MEDIA PERTUMBUHAN MIKROORGANISME (bagian 1)

Media pertumbuhan :a.Pengertian dan Fungsi mediab.Nama-nama mediac.Bahan-bahan media pertumbuhan1.Sumber nutrisi atau zat makananSumber karbonSumber hidrogenSumber nitrogenSumber oksigenSumber fosfatSumber unsur sekelumit (trace element)2.Komposisi media pertumbuhanAgarPeptoneMeat / plant extractFaktor tumbuhKomponen selektifKomponen diferensialpH bufferd.Macam-macam media pertumbuhan1.Berdasarkan sifat fisikSolid mediaLiquid mediaSemisolid media2.Berdasarkan kandungan bahanMedia sintetikMedia non sintetikMedia semi sintetik3.Berdasarkan tujuane.Hal-hal penting dalam pembuatan mediaBahan baku airPenimbangan media pertumbuhanKonsentrasi agar dan proses pelarutan agarKetebalan agar dan luas cawan yang digunakanPengaturan pHProses sterilisasiPencairan kembali media agarPenuangan media ke dalam cawan atau tabungPemyimpanan media jadiPerlakuan untuk media kultivasi anaerobf.Penanganancommercialdehydratedmedia.g.Ilustrasi pembuatan mediah.Referensi

Media pertumbuhan :

a.Pengertian dan fungsi mediaMedium (jamak : media) pertumbuhan adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi yang disediakan dari media berupa molekul-molekul yang selanjutnya dirakit untuk menyusun komponen sel dan memperbanyak diri sehingga sel-sel tersebut dapat dimanfaatkan. Dengan adanya media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi kultur tunggal dan juga memanipulasi mikroorganisme yang didapatkan untuk kepentingan tertentu. Sedangkan menurut Andrewset al.(2004:4) kultur media adalah substansi dengan kadar tertentu dalam bentuk cair, setengah padat atau padat yang mengandung bahan alami dan atau buatan untuk mendukung perkembangbiakan mikroorganisme.

b.Nama-nama mediaMedia pertumbuhan memiliki banyak nama yang umumnya mengacu kepada nama asli sesuai literatur. Terdapat juga media dengan komposisi yang sama tetapi memiliki nama yang berbeda karena diproduksi oleh perusahaan yang berbeda. Misalnya Trypticase Soy Agar diproduksi oleh BBL (BD Diagnostic Systems), Tryptone Soy Agar diproduksi oleh Oxoid Unipath, dan Tryptic Soy Agar produced diproduksi Difco (BD Diagnostic Systems) yang semuanya memiliki komposisi yang sama. Banyak media juga dikenal sebagai akronim, misalnya TSA adalah singkatan dari Trypticase Soy Agar. Jika seseorang memodifikasi komposisi media yang telah ada (memiliki nama asli), maka istilah modifieddiletakkan setelah nama media. Misalnya TSA,modifiedbukanModifiedTSA. Media yang tidak memiliki nama formal umumnya dinamai berdasarkan organisme yang ditargetkan, misalnyaBacillus stearothermophilusBroth (Atlas, 2010:1).

c.Bahan-bahan media pertumbuhan

1.Sumber nutrisi atau zat makananAnalisa dari komposisi kandungan unsur sel mikroorganisme menunjukkan lebih dari 95% dari berat kering terdiri dari unsur utama (major elements) yaitu unsurC, O, H, N, S, P, K, Na, Ca, Mg, dan Fe. Jika suatu jenis mikroorganisme ingin ditumbuhkan dalam cawan petri atau tabung maka harus dipenuhi kebutuhan unsur tersebut dari molekul organik yang terdapat pada media. Komposisi setiap bahan pada media tertentu terhadap mikroorganisme target menggambarkan kondisi nutrisi pada habitat aslinya karena pada keadaan itulah mikroorganisme tersebut optimal tumbuh. Berikut adalah sumber nutrisi media.

Sumber karbonMolekul organik umumnya mengandung karbon sebagai tulang punggungnya seperti karbohidrat, lemak, protein yang terdapat pada pepton, glukosa, dll. Bahan organik inilah yang menjadi sumber karbon utama untuk mikroorganisme heterotrof yang umum dikultivasi.

Sumber nitrogenSumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain yang terkandung padapeptone,meatextract, atautryptose. Sejumlah mikroba juga dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.

Sumber oksigenUntuk mikroorganisme heterotrof yang dikulturkan pada cawan, sebagian besar oksigen didapatkan langsung dari udara sedangkan mikroorganisme yang dikultur pada media cair sumber oksigen berasal dari oksigen yang terlarut air. Oleh karena itu aerasi pada kultur cair dapat meningkatkan pasokan oksigen kepada mikroorganisme.

Sumber fosfatSumber fosfat organik seperti beberapa protein, kofaktor atau ATP yang dapat dijumpai pada bahanyeast extractatau pepton. Namun hampir semua mikroorganisme dapat memanfaatkan fosfat anorganik yang ditambahkan langsung pada media sepertipotassium phosphate, sodium phosphatedll. (Prescott & Harley, 2002:98).

Sumber unsur sekelumit (mikronutrient/trace element)Pada lingkup media pada cawan petri, unsur mikronutrien (Zn, Mn, Mo, Ni, Co, Cu dll.) dapat diperoleh dari akuades atau peralatan gelas. Fungsi mikronutrien ini umumnya menjadi bagian dari enzim atau kofaktor untuk menjadi katalis reaksi atau menjaga struktur protein. Oleh karena itu pembuktian kebutuhan unsur mikronutrien sangat sulit dilakukan dalam skala laboratorium karena setiap jenis mikroorganisme membutuhkannya dalam jumlah yang sangat sedikit (Prescott & Harley, 2002:96).

2.Komposisi media pertumbuhanFormulasi media pertumbuhan prinsipnya hampir sama dengan resep masakan di dapur yang setiap bahan bakunya diatur dengan takaran tertentu. Berikut adalah beberapa bahan-bahan yang umum dipakai dalam pembuatan media pertumbuhanmenurut Atlas (2010:1-8).

AgarAgar adalah bahan yang paling umum digunakan sebagaigelling agentpada media yang terbuat dari ekstrak alga. Agar bukan sebagai sumber nutrisi bagi mikroorganisme namun fungsinya lebih bersifat mekanis yaitu memadatkan media cair sehingga sel tidak larut dalam cairan. Struktur agar terdiri dariD-galactose, 3,6-anhydro-L-galactose,danD-glucuronic acid. Umumnya agar terbuat dari ganggang merah. Agar cocok menjadi agen pemadat karena setelah dilarutkan pada suhu mendidih dapat didinginkan sampai 40-42C sebelum memadat dan tidak akan mencair lagi sebelum suhu mencapai 80-90C.Pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam.

PeptonePeptoneadalah hasil hidrolisis protein yang dibentuk dari proses enzimatik atau digesti asam.Caseinbanyak digunakan sebagai substrat pembentukpeptone, tetapi beberapa bahan lain sepertisoybeanmealjuga sering digunakan.

Meat / plant extractEkstrak dagung dan tumbuhan mengandung asam amino, peptida dengan berat molekul rendah, karbohidrat, vitamin, mineral dantrace metals. Ekstrak jaringan hewan mengandung lebih banyak bahan protein larut air dan glikogen sedangkan ekstrak tumbuhan lebih banyak terdapat karbohidrat di dalamnya.

Faktor tumbuhBanyak mikroorganisme yang membutuhkan faktor tumbuh spesifik yang harus ada dalam media pertumbuhannya. Beberapa diantaranya adalah vitamin, asam amino, asam lemak dan nutrisi dari darah.

Komponen selektifSuatu bahan yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme non target disebut komponen selektif. Komponen selektif dipakai pada media selektif yang berguna untuk mengisolasi bakteri spesifik dari populasi campuran.Bile salts(garam empedu),selenite, tetra-hionate, tellurite, azide, phenylethanol, sodium lauryl sulfate, sodium chloride(konsentrasi tinggi), dan beberapa pewarna (eosin, Crystal Violet, dan Methylene Blue) umumnya dipakai sebagai bahan selektif.Bahan antimikroba juga dapat digunakan untuk menekan pertumbuhan bakteri tertentu, diantaranya adalahampicillin, chloramphenicol, colistin, cycloheximide, gentamicin, kanamycin, nalidixic acid, sulfadiazine,danvancomycin.

Komponen diferensialBerbeda dengan komponen selektif, komponen diferensial ini tidak menekan pertumbuhan mikroorganisme tertentu namun sebagai bahan untuk memudahkan pembedaan mikroorganisme target dari populasi campurannya (deteksi visual). Bahan diferensial seperti pH indikator akan membuat koloni target berbeda warna karena memproduksi asam. Bahan lainnya berupa pewarna kromogenik yang mampu berubah warna jika suatu reaksi enzim spesifik terjadi.

pH buffer / buffer saltspH buffer digunakan untuk menjaga pH media selama digunakan untuk tumbuh karena beberapa mikroorganisme akan tumbuh optimal pada kisaran pH yang spesifik.

d.Macam-macam media pertumbuhan

1.Berdasarkan sifat fisik

Solid mediaMedium padat yaitu media yang mengandung agar 15g/L sehingga setelah dingin media menjadi padat. Media padat berguna untuk menjaga sel tidak berpindah tempat sehingga akan mudah dihitung dan dipisahkan jenisnya ketika tumbuh menjadi koloni. Media padat juga menampakkan difusi hasil metabolit bakteri sehingga memudahkan dalam pengujian suatu hasil metabolit.

Liquid mediaMedium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (NutrientBroth), LB (LactoseBroth). Medium cair akan memberi kesempatan bakteri untuk menyebar dan tercampur dengan seluruh nutrisi sehingga lebih cocok untuk mengoptimumkan pertumbuhan mikroba. Dapat juga untuk mengetahui karakter suatu mikroba berdasarkan kebutuhan oksigen.

Semisolid mediaMedium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat dan tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (NitrogenfreeBromthymolBlue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada mediaNitrateBroth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

2.Berdasarkan kandungan bahan

Media sintetik / media terdefinisi (synthetic media / defined media)Media sintetik adalah media yang seluruh komposisinya diketahui. Media sintetik digunakan dalam penelitian mengenai uji metabolisme suatu mikroorganisme. Banyak jenis mikroorganisme kemoorganotrof heterotrof dapat tumbuh pada media sintetik dengan glukosa sebagai sumber karbon danammonium saltsebagai sumber nitrogen(Prescottet al. 2002:105).Berikut contoh komposisi media sintetik :BG11 Medium for Cyanobacteria (g/liter)-Agar 10.0g-NaNO31.5g-MgSO47H2O0.075g K-H2PO40.04g-CaCl22H2O0.036g-Na2CO30.02g-Citric acid6.0 mg-Ferric ammonium citrate6.0 mg-EDTAdisodium salt1.0 mg-Trace metal mixA51.0 mL

Media kompleks (complex media)Media kompleks adalah media yang sebagian komposisinya tidak diketahui dengan pasti. Media kompleks seringkali dibutuhkan karena kebutuhan nutrisi dari beberapa bakteri tidak diketahui sehingga media sintetik tidak dapat dibuat untuk keperluan ini. Seringkali satu jenis media kompleks dapat cukup kaya untuk memenuhi kebutuhan banyak jenis bakteri. media ini dapat mengandung bahan yang tidak diketahui pasti komposisinya sepertipeptone,meat extractdanyeast extract. Contoh media kompleks adalahnutrient broth, tryptic soy brothdanMacConkey agar(Prescottet al. 2002:105).

3.Berdasarkan tujuanBerikut adalah pembagian media berdasarkan tujuan menurut Barrow & Feltham (1993:8-9) :Media isolasiMedia isolasi adalah media umum yang digunakan untuk mengisolasi suatu mikroba menjadi kultur murni. Biasanya mengandung semua kebutuhan untuk tumbuh, misalnya Blood agar atau Chocolate agar.Media selektif (selective or inhibitory media)Berfungsi untuk menumbuhkan mikroba target / yang diinginkan dan menekan pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan (background flora). Umumnya media selektif menseleksi mikroba target berdasarkan kelompok, genus atau spesiesnya, misalnya EMB agar untuk menseleksi E. coli, Baird parker untuk isolasi S. aureus.Media pengkaya (enrichment media)Media pengkaya termasuk media selektif namun lebih berfungsi untuk memperbanyak mikroba target sehingga saat dilakukan pengkulturan, mikroba yang tidak diinginkan tidak dalam jumlah besar. Media pengkaya harus dalam bentuk cair dan digunakan di awal tahap analisa.Media untuk peremajaan kultur (maintenance of cultures)Media peremajaan kultur seharusnya tidak begitu kaya nutrisi sehingga mempercepat pertumbuhan, misalnya Nutrient agar.Media untuk penentuan kebutuhan nutrisi / kemampuan penggunaan substrat.Media ini berfungsi untuk mendeteksi dan mengidentifikasi kebutuhan suatu substrat dari bakteri (yang tidak diketahui kebutuhan nutrisinya) dengan menghilangkan atau mensubtitusi komponen suatu substrat. Media ini tidak digunakan untuk kebutuhan sehari-hari namun lebih untuk keperluan penelitian. Sebagai contoh sederhananya adalahKoser Citrateuntuk mendeteksi penggunaancitratesebagai sumber karbon tunggal.Media untuk karakterisasi bakteriUmumnya mengandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan dan ditambah substrat yang akan diuji penggunaannya. Reagen atau indikator tertentu dapat juga ditambahkan untuk mengetahui hasil reaksi.Media skrining (screening media)Media ini diperuntukkan untuk menggambarkan sekilas reaksi yang diperoleh dari beberapa substrat seperti produksi H2S pada TSI oleh enterobacteria.Media uji mikrobiologi untuk vitamin, asam amino dan antibiotikMedia ini memerlukan pengontrolan ketat pada saat preparasinya untuk memastikan kemurniannya. Penggunaan cawan kotor dimungkinkan akan menyediakan nutrisi sehingga hasil uji menjadi rancu. Sedangkan media untuk uji antibiotik tidak begitu membutuhkan kepastian kemurnian media karena nutrisi asing tidak berpengaruh kepada hasil uji.Media dasar tanpa nutrisi (non-nutrient basal media)Berfungsi untuk berbagai keperluan pendukung pertumbuhan mikroba seperti pelapisan Chitin agar menggunakan media chitin yang dilarutkan pada Salt agar.

MEDIA PERTUMBUHAN MIKROORGANISME (bagian 2)

e.Hal-hal penting dalam pembuatan mediaBahan baku airPenimbangan media pertumbuhanKonsentrasi agar dan proses pelarutan agarKetebalan agar dan luas cawan yang digunakanPengaturan pHProses sterilisasiPencairan kembali media agarPenuangan media ke dalam cawan atau tabungPemyimpanan media jadiPerlakuan untuk media kultivasi anaerobf.Penanganancommercialdehydratedmedia.g.Ilustrasi pembuatan mediah.Referensi

e.Hal-hal penting dalam pembuatan media pertumbuhan

Bahan baku airAir yang digunakan sebagai bahan baku pembuatan media dapat memakai air destilasi. Konduktivitas air yang digunakan sebaiknya tidak lebih dari 25 S/cm pada 25 C dan mengandung kontaminasi mikroba tidak lebih dari 1000 CFU/ml dan akan lebih baik jika menggunakan air berkonsentrasi mikroba dibawah 100 CFU/ml (ISO/TS 11133-1.2009:7).

Penimbangan media pertumbuhanPenimbangan sebaiknya dilakukan pada timbangan analitik dengan ketelitian 0,1 g dengan kapasitas 2000 g. Penimbangan tidak perlu dilakukan secara aseptis namun tetap dalam keadaan bersih. Penimbangan secara aseptis sebaiknya dilakukan pada medium yang tidak diperbolehkan untuk diautoklaf. Untuk mencegah tercampurnya media dalam wadahnya dengan bahan lain maka sebaiknya menggunakan spatula yang berlainan.

Konsentrasi agar dan proses pelarutan agarKonsentrasi agar 15.0 g/L umumnya digunakan untuk membuat media padat. Konsentrasi yang lebih rendah (7,510.0 g/L) dipakai untuk membuatsoft agarsatau media semisolid. Agar larut pada suhu84C dan memadat pada 38C(Atlas, 2010:1). Konsentrasi agar yang lebih dari ketentuan mengakibatkan proses pemadatan lebih cepat pada saat penuangan. Proses pelarutan agar dapat menggunakanhotplatedanmagneticstirrer. Indikasi larutnya agar umumnya ditunjukkan dengan beningnya media atau mencairnya serbuk agar yang tertempel pada dinding erlenmeyer. Sebaiknya pada saat pelarutan hindari panas berlebihan.Overheatingmengakibatkan sebagian media menjadi buih dan akan mendesak keluar dari mulut wadah dan juga membuat kerak pada dasarnya.

Ketebalan agar dan luas cawan yang digunakanMedia agar yang sangat tipis ketebalannya masih memungkinkan mikroorganisme untuk tumbuh (yangmungkin akan berpengaruh kepada ukuran koloni) dan nutrisi media yang tipis masih cukup memenuhi kebutuhan. Namun ketebalan media lebih mempengaruhi faktor teknis dalam penanaman seperti ketahanan agar saat menerima tekananspreaderatau saat di goresloopdan kehilangan air karena menguap. Namun sebaliknya media padat yang terlalu tebal tentu sangat memboroskan. Volume yang cukup untuk cawan petri diameter 9 cm adalah antara 12-15 ml media.

Pengaturan pHpH sebaiknya diukur sebelum sterilisasi pada suhu 25C sesuai ketentuan pH menggunakan pH meter. Sehingga setelah proses sterilisasi media akan memiliki pH sesuai persyaratan ( 0,2 pH unit). Jika pengaturan pH diperlukan maka dapat diatur dengan larutan sterilsodiumhydroxide(NaOH) 40 g/l atauhydrochloricacid(HCl) 36,5 g/l. Setelah disterilisasi pH sebaiknya dicek kembali dengan sedikit menuang sampel media steril (ISO/TS 11133-1.2009:8).

Proses sterilisasiMedia yang telah siap disterilisasi (15 Psi/1 atm, 121oC selama 15 menit)harus dibuka sedikit tutupnya (jika menggunakan wadah tutup berulir) atau harus dilubangi plastiknya supaya tekanan yang dihasilkan autoklaf dapat masuk ke dalam media. Jika hal ini tidak dilakukan maka tekanan dalam wadah lebih rendah darichamberautoklaf dan menyebabkan sterilisasi menjadi tidak efisien. Menurut Barker (1998:156)Jika media yang disterilisasi dengan autoklaf terdapat dalam jumlah 1 L pada erlenmeyer 2 L maka sebaiknya waktu sterilisasi diperpanjang menjadi 30 menit.(untuk informasi lebih lengkap mengenai autoklaf dapat dilihat pada Bab Sterilisasi)Menurut Barker (1998:157) untuk mencegah presipitasi, pencoklatan dan pecahnya substrat pada sterilisasi menggunakan autoklaf dapat dilakukan beberapa cara pencegahan yaitu :-sterilisasi glukosa terpisah dengan pepton (asam amino) atau senyawa fosfat.-sterilisasi fosfat terpisah dengan pepton atau komponen garam mineral,-sterilisasi garam mineral terpisah dengan agar,-tidak melakukan sterilisasi media dengan pH >7,5 (untuk mengatasinya, sterilisasi pada pH netral kemudian diatur pH menjadi basa dengan larutan basa steril).-tidak melakukan sterilisasi larutan agar dengan pH Dampak pemanasan terhadap komposisi media mulai sejak suhu 60 yang berdampak pada dekomposisi growth factor, karamelisasi gula (reaksi Maillard antara gula dan asam amino) dan perubahan pH (Barrow & Feltham, 1993:13).Atlas (2010:8) menyarankan bahwa media yang mengandung karbohidrat disterilisasi dengan autoklaf pada suhu116118C untuk mencegah dekomposisi karbohidrat dan pembentukan formasi senyawa toksik yang menghambat mikroba. Sedangkan untuk media yang tidak tahan terhadap sterilisasi autoklaf (seperti media yang mengandung protein telur) sebaiknya disterilisasi menggunakan teknik inspisasi (inspissation). Cara ini dapat dilakukan dengan cara memanaskan pada Arnold steam sterilizer dengan suhu 7580C selama 2 jam dan dilakukan pada tiga hari yang berurutan (jeda hari ditujukan untuk memberikan kesempatan mikroba kontaminan untuk berkecambah). Bahan yangheat-labileseperti larutan antibiotik, vitamin atau karbohidrat disterilisasi menggunakan teknik membran filter yang kemudian ditambahkan ke dalam media setelah didinginkan sampai 50C.(untuk informasi lebih lengkap mengenai teknik sterilisasi dapat dilihat pada Bab Sterilisasi.)

Pencairan kembali media agarPencairan kembali media agar steril dapat dilakukan pada waterbath suhu 47-50C dengan waktu minimal supayauntuk menjaga kualitas media. Sebaiknya tidak overheating, angkat segera setelah semuanya mencair dan digunakan tidak melebihi waktu simpan 4 jam(ISO/TS 11133-1.2009:9).

Penuangan media ke dalam cawan atau tabungKeseragaman volume sangat dibutuhkan dalam pendistribisan media untuk memenuhi spesifikasi metode yang dipakai. Untuk media cair yang dituang ke tabung-tabung maka sebaiknya volume yang dipindahkan lebih besar dari pada volume yang dipersyaratkan. Menurut Andrewset al.(2004:9), proses sterilisasi dapat mengurangi volume media sebesar 0,1-0,3 ml sehingga diperlukan penakaran lebih dari yang dipersyaratkan. Misalnyapeptonediluentsyang menurut metode tertentu memiliki spesifikasi volume 90,2 ml maka sebaiknya pipet diatur pada 9,2 ml sehingga setelah disterilisasi volume akhir masuk dalam kisaran spesifikasi.Keseragaman penuangan volume yang sama pada cawan petri dapat diperoleh dengan cara memasukkan media padat yang telah larut ke dalam tabung-tabung sebelum disterilisasi sesuai volume yang dibutuhkan. Kemudian media steril dalam tabung (sebelum agar memadat) disebarkan ke setiap cawan(Prescott & Harley, 2002:78).Cara lainnya adalah menggunakan media dispenser(glass repeating dispenser)seperti yang telah dijelaskan pada Bab Pengenalan Alat. Terkadang demi waktu dan efisiensi, banyak praktisi yang langsung menuang media padat dari botol atau erlenmeyer langsung ke dalam cawan yang tentu saja membutuhkan keahlian dan ketepatan intuisi dalam membaginya.Penuangan media sebaiknya tidak dilakukan dalam keadaan panas >50oC supaya tidak terjadi kondensasi berlebihan pada tutup cawan. Untuk mencegah kondensasi maka media siap tuang didinginkan (dijaga) pada suhu 50oC selama 30 menit kemudian dituang. Pembakaran mulut tabung/Erlenmeyer sebaiknya dilakukan untuk mencegah kontaminasi.ISO/TS 11133-1(2009)menyatakan bahwa pengeringan media cawan yang telah dituang dapat dilakukan dengan membuka tutup cawan pada LAF dan bagian permukaan media menghadap ke bawah supaya kondensasi air yang berada pada cawan petri hilang. atau keringkan pada oven dengan suhu 25-59oC. Pengeringan sebaiknya dilakukan jangan terlalu lama, overdrying mengakibatkan media menjadi retak-retak.

Pemyimpanan media jadiMedia jadi pada cawan yang telah siap pakai sebaiknya disimpan dengan posisi terbalik dan ditumpuk tidak lebih dari tiga cawan atau dapat menggunakanpetri plate storage holder. Media pertumbuhan sebaiknya digunakanfreshsetelah dibuat, tetapi adakalanya dibutuhkan persiapan yang membuat media pertumbuhan yang sudah jadi harus disimpan.Waktu penyimpanan media jadi sangat beragam. MenurutISO/TS 11133-1(2009) media jadi disimpan pada suhu53 C dan disarankan untuk disimpan tidak melebihi 2-4 minggu untuk media cawan dan 3-6 bulan untuk media cair. Media yang ditambah suplemen sebaiknya dipakai pada hari yang sama saat pembuatan.Untuk lebih jelasnya lihat pada tabelshelf life prepared mediaberikut.NameFormStorage timeTemperature storagepH storageColorStorage Condition

BGLB(Brilliant Green Lactose Bile)Broth1 month42C7.40.2Green clearScrew capped tube/bottles

BS(Bismuth Sulphite)Agar1-3 days(5 days max)4C7.40.2Pale green/ straw opaque with flocculent precipitate which must be uniformly dispersed.Sealed petridish

DG18(Dichloran Glycerol 18)Agar7 days42C5.60.2Amber slightly opalescentSealed petridish

HE(Hektorn Enteric)Agar3 weeks42C7.50.2Blue-green, transparentSealed petridish

LT / LST(Lauryl Tryptose)Broth1 month42C6.80.2Light amber, clear to slightly opalescentScrew capped tube/bottles

MRS(De Mann Rogosa Sharpe)Agar14 days42C6.20.2Light amber, clearSealed petridish

RV(Rappaport Vassiliadis)Broth6 months42C5.20.2Green-blue, transparentScrew capped tube/bottles

TSA(Trypticase Soya Agar)Agar30 days42C7.30.2Light yellowSealed petridish

TT(Terta Thionate)Broth7 days42C7.40.2Pale milky opaque which on standing gives a pale liquid over a heavy precipitateScrew capped tube/bottles

XLT4(Xylose Lysine Tergitol 4)Agar3 months42C7.30.2Light rose, transparentSealed petridish

XLD(Xylose Lysine Deoxicholate)Agar5 days42C7.40.2Light rose, transparentSealed petridish

(Corryet al.,2003:394-635).

Terdapat juga bahan dapat berubah menjadi beracun ketika terpapar cahaya seperti beberapa pewarna (dye). Dengan alasan inilah terdapat petunjuk penyimpanan media pada keadaan gelap (Corryet al.,2003:388). Media jadi sebaiknya disimpan dalam suatu kemasan yang berguna untuk meminimalisasi kehilangan air dalam media agar, melindungi dari cahaya dan juga melindungi dari kontaminasi. Secara umum plastik tahan panas cocok untuk membungkus media cawan (tidak peka cahaya) yang telah jadi. Pada keadaan terbungkus inilah media dapat disimpan atau dipindahkan keluar dari kondisi aseptis.Media padat yang disimpan terlalu lama pada suhu ruang akan kehilangan kadar airnya sehingga media semakin mengeras, menipis, pecah-pecah dan jika kehilangan semua air maka akan menjadi kerak di cawan petri. Penyimpanan pada suhu refrigerator lebih dapat mempertahankan kandungan air dalam media agar.Pengecekan sterilitas media dapat mengacu kepada tabelsterility testingyang disarankan oleh Andrewset.al.(2004:7) untuk menguji kualitas media.Suhu uji/penyimpanan inkubasiWaktu minimum uji sterilitas

4-8 C20-25 C35-37 C10-14 hari2-5 hari48-72 jam

Perlakuan untuk media kultivasi anaerobHoldeman, Cato & Moore (1977) dalamBarrow & Feltham (1993:7) menyarankan bahwa untuk mengoptimalkan pertumbuhan mikroorganisme anaerob obligat dapat dilakukan dengan menurunkan potensial redoks (Eh)media sebelum diinokulasikan. Reduksi ini dapat dilakukan saat preparasi media, kondisi ini dijaga pada saat penyimpanan dan sebisa mungkin saat inokulasi. Tehnik khusus ini dinamkanpre-reduced anaerobically sterilized(PRAS) yaitu dengan cara:-menghilangkan oksigen terlarut dengan memanaskan hingga mendidih.-menambahkancystein-flushingdengan gas bebas oksigen dan menyimpannya pada wadah dengan gas bebas oksigen.Media ini sebaiknya mengandung indikator Ehyaitu resazurin yang akan berubah menjadi tidak berwarna ketika terreduksi. Jika oksidasi terjadi maka media berubah menjadi pink yang menandakan bahwa media sebaiknya tidak dipakai.Cysteinjuga dapat menghambat beberapa enzim proteolitik, oleh karena itu jangan menambahkancysteinjika akan melakukan uji mengenai enzim tersebut.

Trubleshootingkesalahan dalam pembuatan mediaMasalahKemungkinan kesalahan

Agar tidak memadatoverheatingselama preparasipH rendah yang menyebabkan terjadinya hidrolisiskesalahan penimbangan agaragar tidak larut sempurnakomposisi tidak diaduk dengan rata

pH tidak sesuaioverheatingselama preparasikualitas air yang rendahkontaminasi larutan kimia lainpengukuran pH tidak pada suhu yang disarankankesalahan pada pH meterburuknya kualitas medium

Warna tidak normaloverheatingselama preparasikualitas air yang rendahkesalahan pengukuran pHkontaminasi larutan kimia lainburuknya kualitas medium

Terbentuknya presipitat / endapanoverheatingselama preparasikualitas air yang rendahkesalahan pengukuran pHkontaminasi larutan kimia lainburuknya kualitas medium

Produktivitas yang rendahkesalahan pada penimbangan atau penambahan suplemenresidu senyawa toksik pada alat gelas atau airoverheatingselama preparasiburuknya kualitas mediumkualitas air yang rendah

Selektivitas yang rendahkesalahan penambahan suplemensuplemen terkontaminasikesalahan penimbanganburuknya kualitas mediumoverheatingselama preparasi

kontaminasikesalahan sterilisasikesalahan teknik aseptissuplemen terkontaminasi

(ISO/TS 11133-1. 2009:17)

f.PenanganancommercialdehydratedmediaCommercialdehydratedmediaadalah sebutan untuk media hasil produksi suatu perusahaan yang komposisinya telah diracikkan sesuai takaran literatur lalu dihilangkan kandungan airnya supaya bertahan lama dan didistribusikan secara komersial.Dehydrated mediabiasanya ditempatkan dalam container berpenutup ulir dan suplemen atau bahan selektif disediakan dalam bentuk cair atau padatan. Kualitas media setelah dibuka sangat tergantung pada kondisi penyimpanannya. Lebih baik media disimpan pada suhu dingin dan jauh dari sinar (terdapat petunjuk detail padapackage). Penurunan kualitas media dapat dilihat dengan adanya perubahan karakteristik bubuk media atau perubahan warna media. Sebaiknya perlu dicatat mengenai tanggal penerimaan media dan tanggal pembukaan media.Keuntungan penggunaandehydratedmediaadalah 1. Mudah dalam preparasinya dan tanpa pengaturan pH. 2. Setiap batch yang dibuat akan menghasilkan konsentrasi yang seragam. 3. Dapat digunakan untuk pembuatan dengan volume kecil (hal yang sangat sulit jika membuat media racikan dalam volume kecil). 4. Penghematan waktu dan biaya. Sedangkan kekurangannya adalah 1. Umumnya memiliki sifat higroskopis. 2.Dehydratedmediatidak cocok untuk jenis media yang mengandung darah atau bahan termolabil lain(Barrow & Feltham, 1993:7).

g.Ilustrasi pembuatan media

e.ReferensiAndrews, S., P. Traynor, A. Scholtes, J. Anderson,N. Shepherd, and A. Tan.2004. Guidelines for Assuring Quality of Food and Water Microbiological Culture Media, Culture Media Special Interest GroupAustralian Society for Microbiology,Australian Society for Microbiology.Atlas, Ronald M.. 2010.Handbook of Microbiological Media(4thEdition). New York : CRC Press.Barker, Kathy. 1998.At The Bench, A Laboratory Navigator. New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press.Barrow, G.I. and R.K.A. Feltham. 1993.Cowan and Steels, Manual for the Identification of Medical Bacteria. New York : Cambridge University Press.Corry, J.E.L., G.D.W. Curtiss, and R.M. Baird. 2003.Handbook of Culture Media for Food Microbiology(Vol.35). Amsterdam: Elsevier.Prescott, L.M., and J.P. Harley. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, 5thEdition. McGraw-Hill Companies.Prescott, L.M., J.P. Harley and D.A. Klein. 2002.Microbiology, 5thEdition. McGraw-Hill CompaniesISO/TS 11133-1.2009.Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media Part 1:General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory, 2ndedition

Media BiakanMikroorganismeOKT 15Posted byNewbie ToraPENDAHULUANUntuk meneliti bakteri di laboratorium, kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya. Dalam laboratorium, lingkungan fisik yang dimaksud adalahmediabiakan.Media biakan adalah media steril yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme. Media biakan terdiri dari garam organik, sumber energi (karbon),vitamindanzatpengatur tumbuh (ZPT). Selain itu dapat pula ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa kompleks lainnya (Soeryowinoto, 1985).

Media Biakan

Media BiakanBerdasrkan bentuknya, media dibagi atas medis cair, semi cair dan padat. Sedang menurut susunannya, media dapat dibagi atas media kompleks dan media sintetikKeragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi diantara bakteri, diimbangi oleh tersedianya berbagai macam media yang banyak macamnya untuk kultuivasinya. Macam media tersebut dapat dibagi berdasarkan bentuknya dan susunannya.Adapun dalam percobaan ini, jenis media yang digunakan adalah jenis mediaPDA(Potato Dekstrose Agar) yang merupakan media padat dan tergolong media kompleks.Media biakan yang mampu mendukung optimalisasi pertumbuhan milroorganisme harus dapat memenuhi persyaratan nutrisi bagi mikroorganisme. unsur tersebut berupa garam organik, sumber energi (karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT). Selain itu dapat pula ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa kompleks lainnya (Soeryowinoto, 1985).Unsur karbon yang digunakan oleh Mikroorganisme dapat berupa pancaran atau cahaya dinamankanfototrof, dan yang lain adalah jeniskemototrofmenggunakan hasil oksidasi senyawa-senyawa kimia dalam media untuk memperoleh energinya (Hadioetomo, 1986).Jenis yang termasuk garam-garam anorganik berupa nitrogen terutama kalium nitrat (KNO3), belerang (sulfur anorganik), fosfor dan unsure-unsur logam anorganik seperti natrium, kalium, kalsiuum, magnesium, mangan, besi, seng, tembaga, dan kobalt (Hendaryono, 1994).Vitamin dalam media biakan berfungsi membentuk substansi yang mengaktivasi enzim. Mikroorganisme memperlihatkan gejala yang berlainan dala pola pengambilan nutrisi. Meskipun semua Mikroorganisme membutuhkan vitamin dalamprosesmetaboliknya, namun beberapa jenis Mikroorganisme nampu mensintesis kebutuhan vitaminnya sendiri dari senyawa-senyawa lain di dalam medium (Hadioetomo, 1986).Vitamin-vitamin yang sering ditambahkan dalam medium biakan adalah : Niasin, Glisin, Piridoksin,HCl, Tiamin, Asam folat, dan lain-lain (Soeryowinoto, 1985)Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit namun dapat mendukung, menghambat dan merubah proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi, tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium, pertumbuhan Mikroorganisme sangat terhambat bahkan mungkin tidak dapat tumbuh sama sekali (Gardener, 1993).Media PDA (Potato Dextrose Agar) adalah macam zat nutisi organic yang digunakan dalam medium biakan. Bahan ini umumnya digunakan pada lanortorium kultur dengan komposisi !0:1:1 kentang,dextrosedanagardalam 1 liter air destilasi (Hendarto, 2002)PDA (Potato Dextrose Agar) merupakan medium yang umum digunakan dalam kultivasi bakteri. Selain karena proses pembuatannya mudah, juga karena memiliki komposisi yang kompleks bagi perkembangan bakteri, yaitu nerupa (Hendaryono, 1994).Bentuk media lain berupa cair adalah campuran komponen-komponen zat kimia tertentu dengan air suling, sedang media yang secara fisik merupakan intermediate antara media cair dan padat, seperti agar lunak.Media biakan ada yang berbentuk padat, cair dan semi padat . Media padat adalah media biakan yang dipadatkan dengan agar, ada yang bersifatreversible(dapat dibalik) seperti agar nutrien dan ada yang bersifatireversible(tidak dapat dibalik) seperti serum darah terkoagulasi. Dalam kedokteran, media padat yang bersifatirreversiblepaling sering digunakan. Sedang agar nutrient banyak digunakan dalam media lain.Media ada yang bersifat kompleks dan sintetik. Media sintetik adalah media yang semua komponennya merupakan bahan kimia yang semua komponennya merupakan bahan kimia yang nyata dan spesifik dari segi kandungannya kurang jelas atau tidak dapat dipastikan, sering diistilahkan dengan medium kompleks (Soryowinoto, 1985).Media kompleks seperti agar nutrient disiapkan dengan cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan menambahkan air pada suatu produk komersial berbentuk medium bubuk yang sudah mengandung semua nutrient yang dibutuhkan. Pada praktisnya, semua nutrisi tersebut secara komersial dalambentukbubuk dan juga dalam bentuk siap pakai di dalam cawan-cawan Petri, tabung atau botol (Hasioetomo, 1986)Demikian sedikit ulasan mengenai media biakan mikroorganiisme pada mikrobiologi, Semoga bermanfaat,Referensi :http://wahyuaskari.wordpress.com/umum/pembuatan-media-biakan/

BAB IPENDAHULUANA.Latar BelakangSterilisasi merupakan suatu hal yang perlu diketahui dalam pembelajaraan mikrobiologi. Tanpa medium, mikroba tidak akan bisatumbuh. Begitupun dengan sterilisasi, sterilisasi harus dilakukan sebelum menggunakan alat-alat atau bahan, hal tersebut dimaksudkan agar tidak ada mikroorganisme lain, yang tidak diinginkan, tumbuh dalam media tersebut.Suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan dari segala bentuk kehidupan terutama mikroba. Bekerja steril adalah syarat utama keberhasilan pekerjaan kita. Sterilisasi perlu dilakukan sehingga hanya biakan murni saja yang ada tanpa kontaminasi mikroba lain. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdapat satu spesies mikroba atau hasil perbanyakan satu sel mikroba.Sterilisasi merupakan salah satu faktor utama dalam fermentasi. Kita tentu mengharapkan tidak terjadi kontaminasi di mana mikroorganisme yang tidak diinginkan tumbuh dan mengganggu proses fermentasi. Teknik sterilisasi berbeda-beda tergantung pada jenis material.Adapun kami melakukan praktikum ini karena praktikum ini bagian dari mata kuliah mikrobiologi (1 sks) yang harus kami ikuti untuk menunjang pengetahuan mata kuliah tersebut.

B.TujuanUntuk mengetahui jenis-jenis dan teknik yang digunakan dalam sterilisasi alat.

BAB IITINJAUAN PUSTAKAMenurut Tim Penyusun Praktikum Mikrobiologi tahun 2011, sterilisasi ada dua jenisyaitu:1.Sterilisasi dengan cara fisikA.PemanasanAir dan uap adalah media panas yang baik. Dalam waktu relatif singkat, alat yang akan disterilkan akan mencapai suhu yang diinginkan. Udara adalah penyalur panas yang kurang baik. Oleh karena itu, untuk mencapai suhu yang diinginkan akan membutuhkan waktu yang cukup lama.1.Panas keringCara ini untuk membunuh mikroba hanya memakai udara panas kering yang tinggi. Sterilisasi panas kering dibedakan atas :a.Panas membaraDengan jalan menaruh benda yang akan di sterilkan dalam nyala api bunsen sampai merah membara. Alat yang disterilkan yaitu sengkelit, jarum, ujung pinset dan ujung gunting.b.Melidah - apikanDengan melewatkan benda dalam api bunsen, namun tidak sampai menyala terbakar. Alat yang disterilkan yaitu scalpel, kaca benda, mulut tabung dan mulut botol.c.Udara keringOven merupakan ciri umum yang dimaksud. Alat ini terbuat dari kotak logam, udara yang terddapat di dalamnya mendapat udara panas melalui panas dari nyala listrik. Alat yang disterilkan yaitu tabung reaksi, cawan petri, pipet, scalpel dari logam, gunting dan botol. Pemanasan satu jam dengann temperatur 160oC dianggap cukup.

2.Panas BasahYang dimaksud panas basah adalah pemanasan menggunakan air atau uap air. Uap air adalah media penyalur panas yang terbaik dan terkuat daya penetrasinya. Panas basah mematikan mikroba. Oleh karena koagulasi dan denaturasi enzim dan protein protoplasma mikroba. Untuk mematikan spora diperlukan panas basah selama 15 menit pada suhu 121oC. Sterilisasi panas basah dapat dibedakan atas tiga golongan yaitu:a.Panas basah 100oCSterilisasi dengan cara ini hasilnya mutlak steril, sehingga biasa dipergunakan di rumah sakit dan laboratorium besar. Cara ini menggunakan tangki yang diisi dengan uap air yang disebut autoclave. Alat yang disterilkan adalah alat dari kaca, kain kasa, media pembenihan, cairan injeksi, dan bahan makanan.B.Filtrasi / PenyaringanPenyaringan dilakukan dengan mengalirkanlarutan melalui suatu alat penyaringan yang memiliki pori pori cukup kecil. Untuk menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan yang umum digunakan tidak dapat menyaring virus. Penyaringan dilakukan dengan untuk mensterilkan cairan yang tidak tahan terhadap pemanasan dengan suhu tinggi seperti : serum, larutan yang mengandung enzim, toksin kuman, ekstraksel, antibiotik dan asam amino.C.Radiasi / PenyinaranMikroorganisme dapat dibunuh dengan penyinaran yang memakai sinar ultrraviolet yang panjang gelombangnya antara 220 290 nm. Radiasi paling efektif adalah 253,7 nm. Sinar matahari langsung mengandung sinar ultraviolet 290 nm, sehingga sinar matahari adalah sinar yang bersifat bakterida yang baik.2.Sterilisasi Dengan Cara KimiaZat kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi dapat berwujud :a.Gas : Ozon, formaldehyde, ethylene oxide gasb.Larutan : deterjen, yodium, alcohol, peroksida fenol, formalin, AgNO3dan merkurokloridSterilisasi dengan cara kimia antara lain dengan disenfektan. Daya kerja antimikroba disenfektan ditentukan oleh konsentrasi, waktu dan suhu. Beberapa contoh desinfektan yang digunakan antara lain : Desinfektan lingkungan misalnya1.Untuk permukaan meja : lisol 5%, formalin 4% dan alcohol.2.Untuk di udara : natrium hipoklorit 1%, lisol 5% atau senyawa fenol lain3.Desinfektan kulit atau luka : dicuci denngan air sabun, providon yodium dan etil alkohol 70%.Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan dari segala bentuk kontaminasi dari mikroba. Proses sterilisasi alat dan medium dalam kegiatan praktikum atau penanganan sampel mikroba sangat dibutuhkan sterilisasi. Apabila teknik sterilisasi tidak diterapkan maka hasil yang dicapai tidak maksimal dan menimbulkan berbagai kontaminasi baik dari alat maupun media tumbuh mikroba (Dwidjoseputro, 1994).Alat yang akan digunakan dalam suatu penenlitian atau praktikumharus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan atau peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibagi menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas), penyaringan, dan penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin) (Hadiotoetomo, 1993).