikuje a kromě toho se může začleňovat do buněčné DNA.

Jednořetězcovou DNA (ssDNA) lineární obsahuje menší část živočišných virů, kruhovou mají některé bakteriofágy. Dvouřetězcová (±) RNA (dsRNA) plní funkci genomu u některých živočišných virů a bakteriofágů. Zvláštností virů s dvouřetězcovou RNA je segmentace genomu. Segmenty v počtu 3 – 12 jsou zpravidla umístěny ve společném nukleokapsidu, s nímž tvoří aktivní infekční jednotku. Jednořetězcová RNA (ssRNA) je přítomna u četných živočišných a rostlinných virů a u některých bakteriofágů. Jednotlivé řetězce mohou mít (+) nebo (-) polaritu a rozdílně utvářené 5´-konce. Častá je i segmentace jednořetězcové genomové RNA. U živočišných virů mají všechny segmenty společný kapsid, zatímco u rostlinných jsou jednotlivé segmenty RNA lokalizovány ve vlastních kapsidech.

Virové bílkoviny obsahují v podstatě stejné aminokyseliny jako bílkoviny buněčné, mohou se však od nich lišit specifickou aminokyselinovou skladbou. Důležitou vlastností kapsidových bílkovin virů je jejich schopnost spontánně vytvářet z identických polypeptidových řetězců, tj. strukturních jednotek (protomer), jednotky morfologické (kapsomery) a z nich pak příslušný kapsid. Tato schopnost je spojena s velmi ekonomickým využíváním genetické informace virů.



Vedle účasti na utváření povrchových struktur plní virové bílkoviny ještě další funkce, mezi něž patří funkce ochranná spočívající v uchovávání virového genomu v nepoškozeném stavu před vnějšími vlivy. Ochranu zajišťuje především kapsid, jehož bílkoviny se vyznačují zvýšenou odolností proti působení proteolytických enzymů. Funkce rozpoznávací je zaměřena na vyhledávání citlivých hostitelských buněk. Tuto schopnost postrádají viry šířené přenašeči. Funkce katalytická se uskutečňuje enzymy kódovanými genomovou nukleovou kyselinou hlavně u složitějších virů. Funkce regulační se projevuje u některých strukturních proteinů, jež mohou ovlivňovat např. replikaci buněčné DNA. Funkce antigenní je dána schopností virových bílkovin vyvolávat v napadeném organizmu tvorbu specifických protilátek.

U obalených virů (např. herpesviry, poxviry, togaviry) se ve vnějším obalu často vyskytují lipidy a sacharidy. Přítomnost sacharidů byla zjištěna i u některých dalších živočišných virů a také bakteriofágů. Mnohé viry obsahují také polyaminy (spermin, spermidin), které mají význam především pro stabilizaci genomové nukleové kyseliny.


• Ze kterých chemických složek je tvořen virion?

• Jakými typy nukleových kyselin může být tvořen virový genom?

• Jaká je struktura a složení virových bílkovin?

• Jakou funkci mají virové bílkoviny?

• Čím je tvořen obal virů?

7.5 Struktura virů

Zralé viriony obsahují jednu molekulu nukleové kyseliny, která je zpravidla uložena v bílkovinném obalu, tzv. kapsidu. Společné označení pro obě složky je nukleokapsid. Strukturními jednotkami kapsidu jsou protomery představující většinou identické polypeptidové řetězce. Jejich spojením nekovalentními vazbami vznikají morfologické jednotky, kapsomery, z nichž je sestaven vlastní kapsid.

Podle způsobu sestavování a výsledného tvaru mohou vznikat kapsidy se symetrickou nebo asymetrickou strukturou. U symetrických kapsidů se obvykle rozlišuje symetrie kubická, závitnicová a binární.

Kapsidy s kubickou symetrií představují mnohostěn s pravidelnými rozměry podél ortogonální osy. Označují se také jako izometrické. Na stěnách o tvaru rovnostranných trojúhelníků jsou rozloženy kapsomery vytvořené nejčastěji z 6 protomer. Proto se nazývají hexamery (hexony). Naproti tomu vrcholy mnohostěnu jsou obsazeny převážně pentamerami (pentony), tj. kapsomerami složenými z 5 protomer (obr. 7.2).



Nukleovákyselina

Obr. 7.2: Struktura kapsidu s kubickou symetrií.

Kapsidy se závitnicovou symetrií jsou sestaveny v podobě šroubovice. Mají tvar tyčinek nebo vláken (obr. 7.3). Spojením protomer vznikají prohnuté diskovité kapsomery, které jsou navzájem vázány za vzniku spirálovitého kapsidu. Ve středu kapsidu vzniká kanálek, ve kterém je ve tvaru závitnice uložená genomová nukleová kyselina. Kapsidy tohoto typu se vyskytují zejména u rostlinných virů.



Obr. 7.3: Viry s různým typem symetrie. a – kapsid s kubickou symetrií (adenovirus), b – kapsid se

závitnicovou symetrií (virus tabákové mozaiky), c – kapsid s binární symetrií (bakteriofág).

Binární symetrie kapsidů je charakteristická především pro některé bakteriofágy. Hlavovou část tvoří obvykle mnohostěn s kubickou symetrií, připojený tyčkovitý bičík je sestaven podle symetrie závitnicové (obr. 7.3). Nukleová kyselina je u těchto fágů umístěna v hlavové části. Genetický materiál většiny bakteriofágů je uložen v kapsidu mnohostěnového tvaru, popř. mohou mít fágy tvar šroubovicové symetrie (fág fd E. coli). T-sudé fágy E. coli (označené T2, T4 a T6) mají kromě mnohostěnové hlavičky obsahující dvouřetězcovou DNA ještě dutý bičík obalený elastickou pochvou. U některých fágů (např. T5) pochva chybí, u jiných je bičík nahrazen krátkým hrotem a některé fágy jsou bez bičíku. Fágy s plně vyvinutým bičíkem (T2, T4) mají na jeho konci hexagonální destičku s hroty a bičíková vlákna (obr. 7.3), která u klidového virionu obtáčejí bičík. Fágy T2 a T4 mají na horním konci bičíku ještě límeček s vlákny, která u zralého virionu přidržují konce bičíkových vláken. Všechny tyto struktury jsou složeny z různých bílkovin.



U řady virů je nukleokapsid pokryt ještě vnějším obalem neboli pláštěm. Tyto viry se označují jako viry obalené (obr. 7.4). Obal je zpravidla složen z dvojité vrstvy fosfolipidů, do níž jsou vnořeny molekuly virově specifických povrchových bílkovin, např. glykoproteinů. Fosfolipidová vrstva je většinou buněčného původu a obaluje povrch kapsidu při průchodu nově vytvořených virionů přes membránové struktury hostitelské buňky.

Kapsid

Kapsid

Nukleovákyselina

Nukleovákyselina

Obal

Hrot

Obr. 7.4: Struktura neobalených (a) a obalených (b) virů.


• V čem se viry odlišují od bakterií?

• Z jakých jednotek je tvořen virový kapsid?

• Popište strukturu virového kapsidu s kubickou symetrií. Uveďte příklady.

• Popište strukturu virového kapsidu se závitnicovou symetrií. Uveďte příklady.

• Popište strukturu bakteriofága. Jakou mají tyto viry symetrii svých kapsidů?

• Uveďte rozdíly mezi obalenými a neobalenými viry.



8. Reprodukční cyklus virů I

Popis lekce:

V této lekci vyučující nejprve obecně charakterizuje životní cyklus virů, zaměří se na první dvě fáze reprodukce virových částic, dále potom popíše třetí fázi reprodukce virů, a sice vlastní reprodukci viru a upozorní na odlišnosti u jednotlivých skupin virů,tj. virů s jednořetězcovou i dvouřetězcovou molekulou DNA, virů s dvouřetězcovou RNA i jednořetězcovou (+)RNA a (-)RNA a retrovirů. Následně pak bude studentům objasněn reprodukční cyklus virulentního a temperovaného bakteriofága.

Klíčová slova:

reprodukce virů, adsorpce virů, penetrace virů, virulentní bakteriofág, temperovaný bakteriofág, DNA viry, RNA viry, retroviry

Délka lekce:

120 minut

Výklad:

8.1 Životní cyklus virů

Jestliže se virus dostane do vnímavé hostitelské buňky, začne se v ní zpravidla množit. Reprodukce viru spojená s tvorbou nových virových částic zahrnuje obvykle několik fází:

1) Adsorpce viru na hostitelskou buňku.

2) Vstup (penetrace) viru do buňky.

3) Vlastní reprodukce viru, během níž probíhají tyto procesy:

a) syntéza virových bílkovin,

b) replikace virového genomu,

c) tvorba nových virionů, jejich dozrávání (maturace) a uvolňování z buňky (eluce).

Časový úsek od adsorpce až po zahájení syntézy nových virionů se nazývá eklipse a doba mezi počátkem interakce viru s buňkou a uvolněním prvních virových částic je označována jako latentní stadium.

Adsorpcí se rozumí připojení viru prostřednictvím zvláštních vazebných míst ke specifickým receptorům hostitelské buňky (obr. 8.1). Příslušné vazebné struktury podmiňující adsorpci virů mají především živočišné viry, bakteriofágy a jejich hostitelské organizmy. Nevyskytují se u většiny fytovirů a rostlin, případně tam, kde je virová infekce uskutečňována mechanicky nebo přenašeči.



HrotBuněčnámembrána

Receptor

Obr. 8.1: Adsorpce živočišných virů na hostitelské buňky. (a) – obalené viry s hroty, (B) neobalené viry.

Po chemické stránce představují vazebná místa virů jednoduché nebo složené proteiny umístěné na výrůstcích obalených a na hrotech kapsidů některých neobalených virů. U jiných neobalených virů mají uvedené vlastnosti povrchové struktury kapsidu. Jako receptory se uplatňují především lipoproteiny a glykoproteiny na povrchu živočišných a bakteriálních buněk.

Penetrace, tj. vstup nebo proniknutí virů do buňky probíhá u virů několika způsoby (obr. 8.2). U obalených živočišných virů je tento děj zpravidla provázen splýváním vnějšího virového obalu s buněčnou membránou. Neobalené viry pronikají do buňky většinou tzv. viropexí podobnou pinocytóze nebo fagocytóze. Během penetrace se viry obnažují, tzn. že se postupně zbavují svého obalu a posléze i kapsidu. Jinak je tomu u bakteriofágů, kde zůstává kapsid na povrchu hostitelské buňky a do cytoplazmy proniká pouze genomová nukleová kyselina fága. Rostlinné viry pronikají do buňky přímo po předchozím narušení buněčné stěny.

Viry vstupující do buňky významně ovlivňují buněčné procesy. Jejich působením dochází především k inhibici syntézy buněčných nukleových kyselin a bílkovin.



Buněčná membrána

Virus v měchýřku

VolnáDNA

Buněčnámembrána

Receptory

Hrot

Obal

Komplex receptor-hrot

Volný nukleokapsid

(a)

(b) Obr. 8.2: Penetrace živočišných virů do hostitelské buňky. (a) – endocytóza (viropexe) neobaleného viru

(herpesvirus), (b) – fúze buněčné membrány a virového obalu (virus příušnic).


• Popište životní cyklus virů.

• Co značí latentní stadium virové infekce?

• Jak vysvětlíte, že hostitelská buňka má receptor pro viry?

• Jakým způsobem získávají obalené viry svůj obal?

• Jaké jsou rozdíly mezi penetrací obalených a neobalených virů?

8.3 Živočišné viry a jejich reprodukce

Reprodukce zahrnuje procesy množení virů. Podle povahy hostitelských buněk se zpravidla rozlišuje reprodukce živočišných, rostlinných a bakteriálních virů.

Pro charakteristiku procesů množení virů je důležité, zda virová mRNA syntetizovaná v hostitelské buňce má stejnou komplementární sekvenci nukleotidů s genomovou nukleovou kyselinou virové částice. Řetězce virové mRNA se potom označují jako pozitivní (+), kdežto komplementární matriční řetězce DNA nebo RNA jsou negativní (-). Z hlediska genetického materiálu a postavení mRNA v procesu reprodukce viru v infikované buňce byl vytvořen systém zařazení živočišných RNA- a DNA-virů do šesti skupin (obr. 8.3):



Obr. 8.3: Vztah mezi jednotlivými skupinami virů a mechanizmus syntézy jejich mRNA. Jednotlivé

skupiny virů (viz následující text) označeny číslicí v kroužku.

Viry s genomovou dvouřetězcovou (±)DNA

Transkripce virů s genomovou dvouřetězcovou (±)DNA probíhá na (-) řetězci DNA. Virová DNA je schopna se zapojit do hostitelova chromozomu (obr. 8.4). DNA viru Epstein-Barrové se do chromozomu hostitelské buňky nezapojuje a zůstává v jejím jádře v několika kopiích v kruhové podobě. DNA virů této skupiny se replikuje v nedělících se (klidových) hostitelských buňkách a stimuluje také replikaci hostitelovy DNA a dělení příslušné buňky. Tím může docházet k rakovinnému bujení. Patří sem papovaviry, adenoviry, herpesviry, poxviry a hepadnaviry. S výjimkou poxvirů se všechny viry této skupiny replikují v jádře hostitelské buňky.



Hostitelskábuňka

Jádro

Cytoplazma

Virion atakuje hostitelskou buňku

Virová DNA

Proteiny kapsidu

Virion vstupuje do buňky a obnažuje svou DNA

Část virové DNA transkribována do mRNA kódující „časné“ virovéproteinyReplikace virové DNA a

produkce virových proteinů

Proteiny kapsidu

Pozdní translace a syntéza kapsidovýchproteinů

Maturace virionů

Uvolněnívirionů z buňky

Obr. 8.4: Replikace DNA virů v hostitelské buňce.

Viry s jednořetězcovou DNA

Viry s jednořetězcovou DNA tvořenou pozitivním nebo negativním řetězcem. Po virové infekci se v hostitelské buňce přechodně vytvoří dvouřetězcová (±)DNA označovaná jako dočasná replikační forma, jejíž (-) řetězec se přepisuje do mRNA. Tuto skupinu reprezentují parvoviry. Jejich DNA se replikuje v jádře hostitelské buňky pomocí enzymového systému hostitele. K této replikaci dochází jen v buňkách, jejichž jádro se právě dělí. Proto způsobují onemocnění hlavně u mláďat zvířat.

Viry s dvouřetězcovou (±)RNA

Viry, jejichž genom představuje dvouřetězcová segmentovaná (±)RNA. Vytvořené pozitivní řetězce RNA slouží zároveň jako mRNA. Virion obsahuje subvirovou částici („core“), jež má aktivitu RNA-polymerázy. Zástupci této skupiny jsou reoviry, často se vyskytující viry s poměrně nízkou patogenitou.

Viry s jednořetězcovou (+)RNA

Transkripcí genomu virů s jednořetězcovou genomovou (+)RNA vzniká (-)RNA, která se přepisuje do (+)RNA (obr. 8.5). Část molekul této (+)RNA plní funkci mRNA, zbývající molekuly vstupují do kapsidů nových virionů. Mezi tyto viry patří koronaviry, pikornaviry, togaviry, z potravinářského hlediska jsou důležité tzv. enteroviry, kam vedle viru dětské



obrny (virus poliomyelitidy) patří ještě Coxsackievirus a Echovirus způsobující střevní onemocnění přenášená potravinami. Mezi pikornaviry patří také původce slintavky, jež se může přenést nepasterovaným mlékem z nemocného zvířete na člověka.

VirováRNA

Virovéproteiny

Cytoplazma

Jádro

Obr. 8.5: Replikace (+)RNA virů.

Viry s jednořetězcovou (-)RNA

Viry obsahující řetězce (-)RNA mohou mít tyto řetězce celistvé nebo segmentované. Virion obsahuje nukleoproteinový komplex („core“) s aktivitou RNA-dependentní RNA-polymerázy. Při transkripci negativního řetězce se pomocí tohoto komplexu syntetizuje (+)RNA, která zčásti vystupuje jako mRNA a zčásti je přepisována do (-)RNA začleněné do nově vznikajících virových částic (obr. 8.6). Segmentovaný genom mají ortomyxoviry, bunyaviry a arenaviry, nesegmentovaný paramyxoviry a rabdoviry. Viriony této skupiny jsou obaleny ještě proteinovou vrstvou bohatou na lipidy a obsahující také glykoproteiny.



Obal viru

Virová RNA

Endocytóza

Endosom

Buněčnámembrána

Uvolněnívirionu

Jádro

VirováRNA

Transkripce

Translace

Replikace

Ribozomy

Virovéproteiny

Endoplazmatickéretikulum

Golgihoaparát

Maturace

Balení Částice RNA+protein

Obr. 8.6: Replikace viru chřipky.

Viry s (+)RNA přepisovanou do DNA

Transkripce virů s (+)RNA přepisovanou do DNA se uskutečňuje za účasti enzymu reverzní transkriptázy. Replikací jednořetězcové DNA vzniká (±)DNA, která přechází v kruhovou formu a začleňuje se do chromozomu hostitelské buňky (provirus) a ovlivňuje její regulaci, takže potom může dojít k rakovinnému bujení. Proto se některé z těchto virů nazývají onkogenní viry. Při její transkripci se vytvářejí jednak mRNA, jednak genomová (+)RNA nových virionů (obr. 8.7). Vzniklé viriony opouštějí hostitelskou buňku pučením, což je obdoba pinocytózy. Tuto skupinu zastupují retroviry, mezi které patří také původci získaného selhání imunity (AIDS), viry HIV-1 a HIV-2.



Obr. 8.7: Replikace virů s reverzní transkriptázou.

Reverzní transkriptáza byla také zjištěna u virů vyvolávajících hepatitidu B člověka a dalších savců, přestože obsahují jako genetický materiál DNA, která je částečně dvouřetězcová (čeleď Hepadnaviridae). Virus setrvává v buňkách hostitele dlouhou dobu bez příznaku nemoci a přitom může být přenášen. Viry hepatitidy B působí pravděpodobně také jako kokarcinogen v lidské rakovině jater.


• Podle kterých kritérií rozlišujeme živočišné viry?

• Stručně popište reprodukční cyklus DNA virů.

• Stručně popište reprodukční cyklus RNA virů.

• Stručně popište reprodukční cyklus retrovirů.

• Které viry nazýváme jako onkogenní? Vysvětlete.



8.5 Viry bakterií a jejich reprodukce

Bakteriofágy napadají téměř všechny druhy bakterií, které mohou sloužit jako hostitelé jednoho nebo několika druhů virů. Nejvíce byly prostudovány viry bakterií E. coli. Genetický materiál většiny bakteriofágů je uložen v kapsidu mnohostěnového tvaru (obr. 8.8, 8.9), popř. mohou mít fágy tvar šroubovicové symetrie (fág fd E. coli).

Obr. 8.8: Bakteriofág lambda napadající hostitelskou buňku E. coli.

DNA T-sudých fágů obsahuje neobvyklou bázi (5-hydroxymetylcytozin) a proto je molekula DNA chráněna proti účinku bakteriálních endonukleáz, které jsou schopny štěpit řetězec DNA v místě s určitým pořadím bází. Tento systém ochrany DNA není v oblasti fágů ojedinělý.

Límeček

Pochva bičíku

Destička

Hrot

Vlákna bičíku

Obr. 8.9: Struktura bakteriofága T4. (a) snímek z elektronového mikroskopu, (b) DNA sbalovaná do

hlavičky fága.

Infekce bakteriální buňky fágem probíhá v několika stadiích. U sudých fágů E. coli dochází nejdříve k adsorpci fágové částice na povrch hostitelské buňky (obr. 8.10). Bičíková vlákna se přitom rozvinou a přichytí svými konci na specifická místa lipoproteinů bakteriální stěny (receptory). U bakteriálních mutantů se změněnou stěnou tak adsorpce příslušného fága



nenastává (mutanty rezistentní k příslušnému typu fága).

Po adsorpci se fág fixuje na buňku pomocí hrotů umístěných v hexagonální destičce na konci fágového bičíku. Buněčná stěna bakterie je pak v místě dotyku tohoto bičíku perforována rozkladným působením enzymu lysozymu, který je obsažen v hexagonální destičce. Kontrakcí bičíkové pochvy fága se do vzniklého otvoru ve stěně vsune kanálek fágového bičíku, kterým vnikne do bakteriální buňky fágová DNA. Ostatní části fága zůstávají vně bakteriální buňky.

Obr. 8.10: Reprodukce fága T4 v buňkách E. coli.

Přítomnost dvouřetězcové fágové DNA v buňce hostitele vede k syntéze tzv. časné mRNA podle části řetězce fágové DNA, tj. k transkripci části fágové DNA. Stavební kameny i enzym RNA-polymerázu poskytuje pro tuto syntézu hostitelská buňka. Podle této mRNA pak probíhá v bakteriálních ribozomech za účasti bakteriálních tRNA syntéza fágových bílkovin. Nejdříve se syntetizují tzv. časné enzymy nutné pro syntézu fágové DNA (např. specifická fágová DNA-polymeráza). Současně se podle fágové mRNA syntetizuje deoxyribonukleáza (DNA-áza), která štěpí hostitelovu DNA.



Kapsomery

Hlavička

Kapsid

Vlákna bičíku

Bičík

Pochva

Bakteriofág Obr. 8.11: Sestavování fágové částice.

Brzy po začátku replikace fágové DNA dochází k transkripci části fágové DNA, která dosud nebyla transkribována, takže vzniká tzv. pozdní fágová mRNA. Podle této mRNA se tvoří specifické virionové bílkoviny, např. podjednotky kapsomerů. Současně s nahromaděním těchto podjednotek se jednotlivé molekuly fágové DNA uspořádají do těsného útvaru. Na jeho povrchu se pak uspořádají kapsomery do tvaru mnohostěnu, čímž vzniká hlavička fága. Současně se samostatně uspořádá hexagonální destička, na destičku se na základě konformace bílkovinných molekul uspořádá bičík s pochvou a pak dojde ke spojení bičíku s hlavičkou, která již obsahuje límeček s vlákny. Nakonec se na bičík napojí bičíková vlákna (obr. 8.11). První kompletní fágová částice se objevuje po cca 15 minutách od adsorpce fága. Během tvorby zralých fágů dochází stále ještě k replikaci některých molekul fágové DNA (obr. 8.10).

Po vzniku určitého počtu zralých fágů se bakteriální buňka rozpadne, lyzuje, a zralé fágy se uvolní do prostředí. Celý proces od adsorpce fága s dsDNA až k lyzi buňky trvá 25 – 30 minut, přičemž počet fágů uvolněných z jedné bakteriální buňky záleží na druhu fága (např. u T-fágů E. coli je jich 150 – 400).

U ostatních fágů obsahujících dsDNA jsou různé odchylky od tohoto průběhu replikace, který je typický pro sudé T-fágy. Např. u fága lambda (λ), který je nejprostudovanějším bakteriofágem, dojde před první transkripcí ke spojení volných konců fágové DNA pomocí bakteriální ligázy. Lokální denaturace fágové DNA, nutná pro její replikaci, je zde zajišťována příslušnými bakteriálními proteiny.



Malé fágy obsahující ssDNA (např. fág ΦX 174) nemají bičík. Některé z nich se na bakteriální buňku přichycují hrotem umístěným na každém rohu jejich mnohostěnové hlavičky. Po infekci fágem není chromozom hostitele poškozen a syntéza bakteriálních makromolekul probíhá dále. Fágová DNA zde však slouží jako matrice, podle níž hostitelova DNA-polymeráza syntetizuje komplementární (-)řetězec. Tím vzniká dvouřetězcová replikační forma fágové DNA, která se pak replikuje semikonzervativně. Tato replikace však brzy ustává a podle komplementárního (-)řetězce se tvoří fágová mRNA. Podle (-)řetězce replikační formy fágové DNA se pak syntetizují také nové molekuly fágové DNA. Ty se pak plynule zapojují do nových fágových částic. Vytvoří se tak kolem 180 virionů, které pak lyzují buňku.

U fága fd, který rovněž obsahuje jednořetězcovou DNA, ale po replikaci opouští buňku bakterie, aniž by ji lyzoval, se fágová bílkovina kapsomerů stává součástí cytoplazmatické membrány bakterie a ukládá se na povrch fágové DNA během průchodu této DNA cytoplazmatickou membránou.

Fágy, jejichž genetický materiál je tvořen jednořetězcovou nízkomolekulární RNA, nesou genetickou informaci pro syntézu 3 až 5 proteinů. V bakteriální buňce se fágová RNA váže na ribozomy a funguje jako mRNA, podle níž ribozomální aparát hostitele syntetizuje specifickou fágovou RNA-polymerázu, pomocí které se syntetizuje komplementární řetězec k fágové RNA, takže vzniká dvouřetězcová RNA (replikační forma RNA). Podle komplementárního (-)řetězce RNA se pomocí fágové RNA-polymerázy syntetizuje virionová (+)RNA. Bakteriální chromozom není po infekci tímto virem narušen, takže během pomnožování fágů se buňka ještě rozdělí. Před lyzí je v buňce přítomno 103 – 104 zralých fágových částic. Lyze nastává cca 40 minut od infekce bakteriální buňky fágem.

Virulentní a temperované bakteriofágy

Fágy jsou většinou přísně specifické, to znamená, že určitý fág může lyzovat jen určitý druh bakterií. Výjimkou jsou např. aktinofágy, které mohou lyzovat řadu různých aktinomycet.

Podle průběhu infekčního procesu se bakteriofágy rozlišují na virulentní a temperované (mírné). Bakteriální buňku mohou lyzovat pouze virulentní fágy. Tyto fágy se mohou přeměnit v tzv. mírné (temperované) fágy, jejichž DNA sice vnikne normálním způsobem do buňky bakterií, avšak není tam schopna vyvolat svou replikaci.

Při infekci bakterií virulentním fágem proběhne normální reprodukční cyklus za tvorby fágových virionů, které zpravidla po lyzi buňky přejdou do prostředí. Celý životní cyklus virulentního fága lze graficky vyjádřit růstovou křivkou, na níž jsou patrné dvě odlišné fáze: fáze latentní trvající od zahájení infekce až do počátku uvolňování virionů z buňky a fáze vzestupu charakterizovaná rychlým zvyšováním počtu fágových částic uvolňovaných z lyzované buňky. Maximální počet uvolněných virionů se označuje jako fágový výnos.

Při infekci bakteriální buňky temperovaným fágem (např. bakteriofág λ) dochází obvykle po penetraci fágového genomu do cytoplazmy k jeho začlenění do buněčného chromozomu za vzniku tzv. profága, který může být při dělení buňky přenášen na další generace. Bylo zjištěno, že u některých druhů fágů (např. fág λ E. coli) je fágová DNA inkorporována vždy na totéž místo chromozomu hostitele. Je však také znám mírný fág, jehož DNA se napojuje na nejrůznější místa bakteriálního chromozomu. Tento jev spojený se zastavením reprodukčního cyklu fága je označován jako lyzogenie (lyzogenizace). K obnovení životního cyklu



temperovaného fága může dojít teprve po uvolnění profága z chromozomu buňky účinkem některých fyzikálních nebo chemických faktorů. Následné procesy reprodukce jsou pak obdobné jako u virulentního fága (obr. 8.12).

Lytický cyklus

Lyzogennícyklus

Obr. 8.12: Životní cyklus temperovaného fága.

Virion fága λ má ikozaedrickou hlavu a pružný bičík opatřený na konci jedním vláknem. Uvnitř hlavy je uložena dsDNA lineární s kohezními konci, které umožňují, aby se lineární DNA přeměnila po vstupu do hostitelské buňky v kruhovou formu, která se v podobě profága začleňuje do chromozomu buňky.

Po vstupu DNA fága λ do hostitelské buňky může dojít buď k produktivní infekci nebo k lyzogenizaci buňky. V průběhu integrace se fágový a buněčný chromozom rozštěpí specifickými endonukleázami a poté se oba chromozomy volnými konci spojí. Vyčlenění (excize) profága probíhá v opačném směru. Oba procesy jsou katalyzovány fágovými enzymy kódovanými zvláštními geny fága λ.

Udržení fágového genomu integrovaného ve stavu profága v buněčném chromozomu je umožněno přítomností λ-represoru představující dimerní bílkovinu kódovanou specifickým genem fága. Tento represor se u profága váže na dva operátorové geny kontrolující transkripci časných mRNA. Represor však nepotlačuje replikaci fágové DNA zapojené do chromozomu bakterie, a proto je profág replikován s tímto chromozomem a dostává se jako jeho součást i do dceřiné buňky a na další potomstvo. Vytvoření této vazby brání přechodu fága do reprodukčního cyklu. Represor ovšem reaguje i s volnou DNA příbuzných virulentních fágů infikujících lyzogenní buňku, a inhibuje tak jejich pomnožení. Tím se stává bakteriální buňka



nesoucí profág vůči těmto virulentním fágům imunní. Teprve inaktivace represoru, např. UV-paprsky, umožní transkripci obou operátorových genů, což se projeví vyčleněním profága z buněčného chromozomu a zahájením procesu reprodukce.

Jsou známy také temperované fágy (např. fág P1 E. coli), jejichž DNA se nenapojuje na bakteriální chromozom, ale replikuje se v kruhové formě (podobné plazmidu) synchronně s replikací bakteriálního chromozomu. Lyzogenní buňky pak tedy obsahují jen jednu molekulu kruhové fágové DNA.


• Popište strukturu bakteriofága.

• Popište reprodukční cyklus bakteriofága.

• Jakým způsobem dochází k sestavování jednotlivých virových částic bakteriofága?

• Které bakteriofágy znáte? Který z nich je nejvíce prostudován a které bakterie infikuje?

• Jaký je rozdíl mezi virulentním a temperovaným bakteriofágem?

• Čím je umožněno udržení fágového genomu integrovaného ve stavu profága v bakteriálním chromozomu?

8.7 Rostlinné viry a viry hub

Rostlinné viry

Rostlinné viry (fytoviry) se množí převážně ve vyšších rostlinách. Genom je nejčastěji tvořen jednořetězcovou RNA, pouze fytoviry z čeledi Reoviridae mají genom tvořený dvouřetězcovou RNA a u zástupců rodu Caulimovirus tvoří genom dvouřetězcová DNA.

Fytoviry způsobují u rostlin nejrůznější onemocnění – virózy, virové žloutenky apod. Některé z nich jsou přenášeny při mechanickém porušení rostliny (např. listu), jiné hmyzem (nejčastěji mšicemi) nebo pylem. Mezi rostlinné viry s (+)RNA náleží také virus tabákové mozaiky, který je nejdéle známým a nejprostudovanějším rostlinným virem (obr. 8.13). V přírodě je velmi rozšířený, neboť je schopen napadat různé hostitele, u nichž způsobuje odlišné nemoci. Další fytoviry obsahující dvouřetězcovou RNA způsobují hospodářsky důležitá onemocnění rýže, kukuřice a jiných obilovin a travin. U mozaikového viru květáku se vyskytuje jako genetický materiál dvouřetězcová DNA, jejíž části byly použity jako vektor v genovém inženýrství rostlin. Tento virus obsahuje také reverzní transkriptázu.



Proteinovépodjednotky

Obr. 8.13: Virus tabákové mozaiky – snímek z elektronového mikroskopu a struktura.

Viry hub (mykoviry)

Existence virů napadajících houby byla zjištěna v 60. letech. Výzkum ukázal, že u plísní jsou viry poměrně rozšířené.

U většiny plísňových virů je nositelem dědičnosti dvouřetězcová RNA, vzácněji jednořetězcová RNA. Většina virových částic obsahuje 2 až 4 molekuly RNA obalené společným kapsidem.

Mykoviry jsou většinou latentní, neboť plísňové buňky, které je obsahují, většinou rostou bez zřetelné lyze a bez morfologických změn. Některé mykoviry však ovlivňují morfologii buněk nebo vyvolávají nepravidelnou lyzi hyf. Viry se většinou hromadí ve starších buňkách plísní, kde tvoří shluky. Z buněk plísní jsou viry občas uvolňovány do vnějšího prostředí, zřejmě při autolýze těchto buněk. Přenos plísňových virů z kmene na kmen probíhá při anastomóze. Jako anastomózu označujeme vytvoření kanálku mezi hyfami dvou různých kmenů plísní vyrostlých ve společném prostředí. Tímto kanálkem se vyměňují jádra i části cytoplazmy a mohou jím projít také viry.

Viry zřejmě ovlivňují metabolizmus napadané plísně, znamenají pro buňku určitou zátěž, jež se projeví zpomalením syntézy plísňových bílkovin. V některých případech se v přítomnosti virů snižuje tvorba sekundárních metabolitů, např. aflatoxinů nebo antibiotik. U některých plísní se jejich patogenita v přítomnosti mykovirů zvyšuje.


• Jaká je charakteristická vlastnost virů rostlin?

• Který je nejznámější rostlinný virus?

• Jaký mají obvykle genom viry hub?

• Jak probíhá přenos plísňových virů?



• Mají viry napadající plísně nějaký vliv na napadenou buňku?



9. Reprodukční cyklus virů II

Popis lekce:

V této lekci v rámci laboratorního cvičení se studenti seznámí s principem práce s bakteriofágem metodou izolace virionů pomocí plak.

Klíčová slova:

bakteriofág, bakterie, plaka, virus, virion

Délka lekce:

180 minut

Výklad:

9.1 Studium bakteriofága

Bakteriofágy jsou viry infikující bakteriální buňky, přičemž každý bakteriofág má širší nebo užší rozmezí hostitele. Někdy je rozmezí hostitele tak specifické, že se určitý bakteriofág množí pouze v některých kmenech určitého druhu bakterií.

Infekce bakteriální buňky fágovým virionem sestává ze dvou dějů: z adsorpce virionu na povrch buňky a ze vstupu (penetrace) jeho genomu do cytoplazmy. Jestliže po infekci následuje replikace fágového genomu, syntéza bílkovin fágového kapsidu a sestavování nových virionů s následnou lyzí buňky, hovoříme o lytické infekci. Tyto fágy jsou virulentní. Kromě virulentních fágů existují i temperované fágy, které vyvolávají buď lytickou infekci hostitelské buňky nebo její lyzogenizaci. Během lytické infekce dochází k uvolňování fágového potomstva v procesu lyze buňky a získáváme tzv. fágový lyzát. Počet nově vytvořených virionů nebo počet virionů ve fágovém lyzátu lze stanovit odvozením od počtu vytvořených plak na indikátorovém kmeni (PFU/ml). Proces uvolňování fágového potomstva z infikovaných hostitelských buněk můžeme sledovat v závislosti na době kultivace adsorpční směsi fág – hostitelská buňka metodou dvouvrstvého agaru nebo sledování procesu lyze hostitelských buněk a vzniku fágového lyzátu.

Ke stanovení fágových částic se tedy využívá nepřímá metoda založená na tvorbě plak (obr. 9.1). Plaky jsou projasněné zóny na tuhém médiu souvisle porostlém hostitelským bakteriálním kmenem. Vznikají v místě, kde se v okamžiku očkování nacházela aktivní fágová částice, která dala po infekci vznik dalším virionům, ty napadly okolní buňky a tak v několika po sobě následujících lytických cyklech dochází k lyzi velkého počtu sousedních hostitelských buněk a vzniká plaka. Plaka tedy představuje potomstvo vzniklé z 1 fágové částice. Základním předpokladem metody je, že počet hostitelských buněk musí být mnohonásobně vyšší než počet fágových částic.



Obr. 9.1: Plaky bakteriofága na tuhé půdě.

Množení virulentního fága na hostitelských buňkách lze dokumentovat stanovením tzv. jednostupňové růstové křivky fága. Sledování uvolňování fágového potomstva je umožněno využitím metody dvouvrstvého agaru. Tato metoda vychází z předpokladu, že počet plak vytvořených po infekci buněk indikátorové kultury odpovídá přibližně počtu virionů ve fágovém lyzátu. Významným faktorem, který se podílí na úspěšném provedení experimentu je přítomnost adsorpčního kofaktoru (Ca2+ nebo Mg2+), použití hostitelských buněk z časné exponenciální fáze růstu a správné nastavení hodnoty tzv. vkladového poměru, který vyjadřuje poměr vložených virionů k počtu hostitelských buněk v adsorpční směsi. Tuto hodnotu je vhodné zvolit v rozmezí 0,1-0,01. Při vyšších hodnotách vkladového poměru může docházet k lyzi buněk ihned po adsorpci na hostitele, aniž by proběhl proces virové reprodukce. Jednostupňová růstová křivka fága umožňuje stanovit počet nově uvolněných virionů připadajících na jednu vloženou fágovou částici.

Další metodou zjišťování přítomnosti bakteriofága v hostitelské kultuře bakterií je sledování lyze hostitelských buněk v adsorpční směsi, kdy spektrofotometricky sledujeme rychlost projasňování vhodné hostitelské bakteriální kultury v důsledku lyze buněk virulentním bakteriofágem.


• Jakým způsobem lze stanovit přítomnost bakteriofága ve vhodné hostitelské kultuře bakterií?

• Vysvětlete princip metody stanovení jednostupňové růstové křivky bakteriofága.



10. Ostatní nebuněčné struktury považované za živé a patogeneze virových nákaz

Popis lekce:

V této lekci vyučující popíše strukturu viroidů, pseudovirů a satelitních virových částic a uvede jejich rozdíly oproti virům,poté objasní strukturu, význam a přenos prionů a uvede jejich význam. Druhá část lekci bude ve stručnosti věnována patogenezi virových nákaz, jejich přenosu a možnostem prevence proti virovým nákazám.

Klíčová slova:

virus, pseudovirus, viroid, satelitní částice, prion, bovinní spongiformní encefalopatie, patogeneze, aktivní a pasivní imunizace.

Délka lekce:

60 minut

Výklad:

10.1 Viroidy, pseudoviry a satelitní virové částice

V rostlinách trpících virózou se nezřídka vyskytují vedle vlastních původců onemocnění menší virové částice označované jako satelitní. Tyto satelitní viry jsou defektní, neboť se mohou rozmnožovat jenom v přítomnosti plnohodnotného viru, který jim poskytne svůj replikační aparát. Příkladem je satelitní virus původce virové nekrózy tabáku obsahující genom, který kóduje pouze obalovou bílkovinu.

Od satelitních virů se liší tzv. pseudoviry, při jejichž sestavování mohou vstupovat do kapsidů i buněčné RNA, popř. syntetické polynukleotidy. Tyto viry nejsou infekční.

Mezi původce nebezpečných virových nákaz některých rostlin patří tzv. viroidy. Představují kovalentně uzavřené kruhové molekuly RNA postrádající bílkovinný obal (kapsid). Mají nepatrné rozměry. Přestože RNA viroidů obsahuje informaci pouze pro jediný krátký peptid, má infekční povahu a způsobuje nádorové onemocnění některých rostlin (brambor, rajčat, apod.). Tato skutečnost nasvědčuje tomu, že v průběhu infekčního procesu se viroidy uplatňují jako prvky regulačních systémů.

10.2 Priony

V poslední době byly zjištěny proteinové nebuněčné infekční částice, které jsou schopny se replikovat v hostitelské buňce, a které neobsahují DNA ani RNA, takže nemají žádný klasický genetický materiál. Tyto částice byly nazvány priony.



Mechanizmus replikace prionů není příliš znám. Je možné, že jde o regulační proteiny, jejichž složení je zakódováno v genomu hostitelské buňky, avšak tato genetická informace nebyla transkribována. Pomocí DNA-sond bylo zjištěno, že zdravá i infikovaná zvířata obsahují genetickou informaci o složení prionového proteinu (PrP). PrP z infikovaného mozku mají totožné složení jako PrP z neinfikovaného, avšak tvoří hydrofobní glykoprotein, který agreguje do tvaru tyčinek. Priony jsou původci nervové nemoci scrapie u ovcí, bovinní spongiformní encefalopatie (BSE, nemoc „šílených krav“, obr. 10.1). Dále vyvolávají Creutzfeldt-Jacobovu chorobu mozku u lidí a pravděpodobně i další choroby vedoucí k degenerativním změnám mozku. Nemoc se vyvíjí velmi pomalu, k propuknutí choroby dochází po několika měsících až rocích od infekce.

Obr. 10.1: Mikroskopický snímek nervové tkáně postižené BSE.


• Charakterizujte viroidy, pseudoviry a satelitní virové částice.

• Definujte termín priony.

• Za které nemoci jsou pravděpodobně zodpovědné priony?

10.4 Patogeneze virových nákaz

Vzhledem k parazitickému způsobu života se viry ve vztahu k hostitelským organizmům jeví jako patogeny, tj. původci různých nákaz. Tyto nákazy mohou být bezpříznakové (inaparentní), které se přes prokazatelnou přítomnost virů výrazněji neprojeví, nebo zjevné (anaparentní), jež přecházejí ve virová onemocnění provázená narušením fyziologické funkce infikovaných buněk, tkání nebo orgánů hostitele. I bez patologických příznaků můžeme v těle hostitele zjistit specifické protilátky, jejichž syntéza byla vyvolána přítomností těchto virů. Zjevné nákazy lze rozlišit na akutní (chřipka), chronické (herpetický opar) a pomalé (AIDS). Svou povahou sem patří i nákazy poškozující plod (zarděnky).



Při infekci pronikají virové částice do hostitelského organizmu různými cestami (obr. 10.2), především respiračním traktem (kapénkové infekce), trávicím ústrojím (alimentární infekce), přenosem z nemocného na zdravého jedince prostřednictvím přenašeče nebo přímým stykem. V infikovaném organizmu se virus šíří sliznicemi, krví a lymfou, po nervových vláknech nebo u rostlin cévními svazky. Celková infekce hostitele se nazývá viremie. Inkubační doba potřebná k dosažení viremie je různá od několika dnů až k několika rokům. Některé viry mají afinitu k určitým orgánům (např. slinné žlázy pro příušnice, mozkové buňky pro virus encefalitidy) a viry se po viremii lokalizují v těchto orgánech.

Obr. 10.2: Přenos virových infekcí.

Řada virů může vyvolávat hromadná onemocnění se stejnými příznaky v populaci určité geografické oblasti. Tento jev se označuje jako epidemie. Pokud dojde k témuž onemocnění na velkém geografickém území, jde o pandemii.

Šíření virové infekce se děje přímým nebo nepřímým přenosem. Přímý horizontální přenos virové nákazy se uskutečňuje přímým kontaktem s nemocným. Viry vstupují do organizmu dýchacími cestami, ústní dutinou, poraněnou pokožkou a pohlavní cestou. Přímý vertikální přenos je přenos z matky na dítě. Nepřímý přenos virových nákaz je uskutečňován přenašeči (vektory) ze zdroje nákazy, kterým mohou být hostitelské nebo rezervoárové organizmy, na zdravé jedince.

Nejúčinnější zbraní proti virovým onemocněním je imunizace. Cílem imunizace je navodit u organizmu takovou odolnost (rezistenci), jaká by se vytvořila pro proběhnutí normální virové infekce. Podmínkou je, že imunizovaný jedinec nesmí jevit žádné známky poškození. Obvykle se rozlišují dva typy imunizace: Aktivní imunizace, při níž je do organizmu vpraven virový antigen. Může být navozena přirozenou infekcí malým množstvím viru, které nevyvolá onemocnění, ale stimuluje tvorbu protilátek, nebo překonáním virového onemocnění, kdy vzniká tzv. postinfekční imunita. V oblasti prevence je aktivní imunizace prováděna uměle, vakcinací, při níž podávaná očkovací látka (vakcína) představuje antigen



vyvolávající rovněž tvorbu protilátek. Používané virové vakcíny jsou buď živé, zpravidla oslabené virulentní formy schopné indukovat tvorbu protilátek, nebo mrtvé připravené z virulentního viru odstraněním jeho infekčnosti. Tuto funkci mohou plnit i některé složky virových částic antigenní povahy. Pasivní imunizace vede k získání odolnosti organizmu proti virové nákaze podáváním přirozených specifických protilátek (aplikace imunitního séra nebo imunoglobulinů). Tento způsob imunizace vede ke krátkodobé prevenci virové nákazy a k zabránění možné epidemie.

Identifikace původce virové nákazy se provádí po jeho izolaci ze vzorků nemocných jedinců. Při diagnostice virů je sledován charakter růstu viru zároveň se změnami, které vyvolává v infikovaných buňkách. K identifikaci virů se používají metody umožňující stanovení morfologie a struktury virových částic včetně povahy jejich genomu a také sérologické a antigenní vlastnosti zároveň se schopností vyvolávat tvorbu protilátek.


• Jakým způsobem se mohou přenášet virové nákazy a jak se jim lze bránit?

• Jaké mohou být virové nákazy? Musí se vždy projevit?

• Definujte termín postinfekční imunita. Jak ji lze navodit?

• Které metody se využívají k identifikaci původců virových nákaz?



Seznam literatury 1.

Seznam správných odpovědí na autotesty

Seznam obrázků Chyba! Nenalezena položka seznamu obrázků.

Seznam tabulek Chyba! Nenalezena položka seznamu obrázků.

Seznam algoritmů Chyba! Nenalezena položka seznamu obrázků.

Rejstřík Chyba! Nebyly nalezeny položky rejstříku.

Documents

M0023 Obecna Mikrobiologie Distancni Text III