T.C İstanbul Üniversitesi

Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı

Danışman : Prof. Dr. Emine Kökoğlu

MEME KANSERLERİNDE PROSTAGLANDİN EB2B

(PGEB2B) OLUŞUMU VE NİTRİK OKSİT

(Biyokimya ve Klinik Biyokimya Uzmanlık Tezi)

Uzm. Öğr. Dr. Özlem Çiftçi

İstanbul - 2007

TEŞEKKÜR

İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı’nda almış

olduğum uzmanlık eğitimi süresince bilimsel desteğini ve hoşgörüsünü esirgemeyen Anabilim Dalı Başkanımız Prof. Dr. Gülden Burçak’a,

İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı’nda almış

olduğum uzmanlık eğitimi süresince ve tezimin hazırlanmasında bilgi ve birikimleriyle yol gösteren, emek veren, her zaman her yönden desteğini hissettiğim, çalışma disiplini ve tecrübesine saygı duyduğum, benim için çok özel bir yere sahip olan değerli hocam Prof.Dr.Emine Kökoğlu’na,

Tezimin deneysel aşamasında geniş bilgi birikimlerinden yararlandığım değerli

hocalarımız Prof.Dr.M.Koray Gümüştaş ve Prof.Dr.Hüseyin Sönmez’e, Eğitimimde emeği geçen tüm anabilim dalımız öğretim üyelerine; Hasta gruplarını oluşturmamda bana çok yardımları olan , Genel Cerrahi Anabilim Dalı

öğretim üyesi Prof.Dr.Varol Çelik’e Uzmanlık eğitimim ve tez çalışmalarımda esirgemediği yardımları, sabrı ve dostluğu

için canım arkadaşım Dr.İlknur Bütün’e, Uzmanlık eğitimim süresince dostluğunu ve sevgisini hep hissettiğim değerli arkadaşım

Dr.Ebru Çetin ve diğer çalışma arkadaşlarıma, Bugüne kadar her zaman yanımda hissettiğim, desteklerini ve ilgilerini hiç esirgemeyen,

benim için varlıkları her şeyden daha önemli olan, sevgili annem ve babama, kardeşlerim Haydar ve Neslihan’a ; biricik kızım Güler’e ve değerli eşim Hasan’a çok çok teşekkür ederim.

Dr. Özlem Çiftçi Bu proje İstanbul Üniversitesi Rektörlüğü Araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No: T-470/25062004

KISALTMALAR AA : Araşidonik asit bFGF : Fibroblast büyüme faktörü cGMP : Siklik GMP CaM : Kalmodulin COX : Siklooksijenaz COX-1 : Siklooksijenaz-1 COX-2 : Siklooksijenaz-2 ECM : Ekstrasellüler matriks EGF : Epidermal büyüme faktörü ER : Endoplazmik retikulum ET-1 : Endotelin-1 HETE : Hidroksieikozatetraenoik asit HPETE : Hidroperoksieikozatetraenoik asit HSP-90 : Isı şok proteini-90 KVS : Kardiyo Vasküler Sistem LO : Lipoksijenaz LAP : Lenfadenopati LPS : Lipopolisakkarit LTA B4 B: Lökotrien AB4 LTBB4 B: Lökotrien BB4 LTCB4 B: Lökotrien CB4 LTEB4 B: Lökotrien EB4 MDA : Malonildialdehid

MMP : Matriks metalloproteinazlar NO : Nitrik Oksit NOx : Nitrit + Nitrat NOS : Nitrik Oksit Sentaz NSAID : Nonsteroid anti-inflamatuar ilaç ÖR : Östrojen Reseptörü PDGF : Trombosit kaynaklı büyüme faktörü PG : Prostaglandin PGDB2 B: Prostaglandin DB2 B

PGEB2 B: Prostaglandin EB2 PGES : Prostaglandin E Sentetaz PGFB2 B: Prostaglandin FB2 B

PGGB2 B: Prostaglandin GB2 B

PGHB2 B: Prostaglandin HB2 B

PGI B2 B: Prostasiklin PLAB2 B: Fosfolipaz AB2 B

PR : Progesteron Reseptörü ROS : Reaktif Oksijen Bileşikleri sPLAB2 B: Sekretuar Fosfolipaz AB2 TGF-1 : Transforme edici büyüme faktörü TNF-α : Tümör nekroz faktör alfa TSP : Trombospondin TXAB2 B: Tromboksan AB2 uPA : Ürokinaz Plazminojen Aktivatör VEGF : Vasküler endotel büyüme faktörü

İÇİNDEKİLER USayfa

1.GİRİŞ ve AMAÇ............................................................................... 1

2.GENEL BİLGİLER.......................................................................... 2

3.GEREÇ ve YÖNTEMLER ............................................................. 33

4.BULGULAR...................................................................................... 47

5.TARTIŞMA ve SONUÇ ................................................................... 90

6.ÖZET ................................................................................................. 96

7.SUMMARY ....................................................................................... 97

8.KAYNAKLAR .................................................................................. 98

9.ÖZGEÇMİŞ ......................................................................................110

1

1. GİRİŞ ve AMAÇ

Kanser, hücresel döngülerde genetik mutasyonlar ve regülasyon bozuklukları sonucu

oluşan ve kardiyovasküler damar hastalıklarından sonra en sık ölüme sebep olan hastalıktır.

Kanser konusundaki genetik ve moleküler düzeydeki gelişmelere rağmen, bu sıralama

günümüzde de değişmemiştir ( 87 ).

Her 8 kadından 1’inde görülerek, kadınlarda en sık görülen kanser türü haline gelen

meme kanseri, aynı zamanda da akciğer kanserinden sonra, ölüme en çok neden olan kanser

türüdür ( 51 ).

Tümör büyüme ve gelişmesinde en önemli aşama anjiogenezdir. Meme kanserinde de

diğer pek çok kanser türünde olduğu gibi, tümör büyümesi ve anjiogenez “ NO Yolu“ ve “

COX Yolu” aktivasyonuyla ilişkilidir ( 9 ). NO Yolu’ nda , nitrik oksit sentaz aracılığıyla L-

arginin ve oksijenden L-sitrüllin oluşumu esnasında nitrik oksit sentezlenir. NOS aktivite

artışı, 3’-5’ siklik GMP seviyelerini yükselterek mikrodamar yoğunluğunu artırıp

anjiogenezle sonuçlanır ( 9 ). COX Yolu’nda ise, COX-1 ve COX-2 olarak bilinen bilinen 2

temel enzim yeralıp, araşidonik asitlerden prostanoidlerin oluşmasını sağlarlar. COX-1

salınımı fizyolojik stimuluslarla gerçekleşen yapısal bir enzimdir. COX-2 ise tümor

promotörleri, karsinojenler, hipoksi…..vb. patolojik uyaranlarla salınıp direkt ve dolaylı pek

çok etki yolunu kullanarak meme kanserini artırır ( 63 ). Meme epitel hücrelerinde

proliferasyon, proanjiogenik faktörlerin salınımı, mutajenlerin salınımı, matriks

metalloproteinazların artırılması, antiapoptotik proteinlerde artma vb. gibi etki yollarından en

önemli ve etkin olan yol anjiogenezin artırılmasıdır ( 128 ).

Literatürlerde, anjiogenezin regülasyonunda çok önemli olan bu 2 yolun

aktivasyonlarının sinerjik olduğu belirtilmekte ve bu konuda yeterli sayıda çalışma

bulunmamaktadır. Biz de çalışmamızda meme tümörlü dokularda ve hastaların serumlarında

her 2 yola ait ürünleri incelemeyi planladık. NO yoluyla ilgili olarak nitrat + nitrit düzeylerini

ve NOS aktivasyonlarını hesapladık. COX yoluyla ilgili olarak ise COX-2 ve PGE B2 B

düzeylerini, sPLA B2 B ve LO aktivitelerini hesaplamaya çalıştık. Ayrıca hastalarımızın yaş,

menopozal durum, tümör tipi, grade, tümör çapı vb. gibi prognostik özellikleriyle de

parametrelerimizin ilişkilerini ve literatürlerde eksikliğini gördüğümüz noktalara açıklık

getirmeyi amaçladık.

2

2. GENEL BİLGİLER 2.1. MEME KANSERLERİ

Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanser türü olup, kansere bağlı ölüm sebepleri

içinde akciğer kanserinden sonra ikinci sırada yer almaktadır. İstatistiklere göre her 8

kadından birinde hayatı boyunca meme kanseri gelişme riski vardır ( 51 ).

En yaygın ilk 3 kadın kanser türleri arasında, morbiditesi ve mortalitesi en fazla olan

meme kanserinin etyolojisi multifaktöryeldir. Genetik, hormonal, çevresel ve diyetsel pek

çok faktörden etkilenir ( 81 ). Bu faktörlerin varlığında riskin hangi oranda artacağını

belirleyen aşağıdaki gibi bir sınıflama yapılmıştır ( 92 ).

Meme kanseri riskini önemli derecede artıran faktörler

- BRCA1, BRCA2’ de mutasyonlar, Li-Fraumeni Sendromu

- İleri yaş

- Ailede meme ve over kanseri hikayesi

- Atipik hiperplazili selim meme hastalığı

- İyonize radyasyona maruz kalma

- Daha önce meme kanseri tanısı almış olmak

Meme kanseri riskini orta derecede artıran faktörler

- Erken menarş

- Geç menopoz

- Hiç doğurmamışlık veya gecikmiş ilk hamilelik ( 30 yaş üzeri )

- Yüksek sosyoekonomik durum

- Obezite ( postmenopozal )

- Oğlu veya kızında yumuşak doku sarkom tanısı

- Daha önce uterus, over veya kolon kanseri tanısı almak

- Hiperplazik fakat atipisi olmayan selim meme hastalığı

- Doğum kontrol ilacı kullanımı ( 10 yıldan uzun )

- Postmenopozal hormon yerine koyma tedavisi

- Alkol alımı

3

Meme kanseri riskini artırdığı düşünülen faktörler

- İlk hamileliğin sonlanması

- Psikosomatik faktörler

- Yüksek yağlı diyet

- Kompleks fibroadenom

- Elektromanyetik alanlara maruz kalmak

Meme kanseri riskini azaltan faktörler

- 20 yaştan önce hamilelik

- 45 yaştan önce overektomi

- Özellikle adolesan ve erken yetişin çağında düzenli egzersiz, emzirme

Meme kanseri riskini etkilemeyen faktörler

- Meme büyüklüğü

- Proliferatif değişiklikler içermeyen fibrokistik hastalık

- Sigara içme

Meme Kanseri Patolojisi

Meme tümörleri, % 90 duktus epitelinden ya da % 10 lobül epitelinden köken alırlar.

Duktal ve lobüler kanserlerin her ikisi de, sınırlayıcı bazal membranı penetre etmeyip

glandüler bölümde sınırlı ise in situ ( non-invaziv ) ve bazal membran penetre edilip stromaya

yayılma yapmış ise invaziv, olmak üzere ikiye ayrılırlar. Meme kanserlerinin başlıca

patolojik sınıflaması aşağıdaki gibidir ( 119 ).

1 – Non-invaziv

-İntraduktal karsinom

-Lobular karsinoma in situ

2 - İnvaziv

-İnvaziv duktal karsinom

-İnvaziv lobular karsinom

-Müsinöz karsinom

4

-Medüller karsinom

-Papiller karsinom

-Tübüler karsinom

-Sekretuar (juvenil) karsinom

-Apokrin karsino

-Metaplastik karsinom

-Diğerleri

İnvaziv duktal karsinom, meme kanserleri içinde en önemli kısmı oluşturur. Sıklığı

ülkeden ülkeye değişmekle beraber % 45 -75 kadardır ( 119 ).

Meme Kanserinde Klinik Gidiş ve Evreleme

Meme kanseri sık olarak hasta veya hekim tarafından sınırlı, tek, ağrısız ve

oynatılabilen bir kitle şeklinde fark edilir. Bu dönemde nodül tipik olarak 4 cm’ den küçüktür.

Ancak ne yazık ki vakaların 2 / 3’ünde lenf düğümlerine yayılmıştır. Dış kadran ve santralde

yerleşmiş lezyonlar tipik olarak ilk kez aksiller nodüllere yayılırlar. İç kadrandaki lezyonlar

ise internal meme arterleri boyunca uzanan lenfatikleri tutarlar. Meme kanserinde er yada geç

lenfatik ve hematojen yollarla yayılım olur ve uzak organ metastazları ortaya çıkar. En çok

akciğerler, iskelet, karaciğer ve surrenaller tutulurken, beyin, dalak ve hipofiz daha az tutulur.

Her organ tutulabilir ve tedavi ile görünürde sağlanmış kontrolden yıllar sonra bile

metastazların ortaya çıkma potansiyeli vardır ( 119 ).

Meme kanseri tanısı konduktan sonra evresinin saptanması, kanserin hangi aşamada

olduğu, nasıl seyredeceği, tedavi yaklaşımlarından hangisinin seçileceği konusunda önemli

bilgiler sunmaktadır. Evrelemede American Joint Commitee on Cancer (AJCC)’in TNM

sınıflaması kullanılmaktadır. T ; tümör büyüklüğü, N ; bölgesel lenf bezlerinin tutulumu, M ;

uzak metastazları göstermektedir. 1997 AJCC TNM sınıflaması aşağıdaki gibidir ( 145 ).

5

UTNM Evrelemesi : Tümör büyüklüğü Bölgesel lenf bezleri Uzak metastaz

tutulumu

Evre 0 : T Bis B N B0 B M B0

Evre I : T B1B NB0 B M B0

Evre IIA : T B0B NB1 B M B0

TB1 B NB1 B M B0

T B2 B NB0 B M B0

Evre IIB : TB2B NB1 B M B0

TB3 B NB0 B M B0

Evre IIIA : TB3B NB0 B M B0

TB3 B NB1 B M B0

TB0-3 B NB2 B M B0

Evre IIIB : TB4B Herhangi bir N M B0

Herhangi bir T NB3 B M B0

Evre IV : Herhangi bir T Herhangi bir N M B1 B

TBx B : Tümör büyüklüğü bilinmiyor

TB0 B : Tümör yok

TBis B : Karsinoma in situ ve/veya tümoral kitle yapmayan Paget kanseri

TB1 B : Tümör büyüklüğü 2 cm veya daha azdır

TB2 B : Tümör büyüklüğü 2 cm’ den fazla fakat 5 cm’ den azdır

TB3 B : Tümör büyüklüğü 5 cm’ den fazla

TB4 B : Göğüs duvarı veya meme cildine yayılım gösteren herhangi bir büyüklükteki

tümörü ifade eder. (kostalar, interkostal kaslar ve musc. serratus ant.’a yayılım

olabilir ama pektoral kaslara infiltrasyon içermez)

N : Bölgesel lenf nodları

NB0 B : Bölgesel lenf ganglionlarına metastaz yok

NB1 B : Aynı taraflı aksiller LAP hareketli

NB2 B : Aynı taraflı aksiller LAP’ lar birbirine ya da altındaki veya üstündeki dokulara infiltre

NB3 B : Aynı taraflı supraklavikular veya infraklavikular LAP şüpheli veya kolda ödem

M BxB : Uzak metastazın varlığı değerlendirilemiyor

M B0B : Uzak metastaz yoktur

M B1B : Uzak metastaz vardır

6

Meme Kanserinde Prognostik Faktörler

Hastalığı biyolojik ve moleküler değişkenlere göre ayırıp bireysel farklılıkları

tanımlayarak en etkin tedavi şeklini belirlemek amacıyla prognostik ve prediktif faktörler

belirlenmiştir. Meme kanserinin tanısında veya cerrahi sonrası saptanan ve hastalığın nasıl

seyredeceği konusunda bilgi veren, hastanın veya tümörün biyolojik özellikleri “ prognostik

faktörler”olarak adlandırılmaktadır. Bu faktörler arasında tedaviye yanıtı belirleyecek olanlar

ise “prediktif faktörler” olarak kabul edilmektedir ( 91, 110 ).

Yaş ve menopozal durum diğer prognostik faktörlere göre daha az önemlidir. Yapılan

çalışmalarda 45-49 yaş arası kadınların en iyi prognoza, 35 yaş altında veya yaşlı kadınlarda

ise kötü prognozlu olduğu gösterilmiştir ( 92 ).

Primer meme kanserli hastalarda tümörün tekrarlama sıklığı, tutulan lenf nodu sayısıyla

ilişkilidir. Aynı taraflı aksiller lenf bezi tutulumu en güvenilir prognostik faktördür. Bölgesel

tedavi sonrası tekrarlama olasılığı lenf bezi tutulumu olanlarda % 50-70 iken, lenf tutulumu

olmayanlarda % 20-35 düzeyindedir. Eklenen her lenf nodu, tekrarlama ve metastaz riskini

artırmaktadır. Primer meme tümörünün lenfatikleri kadar etraftaki kan damarları ve perinöral

dokunun invazyonunun prognostik önemi büyüktür. Perinodal invazyon , metastatik lenf nodu

sayısı ile korelasyon gösteren, lenf nodlarıyla ilişkili kötü bir prognostik faktör iken perinöral

invazyon da çoğunlukla lenfatik invazyonla birlikte bulunan kötü bir prognostik faktördür (

91, 92 ).

Meme kanserlerinin histolojik olarak derecelendirilmesinde en yaygın kullanılan sistem

Bloom ve Richardson tarafından önerilen sistemdir. Bu sistemin Elston ve Ellis tarafından

yeniden düzenlenen ve Nottingham modifikasyonu olarak bilinen şekli; tubül oluşumu,

nükleer pleomorfizm ve mitoz sayısına, hücre çapı ve nukleus çapına dayanarak yapılan

derecelendirmedir. Buna göre 3 histolojik derece bulunur, Grade I iyi, Grade II orta derecede,

Grade III kötü diferansiye tümörleri tanımlar ( 110, 145 ). Düşük grade’li iyi farklılaşmış

tümörlerin prognozları, yüksek grade’li az farklılaşmış tümörlere göre daha iyidir ( 92 ).

Meme kanserlerinde hormon reseptörlerinin varlığı da prognoz ve tedavi açısından çok

önemlidir. Östrojen hormonu, meme epitel hücrelerinin çoğalma ve farklılaşması üzerine olan

etkilerini östrojen reseptörleri (ÖR) yoluyla yapar. ÖR’nin normal memede ekspresyonu

düşüktür ve immunohistokimyasal yöntemlerle ancak hücrelerin % 1-2 kadarında

saptanmıştır. İnvaziv kanserlerde ÖR ekspresyonu % 60-70 kadardır ve bu ekspresyon, daha

düşük nüks riski, daha uzun yaşam ve endokrin tedaviye daha iyi yanıt ile ilişkilidir.

7

Reseptörleri pozitif olan olguların hastalıksız sağkalım oranının menopozal durumları,

tümör çapı, aksiller lenf bezi tutulumundan bağımsız olarak anlamlı derecede uzun olduğu

gösterilmiştir. Meme kanseri tipi ile ÖR ekspresyonu arasında paralellik görülmemiştir ( 92 ).

Meme kanserlerinin % 50-60 kadarı progesteron reseptörü (PR) ekspresyonu gösterir.

PR ekspresyonu ÖR tarafından düzenlenir. ÖR varlığı gibi PR varlığı da daha iyi prognoz ve

hormonal tedaviye daha iyi yanıt ile ilişkilidir. Hormonal tadaviye yanıtın belirlenmesinde

ÖR ve PR beraber değerlendirilmelidir. Çünkü östradiol, PR sentezini uyarır ve PR düzeyleri

meme kanserlerinde fonksiyonel bir östrojen yanıtı mekanizmasının varlığını gösterir ( 123 ).

Tümör büyüklüğü, lenf bezi tutulumu olan meme kanserli hastalarda önemli bir

prognostik faktör değilken, lenf bezi tutulumu olmayan meme kanserli hastalarda önemli

olabilir ( 121 ). Tümör büyüklüğü artışı ile birlikte tekrarlama ve metastaz riski hem lenf bezi

tutulumu olan hem de olmayan hastalarda artar. Lenf bezi tutulumu olmayan hastalarda

tümör çapı 2 cm’den küçükse, 20 yıl içinde nüks etme oranı % 20, 1 cm’den küçüklerde ise

% 12’dir ( 92 ).

Meme Kanserlerinde Prognostik Faktörlerin Sınıflandırılması

Tümör yayılma veya yayılma olasılığının göstergeleri

- TNM evrelemesi

- Aksiller lenf nodu durumu

- Histolojik tip

- Anjiogenez faktörleri

- Hücre çoğalması belirteçleri

- Onkogen ve büyüme faktör reseptör ekspresyonu

- Proteaz ekspresyonu

Organ spesifif metastazların göstergeleri

- PTH r-P ekspresyon

- Vimentin ekspresyon

- Kemik iliği mikrometastazları

Tümör gelişim hızı tümör farklılaşması göstergeleri

- Tümör farklılaşması

- Östrojen ve progesteron reseptör ekspresyonu

- HER2 / neu, EGFR, mutant p53, siklin-D

8

- Proliferasyon belirteçleri (mitotik indeks, timidin işaretleme (labeling) indeks, S-phase

fraksiyonu, Ki 67, PCNA)

Sistemik tedavinin etkinliğinin göstergeleri

- Büyüme faktör reseptör (EGFR,HER2) ekspresyonu

- p53 mutasyonu

- BCL-2 ekspresyonu

- Hormon reseptör ekspresyonu (ÖR, PR)

2.2. MEME KANSERLERİNDE ANJİOGENEZ

Meme kanserlerinde tümör büyüme ve gelişmesini sağlayan ana süreç anjiogenezdir.

Anjiogenez, varolan kan damarlarından yeni kan damarlarının gelişmesi olup, embriyogenez,

yara iyileşmesi ve kadın üreme sisteminde fizyolojik bir süreç olarak oluşurken kanserlerde,

inflamatuar hastalıklarda ve göz hastalıklarında patolojik olarak ortaya çıkar ( 9, 17 ).

Vaskülogenez olarak tanımlanan primordial damarsal sistemin gelişimi; endotelyal

progenitor hücrelerin (anjioblastlar) embriyonik ve embriyo dışı mezoderm içerisinde, ilkel

damarsal ağı oluşturmak üzere farklılaşmasını kapsar. Damarsal ağların uzanması ve değişimi

için ; yeni kapillerlerin oluşması, tomurcuklanma ve önceden oluşan damar ağının yeniden

düzenlenerek küçük ve büyük damarları oluşturması gerekir. Gelişen damarsal yapıların

birbiri ardısıra olgunlaşmaları, perivasküler hücrelerin yeniden yapılanmasına ve bazal

membran üzerinde yapılaşmasını sağlayan faktörlerin varlığına bağlıdır. Embriyonik

vaskülogenez esnasında oluşan olaylar, erişkin anjiogenezine benzer ( 38 ).

Anjiogenez oldukça karmaşık bir mekanizmadır ve bu süreçte en temel hücre, damar

endotelinin temelini oluşturan endotel hücresidir. Perisitler ile birlikte kapiller damar

duvarlarını oluştururlar ve her ikisi de ana damarları, dalları ve kapiller ağı oluşturucu genetik

bilgileri içerirler ( 74 ). Anjiogenezin düzenlenmesi, ekstrasellüler matriks içindeki ve

etrafındaki pek çok büyüme faktörü ve düzenleyici proteinin kontrolü altındadır. Tüm

anjiogenik etkileşimler net olarak bilinmese de büyük olasılıkla anjiogenik uyarıcılar ve

anjiogenez inhibitörleri arasındaki denge, normal damarsal bileşenlerin sessiz halde

kalmalarını sağlamaktadır ( 17 ).

9

Anjiogenez , şu 3 temel kısmı içeren çok basamaklı bir süreçtir;

1- Bazal membranın proteolitik enzimlerce yıkılması : Normal, hastalıklı veya hasarlı

dokuların ürettiği anjiogenezi uyarıcı büyüme faktörleri, difüzyon yolu ile komşu dokulara

ilerlerler. Anjiogenik büyüme faktörleri, yakınlarındaki önceden varolmuş kan damarlarının

endotel hücrelerindeki özgün reseptörlere bağlanırlar. Bağlanma sonrası aktive ettikleri

proteolitik enzimler bazal membranın ve endotel hücrelerini döşeyen ekstrasellüler matriksin

yıkımına neden olurlar. ECM’nin enzimatik yıkılımı, endotel hücrelerinin invazyon ve göç

için uyarılması ve kapiller filizlenmeyi başlatır ( 17 ). Süreç, sonrasında MMP’ların aktive

olmasını gerektirir. Yapılan çalışmalarda, meme kanseri hücrelerinin invazyon aşamalarında

uPA sistemi ve MMP-2 nin çok önemli rol oynadığı gösterilmiştir. COX-2, MMP’ların ve

özellikle de MMP-2 nin aktivasyonlarını artırarak bu ilk ve önemli aşamada anjiogeneze

olan etkisiyle, tümör gelişim ve yayılımına katkıda bulunur. COX-2, doku spesifik

metastazlara , özellikle de kemik metastazlarına PGEB2 B aracılığıyla bu şekilde katkıda bulunur

( 128 ).

2- Endotel hücre aktivasyonu, proliferasyonu ve göçü : Anjiogenik uyarı, proteolitik

yıkım ile veya kısa süre sonra endotel hücrelerini aktive eder. Endotel hücreleri ekstrasellüler

matrikse göç eder ve çoğalır. Bu süreçte etkili anjiogenik faktörler; VEGF (Vasküler endotel

büyüme faktörü), bFGF (fibroblast büyüme faktörü), PDGF (trombosit kaynaklı büyüme

faktörü), ET-1 (Endotelin-1) ve TGF-1 (Transforme edici büyüme faktörü) dir. COX-2 ve

prostaglandinler pek çok proanjiogenik faktörün üretimine katkıda bulunurlar. Yapılan

çalışmalarda PGEB2 Bve PGI B2 B‘nin integrin alfa-V3 aracılığıyla endotel hücrelerinin migrasyon

ve yayılımında önemli rol aldığı gösterilmiştir ( 128 ).

3- Tubul oluşumu ve olgunlaşma, damar stabilizasyonu ve ekstrasellüler

matriksin yeniden şekillenmesi :Endotel hücre çoğalmasından sonra ECM bileşenlerinin

depolanması ve bir araya getirilmesi için ekstrasellüler proteoliz mutlaka lokal olarak inhibe

edilmelidir. Kapiller filizlenme oluştuktan sonra yine bu filizlenmenin ucunda yeni oluşmuş

ECM’de yıkılma ortaya çıkar ve bu sayede daha ileri yayılımı mümkün olur.Bazal

membranın yıkılması endotel hücre göçüne ve filiz oluşumuna izin verir. Endotelin yol

alması ve uzaması sırasında hücre içi ve hücreler arası boşlukta, sonunda kendilerinden

damarların oluştuğu lümenler gelişir ( 17 ). Böylece, ekstrasellüler matriksin birbirini sırayla

izleyen aktivasyon ve inhibisyonları sonucunda kapillerler oluşur. Proteolitik yıkılma ve

endotel hücresi göçünden sonra yeni oluşan kapillerler, yeni bazal membranı oluştururlar. Bu

nedenle, endotel hücrelerinin yeni kapiller yapılar oluşturabilmeleri için birbirlerine ve

10

ECM’e tutunma gereksinimi vardır. Damar olgunlaştıktan ve uygun anjiogenez ortaya

çıktıktan sonra anjiyogenik faktörlerde azalma görülürken, anjiyogenez inhibitörlerinde artış

gözlenir. Böylece endotel hücreleri sessiz bir hale bürünür ve damarlar kan akımını

başlatmaya hazır hale gelmiş olur ( 17 ).

Tümörlerin büyümelerinin anjiogeneze bağlı olduğu ilk olarak 1971’de ortaya atılmıştır.

1980’lerde bu konudaki çalışmalar da, tümör büyüklüğü 0,5 mmP

’ Pnin üstüne çıkınca,

büyümesinin anjiogeneze bağımlı hale geldiği, 0,5 mm ‘ten küçük ise tümör beslenmesinin

difüzyon yoluyla olduğu görülmüştür ( 140 ). Tümör büyümesi sırasında mikrodamarlar,

tümöre besin, oksijen ve büyüme faktörleri sağlamak amacıyla sayıca büyük oranda artış

gösterirler. Tümöral anjiogenezde, anjiogenezi uyarıcılar ve inhibe ediciler arasındaki

dinamik denge bozulur, dengenin bozulmasında tümör ve endotel hücreleri temel rol oynarlar

( 17 ).

Anjiogenezi uyarmak için sadece anjiogenik faktörlerin artması yeterli değildir aynı

zamanda anjiogenez inhibitörlerinin de azalması gerekmektedir ( 95 ).

Bir tümör hücresinin metastaz yapabilmesi için, damar sistemine girmek, dolaşımda

canlı kalabilmek, damar sisteminden dışarı çıkabilmek, hedef organda büyüyebilmek ve

anjiogenezi uyarmak gibi çeşitli bariyerleri aşması gerekmektedir. Deneysel çalışmalarda,

yeniden damarlanmadan önce, tümör hücrelerinin nadiren dolaşıma girdikleri gösterilmiştir.

Yüksek mikrodamar yoğunluğunun ise yüzey alanını artırarak hücrelerin dolaşıma girmesini

kolaylaştırdığı ve hücrelerin sürekli olarak dolaşımda bulunduğu saptanmıştır ( 109 ). NO ve

COX Yollarının herikisi de mikrodamar yoğunluğunun artırılması ve anjiogenez etkisiyle

meme kanserinde en önemli 2 döngü haline gelmişlerdir ( 9, 124 ).

2.3.NİTRİK OKSİT

Nitrik Oksit (NO) ; nitrik oksit sentaz (NOS) isimli enzim ailesi tarafından aminoasit L-

arginin’den sentezlenen bir serbest radikaldir ( 59 ).

Kimyasal özellikleri ilk olarak 1772’de Joseph Priestly tarafından tanımlanmış ve in

vivo olarak varlığı 1914’ de Sir Henry Dale tarafından rapor edilmiştir ( 41 ). 1970’ lerde

etki mekanizmaları üzerinde çalışmalar yoğunlaşmış ve 1987’ de EDRF’nin (endotel kaynaklı

gevşetici faktor) NO olduğu gösterilmiştir ( 49 ). 1988’de damar endotel hücrelerinde L-

argininden sentezlendiği bulunmuştur ( 97 ). 1992 yılında “ Science” dergisi tarafından yılın

molekülü olarak seçilmiştir ( 112 ).

11

NO; düşük molekül ağırlıklı, renksiz, kokusuz, toksik, lipofilik, kısmen suda ve organik

çözgenlerde çözünebilen, reseptöre bağımlı olmadan kolayca diffüze olabilen, hücreler

arasında ve içinde kolaylıkla dolaşabilen bir moleküldür ( 27, 60 ).

Oksijenden sekiz elektron ve nitrojenden yedi elektron birleşmesi ile oluşmuş yüksüz,

heterodiatomik yapıdadır. Bu birleşme, eşleşmemiş elektron varlığında nitrik oksidi

paramanyetik ve radikal bir molekül yapar ( 60 ). Nitrik oksidin özellikleri redoks formlarına

da bağlıdır. Nötral nitrik oksit (NOP

•P ), bir elektron kaybederek NOP

+P (nitrosonyum katyonu)

ve bir elektron alarak NOP

-P ( nitroksil anyonu) oluşturabilir ( 65, 75 ).

Nitrik oksidin hedef olarak etkilediği yapılar; hem molekülü, Fe-S bileşikleri, tiol

grupları ve süperoksit radikalleridir ( 41 ).

Nitrik oksit radikali, superoksit anyon radikali ( OB2 PB

-P) ile peroksinitriti ( ONOOP

-P )

oluşturmak üzere hızla reaksiyona girer. Bu bir serbest radikal değildir fakat kısa ömürlü ve

ön maddelerinden çok daha fazla aktif bir moleküldür ( 132 ). Her ne kadar peroksinitrit

(ONOOP

-P) kararlı bir yapıya sahip olsa da fizyolojik pH da, protonlanması ile OH gibi

davranan ve kuvvetli bir oksidan madde olan peroksinitröz asit (ONOOH) oluşturur ve bu

konjuge asit çok kararsız olup, hızla nitrat ( NOB3B )’a dönüşür ( 41, 68 ).

OB2 B + NO → ONOO P

-P ( peroksinitrit ) + HP

+

→ ( ONOOH ) —> OH P

.P + NOB2 PB

.P → NO B3 PB

-P ( nitrat )

Lipofilik ve difüzyon yeteneği fazla olan NO, plazma membranından reseptöre bağlı

olmaksızın çok kolay diffüze olduktan sonra, hedef hücrede guanilat siklazın hem grubuna

bağlanır ve siklik GMP üretimini aktive eder. cGMP, cGMP bağımlı protein kinazı uyararak

hedef proteinlerdeki serin ve treonin rezidülerini fosforile eder ( 68 ).

Nitrik oksit, oksihemoglobinle birleşerek nitrat ve methemoglobin oluştururken redükte

Hb ile birleşerek nitrozohemoglobin (HbNO) oluşturur. Oksijenin fazla olduğu ortamlarda

nitrozohemoglobin , methemoglobin ve nitrata dönüşür. NO’in sadece hem molekülü ile

birleşmesine rağmen, nitrit Hb’nin globin kısmı ile de birleşir ( 41, 76 ).

Hb( Fe-OB2 B ) + NO → metHb ( Fe( III )) + NOB3 PB

- P

12

Ayrıca nitrik oksit demir, bakır, manganez, kobalt gibi metallerle de özellikle, aktif

merkezde ki demiri hedefleyerek reaksiyonlaşır ( 132, 133 ).

Nitrik oksidin kararlı bir yapısı yoktur.Ortaya çıktıktan ve fonksiyonlarını yerine

getirdikten sonra 3-5 saniyelik yarıömrü vardır.Hızlı bir biçimde ve kendiliğinden otookside

olarak çeşitli azot oksitleri oluşturur. Nitrit ( NOB2 PB

-P ), NO’nun oksijenli çözeltilerde spontan

otooksidasyonuyla ortaya çıkan tek kararlı ürünüdür. Radikal yapısı ve kısa yarıömründen

dolayı NO’in kendisinin tayini zordur. Bu yüzden NO üretimindeki dinamik değişimlerin

yansıması, endojen NO üretiminin göstergesi olarak doku ve serumda, radikalin kararlı son

ürünleri olan nitrit ve nitrat ölçülür ( 65, 75 ).

NOB2 B ve NB2 BOB3 B, primer ve sekonder aminleri N-nitrolayabilen, tiyol içeren peptid ve

proteinleri de S-nitrolayabilen güçlü nitrolayıcı ajanlardır. Bu şekilde potansiyel karsinojenik

nitrozaminleri oluşturarak ve/ veya DNA bazlarında mutajenik deaminasyonları uyararak

etkili olurlar ( 68 ).

NO çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlarda etkili ve bu sebeple yapımı çok hassas

kontrol altında olan bir moleküldür. Başlıca fizyolojik fonksiyonları vazodilatasyon, trombosit

agregasyonunun inhibisyonu, nörotransmisyon ve immun cevabın regülasyonudur ( 141 ).

Damar düz kas hücrelerinde guanilat siklazın hem prostetik grubundaki ferröz demir ile

reaksiyona girerek siklik GMP artışına sebep olması vazodilatasyona neden olur.Benzer

şekilde siklik GMP bağımlı mekanizmalarla trombosit agregasyonunu da inhibe eder ( 61 ).

Ayrıca böbrek gelişimi,sindirim sırasında mideden asit salınımı, spermlerin olgunlaşması,

nosisepsiyon, diş gelişimi, işitme eşiğinin artması, preovulatuar foliküllerin gelişmesi, kemik

gelişiminde ve daha birçok fizyolojik olayda görev alır. Öğrenme, hafıza, uyku, ağrı ve

depresyon ile de ilgilidir ve organizmanın strese adaptasyonunda önemlidir ( 41, 45, 77 ).

Nitrik oksit, aynı zamanda reaktif oksijen radikalleri ve reaktif nitrojen radikalleri

aracılığıyla pek çok hastalığın etyopatogenezinde önemli olan potansiyel sitotoksik bir

ajandır. Hasarlı dokularda artan NO konsantrasyonu, peroksinitrit oluşturarak daha sonra

oluşacak pek çok patolojik fenomene öncülük eder. Reaktif metabolitlerin yoğunlaştığı

bölgede oksidasyon ile prokarsinojenler aktif forma dönüşüp karsinogenez ve metastatik

yayılımda önemli rol oynarlar ( 59 ).

Hücre içi artan NO, çok çabuk olarak nitrit, nitrat, S-nitrosothioller veya peroksinitrite

dönüşür. Oluşan bu NO metabolitlerinin, genotoksitesi vardır ve kanser inisiasyonunu çeşitli

mekanizmalarla etkileyebilirler. Mutajenik nitrosaminlerin aktivasyonu, apoptozisin

13

başlaması, tamir enzimlerinin inhibisyonu veya lipid peroksidasyonunun indüklediği DNA

hasarı yolu ile etkili olabilirler ( 141 ).

NO, hücre spesifik ve konsantrasyona bağlı olarak değişmekle beraber zıt etkilerle

apoptozisi regüle eder. Düşük konsantrasyonlarda apoptozisi inhibe ederken, yüksek

konsantrasyonlarda p53 tümor supressor gen artışına neden olarak apoptozisi indükler (141 ).

NO etkilerini, siklik GMP artışı, p 53 gen artışı ve mitokondrial hem içeren enzimlerin

inaktivasyonları gibi direkt yollarla gerçekleştirmek yanında anjiogenezi artırarak tümör

yayılmasını kolaylaştırarak dolaylı olarak da gerçekleştirir ( 41, 137 ).

Neovaskülarizasyon sürecinde, sinyal iletiminin bir parçası olarak VEGF-R2

aracılığıyla, VEGF’nin anjiogenik etkisinin oluşmasında, NO önemli rol oynar ( 70 ). NO’in

anjiogenezde ve tümör kan akımının arttırılmasında da önemli olduğunu belirten çok sayıda

çalışma vardır ( 137 ). NO inhibitörleri kullanılarak yapılan deneysel meme tümörlerinde

anjiogenez gelişmesini inhibe edildiği ve bu yüzden tedavide kullanılabilir olduğu

belirtilmektedir ( 9, 137 ).

Endotel hücrelerinden salınan NO’in sitoprotektif davrandığı da düşünülmektedir.

Çünkü damar düz kas hücrelerinde gevşeme yaparak kan akışını arttırabilir, trombosit

agregasyonunu inhibe eder, serbest radikalleri uzaklaştırır, damar endoteline lökosit

adhezyonunu ve damar duvarından lökosit göçünü inhibe eder ( 48, 49, 99 ). Diğer taraftan

aktive makrofaj ve Kupffer hücrelerinden salınan NO ve metabolitleri, tümör hücrelerine

sitotoksiktir ve tümör hücresi mitokondrisinin disfonksiyonuna neden olur ( 12, 47, 57 ).

Malin tümörlerde NO, neovaskülarizasyon, damar geçirgenliğinin artması, tümör ve komşu

dokuda vazodilatasyon gibi birçok olayda rol alır. Kan akımının düzenlenmesi ve damar

geçirgenliğinde artma sağlayarak tümör hücrelerinin beslenmesini ve oksijen sağlanmasını

kolaylaştırırken diğer yandan da lökosit endotel etkileşiminin azalması ile konakçı immun

mekanizmasını bozmaya yardım eder. NO’in tümörlerdeki bu fonksiyonları tümör gelişimini

güçlü bir şekilde kolaylaştırır (137 ) .

NO'in biyolojik etkilerindeki komplekslik onun ROS, metal iyonları ve proteinlerle

olan etkileşimi sonucudur. NO'in doza bağlı ve hücre tipine spesifik etkileri direkt ve indirekt

etkileşimlerle düzenlenir. NO, düşük fizyolojik konsantrasyonlarda apoptozisi inhibe ederken

yüksek konsantrasyonlarda toksiktir.Yüksek NO konsantrasyonları, dinitrojen trioksid veya

peroksinitrit gibi toksik reaksiyon ürünleri oluşturarak apoptozis olmaksızın nekroz ile hücre

ölümünü artırır. Uzun süre NO'ya maruz kalınması ile oluşan kronik inflamatuar durum DNA

14

hasarı, DNA tamirinde inhibisyon, programlı hücre ölümünde değişimler, proliferatif sinyal

döngülerinde aktivasyon gibi sonuçlara sebep olarak tümör gelişimine eğilimi artırır ( 76,

133 ). Ayrıca siklooksijenaz enzimini aktive ederek prostanoidlerin oluşmasını, oluşan

prostanoidlein hem kendilerinin hem de reaksiyon sırasında oluşan radikallerin etkileriyle

karsinogenez sürecine katkıda bulunur ( 9 ).

Meme kanserinde NO’in hem stimulatör hem de inhibitör etkileri olduğu belirtilmiştir

ama yine de meme kanserin gelişmesi ve yayılması konusunda araştırmalara açık bilinmeyen

kısımları da vardır ( 40, 52 ).

Sonuç olarak NO ve metabolitleri karsinogenez ve metastazlarda bir yada daha fazla

aşamada görev alarak önemli rol oynar ve bu yüzden kanser araştırmalarında hedef haline

gelmiş moleküllerdir ( 53, 137 ).

2.4.NİTRİK OKSİT SENTAZ

Memeli dokusunda L-argininden NO sentezinin gerçekleşmesinden sorumlu enzimler

nitrik oksit sentaz (NOS , EC 1.14.13.39) olarak bilinir. Bu enzim ailesi vertebralılarda

sitokrom p-450 redüktaz homoloğudur ve enzimatik yoldan , 2 aşamalı olarak nitrik oksit

oluşturulur ( 3, 11, 75, 93, 130 ). İlk basamakta, L-arginin ara ürün olan OH-L-arginin

oluşturmak üzere okside edilir. İkinci basamakta OH-L-arginin bir molekül NO ve bir

molekül L-sitrüllin oluşturmak üzere ileri oksidasyona uğrar ( 9 ). NOS, L-argininin terminal

guanido nitrojen atomlarının oksidasyonunu katalizler. NOS’ın katalizlediği bu reaksiyonda

OB2 B ve NADPH (indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotid fosfat) kosubstrat; BHB4B

(tetrahidrobiopterin), FAD (flavin adenin dinükleotid), FMN (flavin mononükleotid) ve hem

(protoporfirin IX) kofaktör olup kalmodulin (CaM) varlığına gereksinim duyarlar ( 3, 90, 93,

107, 130 ).

Nitrik oksit sentazların bidomain yapıları vardır. Amino terminal yarılarında oksijenaz

aktivitesi, karboksi terminal yarılarında redüktaz aktivitesine sahiptirler. N-terminal bölge;

hem, tetrahidrobiopterin ve L-arginin için bağlanma bölgeleri içerir, C-terminal bölgesi ise

FAD, FMN ve NADPH için bağlanma bölgeleri içerir. Nitrik Oksit Sentaz’ın her 3

izoformunun da kofaktör olarak kalmoduline ihtiyaçları vardır. Kalmodulin, redüktazdan

oksijenaza elektron akımı için gereklidir ( 3, 22 ).

Nitrik oksit sentaz, memeli sistemlerinde ilk olarak damar endoteli, beyin ve aktive

makrofajlarda bulunmuştur. Daha sonraları NOS aktivitesi serebellum, makrofajlar, nötrofiller

15

böbrek, pulmoner epitel hücreleri, mide mukozası ve miyokard gibi birçok dokuda

gösterilmiştir ( 75, 78, 99 ).

Üç farklı NOS karakterize edilmiştir. Bunlar nöronal NOS (tip I , nNOS), indüklenebilir

NOS (tip II, iNOS), endotelyal NOS (tip III, eNOS) olarak sınıflandırılır. Her 3 NOS

izoformu da meme dokusunda bulunur ( 3, 40 ).

nNOS (Tip I) ; Aktivitesi kalsiyuma bağımlıdır. 12. kromozomdaki genlerce kodlanır.

Saflaştırılıp klonlanabilen ilk türdür. İlk olarak nöronlardan identifiye edilmiş olup daha çok

nöral dokularda bulunur. Lokalizasyonu membrana bağlıdır. Üretilen NO konsantrasyonu

pikomolar olarak ifade edilir ( 30 ).

iNOS (Tip II) ; Aktivitesi kalsiyumdan bağımsızdır.17. kromozomdaki genlerce

kodlanır. Lokalizasyonu sitozoldür. İlk olarak makrofaj ve monositlerden identifiye edilmiştir.

Kardiyomyosit, hepatosit, nöron, mikrogliyal hücreler, nötrofiller, vasküler endotel hücre, düz

kas hücresinde bulunur. Endotoksin, interlökin1 (IL-1), gama-INF, TNF-alfa, iNOS’u

indükleyen ajanlardır. Glukokortikoidler, IL-4, IL-10 ise mRNA transkripsiyonunu inhibe

eden ajanlardır. Üretilen NO konsantrasyonu nanomolar olarak ifade edilir. iNOS için en

önemli indüksiyonu sitokinler yaparlar ve uzun bir zamanda fazla miktarda NO üretimi

gerçekleşir ( 141 ). nNOS ve eNOS kısa zaman aralığı için az miktarda NO üretirken, iNOS

için önce transkripsiyonal aktivasyon oluşur ve saatlerce süren, geniş miktarlarda NO üretimi

oluşur ( 30 ).

eNOS (Tip III) ; Aktivitesi kalsiyuma bağımlıdır. İlk olarak endotelden identifiye edilmiş

olup trombosit, myokard hücresi, endokard hücresi, mast hücre ve nötrofillerde de bulunur. 135

kDa’luk bir monomer olarak jel elektroforezde göçer. Sitokrom p- 450 redüktaz ile yüksek

düzeyde homoloji gösterir. Lokalizasyon olarak membrana bağlıdır. Üretilen NO konsantrasyonu

pikomolar olarak ifade edilir. eNOS ve nNOS içeren hücreler, damar endotelinde asetilkoline,

beyinde glutamata cevap olarak fizyolojik miktarlarda NO üretirler ( 98 ).

Memeli NOS’ları sadece dimerik formda fonksiyonel olarak aktiftirler. BHB4 B kritik bir

kofaktördür, iNOS dimerizasyonu için gereklidir. BHB4 B eksik hücrelerde iNOS proteini inaktif

monomerik formda bulunur. BHB4 B varlığında aktif dimerik forma dönüşebilirler ( 80 ).

N-monometil–L-arginin (L- NMMA) ve diğer arginin analogları NOS’ın yarışmalı

inhibitörleridir. N-monometil-L-arginin tüm NOS izoformları için prototip inhibitördür ( 98 ).

NOS’ın meme kanserindeki rolü ilk olarak 1995’de araştırılmıştır ( 85 ). Solid tümörler;

makrofajlar, T-lenfositler, endotelyal hücreler ve stromalarında fibroblastlar gibi pek çok

16

hücre türü içerirler. NOS bu hücrelerin tamamında kültür çalışmalarında gösterilmiştir ( 136 ).

Pek çok çalışmada invaziv ve in situ lezyonlarda iNOS ekspresyonu gösterilmiş fakat selim

lezyonlarda gösterilememiştir. NOS erkenden eksprese olur ve tümör progresyonu için

gereklidir ve tümör boyut artışı ve tümör diferansiyasyonu azalması ile koreledir. Bunun

yanında grade II olanlarda, grade III olanlara oranla iNOS’ın daha fazla olduğunu gösteren

çalışmalar da vardır ( 84 ). Meme, over, prostat ve kolorektal kanserlerde iNOS ile

anjiogenezin ve mikrodamar yoğunluğunun korele olduğu gösterilmiştir ( 84, 136 ). Stromal

hücrelerden üretilen iNOS anjiogenezi artırarak tümör büyümesi, invazyon ve metastaz

basamaklarında yeralıp, kanserin progresyonunda önemli rol oynar ( 141 ).

iNOS ve hormonal etkileşim konusunda da çelişkili sonuçlar mevcuttur. Ratlarda

östradiolun iNOS’u artırdığı görülürken başka bir çalışmada fizyolojik 17-beta östradiolun

iNOS üretimini azalttığı gözlenmiştir. iNOS ekspresyonu, hormonal stimulus ve hormon

reseptör durumundan, hormon konsantrasyonu ve hücre tipine bağlı olarak etkilenir. iNOS

pozitifliği ile biyolojik agresiflik arasında up-regülasyon vardır. iNOS tümör hücreleri ve

stromal hücrelerden NO üretimini artırıp apoptozisi indükler, tümör vaskülarizasyonunu

artırır ve metastazla ilişkilidir ( 141 ). iNOS pozitif vakalarda yaşdan bağımsız olarak iNOS

negatif vakalara oranla daha kötü sonuçlar alınmaktadır ( 84 ).

Endotel hücrelerinden e-NOS aracılığıyla üretilen NO; kan akımını ve angiogenezi

artırır, tümör hücrelerinin adhezyonunu azaltır ve tümör hücrelerinin ölümünü sağlar ( 85 ).

Yapılan pek çok çalışmada e-NOS ekspresyonu ile prognostik faktörler arasında, özellikle

hormon reseptör durumu, menopozal durum ve tanı anındaki hasta yaşı arasında korelasyon

olduğu görülmüştür. Postmenapozal östrojen replasman tedavisi uygulanan ve premenopozal

foliküler fazdaki kadınlarda plasma NO seviyesinin yüksek olduğu gözlenmiştir. Destekleyici

şekilde premenopozal kadınların foliküler fazda cerrahiye girenlerinin durumunun daha da

kötüye gittiği görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlar KVS de e-NOS aktivitesinin östrojen ile

regüle edildiği ve östrojenin de e-NOS ekspresyonunu artırdığı bilgilerini destekleyici

olmuştur ( 85 ).

Meme kanserleri gibi hormonal değişimlerin çok önemli etyolojik faktörler oluşturduğu

solid kanser türlerinde, tümörün endokrin çevresine bağlı olarak endotel hücrelerinden e-NOS

ekspresyonu gerçekleşmesi karsinogenez süreci bakımından çok önemlidir ( 15, 85 ).

17

2.5. SİKLOOKSİJENAZ-2 (COX-2)

Siklooksijenazlar, prostaglandin sentezinde major düzenleyici olarak görev yapan

membrana bağlı , bifonksiyonel enzimlerdir ( 25 ).

Siklooksijenaz enzimi ilk olarak 1976 yılında koyun seminal sıvısından

saflaştırılmış olup, daha sonra 1988 yılında birçok grubtan oluştuğu gözlenmiştir. 1990’lı

yıllarda romatoid artritli hastalarda kanser insidansındaki azalmanın fark edilmesi, NSAİD’ler

ve bu enzime olan ilgiyi artırmış ve 1991 yılında COX-2, 2002 yılında ise COX-1 den COX-

3 elde edilmiştir ( 112 ).

Bu enzim ; prostaglandin H sentaz , prostaglandin endoperoksid sentaz, yağ asidi

siklooksijenaz ve en sık da siklooksijenaz veya COX ( E.C. 1.14.99.1 )olarak adlandırılır

( 142 ).

Siklooksijenaz enzimleri membrana bağlı, hem içeren, glikoprotein yapıda

enzimlerdir. Siklooksijenaz ve peroksidaz aktiviteleri ile oksijenasyon ve araşidonik asidin

redüksiyonunu gerçekleştirirler. Oksijenasyon COX molekülündeki kanallarda, enzimatik

redüksiyon ise hem içeren yüzeyde oluşur (101 ). Araşidonik asitten önce PGG2, sonra PGH2

daha sonra da spesifik izomerazlarla PGDB2 B, PGEB2 B, PGFB2 B, PGI B2 B ve TXAB2 B oluştururlar

(112, 128). Prostanoid sentezinde esas hız kısıtlayıcı basamağı fosfolipaz AB2 B enzimleri

oluştururken , uzun süreli kontrolü sağlayan hız kısıtlayıcı basamağı ise COX enzimleri

oluşturur ( 63, 113 ).

COX’un iki farklı COX-1 ve COX-2 adlı izoformu vardır. COX-1 den mutasyonlarla

oluşmuş olan COX-3 ise , COX-1b veya COX-1varyant olarak da adlandırılır ve yapısal

olarak kalp ve beyinden eksprese edilir ( 112 ). COX enziminin , COX-1 ve COX-2 olarak

bulunan 2 izoformunun sellüler lokalizasyonlarında, doku dağılımlarında, uyarılara verdikleri

cevaplarda, kodlandıkları genlerde ve kinetiklerinde farklılıklar vardır ( 63, 113 ).

COX-1, hemen her dokudan sürekli olarak eksprese edilir. Gastrik mukozanın

bütünlüğünün sürdürülmesi, böbrek kan akışının düzenlenmesi, trombosit fonksiyonları gibi

normal fizyolojik fonksiyonları kontrol eden prostaglandinlerin, üretiminde aracılık eder.

COX-1 ekspresyonu, stimuluslarla 2-4 kat artabilirken, glikokortikoidlerden çok az etkilenir

(128).

COX-2 ise patolojik ve inflamatuar doku proçeslerinde rol alan, üretimi hızlı

indüklenebilen, regülasyonu sıkı olarak düzenlenen bir maddedir. Bazal durumlarda çoğu

18

dokuda saptanamayacak kadar az miktardadır. Büyüme faktörleri, sitokinler, tümor

promotorleri, peroksizomal proliferatörler, hipoksi, iyonize radyasyon ve karsinojenler

tarafından ekspresyonu 10-80 misli artırılabilir. COX-2 ekspresyonu normal böbrek ve

beyin dokusundan, aktive makrofajlardan, inflamasyon sırasında sinovyal hücrelerden ve

malin epitelyal hücrelerden, tümör ilişkili fibroblastlardan, vasküler endotelyal hücrelerden

ve inflamatuar mononüklear hücrelerden yapılır ( 128 ). Onkogenler, büyüme faktörleri ve

tümör promotörleri dışında, çeşitli dokular tarafından bazı olası fonksiyonlar için de COX-2

eksprese edilir. Bunlar ; böbrek ( makula densa ve çıkan Henle kısmından intravasküler

volüm regülasyonu ), beyin (endotelyal hücreler ve kortikal nöronlardan ateş cevabı, nöronlar

arası bağlantı, SSS gelişimi, öğrenme ve hafıza ), kemik ( osteoblastlardan osteoblastik

diferansiasyon ve kemik remodelinginin regülasyonu ), uterus (embriyo implantasyonu ),

gastrointestinal traktüs ( intestinal epitelyum ve gastrik ülserden mukozal sıvı salgılanması,

bakterilerden temizlenme ) gibi olası fonksiyonlardır ( 43, 113 ).

COX-1, nüklear zarf ve endoplazmik retikulumda eşit miktarda bulunur. COX-

1’kodlayan gen 9.kromozomda yeralır ve 22 kb büyüklüğündedir. Bu genin ürünü olan

proteinin büyüklüğü ise 72- kDa olup SDS-PAGE’de tek band oluşturur. COX-2 enzimi ise

miktar olarak nüklear zarfta endoplazmik retikulumdan 2 kat daha fazla bulunur.1.

kromozomda yeralan 8.3 kb’lık gen tarafından kodlanır. Molekül ağırlıkları 72-kDa ve 74-

kDa olan, glikozillenmiş ve SDS-PAGE’de çift band yapan proteinler oluşur ( 113 ).

COX-2 geninin promotor bölgeleri, TATA sekansı ve inflamatuar aracılara duyarlı

transkripsiyon faktörü taşırlar. Bu sayede hızlıca indüklenebilirler. COX-1 geninde TATA

sekuansı ve erken hızlı cevap elemanları yoktur ve bu COX-1 geninin regülasyonu henüz çok

fazla anlaşılamamıştır. COX-2 mRNA’sı, COX-1 mRNA’sından daha az stabildir.

Glukokortikoidler COX-2’nin ekspresyonunu transkripsiyonel düzeyde inhibe edebilir ya da

stabilitesini değiştirebilirler. COX-2’nin indüklenebilirliği COX-2 geninin 59-flanking

bölgesinde çok sayıda cis-acting elemanlarının varlığı ile de kısmen açıklanabilir. COX-2

mRNA’sının stabilitesinin artması da COX-2 indüksiyonuna yol açabilir. Bu bulgular COX-

1’in homeostatik fonksiyonlarda bazal olarak transkribe edilen , “housekeeping gene”ürünü

olması; COX-2’nin ise patolojik ve inflamatuar doku proçeslerinde rol alan, hızlı

indüklenebilen, regülasyonu sıkı olarak düzenlenen bir madde olmasıyla uyumludur ( 64, 112,

113, 128 ).

COX-1 ve COX-2 enzimleri birbirine yapı olarak oldukça benzeyen uzun ince bir kanal

yapısına sahiptirler. Her COX enzimi 3 major domain içerir ;

19

1-N terminal epidermal growth factor (EGF) domain ;

2-C-terminal katalitik domain;Hem bağlanma bölgesi, siklooksijenaz aktivitesi gösterir,

yağ asitleri ve NSAİD leri bağlar.

3-helikal membran binding (MBD) domain ; içerdiği 4 heliks yapısı ile C-terminal

kısmın etrafını sararak membran boyunca COX integrasyonu sağlar ( 101, 112 ).

COX-1 ve COX-2 proteinlerinin aktif bölgelerinin birbirine çok benzer olmasına karşın,

COX-2’nin farklı yapı özelliği onun selektif olarak inhibisyonuna sebep olmaktadır. COX-

1’in aminoasit dizisinde 120.sıradaki izolösinin yerini COX-2’de daha küçük bir aminoasit

olan valin almakta, bu değişiklik COX-2’deki merkezi kanalın etrafında kullanılmayan geniş

hacimli “yan cep” olarak adlandırılan bir aktif alan yaratmaktadır. Bu ek alana bağlanmak

üzere tasarlanan bileşikler potent ve selektif COX-2 inhibitörleridir (34).

COX yolu ürünlerinin diffüze olabilen yapıları ve ikinci habercilerin bu yolda görev

alması nedeniyle, COX-1 ve COX-2 nin birçok fizyolojik ve patolojik olayda önemli

görevleri vardır. Hemostaz, trombosit agregasyonu, böbrek ve mide fonksiyonları, immunite,

midenin sitoproteksiyonu, renal kan akımı, kemik metabolizması, üreme, ağrı, ateş, kanser ve

inflamasyon gibi...süreçlerde etkili olurlar ( 128, 149 ).

COX-2 enziminin kronik aktivasyonu özellikle inflamasyon ve kanser olmak üzere

önemli patolojilere yol açar. Bu etkiler siklooksijenaz aracılı parakrin ve otokrin döngülerin

regülasyonuyla gerçekleşir. Prostaglandinler G-bağlı stoplazmik membran reseptörleri veya

nüklear peroksizom proliferatorlerce aktiflenen reseptörlerle (PPARs) etkileşerek COX-2

etkilerinin gerçekleşmesine aracı olurlar. Aşırı üretilen COX-2 çeşitli mekanizmalarla kanser

gelişimi ve yayılımını sağlar. Bunlar ;

-hücre proliferasyonu ; özellikle PGEB2 B ve PGFB2 B-alfa üretimini artırarak hücre

büyümesini stimule ederler. PGEB2 B bu etkilerini EGF aracılığıyla yapar. PGEB2 B'nin epitel

hücrelerine olan direkt mitojen etkisi yanında östrojen seviyesini de artırarak indirektetkiside

vardır.Adipoz doku çevresindeki stromal hücrelerden aromataz gen ekspresyonunu artırırlar

ve epitelyal hücreler için mitojen olan Aromataz, adipoz dokuda östrojen sentezinden

sorumludur ( 128 ).

-Apoptoz ; COX-2 antiapoptotik ve proapoptotik moleküllerin hücresel seviyesini etkiler.

PGEB2 B aracılığıyla antiapoptotik Bcl-2 upregülasyonunu düzenler. Aynı zamanda hücre

siklusunun G1 fazında gecikme yaparak apoptozise direnci artırır. Deneysel oluşturulan meme

kanseri modellerinde , COX-2 aşırı ekspresyonunun epitelyal hücrelerdeki apoptotik indeksi

20

azalttığı, antiapoptotik bcl-2 proteinini artırdığı, proapoptotik bax ve bcl-xl proteinlerini

azalttığı gözlenmiştir ( 128 ).

-Anjiogenez ; COX-2 nin indüklediği anjiogenez, anjiogenik faktörlerin artışı veya

antianjiogenik faktörlerin azalışı veya herikisinin kombinasyonunu içerir. COX-2 ve onun en

önemli ürünü olan PGEB2,B epitelyal, endotelyal hücreleri ve fibroblastları etkileyerek

anjiogeneze katkıda bulunur. COX-2'nin aşırı ekspresyonu ile VEGF, bFGF, TGF-1, PDGF

ve ET-1 gibi proanjiogenik moleküllerin üretimini artırılarak anjiogenez artırılır (128 ).

VEGF, VEGFR1 ve VEGFR2 olarak bilinen 2 adet transmembran tirozin kinaz aktiviteli

reseptörü ile etkilerini gerçekleştiren en önemli proanjiogenik moleküldür ( 116 ). Hayvan

çalışmalarında COX-2’ nin anjiogenezi VEGF aracılığıyla indüklediği , aynı zamanda COX-2

inhibitörleri kullanıldığı zaman anjiogenezin bloke edildiği gözlenmiştir ( 113 ). Meme

kanserlerinde tümör anjiogenezi göstergesi olarak, mikrodamar yoğunluğu potent prognostik

indikatör olarak kullanılır. Yüksek seviyede COX-2, VEGF, MMP ve düşük trombospondin

( TSP-1 ) içeren tümörlü doku yüksek mikrodamar yoğunluğu ile ilişkilidir ve tümörlerde

agresif büyüme, invazyon ve metastaza sebep olur ( 44 ). Costa ve arkadaşları da meme

tümörlü geniş hasta serilerinde, COX-2 ekspresyonu ile mikro damar yoğunluğu arasında

anlamlı korelasyon bulunduğunu tespit etmişlerdir ( 64 ). Anjiogenezi artırıcı etkilerinden

dolayı meme kanserleri için kötü prognostik olan VEGF’nin regülasyonunun

düzenlenmesinde COX-2 çok önemlidir ( 116 ).

-Hücre invazyonu ; Meme kanseri hücrelerinin invazyonunda uPA sistemi ve MMP-2

önemli rol oynar ve metastatik meme kanseri hücrelerinde uPA’nın aşırı ekspresyonu

sözkonusudur. COX-2, MMP-2’yi artırıp, E-cadherini azaltarak invazyonda görev alarak

yayılımı kolaylaştırır. Aşırı artan COX-2, özellikle PGE aracılığıyla oluşan osteoklast

oluşumu ve kemik rezorpsiyonuna bağlı kemik metastazlarını bu yol ile gerçekleştirir

(64, 128 ).

-İmmun Supresyon ; COX-2, prostaglandinler aracılığıyla immun sistem hücrelerinin

büyümesini inhibe ederek tümör hücrelerinin konak immun yanıtından kaçışına katkıda

bulunurlar ( 13, 113 ).

-Mutajenik etkiler ; Prostaglandin bağlı etkiler haricinde COX reaksiyonları sırasında

MDA gibi mutajenlerin oluşması ve ayrıca COX-2 nin intrinsik peroksidaz aktivitesinin

olması da mutajenik etki yapar. PGGB2 B‘ den PGHB2 B’ ye oksidasyon sırasında kanserojen

aromatik aminler oluşur ( 128 ). Oluşan MDA potent mutajendir ve DNA hasarına yolaçar.

21

Ayrıca oluşan karsinojenler okside olarak aromatik aminler, heterosiklik aminler ve

dihidrodiol türevlerini oluşturarak da karsinojeneze katkıda bulunurlar ( 64 ).

-Kemoteropatiklere direnç ; COX-2 , ATP binding casette ( ABC ) transporter MDRI,

P-gp olarak da bilinen proteinin ekspresyonunu artırarak tümörlerin kemoterapotiklere

direncini artırır ( 113 ).

Yapılan çeşitli çalışmalarda, malin patolojiler haricinde, premalin durumlarda da COX-

2’nin artmış ekspresyonlarının saptanması tümörigenez de kritik rol oynadığını destekler

niteliktedir. Bu alanda, ilk ve en çok çalışma, insan ve hayvanlarda kolon poliplerinde

yapılmış ve stromal hücrelerde erkenden tespit edilmiştir. Benzer şekilde pekçok kanser

türünde epitelyal, endotelyal ,stromal ve inflamatuar hücrelerde de erkenden tespit edilmiştir.

Ayrıca metastatik vakalarda, özellikle kemik ve diğer organ metastazlarında da hem

metastatik hem de tümörün çevresindeki hücrelerden COX-2 nin eksprese edildiği

görülmüştür ( 21, 113, 134 ).

Hayvan çalışmalarında 35 gün süreyle COX-1 ve COX-2 yi inhibe etmek için ibuprofen

verilmiş ve tümör volumündeki azalma istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur.1576 vakalık

geniş serilerde yapılan çalışmalarda COX-2 ile tümör evresi, hormon reseptör durumu ve

HER-2 varlığı arasında ilişki olduğu gözlenmiştir ( 34 ).

Yükselmiş COX-2 seviyeleri büyük tümör boyutu, yüksek histolojik grade, negatif

hormon reseptör durumu, yüksek proliferasyon hızı ( Ki-67 ), yüksek p53 ekspresyonu, HER-

2 onkogen amplifikasyonu varlığı, aksiller nod varlığı, duktal tip histoloji varlığı ile korele,

kötü prognostik ve istenmeyen özelliklerle ilişkili bir bulgudur ( 128 ).

2.6.PROSTAGLANDİN EB2B (PGE B2B)

Prostaglandinler çeşitli organlardaki hücre fonksiyonlarını etkileyen, biyolojik olarak

aktif siklik yağ asidi türevleridirler. İlk defa 1930’larda prostat bezinde bulunduklarından

prostaglandinler diye adlandırılmışlardır. 1970’lerden sonra tromboksanlar ve lökotrienler

bulunmuştur. Prostaglandinler ve ilişkili oldukları tromboksanlar, lökotrienler gibi bileşiklerin

tamamına genel olarak eikozanoidler adı verilir. Eikozanoidler çok potent bileşiklerdir ve çok

sayıda biyolojik yanıta sebep olurlar ( 112 ).

Prostaglandinler ; inflamasyon, düz kas tonusu, homeostazis, trombosit fonksiyonu,

böbrek su-tuz dengesi, uterus aktivitesi, endokrin, santral sinir sistemi ve gastrointestinal

22

sekresyon gibi bir dizi fizyolojik ve patolojik olaylarda görev alan parakrin veya otokrin lipid

medyatörlerdir ( 49 ).

Sentezlendikleri yerlere yakın etki gösterdiklerinden yerel etkili hormonlar olarak kabul

edilirler. Hormonlardan farklı olarak bu etkilerini, eritrositler hariç bütün dokularda

gösterirler. Bu bileşikler çok az miktarlarda üretilirler ve oldukca kısa ömürlüdürler.

Prostaglandinler sentez bölgelerinde inaktif ürünlere metabolize olurlar ve kayda değer bir

miktarda depolanmazlar ( 112 ).

Eikosanoid üretimi, PGH sentaz aktivitesi ve ekspresyonuyla, regüle edilir. Yapısal olan

PGHS-1, bazal PG seviyesini sağlar. İndüklenebilir olan PGHS-2 ise hücrelerde yok yada çok

azdır, akut indüksiyonla salınımı artar. PGHS’ların hem siklooksijenaz hem de peroksidaz

aktiviteleri vardır. Siklooksijenaz aktivasyonuyla araşidonik asite 2 molekül oksijen katılarak

PGGB2 B oluşturulur, peroksidaz aktivitesi ile de elektron redükte edilerek PGGB2 B’ den PGHB2 B

oluşturulur .( 32 ).

Prostaglandinlerin diyetle alınan öncül maddesi esansiyel yağ asiti olan linoleik

asittir.Linoleik asit, prostaglandinlerin öncülü olan 20 karbonlu çoklu doymamış yağ

asitlerine dönüşür. Fosfolipaz AB2B ve Fosfolipaz C etkisiyle membrana bağlı fosfolipidlerden

sn-2 pozisyonda ayrılan araşidonik asit prostaglandinlerin büyük kısmının öncül maddesidir.

Eikosanoid üretimi, PGH sentaz aktivitesi ve ekspresyonuyla, regüle edilir. PGHS’ın

PGHS-1 ve PGHS-2 olmak üzere 2 izoformu vardır. Yapısal olan PGHS-1, bazal PG

seviyesini sağlarken, indüklenebilir olan PGHS-2 ise hücrelerde yok yada çok azdır, akut

indüksiyonla salınımı artar. Prostaglandinlerin sentezinde ilk basamak, araşidonik asitin

PGGB2 B ve PGHB2 B oluşturmak üzere prostaglandin endoperoksit sentaz kompleksi tarafından

oksitlenmesi ve çembersel şekil almasıdır. PGHS’ların hem siklooksijenaz hem de peroksidaz

aktiviteleri vardır. Siklooksijenaz aktivasyonuyla araşidonik asite 2 molekül oksijen katılarak

PGGB2 B oluşturulur, glutatyon bağımlı olan peroksidaz aktivitesi ile de elektron redükte edilerek

PGGB2 B’ den PGHB2 B oluşturulur ( 32 ). PGGB2 B ve PGHB2 B oluştuktan sonra spesifik izomerazlarla

PGDB2 B, PGEB2 B, PGF2alfa, PGI B2 B ve TXAB2 B oluşur ( 113, 142 ).

PGG; PG biyosentezinde endoperoksid şeklinde bir ara maddedir. PGG ara maddeleri,

PGA, PGB, PGE ve PGF’e dönüşürler.17 doğal PG vardır, fakat bunlardan sadece 7 tanesi

organizmada yaygın olarak bulunur ve primer prostaglandinler olarak bilinirler. İnsan

vücudunda en fazla bulunan primer PG ise PGEB2 B’ dir ( 112 ).

23

Prostaglandinlerin ana bileşiği, bir siklopentan halkasına bağlı 20 C zincirli prostanoik

asittir. Her PG’in bir siklopentan halkası ve iki yan zinciri vardır. Yan zincirin birinde –

COOH grubu bulunur. Siklopentan halkasının 9. ve 11.C’larındaki O= ve/veya OH takılarına

sayılarına ve yerlerindeki değişmelere göre farklı PG’ler oluşur.İlk izole edilen iki PG, eterde

ya da fosfat tamponunda erirliklerine göre, PGE ve PGF olarak adlandırılmıştır ( 112 ).

PGHB2 B oluştuktan sonra PGE B2 B oluşmasını sağlayan terminal sentetaz , COX-2 birlikte

regüle edilen Prostaglandin E Sentaz( PGES)’ dır. PGEB2 B sentezi, bu 2 enzimin regülasyonu ile

düzenlenir. 3 tür PGE sentaz vardır.Bunlar ;

Mikrozomal PGE Sentaz-1 ( mPGES-1) Mikrozomal PGE Sentaz-2 (mPGES-2) Sitozolik PGE Sentaz ( cPGES)

mPGES-1; mRNA boyutu 14,8 kb ve kromozomal lokalizasyonu 9q34.4 dür.

İndüklenebilir transkripsiyonal regülasyonu vardır. Protein moleküler ağırlığı 15-16 kDa’dur.

Subsellüler lokalizasyonu nüklear membrandır. Prostat, testis, plasenta, meme ve mesanede

bulunur. PGHB2 B için Km'i 40 mikromolardır. Regülasyonunda IL-1 beta ve diğer sitokinler

görev alır ( 112, 62 ).

mPGES-2; mRNA boyutu 2 kb ve kromozomal lokalizasyonu 9q33-q34 tür.

Konstütif transkripsiyonal regülasyonu vardır. Protein moleküler ağırlığı 33 kDa’dur.

Subsellüler lokalizasyonu golgi ve stoplazmadır. PGHB2 B için Km’i 28 mikromolardır. Genital

organlar hariç tüm vücutta özellikle de beyin, kalp, iskelet kası, karaciğer ve böbrekte

bulunur. SH grupları, glutatyon, 2 merkaptoetanol ve en çok da dithiothreitol tarafından aktive

edilir ( 62, 112 ).

cPGES; ilk olarak 2000 yılında identifiye edilmiştir. Kromozomal lokalizasyonu

12q13 ve .mRNA boyutu 1,9 kb’tır. Konstütif transkripsiyonal regülasyonu vardır. Protein

moleküler ağırlığı 26 kDa’dur. Subsellüler lokalizasyonu stoplazma ve nüklear membrandır.

PGHB2 B için Km'i 14 mikromolardır. Glutatyon varlığında aktivitesi regüle edilir. 1-chloro-2,4-

dinitrobenzen, p-nitro-feniletil bromid, etakrinik asit tarafından inhibe edilir. Doku dağılımı

eştir en çok testis olmak üzere tüm organlarda bulunur. İnflamatuar sitokinler proteinin

lokalizasyonunu ve aktivitesini etkiler. HSP-90 ile ilişkilidir ( 62, 112 ).

Yapısal ya da hücre spesifik stimuluslar, sinyal molekülleri ve travma etkisiyle

araşidonik asitlerden COX aracılığıyla, özellikle endoplazmik retikulumda prostaglandinler

sentezlenirler (112 ). Yeni sentezlenen PG’ler ekstrasellüler boşluğa , organik anyon taşıyıcı

polipeptid familyasından bir taşıyıcı ile kolaylaştırılmış transport ile taşınır. PG transporter ile

24

PG’lerin hızlı transportunda, PG giriş çıkışında, elektrojenik anyon değişimi sorumludur, ve

ayrıca “Multi drug resistance proteinler” de PG transportunda görev alırlar ( 112 ). Transportu

gerçekleşen PG’ler plazma membranına lokalize EP reseptörleri ( EP1, EP2,EP3,EP4 ) ile G

protein bağlı reseptörler aracılığıyla, PPARs’ı aktive ederek etkilerini gerçekleştirirler( 62,

147 ). Farmakolojik özelliklerinin ve ikinci habercilerinin farklılıklarına göre ayrılmış EP1,

EP2, EP3 ve EP4 olmak üzere 4 farklı reseptör vardır. EP’ler ve ilişkili biyolojik

fonksiyonlar da farklılıklar gösterir.

EP1;Nöronal fonksiyon ile ilişkilidir. Protein kinaz C için stimulatördür. Gq

proteinlerine bağlanır ve fosfolipaz C ve kalsiyum gerektirir.

EP2 ; Kadınlarda reprodüktif fonksiyon, vasküler hipertansiyon, tümör gelişmesi ile

ilişkilidir. Gs proteinlerine bağlanıp intrasellüler CAMP’yi artırıp, protein kinaz A’ yı aktive

ederler.

EP3 ; Ateş, gastrik mukozal proteksiyon, ağrı hipersensitivite, böbrek fonksiyonları,

anti-alerjik yanıt ile ilişkilidir.Adenilat siklaz- protein kinaz A için inhibitör etkilidir. Gi

proteinlerine bağlanıp intrasellüler CAMP seviyesini azaltırlar ( 13, 101, 139 ).

EP4; Ductus arteriosus kapanması, inflamasyon ve kemik rezorpsiyonu ile ilişkilidir.

Gs proteinlerine bağlanıp intrasellüler CAMP’yi artırıp, protein kinaz A’ yı aktive ederler.

(13, 101, 139 ).

Prostanoidler ; inflamatuar reaksiyon, juksta artikular kıkırdak ve kemik erozyonu,

gastrointestinal ülserasyon ve sitoproteksiyon, anjiogenez ve kanser, hemostaz ve tromboz,

trombosit agregasyonu, renal hemodinamikler, vazokonstriksiyon, vazodilatasyon

nörotransmisyon, kan basıncı regülasyonu, uyku, inflamasyon ve böbrek hastalıklarının

progresyonu gibi pek çok fizyopatolojik süreçte önemli rol oynarlar ( 46, 62,113 ).

PGEB2 B, özellikle böbrek olmak üzere çoğu doku tarafından üretilen PG’dir. Fizyolojik

süreçler yanında patogenezlerde de etkilidir. Vazodilatasyon yapıcı etkisiyle inflamasyonun

vasküler fazında rol oynar ve vazoaktif aminlerle beraber etki ederek mikrovasküler

permeabiliteyi artırır. Ayrıca PGI B2B ile birlikte osteoklastik kemik rezorbsiyonunu da uyarır ve

T ve B lenfosit fonksiyonları üzerinde de etkilidirler ( 139 ).

Inflamatuvar reaksiyonlar sırasında dokularda oluşan serbest radikal ve prostaglandin

miktarları birbiriyle ilişkilidir. Araşidonik asidin siklik endoperoksitleri olan PGGB2 B’nin

PGHB2 B’ye dönüşümü sırasında ve ayrıca lipoksijenaz aracılığıyla lipid peroksitler oluşurken

25

,aktif oksijen radikalleri olan superoksit anyonu ve serbest hidroksil radikali oluşmaktadır.

Bu yüzden eikozanoidler, oluşumları sırasında ortaya çıkan serbest radikal miktarı ile de

patogenezlerde önemli olurlar. Ayrıca sitokinler tarafından damar endotelinde nitrik oksid

sentetaz (NOS) tarafından sentez edilen NO, siklooksijenazı stimüle ederek iltihabi dokuda

prostoglandinlerin sentezini de artırmaktadır ( 41 ).

Prostaglandinler sinyal molekülü olarak hücre proliferasyonu, diferansiyasyon ve

apoptozda da önemli regülatörlerdir ( 62 ). Epitelyal malinitelerde en çok oluşan prostanoid

olan PGEB2 B, hücre proliferasyonu, motilitesi ve anjiogenezi artırır ve immun yanıtı baskılar (

147 ). Prostaglandinlerin tümör gelişimindeki etkileri direkt veya indirekt olabilir.Tümör

hücrelerinde EP reseptörlerinin varlığına göre yaptığı direkt etkilerine genel olarak

bakıldığında;

-Östrojen üretiminin artırılması: Meme kanserlerinin % 60'ı hormon bağımlıdır,

östrojen reseptörü içerir ve hedef tümör hücrelerinin büyümesi ve çoğalması için östrojen

gerekir. Östradiol, aromataz olarak adlandırılan sitokrom p 450 enzim kompleksi aracılığıyla

androjenlerden lokal olarak meme dokusunda sentezlenen en etkili östrojendir. Aromataz

aktivitesi en fazla overlerde olmakla beraber meme adipoz dokusunda da bulunur. Östrojen

biyosentezinde anahtar, cAMP aracılı yollarla glukokortikoid ve sitokinlerin

promotörlüğüdür. Bu yüzden COX-2 izozimleri aracılığıyla lokal oluşan PGEB2 B, intrasellüler

cAMP seviyesini artırıp, östrojen biosentezini stimule eder ve östrojen bağlı meme kanseri

gelişmesini etkiler ( 14, 118 ) .Meme kanseri patogenezinin gelişmesinde COX-2 ve

Aromataz enzimlerinin parakrin etkileşimi ve artışı sözkonusudur ( 13 ).

-Apoptoz ; PGEB2 B, Bcl-2’ yi indükleyerek antiapoptotik etki gösterir ( 74 ).

-Anjiogenez ; endotelyal tubül formasyonu ve proanjiogenik faktörlerin salınımına

katkıda bulunarak anjiogeneze destek sağlar ( 74 ).

-Hücre proliferasyonu ; Fibroblastların, osteoblastların ve meme epitel hücrelerinin

direkt stimulasyonuna sebep olarak ve ayrıca indirekt olarak östrojen sentezini artırarak

proliferasyona katkıda bulunurlar ( 64 ).

-Migrasyon, invazyon ; PGEB2 B ve PGI B2 B, integrin alfa-V3 aracılığıyla endotel

hücrelerinin migrasyon ve yayılımında önemli rol alırlar ( 128 ).

İndirekt olarak ise antitümör etkisi olan NK hücreleri ve makrofajları baskılayarak

dolaylı olarak tümör gelişmesi ve yayılımına katkıda bulunurlar ( 139 ).

26

Yapılan çalışmalarda pek çok kanser türünde özellikle meme ve kolon kanserlerinde

üretilen prostaglandin miktarının normal dokudan çok daha fazla olduğu görülmüştür.

Prostaglandin miktarı fazla olan tümörlerde daha çok kemik olmak üzere metastazların daha

fazla, postop survin daha zayıf olduğu da gözlenmiştir ( 14, 34, 79 ).

2.7. SEKRETUAR FOSFOLİPAZ AB2B (sPLAB2B)

Fosfolipaz AB2 B (PLAB2 B) enzimleri, gliserofosfolipidlerin 2.karbonundaki ester bağının

hidrolizini katalizleyerek lizofosfolipit ve serbest yağ asidi oluşturan, araşidonik asit

kaskadındaki hız sınırlayıcı enzimlerdir ( 25 ). Serbest yağ asidi olarak oluşan araşidonik

asidin lipoksijenaz ve siklooksijenaz yolları eikosanoidleri oluşturması ve lizofosfolipidlerin

ise biyolojik olarak aktif önemli sinyal molekülleri olması bakımından bu reaksiyon ve bu

enzimler çok önemlidirler ( 39, 106 ).

Fosfolipaz AB2 B enzimleri birçok memeli dokusunda, pankreas sıvısında, yılan ve arı

zehirlerinde çok fazla miktarda bulunur. Aktivasyonları Protein kinaz C ve / veya kalsiyum

bağımlı translokasyon mekanizmalarıyla fosforilasyon ile düzenlenir ( 106 ).

PLAB2 B’ler intra ve ekstrasellüler alanlarda bulunabilen geniş bir enzim ailesidir. Yaklaşık

20 kadar PLAB2 B enzimi tanımlanmış olsa da, içerdikleri nükleotid ve aminoasit kısımlarına

göre 3 geniş grupta toplanırlar. Bunlar ;

-sekretuar PLA2 ( grup IB, IIA, IIC, IID, IIE, IIF, III, V, X ve XII ),

-kalsiyum bağımlı sitozolik PLA2 ( grup IVA, IVB ve IVC )

-kalsiyumdan bağımsız sitozolik PLA2 ( grup VIA-1, VIA-2 ve VIB ) olmak üzere

sınıflandırılmışlardır ( 2, 7, 23 ).

Sekretuar Fosfolipaz AB2 B( sPLAB2 B)

sPLAB2 B enzimleri omurgalı ve omurgasızlarda, bitki, mantar, bakteri ve virüslerde

bulunan, kalsiyum bağlama ve katalitik bölgeleri olan, disülfitten zengin, küçük enzimlerdir.

10 farklı üyeden oluşan, en geniş ve en çok çalışılan PLAB2 B grubudur ( 23 ).

Bu enzim ailesi üyeleri, 14-19 kDa gibi düşük moleküler ağırlıklarda, hücrelerden

ekstrasellüler olarak sekrete edilebilen, katalitik aktiviteleri için mikromolar

konsantrasyonlarda kalsiyum gerektiren kalsiyum bağımlı enzimlerdir. sPLAB2 B enzimlerinin

içerdiği multipl disülfid bağları , üzerlerinde yeralan kalsiyum bağlayan kısımlar ile enzimin

27

stabilite ve aktivitesine katkıda bulunurlar. Hücrelerde enzim inaktif iken , disülfid bağlarının

modifikasyonu ile enzim aktiflenmesi hedeflenir ( 103 ). Enzim, membrandaki veya agrege

fosfolipidlerdeki fosfolipid molekülünün, aktif bölgesine bağlanır. Bu bağlanmaya katyonik,

aromatik ve alifatik kısımlar katkıda bulunur ve aromatik kısım triptofan, bağlanmada en

önemli kısmı oluşturur. sPLAB2 B’lerin strüktür ve fonksiyon çalışmaları göstermiştir ki

karboksi terminal uçtaki sterik ve iyonik özellikler grup özelliklerini de belirler. 10 farklı tip,

primer strüktürü ve sistein rezidülerinin durumuna göre numaralandırılmışlardır. İlk olarak

pankreatik sıvıda tanımlanmış ve grup IB olarak adlandırılmışlardır. Daha sonra artritik

snoviyal sıvıdan izole edilmiş ve grup II sPLA2 olarak tanımlanmışlardır. Bu ailenin sonradan

gelen üyelerinin de geniş bir doku spesifikliği göstererek inflamasyonda rol aldığı saptanmış

ve daha sonradan tanımlanan 8 üye grup IIC , V, X, IID, IIE, IIF, III ve XII olarak

adlandırılmışlardır ( 23 ).

sPLAB2 B grupları arasındaki temel farklılık, seçtikleri fosfolipidlerin hidrolizinde ortaya

çıkar. Örneğin grup II sPLAB2 B anyonik uçtaki nötral fosfolipidleri tercih ederken, grup V ve X

ise nötral fosfolipidleri tercih etmezler. Bu substrat farklılıkları farklı sellüler fonksiyonları da

destekler. sPLAB2 B-IIA harici diğer grupların biyolojik fonksiyonları ve diğer sellüler

sistemlerle ilişkileri hakkında çok daha az bilgi vardır. sPLAB2 B-II A’ nın inflamasyondaki

rolleri yanı sıra tümör gelişimi ve progresyonunda da önemli rol oynadığı gösterilmiştir. Grup

VII ve VIII sPLAB2 B’ler ,yağ asitlerinin etkisiyle oluşan oksidatif hasardan koruyucu rol

yaparlar. En yaygın sPLAB2 B’nin, grup V olduğu bilinirken, Grup X sPLA B2 B’nin ise pro-formdan

matür forma enzimatik olarak dönüştüğü, endojen ligandlarla etkileşiminden sonra PPAR

aktivitesini modifiye ettiği bilinmektedir. sPLAB2 B’lerin pekçok izoformlarının fonksiyonları

ise bilinmemektedir ( 2, 23, 100 ).

sPLAB2 B’ ler farklı patolojilerde farklı paternlerden eksprese olurlar. Grup IB pankreatik

asiner hücrelerden, profosfolipaz AB2 B şeklinde inaktif öncül olarak salınır ve bağırsak

lümeninde tripsin ile aktiflenir. Besinlerdeki ve safra sekresyonundaki gliserol içeren

fosfolipitlerin 2.karbonuna bağlı yağ asitlerini hidroliz ederek lizofosfolipitleri oluşturur. .

Tüm gliserol içeren fosfolipitler üzerine etkilidir. İnce bağırsakta yıkımı gerçekleştiren ve

salgılanmaları hormonların denetiminde olan pankreas enzimlerinden biri olarak, lipid

sindiriminde aldıkları bu görev, glukokortikoidler tarafından inhibe edilir .Grup-IB akciğer,

dalak, böbrek, over, prostat gibi dokularda da saptanmış olup hücre proliferasyonu, hücre

migrasyonu, eikosanoidlerin salınımı ve akut akciğer hasarı ile ilgili fonksiyonlarda da görev

aldığı bilinmektedir ( 94 ).

28

Grup IIA sPLAB2 B, “inflamatuar tip sPLAB2 B“ olarak da adlandırılır. İntestinal paneth

hücrelerinde, prostat epitel hücrelerinde, romatoid artrit eklemlerinde, aterosklerotik

lezyonlarda gösterilmiştir. Memeli dokularının büyük kısmında, inflame dokularda,

ekstrasellüler sıvılarda ve plazmada yüksek konsantrasyonlarda saptanmıştır. IL-1 alfa, IL-1-

beta, TNF-alfa ve LPS gibi proinflamatuar sitokinlerce salınımı stimule edilir.

Glukokortikoidler, anti-inflamatuar sitokinler, büyüme faktörleri, TGF-B, PDGF, IGF-I ve

IGF-II gibi maddeler tarafından salınımı suprese edilir ( 82). İnflamasyon sırasında, ayrıca

birçok sPLAB2 B üyesinin ekspresyonu indüklenir, bazı tiplerin fonksiyon, lokalizasyon ve

dinamikleri hala araştırılmaktadır . sPLAB2 B IIA kardiyovasküler risk faktörü olarak da bilinir

ve kardiak dokuda tespit edilmiştir. sPLAB2 B IIA ve V’in, PGEB2 B oluşturarak renal homeostaza

katkıda bulundukları ve ayrıca PGEB2 B aracılığıyla hepatik dokunun tamir ve korunmasını

artırdıkları bilinmektedir ( 94 ).

Memeli hücrelerinin plasma membranlarındaki lipid komponent fosfotidilkolin ve

sfingomyelinden çok zengindir ve içerdiği anyonik heparan sulfat proteoglikanlar, potansiyel

sPLAB2 B spesifik reseptörlerdir ( 23 ). Fosfolipazların katalitik aktivitelerine ilaveten bazı

sPLAB2 B formları transmembran PLA2 reseptörlerine bağlanarak biyolojik yanıtları stimule

ederler ( 83 ). Farklı tip sPLAB2 B’ lerin farklı proteinlerle taşındığı ve farklı sPLAB2 B

reseptörlerinin olduğu saptanmıştır. Tanımlanan 5 farklı tip reseptör içinde en çok M ve N

reseptörleri kullanılmaktadır. sPLA2 bağlayıcı proteinlerden ilk olarak N-tipi reseptörler

tanımlanmıştır. Moleküler ağırlıkları 36-51 ve 85-88 kDa arasında değişen 2 proteinden

oluşurlar. N tipi reseptörler ilk olarak beyinde gösterilmiş ve nörotoksik etkilerin

oluşmasından bu reseptörlere bağlanma sorumlu tutulmuştur.. M tipi reseptörler ise ilk olarak

tavşan iskelet kasından elde edilmiştir ve sPLAB2 B bağlama özellikleri N-tipi reseptörlerden

oldukça farklıdır. sPLAB2 B aktivitesinin negatif regülatörü olarak hem aktivitesini inhibe eder

hem de endositik özellikleri vardır. Hücre proliferasyonu, hücre migrasyonu,hücre

kontraksiyonu, hormon salınımı, lipid medyatör salınımı gibi biyolojik etkilerde görev

yaparlar ( 82, 111 ).

Memeli sPLAB2 B ailesi hızlı büyüyen, multipl rol ve regülatör kompleks mekanizmalarını

içeren homolog proteinlerdir ( 23 ). Fizyolojik koşullarda fosfolipid turnoverı, lipoprotein

metabolizması, eikosanoid üretimi, hücresel cevap, sinyal transdüksiyonu, konak yanıtı,

sindirim fonksiyonları, membran yeniden şekillenmesi, ekzostoz, fosfolipid peroksidlerin

detoksifikasyonu, birçok hastalık ve kanser belirteçlerinin potansiyel regülasyonu,

antibakteriyel aktivite ve nörotransmitter salınımı gibi fonksiyonları vardır. Patolojik

29

durumlarda aktivitelerinin artması ise esansiyel membran gliserofosfolipidlerinin kaybı,

membran permeabilitesinin değişmesi, iyon homeostazının bozulması, serbest yağ asidi

salınımının artması , hücre proliferasyonu artışı, hücre migrasyonu artışı ve lipid peroksidlerin

birikmesi ile sonuçlanır ( 73 ). Yapılan çalışmalarda kolon, prostat, gastrik mukoza, pankreas

ve ince bağırsak kanseroz dokularında normal dokulardan anlamlı olarak fazla olduğu

görülmüştür. sPLAB2 B’ nin inhibe edildiği çalışmalarda proliferasyonunda inhibe olduğu,

apoptozisin arttığı ve anjiogenezin suprese olduğu görülmüştür. Kanser tedavisinde sPLAB2 B

inhibe edilince endotelyal hücre proliferasyonu, endotelyal hücre migrasyonu ve yeni damar

oluşumunun baskılanması gibi antianjiogenik etkilerin oluştuğu gözlenmiştir ( 83 ). Ayrıca

sinir sisteminde sPLAB2 B’ nin en fazla ve geniş dağılımının, nöronların oluşması ve hafıza ile

ilgili hipokampüs bölgesinden olduğu da bilinmektedir ( 7, 151 ).

sPLAB2 B’nin inflamatuar tepkimelerde bir akut faz proteini (AFP ) olduğu kabul

edilmektedir. İnflamasyonun distal mediatörlerinin , direkt doku hasarına neden olduğu iyi

bilinmektedir. AA, toksik oksijen radikalleri , PAF bu mediatörler arasında yer almaktadır.

İnflamasyonun proksimal mediatörleri ise IL’ler , TNF, sPLAB2 B gibi substanslardır.

İnflamatuar olaylar ile AA yüksekliğinin birlikteliği insan ve hayvan modellerinde de ortaya

konmuştur. sPLAB2 B akut faz yanıtında, bakteriyel invazyona karşı savunmada önemli bir role

sahiptir ve fagositoz, kemotaksis, süperoksid ve lizozomal enzimlerin açığa çıkışı gibi nötrofil

fonksiyon değişiklikleri ile ilişkilidir. sPLAB2 B aynı zamanda bakterisidal, permeabilite artırıcı

protein ile birlikte lökositlerde bakterilerin öldürülmesinde rol almaktadır. PMNL’lerin

inflamatuar yanıtta önemli bir işlevleri , PAF, eikosanoidler gibi mediatörlerin üretilmesidir.

Bu olaylardaki birinci basamak ise, hücresel fosfolipidlerin PLA2 ile hidrolizidir. Açığa çıkan

AA’de, çeşitli sitokinlerin açığa çıkmasına öncülük etmektedir. sPLAB2 B mast hücrelerinden

histamin salınımında da aracı bir mediyatör olarak kabul edilmektedir ( 126 ).

sPLAB2 B, IL-1, IL-6 ve TNF-alfa gibi proinflamatuar sitokinlerin salınımını indükler ve

makrofaj ve fagositlerde sitokin üretimini regüle eder. Ayrıca makrofajlarda iNOS

ekspresyonunu stimule ederek NO oluşmasını artırarak da inflamatuar sürece katkıda bulunur.

E-isolinaridial ve metilketon gibi inhibitörler kullanılarak sPLAB2 B’ninB Binhibe edildiği

çalışmalarda NO'in ve süperoksid oluşumunun azaldığı gözlenmiştir ( 6 ) . Makrofajlarda

sPLAB2 B aktivasyonunun en önemli komponenti olarak ROS oluşur ve peroksinitrit sPLAB2 B’ yi

aktive ederek araşidonik asit salınımına neden olur. NO, araşidonik asit salınımında promotor

rol oynar. NO üretimi ve araşidonik asit yolu arasında süperoksit ve peroksinitrit aracılığıyla

oluşan etkileşime bağlı bir ilişki olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Süperoksit ve

30

peroksinitrit sPLA B2 B aktivitesi ve araşidonik asit salınımını regüle ederler. NO üretimi arttıkça

araşidonik asit salınımının artması ve NOS inhibitörleri kullanılan çalışmalarda da araşidonik

asit salınımının azalması, NOS ve sPLAB2 B enzimatik kaskadları arasında amplifikasyon

olduğunu göstermektedir ( 1, 106 ). sPLAB2 B aracılığıyla serbestleşen araşidonik asitin

lipoksijenaz ve siklooksijenaz yolları ile oksidatif metabolize olması ile de sPLAB2B’ nin ROS

oluşturmaya ve lipid peroksidasyonuna indirekt etkisi vardır. Lipid peroksidasyonu membran

da düzensiz organizasyona neden olarak, membran akışkanlığı ve geçirgenliğini değiştirerek,

metabolik proçesleri inhibe ederek ve iyon transportunu değiştirerek pek çok patoloji için

aracı olur ( 2, 98 ).

121 Meme kanseri, 31 over kanseri ve 37 GİS kanserli metastatik hastada aynı anda

yapılan çalışmalarda sPLAB2 B’nin metastazlı hastalarda erkenden tespit edilebilen yararlı bir

belirteç olduğu sonucuna varılmış ve bu sonuç artan enzim aktivitesinin yüksek COX-2

dolayısıyla yüksek PGEB2 B seviyelerine neden olması ile bağdaştırımıştır ( 24 )

Sitozolik Fosfolipaz AB2 B ( cPLAB2 B );

Grup IVA, IVB ve IVC olarak 85, 114 ve 61 kDa’ luk molekül ağırlıklardadırlar. Lipid

substratlara bağlanma ve araşidonik asit hidrolizi için mikromolar konsantrasyonlarda

kalsiyum gerektirirler ( 2 ).

Kalsiyumdan Bağımsız Sitozolik Fosfolipaz AB2 B ( iPLAB2 B );

Grup VI olarak, 84-88 kDa’ luk moleküler ağırlıktadır ve araşidonik asit için

nonselektiftir. Kalsiyumdan bağımsızdır ( 2 ).

2.8. LİPOKSİJENAZ( LOX )

Lipoksijenazlar, araşidonik asitlerden lipid hidroperoksidlerin oluşmasından sorumlu

enzimlerdir. Substratları araşidonata göre 5, 8, 12 ve 15 lipoksijenaz olarak tanımlanmışlardır.

5, 8, 12 ve 15. karbonlara oksijen katarlar ve oluşan primer ürünler 5,8,12 ve 15 –HPETE (

Hidro Peroksi Eikosa Tetra Enoik Asit )dir. Daha sonrasında glutatyon peroksidaz ile

hidroksi formlarları olan 5, 8, 12 ve 15-HETE ( hidroksieikozatetraenoik asit)’lere dönüşürler

( 37, 144 ).

31

5-LOX ; 2 enzimatik aktivitesi olan dioksijenazdır. İlk olarak oksijenaz aktivitesi ile

araşidonik asite moleküler oksijen katılarak 5-HPETE oluşturulur daha sonra LTA4 sentaz ile

stabil olmayan epoksid LTA4 oluşturulur. 5-LOX ‘un katalitik aktivitesinde FLAP (Five

Lipoksijenaz Activating Protein) olarak adlandılan 18 kDa ağırlığında membran bağlı protein

önemli rol oynar. Lökotrien A4 hidrolaz ile LTA4’ ten LTB4 ( Hidrolitik atak ) oluşur ve

etkili nötrofil kemoatraktant ve lökosit adhezyon stimülatörüdür. LTC4 sentetaz aracılığıyla

LTA4’ ’ün glutatyon ile konjugasyonuyla LTC4 oluşur. LTC4 taşıyıcı sistemle hücre dışına

salınır ve burada GGT ile glutamik asidin uzaklaştırılması ile LTD4 oluşur.Ekstrasellüler

dipeptidazların etkisiyle LTD4’den LTE4 oluşur .LTC4, LTD4 ve LTE4, “sisteinil

lökotrienler “olarak adlandırılırlar. Strüktür yapıları tanımlanmadan önce “slow-reacting

substance of anaphylaxis” (SRS-A) olarak adlandırılmışlardır.

LTA4 ; Lökositler, trombositler, mast hücreleri ve kalp, akciğer damarsal dokularında

üretilir.

LTB4 ;Polimorfonüklear lökositlerin artmış kemotaksisi, lizozom enzimlerinin

salıverilmesi, beyaz kan hücrelerinin adhezyonundan sorumludur

LTC4, LTD4 ve LTE4 ; Düz kas kasılması, bronş kasılması, damar kasılması, artmış

damar geçirgenliğinden sorumludurlar

5-LOX Yolu; pek çok intrasellüler sinyal yolu ile etkileşerek kanser hücrelerinin

proliferasyonunu kontrol ederek kanserin progresyon aşamasında görev alır. Hayvan

çalışmalarında , 5-LOX Yolu’ nda inhibisyon yapıldığı zaman akciğer kanserinde anlamlı

gerileme olduğunu gösteren çalışmalar vardır ( 42, 114, 115 ).

12-LOX ; Doku lokalizasyonları, substrat spesifikliği, immmunojen özellikleri ve yapı

homolojilerine göre lökosit ve platelet tip olarak 2 ayrı formu tanımlanmıştır. Her 2 tip de pek

çok kanserli dokuda bulunmuştur.12-LOX kanser hücrelerinin proliferasyonu ve survi ile

ilgilidir. İnhibe edildiği zaman kanser hücrelerinin proliferasyonu inhibe edilir ve apoptoz

indüklenir. Yapılan çalışmalarda özellikle prostat kanserinde tümor grade ve evresi ile korele

düzeyleri olduğu görülmüştür. Meme kanserli dokularda etkilerini özellikle EGF aracılığıyla

yaptığı belirtilmektedir ( 104 ). Metastatik kanserlerde metastatik olmayanlardan anlamlı

olarak fazla olduğu gözlenmiştir ( 37 ).

8-LOX ; Henüz yeni tanımlanmıştır. Deride irritasyon yada tümör promotörleri ile

tedaviden sonra ekspresyonu görülmüştür. Oluşan ürün 8-HETE dir. 8-HPETE ve 8-HETE

32

nin fonksiyonları bilinmemektedir. Karsinogez ve kanser gelişmesindeki rolü hakkında çok az

bilgi vardır ( 37 ).

15-LOX ; Dokularda geniş dağılımı vardır.Araşidonik asitten önce 15-HPETE daha

sonra glutatyon peroksidaz ile 15-HETE oluşur.2 tane izoenzimi vardır.15-LOX-1 linoleik

asidi, 15-LOX-2 ise araşidonik asiti substrat olarak tercih ederler.15-LOX-1 ile 13-S-HODE,

15-LOX-2 ile 15-HETE oluşur. 15-LOX’un kanser gelişimindeki rolü tam olarak bilinmiyor

ve bazı yazarlara göre zıt yönlerdedir.13-S-HODE ise hücre proliferasyonunu artırır, farklı

hücrelerin EGF’ ye mitojenik yanıtını artırır ve bazı yazarlara göre de apoptozisi

artırmaktadır. Bunun yanında 15-S-HETE’nin ise diğer LOX ürünlerini antagonize ederek

antitümör etkiler oluşturduğuna dair yayınlar vardır.Bazı yazarlara göre ise apoptozisi suprese

eder ve kanser hücrelerine etkisi yoktur. Tümörigenezde aldığı rolün tam olarak

anlaşılabilmesi için daha çok çalışmalara gerek vardır ( 37, 67, 127 ).

Siklooksijenazlar, prostaglandinler ve lökotrienler, çoklu doymamış yağ asitlerinin

yapısına moleküler oksijen katılması ile oluşan biyolojik olarak aktif lipid yapılarıdır.

Sentezleri sırasında lipid peroksidleri ve lipid oksidasyon ürünleri oluşturarak patolojik

değişimlere öncülük ederler ( 26, 122 ).

33

3.GEREÇ VE YÖNTEMLER 3.1. Kullanılan Aletler ve Cam Malzemeler Derin dondurucu ( -80 ºC ) ( Rua Instruments ), Spektrofotometre ( Shimadzu UV-1201 ), ELISA okuyucu ( Biotek FL 600 ), ELISA okuyucu ( ELx 800 ) , ELISA okuyucu ( DNM – 9602 ), Elektronik tartı ( Shimadzu Libror ), pH metre ( Shott CG 840 ), Sonikasyon cihazı ( MSE ), Mekanik homojenizatör ( Heidolph RZR 2021 ), Santrifüj ( Heraeus Biofuge Stratus ), Vorteks ( Elektromag ), Shaker ( JANKE & KUNKEL, IKA-Labortechnik ) Otomatik pipetler ve pipet uçları, santrifüj tüpleri, deney tüpleri, Polipropilen tüpler, balon joje, cam pipetler, cam kapsül, ependorf, vb. malzemeler. 3.2. Kimyasal Maddeler Bakır sülfat ( Sigma ), Sodyum karbonat ( Merck ), Sodyum-potasyum tartarat ( Merck ), Sodyum hidroksit ( Carlo-Erba ), Bovin serum albumin ( Sigma ), Sodyum wolframat ( Merck ),

34

Sodyum molibdat ( Merck ), Orto fosforik asit ( Merck ), Hidroklorik asit ( Carlo-Erba ), Lityum sülfat ( Merck ), Brom ( Merck ), Potasyum nitrat ( Merck ), Potasyum dihidrojen fosfat ( Merck ), Disodyum hidrojen fosfat ( Merck ), Sodyum klorür ( Merck ), Potasyum klorür ( Merck ), İndometazin ( Sigma ), Tris ( Sigma ), NP-40 ( Applichem ), EDTA ( Sigma ), Phenylmethyl-sulfonyl fluoride ( PMSF ) ( Sigma ), İsopropanol ( Atabay ), Aprotinin ( Sigma ), HPLC-grade water 3.3.Hasta Temini ve Uygulanan İşlemler

Çalışmamızda İ.Ü Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı Meme

Cerrahisi servisinden ameliyat sonrası elde edilen patolojisi malin olarak değerlendirilen 20

adet meme kanseri dokusu ve peritümöral dokuları ve operasyon öncesinde alınmış serumlar

kullanılmıştır .

Çalışma grubumuzdaki hastalar, tamamı kadın ve yaş ortalamaları 54 olmak üzere 12

adet invaziv duktal kanser, 8 adet Mikst tipte invaziv kanser patolojik tanısı almış hastalardan

35

oluşturuldu. Kontrol olarak ; dokular için tümöral dokudan 3 cm. ilerideki peritümöral

dokular, serumlar için ise 10 sağlıklı kadından elde edilmiş serumlar kullanıldı.

Dokular alındıktan sonra serum fizyolojik ile yıkandıktan sonra sıvı azot altında

donduruldu ve –80 ºC‘de çalışma anına kadar saklandı. Çalışma anında dokular yaş olarak

tartıldıktan sonra, her parametre kendisi için uygun tampon da 4 ºC’de homojenize edildi ve

% 10’ luk ( w/v ) homojenatlar elde edildi. NO ve protein tayini için 0.1 N Fosfat Tamponu,

LO ve sPLAB2 B için Tris tamponu, PGEB2 B ve NOS için PBS tamponu, COX-2 için ise TNE

tamponu kullanıldı. Elde edilen doku homojenatları 30 saniye sürelerle iki kez MSE

sonikasyon cihazında sonike edildi. NO ve protein tayini için hazırlanan homojenatlar 15 000

g’de 15 dakika, COX-2 tayini için hazırlananlar 20 000 g’ de 10 dakika, PGEB2 B için hazırlanan

homojenatlar 13 000 g’de 15 dakika, sPLAB2B ve LO için hazırlanan homojenatlar 10 000 g’

de 15 dakika, NOS için hazırlanan homojenatlar 20 000 g’ de 20 dakika ( 3 kez ) santrifüj

edildiler. Çalışmalar süpernatantlardan alınan örneklerde yapıldı.

Ayrıca hastalardan operasyon öncesi düz tüpe alınan kanlar da santrifüj edildikten

sonra elde edilen serumlar çalışma gününe kadar –80 ºC’de saklandı. Çalışma günü kit

prosedürlerine uygun olarak çalışıldı.

3.4.Meme Dokusu Protein Tayini

Meme dokuları protein düzeyleri saptanırken, Folin-Lowry yönteminden yararlanıldı

( 88 ).

Prensip ;

Alkali bakır iyonlarının (Biüret ayıracı) proteinlerin peptid bağlarıyla koyu mavi renk

oluşturması ve kompleks inorganik tuz karışımı Folin-Ciocalteau Fenol ayıracının

(fosfotungstik asit ve fosfomolibdik asit karışımı) proteinlerde bulunan serbest veya peptid

bağıyla bağlı tirozin ve triptofan ile şiddetli mavi-yeşil renk vermesi esasına dayanır.

Kullanılan Çözeltiler :

1- Albumin çözeltisi : % 100 mg ( W/V )

2- Alkali tartarat çalışma çözeltisi : Bakır sülfat (1x) + alkali tartarat stok çöz.(9x) Bakır sülfat ( CuSOB4 B5HB2 BO) : % 0,1

36

Alkali tartarat stok çözeltisi : 20,1 gr sodyum karbonat, 0,5 gr sodyum potasyum

tartarat 0,1 N NaOH içinde (1 lt ) çözülerek hazırlanır.

3- Folin- Ciocalteau Fenol çözeltisi : 100 gr sodyum Wolframat, 25 gr sodyum molibdat

karışımı 700 ml suda çözülür. 50 ml % 85’ lik orto fosforik asit ve 100 ml derişik hidroklorik

asit ilavesi ile geri soğutucu altında 10 saat kaynatılır. 150 gr lityum sülfat, 50 ml su, 2-3

damla brom eklenerek 15 dakika daha kaynatılır. Soğutulup 1 lt’ye tamamlanır.

Yöntemin Uygulanışı :

Dokular çalışma günü – 80 ºC’ den çıkartıldıktan sonra , pH 7,5 Fosfat tamponu ile %

10’luk homojenatlar hazırlandı. Homojenizasyondan sonra 30 saniye sürelerle MSE

sonikasyon cihazında 2 kez sonike edildi. Daha sonra 15 000 g’ de 15 dakika santrifüj edildi.

Çalışmalar süpernatantlarda yapıldı.

Çalışma Şeması : UKör (ml)U Ustd (ml) U Uörnek (ml)U

Doku homojenatı - - 0,1 Standart - 0,1 - Distile su 0,1 - - Alkali tartarat çalışma çöz. 5 5 5 Oda ısısında 15 dakika inkübasyon ½ oranında dilüe Folin çöz. 0,5 0,5 0,5 İyice karıştırılıp oda ısısın da 30 dakika inkübasyon 750 nm dalga boyunda absorbanslar okunur. Hesaplama :

% mg protein = 100xA

A

std

örnek

3.5.Meme Dokusu Nitrit / Nitrat Tayini “ Roche Nitrit / Nitrat kolorimetrik metot “kiti kullanılmıştır ( 5, 17 ). Prensip:

Nitrat, nitrat redüktaz tarafından indirgenmiş nikotin amid dinükleotid fosfat

(NADPH) varlığında nitrite indirgenir. Oluşan nitrit, sülfanilamid ve N-(1-naftil)-etilen-

diamin dihidroklorid ile reaksiyona girerek kırmızı mor renkli diazo bileşiğini oluşturur.

37

Diazo bileşiğinin 540 nm dalga boyunda absorbansı ölçülürek toplam nitrit ve nitrat ( NOx )

tayin edilmiş olur

Nitrat +NADPH +H P

+P BUNİTRAT REDÜKTAZUB Nitrit + NADP P

+P + HB2 BO

Nitrit + sülfanilamid +N-(1-naftil)-etilendiamin Diazo bileşiği Kullanılan Çözeltiler :

-Potasyum Fosfat Tamponu ( pH 7,5 )

-Stok potasyum nitrat standardı ( 50 mg/dl ) : 81,5 mg potasyum nitrat ( KNOB3 B) 100

ml distile suda çözülerek 500 mg/L nitrat içeren stok standardı hazırlandı. Bu stok çözeltiden

seyreltmelerle 5 mg/L ve 0,05 mg/L arası konsantrasyonlarda standart serileri hazırlandı.

-Reaksiyon karışımı : 0,5 mg NADPH içeren her bir tableti sulandırmak için 3 ml

potasyum fosfat tamponu kullanıldı.

-Nitrat Redüktaz çözeltisi : 4 U Nitrat redüktaz içeren her bir şişe 0,7 ml distile suda

çözülerek hazırlandı.

-Renk Reaktifi 1 : sulfanilamid içerir (Griess reaktifi 1)

-Renk Reaktifi 2 : N-(1-naftil)-etilendiamin dihidroklorit içerir (Griess reaktifi 2)

Yöntemin Uygulanışı :

Dokular, çalışma günü – 80 ºC’ den çıkartıldıktan sonra , pH 7,5 Fosfat tamponu ile %

10’ luk homojenatlar hazırlandı. Homojenizasyondan sonra 30 saniye sürelerle MSE

sonikasyon cihazında 2 kez sonike edildi. Daha sonra 15 000 g’ de 15 dakika santrifüj edildi.

Çalışmalar süpernatantlarda yapıldı. Ayrıca serumlar -80 ºC’den çıkartıldıktan sonra oda

ısısında çözüldü ve sonrasında yöntem direkt uygulandı.

Çalışma Şeması : UKör nitrit+nitrat (µl)U UÖrneknitrit+nitrat(µl)U

Örnek - 250 Distile su 250 - Reaksiyon karışımı 125 125 Nitrat Redüktaz çöz. 10 10 Karıştırılıp 15-25 ºC’de 30 dak. inkübe edildi, AB1B okundu Renk Reaktifi- 1 125 125 Renk Reaktifi -2 125 125 Karıştırılıp, 15-25 ºC’ de, karanlıkta 15 dak. inkübasyon ve AB2B okundu.

BNİTRAT REDÜKTAZB

38

Hesaplama : ∆A BNitrit+NitratB = (A B2B - A B1 B) Bnitrit+nitratB - (AB2B –AB1 B) Bkör nitrit+ nitrat Hesaplamalar standart eğrisi kullanılarak yapılır 3.6.Meme Dokusu COX-2 Tayini

“Assay Designs”e ait “Human Cyclooxygenase-2 Enzyme Immunometrik Assay Kit “

kullanılmıştır ( 20, 138 ).

Prensibi ;

Sandviç prensibine dayalı solid faz enzim bağlı immunosorbent yöntemidir. Örnek ve

standartlar COX-2’yi tanıyan antikorlarla kaplı kuyucuklarda inkübe edilir. Bu

inkübasyondan sonra COX-2, solid faza bağlı antikorlar tarafından yakalanır. Örnekteki bağlı

olmayan materyal yıkama ile uzaklaştırılır. Daha sonra Horseradısh Peroksidaz ile işaretli

ikinci antikor kuyucuklara eklenir. İşaretli antikorlar, yakalanmış COX-2’lere bağlanırlar.

Kısa bir inkübasyonun ardından işaretli antikorların fazlası yıkama ile uzaklaştırılır ve

substrat eklenir. Substrat, bağlanmış COX-2’lerle reaksiyonlaşır .Tekrar bir inkübasyondan

sonra mevcut COX-2 ile orantılı renk oluşur, reaksiyon durdurulur ve 450 nm’de

absorbanslar okunur.

Standart konsantrasyonlarına karşılık gelen absorbanslarla standart grafiği oluşturulur.

Yöntemin Uygulanışı :

Çalışma günü ilk olarak pH 8.0, TNE tampon hazırlanmıştır (10 mmol Tris ( 1,21 gr ),

0,15 M NaCl ( 8.76 gr ) , % 1 NP-40 (10 ml), 1 milimolar EDTA). Hazırlanan tampona 0,1

mmol PMSF ( 0,0174 mg / ml, isopropanolde ) ve 1 mikrogram / ml aprotinin eklenmiştir.

Dokular -80 ºC’den alındıktan sonra, önce tartıldı ve sonrasında TNE tampon ile %10’luk

homojenatlar hazırlanmıştır. Homojenizasyondan sonra MSE Sonikasyon cihazında 30 saniye

sürelerle 2 kez sonike edilmiştir. Daha sonra polipropilen tüplerde, 20 000 g’ de 10 dakika 4

ºC’de santrifüj edilmiştir. Çalışma yapılan ortamın ısısı oldukca düşük tutulmuştur.

Süpernatantlara yöntem uygulanmıştır

Kit serum kullanımına uygun olmadığı için serum örneklerinde bu parametre çalışılamamıştır.

39

Çözeltilerin Hazırlanması :

1-Yıkama tamponu: Kit içinden çıkan stok solusyon deiyonize su ile 40 kat sulandırılarak 1

litrelik solusyon hazırlanmıştır.

2- Liyofilize COX-2 Konjugatı : Liyofilize konjugat uygun dilüe edici solusyonuyla

birleştirilip, vortekslenerek hazırlanmıştır.

3- Substrat hazırlanması : 1 TMB tablet , 2.5 ml substrat tamponu ile çözüldükten sonra,

üzerine 2,75 ml Peroksid Solusyonu eklenip, karıştırılıp ve 15 dakika içinde kullanılmıştır.

4-Standartlar : Kit içinden çıkan stok std şişesine 500 mikrolitre deiyonize su eklenip,oda

ısısında 5 dakika kibarca sallanarak 550 ng /ml lik konsantrasyonda çözelti elde edilmiştir. Bu

çözeltiye seyreltme tamponundan yapılan dilüsyonlarla standart serisi hazırlanmıştır.

UStd U Useyreltme tamponu(µl) U UEklenen Volum U UCOX-2 konstr ( ng / ml)U

1 750 stokdan 250 ml 137,5

2 500 std 1 den 500 ml 68,75

3 500 std 2 den 500 ml 34,38

4 500 std 3 den 500 ml 17,19

5 500 std 4 ten 500 ml 8,59

6 500 std 5 ten 500 ml 4,30

7 500 std 6 dan 500 ml 2,15

S0 : 0 (ng / ml COX-2) Hesaplama: Hesaplamalar standart eğrisi kullanılarak yapılır. Çalışma Şeması : Kör So Standart Örnek Seyreltme tamponu - 100 - - Standart - - 100 - Örnek - - - 100 Yavaşça sallanır

37 ºC’ de 1 saat inkübe edilir 200 mikrolitre yıkama tamponu ile her kuyucuk 7 defa yıkanır

Bağlı Antikor - 100 100 100 4 ºC’ de 30 dakika inkübe edilir

200 mikrolitre yıkama tamponu ile her kuyucuk 9 defa yıkanır Substrat 100 100 100 100 Oda ısısında 30 dakika inkübasyon Stop Solusyon 100 100 100 100 450 nm’ de okuma yapılır.

40

3.7. Meme Dokusunda Prostaglandin E B2B (PGE B2B) Tayini

“Assay Designs”e ait “High Sensitivity Prostaglandin EB2 B kit” kullanılmıştır ( 20, 138 ).

Prensip:

Bu kit; standart, örnekler veya alkali fosfataz molekülün deki PGEB2 B ‘lere kovalent

bağlanacak monoklonal antikorları içeren “kompetetif immunoassay” yöntemini içerir.

Antikor- PGE B2 B bağlanmasının ardından oda ısısında inkübasyon ve sonrasında yıkama

yapılarak bağlı olmayan materyaller uzaklaştırılır. Daha sonra substrat eklenir, substrat ve

alkali fosfataza bağlı konjugatlar arasında reaksiyon oluşması beklenir ve 530 nm’de okuma

yapılır. Elde edilen absorbanslar standart ve örneklerin PGEB2 B içeriği ile ters orantılıdır.

Yöntemin Uygulanışı :

Çalışma öncesi ilk olarak pH 7.4 PBS tampon hazırlandı ( 137 mmol NaCl, 2,7 mmol

KCl 10 mmol NaB2 BHPOB4 B), 2 milimolar KHB2 BPOB4 B ) Hazırlanan tampona 10 mikrogram / ml

olacak şekilde indometazin eklendi

Çalışma günü ,- 80 ºC’ den çıkarılan dokular ilk olarak tartıldı ve PBS tampon ile %

10’ luk homojenatlar hazırlandı. Homojenizasyondan sonra MSE sonikasyon cihazın da 30

saniyelik sürelerle 2 kez sonike edildi. Daha sonra 13 000 g’de 15 dakika santrifüj edildi.

Çalışmalar süpernatantlarda yapıldı. Serumlar oda ısısında çözüldükten sonra, önceden

yapılmış deneme çalışmalarına uygun dilüsyonlar elde edilip yöntem direkt uygulandı.

Çözeltilerin Hazırlanması : 1- Yıkama tamponu: Kit içinden çıkan stok yıkama tamponu deiyonize su ile 20 kat

sulandırılarak hazırlandı.

2- Standartlar : 50,0 pg/ ml konsantrasyondaki stok standart çözeltiye, standart dilüent

olarak seyreltme tamponu kullanılarak 8 ayrı tüpte standart çözeltileri hazırlandı.

USTDU Ustd dilüent (µL)U Ueklenen volum (µl)U UPGEUBU2 UBU konstr (pg/ml)U

1 980 stok,20 1,000

2 500 std 1 den 500 500

3 500 std 2 den 500 250

4 500 std 3 den 500 125

5 500 std 4 den 500 62,5

41

6 500 std 5 den 500 31,25

7 500 std 6 dan 500 15,63

8 500 std 7 den 500 7,81

Çalışma Şeması : UKörU UTAU UNSBU Ustd U UBo U UörnekU

Std dilüent - - 100 - 100 -

Std - - - 100 - -

Örnek - - - - - 100

Seyreltme tamp. - - 50 - - -

Konjugat - - 50 50 50 50

Bağlı antikor - - - 50 50 50

Oda ısısında ,500 rpm’de 2 saat shaker (çalkalayıcı ) 400 mikrolitre yıkama tamponu ile her kuyucuk 3 defa yıkanır Konjugat - 5 - - - - Substrat 200 200 200 200 200 200 Oda ısısında 60 dakika shaker (500 rpm) 405 nm’de okuma yapılır 3.8. Meme Dokusunda Sekretuar Fosfolipaz A2 (sPLA B2B) Aktivitesi Tayini

“Cayman Chemical Company kolorimetrik assay ” kiti kullanılmıştır ( 35, 36 ). Prensip: Bu ölçüm, substrat olarak 1,2- dithio analoğu fosfatidilkolinin (1,2-dithio PC)

kullanılarak sPLAB2 B aktivitesinin genel olarak hesaplandığı kolorimetrik bir yönteme dayanır.

Kuyucaklarda örneklerin üzerine substratların eklenmesiyle reaksiyon başlatılır. Kuyucuk

tablası yavaşça sallanarak 405 nm’de hemen 1 dakika arayla 5 okuma yapılır. Sonuçlar kit

içeriğinde belirtilen formülden yararlanılarak hesaplanır.

Yöntemin Uygulanışı :

Çalışma günü , - 80ºC’ den çıkartılan dokular önce tartıldı, sonra pH 7,5 Tris tamponu ile

% 10’luk homojenatlar hazırlandı. Daha sonra MSE sonikasyon cihazında 30 saniyelik

42

sürelerle 2 kez sonike edildi. Sonikasyondan sonra 10 000 g’de 15 dakika 4 ºC de santrifüj

edildi. Çalışmalar süpernatantlarda yapıldı. Ayrıca serumlar da oda ısısında çözüldükten

sonra, önceden yapılmış deneme çalışmalarına uygun dilüsyonlar elde edilip yöntem direkt

uygulandı.

Çözeltilerin Hazırlanması :

1. Yıkama tamponu: Kit içinden çıkan konsantre seyreltme tamponunun HPLC Grade

water ile 10 kat sulandırılarak hazırlanmıştır.

2. DTNB : 0,4 M Tris-HCl (pH 8) tamponunda 10 Mm DTNB hazırlanmış, çalışırken

karanlıkta ve buz içinde kullanılmıştır

3. Diheptanoyl Thio-PC Substrat : Bir şişe substrat ,12 ml seyreltme tamponu ile dilüe

edilerek 1,66 milimolar konsantrasyonda substrat elde edilmiştirDaha sonra rengi

açılana kadar vortekslenmiştir

4. Bee venom PLAB2 B Kontrol : 10 mikrolitre enzim ,990 mikrolitre seyreltme tamponu ile

dilüe edilerek 100 mikrogram/ml lik enzim solüsyonu hazırlanmıştır.

Çalışma Şeması : UKör(µL) U UKontrol (µL) U UÖrnek(µL) U

(Bee Venom PLA B2 B) Ölçüm tamponu 15 5 5

DTNB 10 10 10

Bee Venom sPLAB2 B - 10 -

Örnek - - 10

Substrat 200 200 200

Kuyucuk tablası yavaşça sallanır

405 nm’de 1 dakika arayla 5 okuma yapılır

Hesaplama : sPLAB2 B Aktivitesi dilüsyon x01,0

225,0xmM 66.10

dak/A1-

405∆=

= µmol / dak/ ml

43

3.9. Meme Dokusunda Lipoksijenaz (LO) Aktivitesi Tayini “Cayman Chemical Company” e ait “Lipoxygenase Inhibitör Screening Assay Kit”

kullanılmıştır ( 50, 150 ).

Prensip : Lipoksijenaz reaksiyonu ile oluşan hidroperoksidlerin tespit ve ölçümüne dayanan

genel bir kolorimetrik yöntemdir. Hidroperoksitlerin tamamına pozisyon ayırt edilmeksizin

eşit duyarlılıktadır. Kuyucaklara önce enzim sonra substrat eklenir ve kısa bir süre inkübe

edilir. İnkübasyondan sonra eklenen kromojenlerle reaksiyon tamamlanıp absorbanslar

okunur.

Yöntemin Uygulanışı :

Çalışma günü – 80ºC’ den çıkarılan dokular önce tartıldı ve daha sonra pH 7,5 Tris

tamponu ile % 10’luk homojenatlar hazırlandı. Homojenizasyondan sonra MSE sonikasyon

cihazında 30 saniyelik sürelerle 2 kez sonike edildi. Daha sonra 10000 g de 15 dakika

santrifüj edildi. Çalışmalar süpernatantlarda yapıldı. Serumlar oda ısısında çözüldükten sonra,

önceden yapılmış deneme çalışmalarına uygun dilüsyonlar elde edilip yöntem direkt

uygulandı.

Çözeltilerin Hazırlanması : 1-Yıkama tamponu:seyreltme tamponu HPLC-grade water ile 10 kat sulandırılarak

hazırlanmıştır.

2-Developing Reagent 1 : kullanıma hazır

3-Developing Reagent 2 : kullanıma hazır

4-Kromojen : Developing Reagent 1 ve 2 den eş miktar alınarak vortekslendi

5- 15-LO standart : 10 µl enzim ve 990 µl assay bufferdan alınarak hazırlandı

6- Substrat : 25 µl araşidonik asit, 25 µl KOH ve 950 ml HPLC-grade water kullanılarak

1 milimolar konsantrasyon da araşidonik asit çözeltisi hazırlandı

7-KOH : 0,1 M KOH

Standartların Hazırlanması

Std 1 = 10 / 1000 (10 µl enzim, 990 µl HPLC-grade water)

Std 2 = 5 / 1000 (5 µl enzim, 995 µl HPLC-grade water)

44

Std 3 = 2,5 / 1000 (2,5 µl enzim, 997,5 µl HPLC-grade water)

Std 4 = 1,25 / 1000 (1,25 µl enzim, 998,75 µl HPLC-grade water)

Std 5 = 0,625 / 1000 (0,625 µl enzim, 999,375 µl HPLC-grade water)

Çalışma Şeması UKör (µl) U UStandart (µl) U UÖrnek(µl) U

Örnek - - 90 Seyreltme tamponu 100 10 10 LO Std - 90 - Substrat 10 10 10 Kromojen 100 100 100 5 dakika sallanır ve 500 nm’ de okunur

3.9. Meme Dokusunda Nitrik Oksit Sentaz Aktivitesi Tayini “ Bioxytech Nitric Oxıde Synthase Assay Kit” kullanılmıştır ( 16 ).

Prensip:

Nitrat redüktaz tarafından nitrite redükte edilen nitrat miktarı Griess Reaksiyonu ile elde

edildikten sonra kit içeriğinde belirtilen formülden yararlanılarak NOS aktivasyonunun

hesaplanması temeline dayanır.

Yöntemin Uygulanışı :

Çalışma günü – 80 ºC’den çıkarılan dokular önce tartıldı ve pH 7,4 PBS ile % 10’ luk

homojenatlar hazırlandı. Homojenizasyondan sonra MSE Sonikasyon cihazı ile 30 saniyelik

sürelerle 2 kez sonike edildi. Daha sonra 20 000 g’de 20 dakika 3 kez santrifüj edildi ve

çalışmalar süpernatantlarda yapıldı. Serumlar oda ısısında çözüldükten sonra yöntem direkt

uygulandı.

Çözeltilerin Hazırlanması

1-Ölçüm Tamponu: 1 kutusu için 100 ml HPLC-Grade Water kullanıldı.

2-Nitrat Redüktaz :1 kutusu için 100 ml HPLC-Grade Water kullanıldı.

3-Ko-Faktör : 1 kutusu için 1,2 ml assay buffer eklendi.

4-Nitrat Std : 1 kutusu için 1 ml assay buffer eklendi

5-LDH : 1 kutusu için 1,2 ml assay buffer eklendi

6-Griess Reagent R1 ve R2 kullanıma hazır

7-NADPH :1 milimolar solusyonu hazırlandı

45

Standartların Hazırlanması : UNitrat std (µL) U Useyreltme tamp(µL) U Ukonsantrasyon (nmol/ml)U

Std1 0 60 0

Std 2 5 55 5

Std 3 10 50 10

Std 4 15 45 15

Std 5 20 40 20

Std 6 25 35 25

Std 7 30 30 30

Std 8 35 25 35

Çalışma Şeması : UKör (µL) std (µL) örnek(µL) Ölçüm Tamponu 200 20 20 Örnek - 40 40 NADPH - 10 10 Nitrat Redüktaz - 10 10 Oda ısısın da 60 dakika inkübasyon Kofaktor preparat - 10 10 LDH - 10 10 Oda ısısın da 20 dakika inkübasyon R1 - 50 50 R2 - 50 50 Oda ısısın da 10 dakika inkübasyon ve 540 nm’ de okuma yapılır. Hesaplama : NOS aktv. { } TRXN/)VS/200( m/)bA( 540 −= = nmoles / mililitre / dakika A 540 : 540 nm’deki absorbans b : y-intercept m : eğim 200 : son hacim (µl) VS : kuyucuklardaki örnek hacmi (40 µl) TRXN . Toplam inkübasyon zamanı (60 dak)

46

3.10.Bulguların İstatistiksel Değerlendirilmesi

Sonuçlar ortalama ± SD olarak ifade edildi. İstatistiksel olarak değerlendirilirken n= 20

olarak kabul edilip, eşli t-testi, bağımsız t-testi, Man Whitney U Testi ve Wilcoxon Signed

Ranks Testi kullanıldı. Wilcoxon Signed Ranks Testi tümoral ve peritümöral doku

kıyaslamalarında kullanıldı. Man Whitney U Testi ise hasta ve kontrol serumlarının

kıyaslanmasında kullanıldı.

47

4.BULGULAR

Örneklerin alındığı yaş, menopozal durum, tümör tipi, grade ve tümör çapına göre

sınıflaması Tablo I’de verilmektedir.

Meme tümöral doku, peritümöral doku, hasta serumları ve kontrol serumlarındaki NO,

COX-2 ve PGEB2 B düzeyleri Tablo II’de verilmektedir. Tablo III’de ise tümöral, peritümöral

dokularda, hasta serumları ve kontrol serumlarında saptanan NOS, LO ve sPLAB2 B aktiviteleri

verilmektedir. Tablo IV’de ise tümöral-peritümöral doku, hasta serumu-kontrol serumu

gruplarındaki hasta sayıları, analiz sonuçlarının ortalamaları ve standart sapmaları

verilmektedir.

Grafik 1’de görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde, peritümöral

dokuya göre anlamlı yükseklik vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 2’de görüldüğü gibi NOx düzeyleri için meme tümörlü hasta serumlarında,

kontrol serumlarına göre anlamlı yükseklik vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 3’de görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde 50 yaş öncesi

ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur ( p > 0,05 ).

Grafik 4’te görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde 50 yaş öncesi

ve sonrasında hasta serumları ile kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur ( p > 0,05 ).

Grafik 5’de görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur

( p > 0,05 ).

Grafik 6’da görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında hasta serumları ile kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur (p>

0,05 ).

Grafik 7’de görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde tümör

çaplarına göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 8’de görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde tümör

çaplarına göre hasta serumları ile kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

48

Grafik 9’da görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümör dokularında ,invaziv

duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında anlamlı fark vardır ( p<0,05 ).

Grafik 10’da görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde ,invaziv

duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında hasta ve kontrol serumları için

anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 11’de görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde grade’e

göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 12’de görüldüğü gibi NOx düzeyleri için insan meme tümörlerinde grade’e göre

hasta serumları ile kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 13’de görüldüğü gibi COX-2 düzeyleri için insan meme tümörlerinde,

peritümöral dokuya göre anlamlı yükseklik vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 14’de görüldüğü gibi COX-2 düzeyleri için insan meme tümörlerinde 50 yaş

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05 ).

Grafik 15’de görüldüğü gibi COX-2 düzeyleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05 ).

Grafik 16’da görüldüğü gibi COX-2 düzeyleri için insan meme tümör dokularında,

invaziv duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında anlamlı fark vardır

( p<0,05).

Grafik 17’de görüldüğü gibi COX-2 düzeyleri için insan meme tümörlerinde tümör

çaplarına göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark vardır ( p<0,05 ).

Grafik 18’de görüldüğü gibi COX-2 düzeyleri için insan meme tümörlerinde tümör

grade’lerine göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05).

Grafik 19’da görüldüğü gibi PGEB2 B düzeyleri için insan meme tümörlerinde, peritümöral

dokuya göre anlamlı yükseklik vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 20’de görüldüğü gibi PGE B2 B düzeyleri için meme tümörlü hasta serumlarında,

kontrol serumlarına göre anlamlı yükseklik vardır ( p< 0,05 ).

49

Grafik 21’de görüldüğü gibi PGE B2B düzeyleri için insan meme tümörlerinde 50 yaş

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark vardır

( p<0,05 ).

Grafik 22’de görüldüğü gibi PGE B2B düzeyleri için insan meme tümörlerinde 50 yaş

öncesi ve sonrasında hasta serumları ile kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05 ).

Grafik 23’de görüldüğü gibi PGE B2B düzeyleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark vardır

( p<0,05 ).

Grafik 24’de görüldüğü gibi PGE B2B düzeyleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında hasta serumları ile kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05 ).

Grafik 25’de görüldüğü gibi PGEB2 B düzeyleri için insan meme tümör dokularında,

invaziv duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında anlamlı fark vardır

( p<0,05 ).

Grafik 26’da görüldüğü gibi PGEB2 Bdüzeyleri için insan meme tümörlerinde ,invaziv

duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında hasta ve kontrol serumları için

anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 27’de görüldüğü gibi PGE B2 Bdüzeyleri için insan meme tümörlerinde tümör

çaplarına göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark vardır ( p<0,05 ).

Grafik 28’de görüldüğü gibi PGE B2 Bdüzeyleri için insan meme tümörlerinde tümör

çaplarına göre hasta ve kontrol serumları için anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 29’da görüldüğü gibi PGEB2 Bdüzeyleri için insan meme tümörlerinde grade’e göre

tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 30’da görüldüğü gibi PGEB2 Bdüzeyleri için insan meme tümörlerinde grade’e göre

hasta ve kontrol serumları için anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 31’de görüldüğü gibi sPLA B2 B aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, tümöral

dokularda peritümöral dokuya göre anlamlı yükseklik vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 32’de görüldüğü gibi sPLAB2 B aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, hasta ve

kontrol serumları arasında anlamlı fark vardır ( p< 0,05 ).

50

Grafik 33’de görüldüğü gibi sPLA B2 B aktiviteleri için insan meme tümörlerinde 50 yaş

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark vardır

( p<0,05 ).

Grafik 34’de görüldüğü gibi sPLA B2 B aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, 50 yaş

öncesi ve sonrasında hasta ve kontrol serumları arasında anlamlı fark vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 35’de görüldüğü gibi sPLAB2B aktiviteleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark vardır

( p<0,05 ).

Grafik 36’da görüldüğü gibi sPLAB2B aktiviteleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında hasta ve kontrol serumları arasında anlamlı fark vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 37’de görüldüğü gibi sPLA B2 B aktiviteleri için insan meme tümör dokularında

,invaziv duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında anlamlı fark vardır

( p<0,05 ).

Grafik 38’de görüldüğü gibi sPLA B2 B aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, invaziv

duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında hasta ve kontrol serumları için

anlamlı fark vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 39’da görüldüğü gibi sPLAB2 B aktiviteleri için insan meme tümör dokularında,

tümör çaplarına göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark vardır

( p<0,05 ).

Grafik 40’da görüldüğü gibi sPLA B2 B aktiviteleri için insan meme tümörlerinde tümör

çaplarına göre hasta ve kontrol serumları arasında anlamlı fark vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 41’de görüldüğü gibi sPLA B2 B aktiviteleri için insan meme tümör dokularında ,

grade’e göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark vardır ( p<0,05 ).

Grafik 42’de görüldüğü gibi sPLA B2 B aktiviteleri için insan meme tümörlerinde grade’e

göre hasta ve kontrol serumları için anlamlı fark vardır ( p<0,05 ).

Grafik 43’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, peritümöral

dokuya göre anlamlı yükseklik vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 44’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, hasta ve

kontrol serumları arasında anlamlı fark vardır ( p< 0,05 ).

51

Grafik 45’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümörlerinde 50 yaş

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05 ).

Grafik 46’da görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, 50 yaş

öncesi ve sonrasında hasta ve kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 47’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05 ).

Grafik 48’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında hasta ve kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 49’da görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümör dokularında ,invaziv

duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 50’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, invaziv

duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında hasta ve kontrol serumları için

anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 51’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümör dokularında, tümör

çaplarına göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 52’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümörlerinde tümör

çaplarına göre hasta ve kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 53’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümör dokularında ,

grade’e göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 54’de görüldüğü gibi LO aktiviteleri için insan meme tümörlerinde grade’e

göre hasta ve kontrol serumları için anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 55’de görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümörlerinde,

peritümöral dokuya göre anlamlı yükseklik vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 56’da görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, hasta ve

kontrol serumları arasında anlamlı fark vardır ( p< 0,05 ).

Grafik 57’de görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümörlerinde 50 yaş

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05 ).

52

Grafik 58’de görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, 50 yaş

öncesi ve sonrasında hasta ve kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 59’da görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05 ).

Grafik 60’da görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümörlerinde menapoz

öncesi ve sonrasında hasta ve kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 61’de görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümör dokularında,

invaziv duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında anlamlı fark vardır

(p<0,05 ).

Grafik 62’de görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümörlerinde, invaziv

duktal kanserler ile mikst tipte invaziv kanserler arasında hasta ve kontrol serumları için

anlamlı fark vardır ( p<0,05 ).

Grafik 63’de görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümör dokularında,

tümör çaplarına göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur

( p>0,05 ).

Grafik 64’de görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümörlerinde tümör

çaplarına göre hasta ve kontrol serumları arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 65’de görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümör dokularında ,

grade’e göre tümöral dokularla peritümöral dokular arasında anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

Grafik 66’de görüldüğü gibi NOS aktiviteleri için insan meme tümörlerinde grade’e

göre hasta ve kontrol serumları için anlamlı fark yoktur ( p>0,05 ).

53

Hasta Yaş Menopoz Durum Çap Patolojik Tanı Grade İlave Hastalık

1 K.A 50 Sonrası 3 cm İnvaziv Duktal Kanser - Ü.K

2 G.A 36 Öncesi 3,6 cm İnvaziv Duktal Kanser - -

3 G.S 66 sonrası 2,5 cm Mikst Tipte İnvaziv Kanser - DM

4 N.H 50 Sonrası 1,9 cm İnvaziv Duktal Kanser 3 Safra Kese Hast

5 S.Ş 47 Öncesi 3,5 cm İnvaziv Duktal Kanser 3 Panik Atak

6 M.K 51 Sonrası 2 cm Mikst Tipte İnvaziv Kanser 3 -

7 M.D 37 Öncesi 3 cm İnvaziv Duktal Kanser 2 -

8 A.K 58 Sonrası 3 cm İnvaziv Duktal Kanser 2 OA

9 İ.B 49 Sonrası 2,2 cm İnvaziv Duktal Kanser 3 -

10 B.E 55 Sonrası 2,2 cm Mikst Tipte İnvaziv Kanser 2 Guatr

11 S.P 55 Sonrası - İnvaziv Duktal Kanser 2 -

12 Ö.K 73 Sonrası - İnvaziv Duktal Kanser - -

13 M.E 70 Sonrası 2,5 cm İnvaziv Duktal Kanser 2 HT

14 F.G 61 Sonrası 5 cm Mikst Tipte İnvaziv Kanser 2 -

15 N.Ü 60 Sonrası 3,5 cm İnvaziv Duktal Kanser 2 DM

16 Ö.A 61 Sonrası 5 cm Mikst Tipte İnvaziv Kanser 2 -

17 A.A 47 Öncesi 2,5 cm İnvaziv Duktal Kanser 3 -

18 S.E 61 Sonrası 5 cm Mikst Tipte İnvaziv Kanser 2 -

19 A.U 50 Sonrası 5 cm Mikst Tipte İnvaziv Kanser 2 -

20 F.Z 61 Sonrası 5 cm Mikst Tipte İnvaziv Kanser 2 -

Tablo I: Hasta grubu özellikleri

54

NO Değerleri COX-2 Değerleri PGEB2B Değerleri

Hasta tümöral doku ****

peritümöral doku ****

Hasta serumu **

Kontrol serumu **

tümöral doku ***

peritümöral doku ***

tümöral doku ***

peritümöral doku ***

Hasta serumu*

Kontrol serumu *

1 K.A 3804 1039 21,1 40,1 800 590 21060 4942 220 100 2 G.A 1532 1344 44,02 20,4 780 580 9559 1765 223 190 3 G.S 5136 755,2 20,8 44,2 2170 1740 6554 5104 210 191 4 N.H 6992 4413 23,2 26,8 930 720 9885 10760 230 120 5 S.Ş 3569 1783 15,04 23,1 1560 820 4201 4348 125 70 6 M.K 3683 - 48,8 29,01 540 - 1957 - 223 58 7 M.D 3912 1004 19,3 23,8 3620 2010 23250 7865 204 80 8 A.K 1539 687,6 20,9 27,6 940 560 17900 5618 100 92 9 İ.B 4778 2112 48,2 20,2 2040 950 45300 10600 280 106 10 B.E 1331 - 44,02 20,4 560 - 21550 - 249 104 11 S.P 2422 1722 20,8 590 680 5856 5592 203 12 Ö.K 1451 754,7 25,08 4500 730 6321 1910 250 13 M.E 3213 - 49,4 1560 - 3625 - 130 14 F.G 925,1 - 44,04 3250 - 2438 - 101 15 N.Ü 7396 3112 21,1 570 480 26310 1735 122 16 Ö.A 935,2 - 48,8 330 - 4373 - 220 17 A.A 1863 - 23,9 390 - 3586 - 135 18 S.E 537,3 - 21,1 400 - 3534 - 210 19 A.U 2709 - 23,1 1380 - 2625 - 205 20 F.Z 936,4 - 19,3 1850 - 2648 - 240

Tablo II: Dokularda ve serumlardaki PGE B2 B (ng/mg protein – ng/ ml), COX-2 (ng/mg protein) ve NO (nmol/mg protein- nmol/ml)düzeyleri * : ng/ml **: nmol/ml *** : ng/mg protein **** :nmol/mg protein

55

sPLAB2B Aktivitesi LO Aktivitesi NOS Aktivitesi

Hasta tümöral doku *

Peritümöral doku *

Hasta serumu**

Kontrol serumu** tümöral doku *

peritümöral doku *

Hasta serum***

Kontrol serum***

tümöral doku *

peritümöral doku *

Hasta serumu***

Kontrol serumu***

1 K.A 332,1 19,5 0,36 0,17 20,2 11,4 20,4 11,9 0,6 0,4 1,34 0,57 2 G.A 400 20,6 017 0,14 5,1 6,6 16,7 9,8 0,5 0,3 1,5 0,49 3 G.S 678 78,8 0,63 0,21 18 17,3 17,6 9,4 0,5 0,6 1,33 0,57 4 N.H 275,9 62,8 0,31 0,31 18,1 14,9 21,3 11,2 0,6 0,4 1,88 0,61 5 S.Ş 524,3 24,4 0,7 0,22 18,6 12,2 17 10,6 0,4 0,5 1,56 0,56 6 M.K 195,7 - 1 0,26 10,2 - 20,2 10,2 0,5 - 0,88 0,46 7 M.D 357,4 49,8 1,8 0,33 22,8 10,8 17,2 11,9 0,5 0,2 0,77 0,59 8 A.K 473,1 63,7 0,78 0,2 14,3 14,3 16,8 10,7 0,6 0,4 1,55 0,56 9 İ.B 969,7 90,1 0,21 0,23 26,9 14,5 23,2 10,8 0,6 0,4 1,5 0,54 10 B.E 202,1 - 0,35 0,21 12,6 - 22,2 10,9 0,5 - 1,42 0,58 11 S.P 511,2 77,6 2,6 8,3 11,6 15,2 0,6 0,6 1,42 12 Ö.K 135,2 24,3 1,8 20,3 13,3 15,8 0,5 0,5 1,46 13 M.E 281,3 - 0,94 16,5 - 17,1 0,5 - 1,19 14 F.G 203,5 - 0,68 17,2 - 18,05 0,3 - 1,28 15 N.Ü 1078 35,3 0,85 16,4 9,9 17,5 0,6 0,4 1,33 16 Ö.A 198,2 - 0,90 17,6 - 18,6 0,3 - 1,4 17 A.A 275,4 - 0,58 8 - 15 0,3 - 1,16 18 S.E 142,1 - 0,96 5,5 - 18,4 0,2 - 1,3 19 A.U 296,6 - 0,94 10,6 - 19,2 0,4 - 1,5 20 F.Z 207,6 - 0,90 8,7 - 17,8 0,3 - 1,5

Tablo III: Dokularda ve serumlardaki sPLAB2 B (nmol/dak/ mg protein – µmol/dak/ml), NOS(nmol/dak/mg protein – nmol/dak/ml) ve LO (nmol/dak/ mg protein – nmol/dak/ml)aktiviteleri * : nmol/dak/ mg protein ** : µmol/dak/ml ***: nmol/dak/ml

56

NO COX-2 PGEB2 B sPLAB2 B LO NOS

Tümöral doku

(n=20)

4420 ± 2188,26

(nmol/mg protein)

1681 ± 1312,05

(ng/mg protein)

16,01 ± 12,45

(ng/mg protein)

383 ± 250

(nmol/dak/mg protein)

14,8 ± 5,9

(nmol/dak/mg protein)

0,474 ± 0,124

(nmol/dak/mg protein)

Peritümöral

doku (n=11)

1765 ± 1118,54

(nmol/mg protein)

896,36 ± 504,643

(ng/mg protein)

5,47 ± 3,195

(ng/mg protein)

50 ± 26

(nmol/dak/mg protein

9,44 ± 2,8

(nmol/dak/mg protein

0,3 ± 0,119

(nmol/dak/mg protein)

Hasta serumu

(n=20)

30,02 ± 12,85

(nmol/ml)

-

194 ± 54,2

(ng/ml)

0,9 ± 0,7

(nmol/dak/ml)

18,2 ± 2,4

nmol/dak/ml

1,364 ± 0,241

(nmol/dak/ml)

Kontrol serum

(n=10)

22,38 ± 3,248

(nmol/ml) -

113 ± 52

(ng/ml)

0,2 ± 0,1

(nmol/dak/ml)

10,71 ± 0,9

nmol/dak/ml

0,551 ± 0,051

(nmol/dak/ml)

Tablo IV. NO, COX-2, PGEB2 B düzeylerinin ve sPLA B2 B,LO, NOS aktivitelerinin ortalama düzeyleri ve standart sapmaları

57

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

tümör NOx peritümör NOx

nmol

/mg

prot

ein

GRAFİK 1: Meme tümörü ve peritümör dokusu ortalama NOx (nmol/ mg protein) ve standart sapmaları (± SD) p< 0,05

01020304050

Hasta serumu Kontrol serumu

nmol

/ml

GRAFİK 2: Meme tümörlü hastaların serumları ve kontrol serumları NOx (nmol/ ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) p< 0,05

nmol

/mg

prot

ein

nmol

/ml

58

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

+50 yaş kontrol -50 kontrol

nmol

/mgr

pro

tein

GRAFİK 3: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku NOx (nmol/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) p>0,05

05

101520253035404550

+50 yaş -50 kontrol

nmol

/ml

GRAFİK 4: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların ve kontrol grubu hastaların serum NOx ( nmol/ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) p>0,05

nmol

/ml

59

0500

10001500200025003000350040004500

menopozöncesi

kontrol menopozsonrası

kontrol

nmol

/mgr

pro

tein

GRAFİK 5: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku NOx (nmol/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) p>0,05

0

10

20

30

40

50

menopoz öncesi menopoz sonrası kontrol

nmol

/ml

GRAFİK 6: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların ve kontrol grubu hastaların serum NOx (nmol/ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) p>0,05

nmol

/mg

prot

ein

nmol

/ml

60

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0-2 cm kontrol 2,1-5 cm kontrol +5 cm

nmol

/mgr

pro

tein

GRAFİK 7: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların tümöral ve pertümöral doku NOx (nmol/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) p>0,05

0

10

20

30

40

50

0-2 cm 2,1-5 cm +5 cm kontrol

nmol

/ml

GRAFİK 8: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının NOx (nmol/ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) p>0,05

nmol

/mg

prot

ein

nmol

/ml

61

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

İDK kontrol mikst tip kontrol

nmol

/mgr

pro

tein

GRAFİK 9: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların tümöral ve peritümöral dokularının NOx (nmol/ mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) p

0

10

20

30

40

50

60

İDK mikst tip kontrol

nmol

/ml

GRAFİK 10: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının NOx (nmol/ ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0.05)

nmol

/mg

prot

ein

nmol

/ml

62

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

Grade 2 kontrol Grade 3 kontrol

nmol

/mgr

pro

tein

GRAFİK 11: Grade 2 ve Grade 3 hastaların tümöral ve peritümöral dokularının NOx (nmol/ mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0.05)

0

10

20

30

40

50

Grade 2 Grade 3 kontrol

nmol

/ml

GRAFİK 12: Grade 2 ve Grade 3 hasta serumlarının ve kontrol serumlarının NOx (nmol/ ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0.05)

nmol

/mg

prot

ein

nmol

/ml

63

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

tm COX-2 p-tm COX-2

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 13: Meme tümöral ve peritümöral dokularının COX-2 (ng/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

+50 yaş kontrol -50 kontrol

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 14: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku COX-2 ( ng/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

ngl/m

g pr

otei

n ng

l/mg

prot

ein

64

0500

100015002000250030003500

menopozöncesi

kontrol menopozsonrası

kontrol

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 15: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku COX-2 (ng/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

İDK kontrol mikst tip kontrol

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 16: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların tümöral ve peritümöral dokularının COX-2(ng/ mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0.05)

ngl/m

g pr

otei

n ng

l/mg

prot

ein

65

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0-2 cm kontrol 2,1-5 cm kontrol +5 cm

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 17: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların tümöral ve pertümöral doku COX-2 (ng/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0.05 ve p>0,05)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Grade 2 kontrol Grade 3 kontrol

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 18: Grade 2 ve Grade 3 hastaların tümöral ve peritümöral dokularının COX-2 (ng/ mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0.05)

ngl/m

g pr

otei

n

ngl/m

g pr

otei

n

66

0

5

10

15

20

25

30

tm PGE2 p-tm PGE2

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 19: Meme tümöral ve peritümöral dokularının PGEB2 B (ng/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p< 0,05)

0

50

100

150

200

250

300

Hasta serumu Kontrol serumu

ngr/m

l

GRAFİK 20: Meme tümörlü hastaların serumları ve kontrol serumları PGEB2 B(ng/ ml) düzeyleri ve standart sapmaları(± SD) (p< 0,05)

ngl/m

g pr

otei

n

tm PGEB2 B p-tm PGEB2 B

ngl/m

l

67

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

+50 yaş kontrol -50 kontrol

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 21: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku PGEB2 B (ng/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

050

100150200250300

+50 yaş -50 kontrol

ngr/m

l

GRAFİK 22: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların ve kontrol grubu hastaların serum PGEB2 B (ng/ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

ngl/m

g pr

otei

n ng

l/ml

68

0

5000

10000

15000

20000

25000

menopozöncesi

kontrol menopozsonrası

kontrol

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 23: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku PGEB2 B (ng/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

0

50

100

150

200

250

300

menopoz öncesi menopoz sonrası kontrol

ngr/m

l

GRAFİK 24: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların ve kontrol grubu hastaların serum PGEB2 B (ng/ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

ngl/m

g pr

otei

n ng

l/ml

69

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

İDK kontrol mikst tip kontrol

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 25: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların tümöral ve peritümöral dokularının PGEB2 B (ng/ mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0.05 ve p>0.05)

0

50

100

150

200

250

300

İDK mikst tip kontrol

ngr/m

l

GRAFİK 26: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının PGEB2 B (ng/ ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0.05)

ngl/m

g pr

otei

n ng

l/ml

70

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

0-2 cm kontrol 2,1-5 cm kontrol +5 cm

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 27: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların tümöral ve pertümöral doku PGE B2 B (ng/mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05 ve p<0.05)

0

50

100

150

200

250

300

0-2 cm 2,1-5 cm +5 cm kontrol

ngr/m

l

GRAFİK 28: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının PGEB2 B (ng/ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

ngl/m

g pr

otei

n ng

l/ml

71

0

5000

10000

15000

20000

25000

Grade 2 kontrol Grade 3 kontrol

ngr/m

gr p

rote

in

GRAFİK 29: Grade 2 ve Grade 3 hastaların tümöral ve peritümöral dokularının PGEB2 B (ng/ mg protein) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0.05)

0

50

100

150

200

250

300

Grade 2 Grade 3 kontrol

ngr/m

l

GRAFİK 30: Grade 2 ve Grade 3 hasta serumlarının ve kontrol serumlarının PGEB2 B(ng/ ml) düzeyleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0.05)

ngl/m

g pr

otei

n

ngl/m

l

72

0

100

200

300

400

500

600

700

tm sPLA2 p-tm sPLA2

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 31: Meme tümöral ve peritümöral dokularının sPLAB2 B (nmol/dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

Hasta serumu Kontrol serumu

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 32: Meme tümörlü hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının sPLAB2B (nmol/dak/ ml) aktiviteleri ve standart sapmaları(± SD) (p< 0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

tm sPLAB2B p-tm sPLAB2B

nmol

/dak

/ml

73

0

100

200

300

400

500

600

700

+50 yaş kontrol -50 kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 33: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku sPLAB2 B(nmol/ dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p< 0,05)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

+50 yaş -50 kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 34: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların ve kontrol grubu hastaların serum sPLAB2 B (nmol/dak/ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

74

0

100

200

300

400

500

600

700

menopoz öncesi kontrol menopoz sonrası kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 35: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku sPLAB2 B (nmol/dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

menopoz öncesi menopoz sonrası kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 36: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların ve kontrol grubu hastaların serum sPLAB2 B( nmol/dak/ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

75

0

100

200

300

400

500

600

700

800

İDK kontrol mikst tip kontrol

nmol

/mgr

pro

tein

GRAFİK 37: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların tümöral ve peritümöral dokularının sPLAB2 B(nmol/dak/ mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

İDK mikst tip kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 38: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının sPLAB2 B (nmol/dak/ ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

76

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0-2 cm kontrol 2,1-5 cm kontrol +5 cm

nmol

/dak

/mg

prot

ein

GRAFİK 39: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların tümöral ve peritümöral doku sPLAB2 B (nmol/dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0-2 cm 2,1-5 cm +5 cm kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 40:Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının sPLAB2 B (nmol/dak/ml)aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

77

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Grade 2 kontrol Grade 3 kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 41: Grade 2 ve Grade 3 hastaların tümöral ve peritümöral dokularının sPLAB2 B (nmol /dak /mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Grade 2 Grade 3 kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 42: Grade 2 ve Grade 3 hasta serumlarının ve kontrol serumlarının sPLAB2 B(nmol /dak / ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p< 0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

78

0

5

10

15

20

25

tm-LO p-tm-LO

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 43: Meme tümöral ve peritümöral dokularının Lipoksijenaz (nmol/dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

0

5

10

15

20

25

Hasta serumu Kontrol serumu

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 44: Meme tümörlü hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının Lipoksijenaz (nmol/dak/ ml) aktiviteleri ve standart sapmaları(± SD) (p< 0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

79

0

5

10

15

20

25

30

35

+50 yaş kontrol -50 kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 45: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku Lipoksijenaz (nmol/ dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p> 0,05)

0

5

10

15

20

25

+50 yaş -50 kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 46: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku Lipoksijenaz (nmol/ dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p> 0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

80

0

5

10

15

20

25

menopoz öncesi kontrol menopoz sonrası kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 47: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku Lipoksijenaz (nmol/dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

0

5

10

15

20

25

menopoz öncesi menopoz sonrası kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 48: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların ve kontrol grubu hastaların serum Lipoksijenaz (nmol/dak/ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

81

0

5

10

15

20

25

İDK kontrol mikst tip kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 49: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların tümöral ve peritümöral dokularının Lipoksijenaz (nmol/dak/ mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

0

5

10

15

20

25

İDK mikst tip kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 50: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının Lipoksijenaz (nmol/dak/ ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

82

0

5

10

15

20

25

0-2 cm kontrol 2,1-5 cm kontrol +5 cm

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 51: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların tümöral ve peritümöral doku Lipoksijenaz (nmol/dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

0

5

10

15

20

25

0-2 cm 2,1-5 cm +5 cm kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 52: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının Lipoksijenaz (nmol/dak/ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

83

0

5

10

15

20

25

30

Grade 2 kontrol Grade 3 kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 53: Grade 2 ve Grade 3 hastaların tümöral ve peritümöral dokularının Lipoksijenaz (nmol /dak /mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

0

5

10

15

20

25

Grade 2 Grade 3 kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 54: Grade 2 ve Grade 3 hasta serumlarının ve kontrol serumlarının Lipoksijenaz (nmol /dak / ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p> 0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

84

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

tm-NOS p-tm NOS

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 55: Meme tümöral ve peritümöral dokularının NOS (nmol/dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

Hasta serumu Kontrol serumu

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 56: Meme tümörlü hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının NOS (nmol/dak/ ml) aktiviteleri ve standart sapmaları(± SD) (p< 0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

85

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

+50 yaş kontrol -50 kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 57: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku NOS (nmol/ dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

+50 yaş -50 kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 58: 50 yaş sonrası ve 50 yaş öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku NOS (nmol/ dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

86

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

menopoz öncesi kontrol menopoz sonrası kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 59: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların tümöral ve peritümöral doku NOS (nmol/dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

menopoz öncesi menopoz sonrası kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 60: Menopoz sonrası ve öncesi hastaların ve kontrol grubu hastaların serum NOS (nmol/dak/ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

87

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

İDK kontrol mikst tip kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 61: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların tümöral ve peritümöral dokularının NOS (nmol/dak/ mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

İDK mikst tip kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 62: İnvaziv Duktal Kanser ve Mikst Tipte İnvaziv Kanserli hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının NOS (nmol/dak/ ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p<0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

88

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0-2 cm kontrol 2,1-5 cm kontrol +5 cm

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 63: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların tümöral ve peritümöral doku NOS (nmol/dak/mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

0-2 cm 2,1-5 cm +5 cm kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 64: Tümör çapları 0-2 cm, 2,1- 5 cm ve 5 cm’den büyük hastaların serumlarının ve kontrol serumlarının NOS (nmol/dak/ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

89

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Grade 2 kontrol Grade 3 kontrol

nmol

/dak

/mgr

pro

tein

GRAFİK 65: Grade 2 ve Grade 3 hastaların tümöral ve peritümöral dokularının NOS (nmol /dak /mg protein) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p>0,05)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

Grade 2 Grade 3 kontrol

nmol

/dak

/ml

GRAFİK 66: : Grade 2 ve Grade 3 hasta serumlarının ve kontrol serumlarının NOS (nmol /dak / ml) aktiviteleri ve standart sapmaları (± SD) (p> 0,05)

nmol

/dak

/mg

prot

ein

nmol

/dak

/ml

90

5. TARTIŞMA ve SONUÇ

Meme tümörlerinin büyüme ve gelişmesinde en önemli aşamalar anjiogenez, hücre

çoğalması ve invazyondur. NO Yolu ve COX Yolu, bu 3 aşamayı da hedefler ve karşılıklı

etkileşim içindedir.

NO Yolu, NOS aracılığıyla L-arginin’den sitrüllin ve nitrik oksit oluşması ile

sonuçlanır. Nitrik oksidin damar geçirgenliğini düzenleyici fizyolojik etkileri anjiogenez

süreci sırasında önemlidir. Tümör damarlanmasını artırmada çok önemli etkileri olan

VEGF’nin , endotel üzerine olan etkilerinin NO sentezinin uyarılması yoluyla meydana

geldiği belirtilmektedir. Ayrıca nitrik oksit, hem sitotoksik bir ajan olarak hem de tümör

büyümesinin uyarıcısı olarak tümörigenez sürecinde çok önemli rol oynar ( 58, 96 ). Dai

Fukumura’ ya göre malin tümörlerde NO, neovaskülarizasyon, damar geçirgenliğinin

artması, tümör ve komşu dokuda vazodilatasyon gibi birçok olayda rol oynamaktadır. Ayrıca

lökosit endotel etkileşiminin azalması, konakçı immun mekanizmasının etkilerinden

kurtulmasına yardım eder. Aynı araştırmacı tarafından NO’in tümörlerdeki bu

fonksiyonlarının tümör gelişimini güçlü bir şekilde kolaylaştırdığı savunulmuştur ( 47 ).

Nitrik oksit ve NOS’ın varlığı malin melanom, meme, kolorektal, renal hücre, pankreas,

jinekolojik, prostat, akciğer, mide ve baş boyun tümörleri gibi çeşitli insan malin

tümörlerinde gösterilmiştir ( 78, 96, 129 ). NOS aktivitesi ve ekspresyonu renal hücreli

karsinom ve kolorektal karsinom hariç tümör dokularında komşu normal dokulara kıyasla

daha yüksek bulunmuştur ( 96, 129 ).

Andrade ve arkadaşları endojen NOS’ın inhibisyonunun tümör kan akımını azalttığını

bildirmişlerdir ( 4 ). Meyer ve arkadaşları NOS inhibisyonunun tümör perfüzyonunu geri

dönüşümsüz olarak azalttığını göstermişlerdir ( 47, 102 ). NOS antagonistlerinin tümör kan

akımını ve dolayısı ile tümör hacminin azaltılmasında kullanılabileceği ileri sürülmektedir

( 137 ).

Biz çalışmamızda NO Yolu aktivasyonunu değerlendirmek için NOx (nitrit + nitrat)

düzeylerini ve NOS aktivasyonlarını hem meme dokularında hem de serumda saptadık.

Tümöral dokularda peritümöral sağlam dokulara kıyasla ve hasta serumlarında da kontrol

serumlarına kıyasla, NOx düzeylerini ve NOS aktivitelerini, anlamlı olarak yüksek bulduk

91

(p<0,05). Fakat NO düzeyleri ve NOS aktivasyonları ile yaş, menapoz, tümör çapı ve grade

arasında hem doku örneklerinde hem de serumlarda herhangi bir ilişki bulamadık ( p>0,05 ).

Coşkun ve arkadaşları meme kanserli hastalarda serum NO düzeylerini kontrol

grubundan yüksek bulmuşlardır ( 28 ). Unal ve arkadaşları ise, deneysel olarak

oluşturdukları meme kanserlerinde hem meme dokusunda hem de plazmada NO

konsantrasyonlarını yüksek bulmuşlardır ( 66 ).

Tümör hücrelerinden NOS ekspresyonu tümörün infiltre ettiği makrofajlardan ve tümör

çevresindeki damar endotelinden gerçekleşir ( 86 ). Samoszuk ve ark. RNS’lerin major

kaynağının kanser hücrelerinden ziyade inflamatuar hücreler olduğunu ve inflamatuar

hücrelerin anjiogenezin ilerlemesinden sorumlu olduğunu bildirmişlerdir ( 125 ). Meme

kanserli hastalardaki NO düzeyindeki artıştan tümör dokusundaki inflamatuar hücrelerde yer

alan iNOS’un sürekli uyarılması, ayrıca VEGF’nin özellikle eNOS olmak üzere eNOS ve

iNOS’u aktive etmesi sorumlu olabilir ( 9 ). Meme kanserli hastalarda serumlarda ve

dokularda yüksek miktarlarda tespit ettiğimiz NO düzeyleri ve NOS aktiviteleri; VEGF’nin

stimule edeceği anjiogenez için NOS aktivite artışı gerekir bulgusunu da destekler.

COX Yolu ise fizyolojik ve patolojik pek çok süreçte çok etkindir. Membran

fosfolipidlerinden Fosfolipaz AB2B ( PLAB2 B) aracılığıyla araşidonik asitin oluştuğu önemli ve hız

kısıtlayıcı basamak ile başlar. Daha sonra araşidonik asitlerden siklooksijenazlar ( COX )

aracılığıyla PGGB2B ve sonrasında izomerizasyonla PGEB2B, PGDB2B, PGIB2B ve PGFB2Balfa oluşur.

Fizyolojik fonksiyonların devamında etkili COX-1 ve patolojik süreçlerde etkili COX-2 olmak

üzere 2 çeşit COX enzimi vardır. COX-2 enzimi başta karsinojenler olmak üzere inflamatuar

ajanlar, hipoksi, büyüme faktörleri vb. pek çok stimulusla indüklenir. Prostanoidler içinde hem

miktar olarak fazla olan, hem de tümör biyolojisindeki etkilerinin çeşitliliği en fazla olan

PGEB2B‘dir. COX-2 ve PGEB2B anjiogenez, apoptoz, invazyon, konak immun yanıtı ve hücre

proliferasyonuna olan etkileriyle meme tümörlerinin gelişme ve yayılmasına önemli katkılarda

bulunurlar. Proanjiogenik faktörleri artırıp, antianjiogenik faktörleri azaltarak kombine bir etkiyle

anjiogenezi artırırlar. Antiapoptotik proteinleri artırıp, proapoptotik proteinleri azaltarak apoptoza

direnci artırırlar. MMP’ların aktivasyonlarını, MDA gibi mutajenlerin oluşmasını ve hücre

proliferasyonunu artırarak doğrudan, konak immun yanıtını zayıflatarak dolaylı olarak

tümörigeneze katkıda bulunurlar. Ayrıca aromataz aktivasyonunu artırarak östrojen sentezini ve

östrojen bağımlı meme kanseri gelişmesini artırırlar. COX-2 inhibitörleri kullanılarak yapılan

çalışmalarda anti-anjiogenik ve proapoptotik etkiler ve doku spesifik östrojen sentezinin

92

inhibisyonu sağlanarak kemoprevensiyon elde edildiğinin gözlenmesi de bu bilgileri destekler

niteliktedir( 13, 34, 64 ).

Ristimaki ve ark. 1576 vakalık bir çalışmada yükselmiş COX-2 seviyeleri ile geniş

tümör boyutu, yüksek proliferasyon hızı, aksiller lenf metastazlarının varlığı, duktal histoloji,

HER2 gen amplifikasyonu ve agresif meme kanseri gelişmesi arasında pozitif ilişki

görmüşlerdir ( 64 ). Bunun yanında Davies ve ark. 100 vakalık doku immunhistokimya

çalışmasında COX-2 ekspresyonu ile tümör boyutu, grade, aksiller lenf düğümü tutulumu ve

vasküler invazyon arasında anlamlı ilişki bulamamışlardır. Ki 67(proliferasyon belirteci), CD

31(Anjiogenetik endotelyal hücre belirteci), HER2 gen amplifikasyonu ve ER arasında

anlamlı ilişki gözlemlemişlerdir ( 33 ).

Soslow ve arkadaşlarının COX-2 ekspresyonu artışının invaziv duktal kanserlerde diğer

tip kanserlerden çok daha fazla olduğunu ve invazyona eğilimin artığını göstermeleri COX-2

artışı ve invazyon gelişimi konusundaki bulgularımızı destekler niteliktedir ( 129 ).

Brueggemeier ve ark. meme dokularında COX-2 ve aromataz ekspresyonunu

değerlendirerek yaptıkları çalışmalarda linear anlamlı ilişki bulmuşlardır ( p<0,0001 ).

Davies ve arkadaşlarının ER ve COX-2 arasında buldukları pozitif anlamlı ilişki de östrojen

bağımlı mekanizmalarla meme kanseri gelişmesi ve COX Yolu arasındaki kuvvetli ilişkileri

göstermektedir ( 13, 33 ).

Dai ve ark. serviks kanserli dokularda COX-2, PGEB2 B ve VEGF düzeylerini

değerlendirdikleri bir çalışmada her 3 parametrenin de tümöral alanlarda peritümöral

alanlardan anlamlı olarak daha fazla olduğunu, grade ve evreye göre sonuçlarda anlamlı

değişim olmazken, tümör boyutu 4 cm’nin üzerinde olan hastalarda 4 cm’nin altındaki

tümörlere nazaran anlamlı fark olduğunu gözlemlemişlerdir ( 31 ).

Biz de çalışmalarımızda meme tümörlü hastaların tümöral dokularında peritümöral

dokulara, meme tümörlü hastaların serumlarında kontrol serumlarına oranla COX-2 ve PGEB2B

düzeylerini anlamlı olarak yüksek bulduk ( p<0,05 ). COX-2 düzeylerinde yaş, grade ve

menopoz durumlarına göre anlamlı değişiklik saptamazken, invaziv duktal kanserli

hastalarda mikst tipte invaziv kanserli hastalara nazaran anlamlı fark saptadık ( p<0,005 ).

Ayrıca tümör çapı 2 cm’nin üzerinde olan hastalarda , 2 cm’nin altında tümör çapı olan

hastalara nazaran anlamlı fark tespit ettik ( p<0,005 ). PGEB2 B düzeylerinde ise 50 yaş öncesi

hastalarda 50 yaş sonrasına kıyasla, menapoz öncesi olanlarda menapoz sonrasına kıyasla

doku örneklerinde anlamlı olarak yüksek saptayarak COX Yolu ürünleri ve östrojen bağımlı

93

meme kanseri gelişimi arasındaki pozitif ilişkiyi destekleyecek sonuçları tespit etmiş olduk

( p<0,05 ). İnvaziv duktal kanserli hastalarda mikst tipte invaziv kanserli hastalara nazaran ve

tümör çapı 2 cm’den büyük hastalarda 2 cm’den küçük olan hastalara nazaran anlamlı

derecede fazla ( p<0,05 ) saptadığımız PGEB2 B sonuçlarına ulaştık. Grade ile PGEB2 B düzeyleri

arasında anlamlı ilişki saptayamadık ( p>0,05 ). COX-2 ve PGEB2 B sonuçlarımıza ve elimizdeki

literatür bilgilerine dayanarak meme tümörlerinde COX Yolu aktiflendikce invazyon eğilimi

ve tümör boyutu artar sonuçlarına da ulaşmış olduk.

Fosfolipaz A2 enzimleri, membran fosfolipidlerinden hidroliz ile araşidonik asit ve

lisofosfolipidleri oluşturan, COX Yolu başlangıcında yer alarak hız kısıtlayıcı basamağı

katalizleyen önemli enzim gruplarıdır. Sekretuar PLAB2 B(sPLAB2 B), kalsiyum bağımlı sitozolik

PLAB2 B(cPLAB2 B) ve kalsiyumdan bağımsız sitozolik PLAB2 B (iPLAB2 B) olmak üzere 3 grupta

değerlendirilirler. sPLAB2B 10 farklı üyeden oluşur, en geniş ve en çok çalışılan PLAB2 B grubudur.

PLAB2 B tipleri doku dağılımları açısından farklılıklar göstermekle beraber lipid sindirimi,

eikosanoidlerin salınımı, antibakteriyel defans, membran yeniden şekillenmesi gibi temel

biyolojik aktiviteleri vardır ( 7, 23, 82, 83, 94 ).

Massing ve arkadaşları, 121 meme kanserli, 31over kanserli, 37 GİS kanserli ve 172

sağlıklı bireyi kullanarak yaptıkları bir çalışmada kanserli hastalarda sPLAB2 B aktivitesinde

anlamlı bir artış olduğunu ve erken tespit edilen bir protein olduğundan tümör belirteci olarak

kullanılabileceğini belirtmişlerdir ( 24 ).

Yamashıta ve ark. 78 malin, 16 selim meme tümöründe yaptıkları bir çalışmada tüm

tümörlü dokularda anlamlı olarak fazla miktarda sPLAB2B aktivitesi saptamışlardır. Bu hastalar

da yaş, ER, PR ve tutulan lenf düğümü sayısıyla sPLAB2 B aktivitesi arasında anlamlı ilişki

saptamamışlar fakat tümör boyutu, grade, histolojik tip, uzak metastaz varlığı ve damar

tutulumu ile sPLAB2 B aktivitesi arasında anlamlı ilişki saptamışlardır ( 151 ). Prostat, kolon,

over kanserlerinde yapılan çalışmalarda da benzer sonuçlar alınarak çeşitli araştırıcılar

tarafından invazyon sürecine katkılarıyla kanser gelişim ve yayılımındaki önemi

vurgulanmıştır ( 24, 100, 108, 131 ).

Biz de yaptığımız çalışmalarda PLAB2 B aktivitesini meme tümörlü hastaların tümöral

dokularında peritümöral dokulara kıyasla, hasta serumlarında kontrol serumlarına kıyasla

anlamlı olarak fazla saptadık ( p<0,05 ). sPLAB2 B aktivitelerinin yaş, grade, menopozal durum,

tümör çapı, tümör tipine bağlı olarak kendi kontrol gruplarına nazaran anlamlı değişimler

gösterdiğini tespit ettik ( p<0,05 ).

94

NO Yolu ve araşidonik asit yolu arasında süperoksit ve peroksinitrit aracılığıyla oluşan

etkileşime bağlı bir ilişki olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Peroksinitrit sPLA B2 B’yi

aktive ederek araşidonik asit salınımına neden olur. NO üretimi artışı olduğu zaman

araşidonik asit salınımının da artması, NOS inhibitörleri kullanılan çalışmalarda araşidonik

asitin de azalması da NOS ve PLAB2 B arasında amplifikasyon olduğunu göstermektedir ( 106 ).

Bizim sonuçlarımızda da NOS ve PLAB2 B aktivasyonlarının aynı gruplarda benzer

yükseklikleri, bu bilgileri destekleyici tarzdadır.

NO Yolu ve COX Yolu arasındaki etkileşimler pek çok araştırıcı gibi bizimde

dikkatimizi çekti. Bing ve ark. meme ve kolon kanserlerinde COX-2 ve NOS

ekspresyonlarındaki anlamlı artışları değerlendirmişler ve sonuçta bu 2 enzim arasında ilişki

olduğunu belirtmişlerdir ( 9 ). Salvemini ve ark. da NO üretimi ve COX aktivasyonu arasında

sinerjistik etki olduğunu, benzer şekilde Davidge ve ark. da endotelyal hücrelerden NO’in

üretiminin COX sentezi aktivasyonunun artması ile eikosanoid üretimini artırdığını öne

sürmüşlerdir ( 124 ). COX enziminin aktif merkezinde içerdiği hem demirinin NO için

potansiyel hedef olması, enzimdeki hemin, NO seviyesini yada ekspresyonunu regüle

edebilmesi bizim de çalışmamız da tespit etmiş olduğumuz NO ve COX yollarının sinerjstik

aktivasyonlarını sağlar.

Yağ asitlerinin kanser hücrelerinin sitotoksitesi, büyümesi ve metastazlarıyla ilgili

etkilerini sağlayan diğer bir araşidonik asit yolu da Lipoksijenaz yoludur. Bu yolda 5, 8, 12

ve 15 lipoksijenazlar kullanılarak lipid hidroperoksidler oluşur ve bu etkiler metabolitler

aracılığıyla gerçekleşir. İnflamasyondaki etkileri daha çok araştırılmış olmakla beraber

kanser konusundaki çalışmalar henüz çok kısıtlıdır. Kanser hücrelerinin büyümesi migrasyon,

proliferasyon ve metastatik potansiyellerinin artışına yönelik etkileri olduğu görülmüştür

( 37, 144 ).

Jiang ve ark. meme dokularında COX-2 ve lipoksijenaz düzeylerini beraber

değerlendirdikleri 120 vakalık bir çalışmada tümöral dokularda peritümöral dokulara kıyasla

anlamlı olarak fazla miktarda her 2 enzimin de ekspresyonunu saptamışlardır. Tümör boyutu,

grade ve tümör histolojisi ile aralarında anlamlı ilişki görememişlerken lenf tutulumu ile LO

seviyeleri arasında anlamlı ilişki saptamışlardır ( 71 ).

Bizde çalışmamızda meme tümörlü dokularda peritümöral dokulara kıyasla, hasta

serumlarında kontrol serumlarına oranla, anlamlı olarak fazla miktarda lipoksijenaz aktivitesi

saptadık. Fakat yaş, menapoz, grade, tümör çapı ve tümör tipi ile ilgili olarak kendi

kontrolleriyle anlamlı fark göremedik. Lipoksijenaz alt tiplerine yönelik daha hassas

95

yöntemlerle yapılacak yeni çalışmalarla bu tür klinikopatolojik değişkenlerle anlamlı ilişkiler

saptanacağına inanmaktayız.

Kanserin gelişme ve yayılımında çok önemli görevleri olan NO Yolu ve Araşidonik

Asit Yolu’ndaki parametrelerin birlikte, aynı anda değerlendirildiği bir çalışma literatürde

bulunmamaktadır. Bütün bu parametrelerin değerlendirildiği çalışmamızda, literatüre katkıda

bulunacak sonuçları elde ettik ve bu konuda gelecekte yapılacak araştırmalara ışık tutacağına

inanmaktayız.

96

6.ÖZET

Meme kanserlerinin gelişme ve yayılmasında NO Yolu ve COX Yolu doğrudan yada

dolaylı yollardan etkili olurlar. Her iki yol karşılıklı etkileşim ve sinerjizma içindedir. NO

Yolu’nda L-argininden NOS aracılığıyla nitrik oksit oluşur. COX Yolu’nda ise araşidonik

asitten prostanoidler oluşur. Nitrik oksit damar geçirgenliğini artırarak, neovaskülarizasyon ve

vazodilatasyon yaparak tümör kan akımını artırır ve tümör büyümesinde etkili olur.COX

Yolu’nda oluşan ürünler de tıpkı NO gibi anjiogenez sürecini etkileyerek tümörigeneze

katkıda bulunurlar. Her iki yol ortak etkilerde bulunurken karşılıklı sinerjizma gösterirler.

Biz bu çalışmada NO ve COX Yolları arasındaki etkileşimi meme tümörlü hastaların

tümöral dokularında ve serumlarında çeşitli parametreleri kullanarak saptamaya çalıştık. NO

Yolu’na ait NOx (nitrit + nitrat) düzeylerini ve NOS aktivitelerini hastaların hem tümöral

dokularında hem de serumlarında kontrollerine oranla anlamlı olarak fazla saptadık

( p<0,05 ). Araşidonik asit metabolizması ile ilgili olarak ise Lipoksijenaz ve sPLAB2B

aktivitelerini, COX-2 ve PGEB2 B seviyelerini tümöral dokularda ve serumlarda değerlendirdik.

Tüm parametrelerimizi tümöral dokularda peritümöral dokulardan, hasta serumlarında kontrol

serumlarından anlamlı olarak fazla bulduk ( p<0,05 ). Lipoksijenaz aktivitesi ile prognostik

faktörlerimiz arasında anlamlı ilişki göremedik ( p>0,05 ) ama sPLAB2 B aktivitesi ile tüm

prognostik faktörlerimiz arasında anlamlı ilişki saptadık ( p<0,05 ). COX-2 düzeyi ile tümör

çapı ve tümör tipi arasında anlamlı değişimler saptarken, PGEB2 B ile yaş, tümör tipi ve tümör

çapı arasında anlamlı ilişki saptadık ( p<0,05 ).

Çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçlar NO ve COX yolları arasındaki ortak yönde

değişimleri destekler niteliktedir. Kanser tedavisinde bu 2 yolu hedef alan inhibisyon

çalışmalarıyla daha çok antianjiogenik etki ve daha etkin sonuçlar alınacağına inanmaktayız.

97

7.SUMMARY

In breast cancers, two cellular pathways have emergedas being closely associated with

angiogenesis and tumor growth: the COX pathways and the NO pathway. There is synergistic

effect between the two pathways. NO pathway results in the oxidation of guanido group of L

arginine to citrulline and NO through the activity of NO synthases. And the COX pathway

results in the formation of prostanoids from arachidonic acid. NO productıon occurs in several

steps leading to neovascularization and tumor growth in some cancers.COX also play

animportant role, in promoting angiogenesis in cancer. The connection between iNOS and

COX-2 actıvatıon is documented by a synergistic effect of NOS and of COX.

In this study we aimed to determine the synergy between these two pathways by using

different parameters in cancerous and adjoining areas of specimens from human breast cancer

obtained during surgery.

Values of nitric oxide end products (nitrit + nitrate) were statistically higher in cancer

areas as compared with adjoining areas and so were serum nitrite+nitrate levels in patients

than healthy subjects. ( p<0,05)

Activities of LO, sPLAB2 B, and the levels of COX-2, PGEB2 B were determined in tumoral

tissues mean values for these parameters statistically exceed those in adjoining areas. Also the

serumlevels were significantly higher in patients serums than in control serums ( p<0,05 ).

There wasn’t a significant relationship between LO activity and our prognostic factors.

(p>0,05).sPLAB2 B activity has been found to be related significantly with all prognostic factors,

while COX-2 levels and PGEB2 B were statistically related with some of the prognostic factors.

Our findings supports the synergistic effect of the two pathway. We believe that studies

aiming the inhibition of NO and COX pathways will open interesting options for research

and therapy of breast cancer.

98

8.KAYNAKLAR

1- Abe M, Kitsuki H, Saruwatari S, Asoh H, Sakurada T, Kuwata H, Nakatani Y, Kudo I, Furukawa T. Cancer cells isolated from malignant pleural and peritoneal effusions inhibit phospholipase A2activity in human polymorphonuclear leukocytes. Cancer Letters .1997 ; 121: 155-161

2- Adibhatla RM, Hatcher JF. Phospholipase A2, reactive oxygen species, and lipid

peroxidation in cerebral ischemia.Free Radical Biology & Medicine. 2006; 40: 376-387

3- Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function

and inhibition. Biochem J. 2001; 357( Pt 3): 593-615 4- Andrade SP, Hart IR, Piper PJ. Inhibitors of nitric oxide synthase selectively reduce

flow in tumor- associated neovasculature. Br J Pharmacol. 1992; 107(4): 1092-5 5- Arneth W, Herold B. Nitrat/ Nitrit-Bestimmung in wurstwaren nach enzymatischer

reduction. Fleischwirtschaft. 1988; 68: 761-764 6- Baek S-H, Kwon TK, Lim J-H, Lee Y-J, Chang H-W, Lee S-J, Kim J-H, Kwun K-B.

Secretory Phospholipase A2-Potentiated Inducible Nitric Oxide Synthase Expression by Macrophages Requires NF-KAPPAB Activation. The Journal of Immunology. 2000; 164: 6359-6365

7- Balboa MA, Varela-Nieto I, Lucas KK, Dennis EA. Expression and function of

phospholipase A2 in brain. FEBS Letters. 2002; 531: 12-17 8- Bezugla Y, Kolada A, Kamionka S, Bernard B, Scheibe R, Dieter P. COX-1 and

COX-2 contribute differentially to the LPS-induced release of PGE2 and TXA2 in liver macrophages. Prostaglandins & other Lipid Mediators. 2006; 79: 93-100

9- Bing RJ, Miyataka M, Rich KA, Hanson N, Wang X, Slosser HD, Shi S-R. Nitric

Oxide, Prostanoids, Cyclooxygenase, and Angiogenesis in colon and Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 2001; 7: 3385-3392

10- Bolego C, Buccelati C, Rdaelli T, Cetin I, Puglisi L, Folco G, Sala A. eNOS, COX-2

and prostacyclin production are impaired in endothelial cells from dibetics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006; 339: 188-190

11- Bredt DS, Hwang PM, Snyder SH. Localization of nitric oxide synthase indicating a

neural role for nitric oxide. Nature. 1990; 347( 6295): 768-770 12- Brennan PA, Downie IP, Langdon JD, Zaki GA. Emerging role of nitric oxide in

cancer. Br J Oral Maxillofac Surg. 1999; 37( 5 ): 370-373

99

13- Brueggemeier RW, Richards JA, Petrel TA. Aromatase and cyclooxygenases: enzymes in breast cancer. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology.2003;86: 501-507

14- Brueggemeier RW, Quinn AL, Parret ML, Joarder FS, Harris RE, Robertson FM.

Correlation of aromatase and cyclooxygenase gene expression in human breast cancer specimens. Cancer Letters. 1999 ; 140 : 27-35

15- Bulut AŞ, Erden E, Sak SD, Doruk H, Kursun N,Dincol D. Significance of inducible

nitric oxide synthase expression in benign and malignant breast epithelium: an immunohistochemical study of 151 cases. Virchows Arch.2005;447: 24-30

16- Busconi L, Michel T. J. Biol. Chem. 1993;268: 8410 17- Carmeliet P. Angiogenesisin health and disease. Nat Med. 2003; 9: 653-660 18- Chaitidis P, Schewe T, Sutherland M, Kühn H, Nigam S. 15-Lipoxygenation of

phospholipids may precede the sn-2 cleavage by phospholipasesA2 : reaction specificities of secretory and cytosolic phospholipases A2 towards native and 15-lipoxygenated arachidonoyl phospholipids. FEBS Letters. 1998; 434: 437-441

19- Chang C-I, Liao JC, Kuo Lih. Macrophage Arginase Promotes Tumor Cell Growth

and Suppress Nitric Oxide-mediated Tumor Cytotoxicity. Cancer Research. 2001; 61: 1100-1106

20- Chard T, in “An Intro to Radioimmunoassay & Related Tech. 1990, 4P

thP Ed., Elsevier,

Amsterdam 21- Cheng J, Imanishi H, Iijima H, Shimomura S, Yamamato T, Amuro Y, Kubota A,

Hada T. Expression of cyclooxygenase-2 and cytosolic phospholipase A2 in the liver tissue of patients with chronic hepatitis and liver cirrhosis. Hepatology Research. 2002; 23: 185-195

22- Cho HJ, Martin E, Xie QW, Sassa S, Nathan C. Inducible nitric oxide synthase:

identification of amino acid residues essential for dimerization and binding of tetrahydrobiopterin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92( 25 ): 11514-11518

23- Cho W. Structure, function, and regulation of Group V phospholipase A2. Biochimica et Biophysica Acta. 2000 ; 1488 : 48-58

24- Chou Y-C, Chen Y-J, Lai C-R, Wang P-H, Chan H, Yuan C-C. Cyclooxygenase-2

expression is higher in ovarian cancer tissue adjacent to endometriosis than in ovarian cancer without comorbid endometriosis. European Journal of Obstetrics &Gynecology and Reproductive Biology. 2006; 124: 101-105

25- Cirino G. Multiple Controls in Inflammation. Biochemical Pharmacology. 1998; 55:

105-111 26- Coffey MJ, Phare SM, Peters-Golden M.Interaction between nitric oxide, reactive

oxygen intermediates, and peroxynitrite in the regulation of 5-lipoxygenase metabolism.Biochimica et Biophysica Acta. 2002 ; 1584: 81-90

100

27- Contestabile A. Roles of NMDA receptor activity and nitric oxide production in brain development. Brain Res Rev. 2000;32( 2-3): 476-509

28- Coşkun U, Günel N, Sancak B, Günel U, Onuk E, Bayram O, Yılmaz E, Candan S,

Özkan S.Significance of serum vascular endothelial growth factor, insulin-like growth factor-I levels and nitric oxide activity in breast cancer patients. The Breast. 2003; 12: 104-110

29- Culotta E, Koshland DE. NO news is good news. Science. 1992;258( 5090 ):1862-5 30- Cuzzocrea S, Persıchını T, Dugo L, Colasantı M, Muscı G. Copper Induces Type II

Nitric Oxide Synthase In Vıvo. Free Radical Biology & Medicine. 2003; 34: 1253-1262

31- Dai Y, Zhang X, Peng Y, Wang Z. The expression of cyclooxygenase-2, VEGF and

PGs in CIN and cervical carcinoma. Gynecologic Oncology . 2005 ;97 : 96-103 32- Davidge ST, Baker PN, McLaughlin MK, Roberts JM. Nitric Oxide Produced by

Endothelial Cells Increases Production of Eicosanoids Through Activation of Prostaglandin H Synthase. Circ. Res. 1995; 77 : 274-283

33- Davies G, Salter J, Hills M, Martin L-A, Sacks N, Dowsett M. Correlation between

Cyclooxygenase-2 Expression and Angiogenesis in Human Breast Cancer.Clinical Cancer Research. 2003; 9: 2651-2656

34- Davies GLS. Cyclooxygenase-2 and chemoprevention of breast cancer. Journal of

Steroid Biochemistry & Molecular Biology.2003; 86: 495-499 35- Dennis EA. Phospholipases. Enzymes .1983; 16: 307-353 36- Dennis EA. Diversity of group types, regulation and function of phospholipase A2. J.

Biol. Chem. 1994; 269: 13057-13060 37- Ding X-Z, Hennig R, Adrian TE. Lipoxygenase and cyclooxygenase metabolism: new

insights in treatment and chemoprevention of pancreatic cancer. Molecular Cancer. 2003; 2: 1-32

38- Drake CJ, Little CD. VEGF and vascular fusion: implications for normal and

pathological vessels. J Histochem Cytochem. 1999; 47: 1351-1356 39- Eder AM, Sasagawa T, Mao M, Aoki J, Mills GB. Constitutive and Lysophosphatidic

Acid ( LPA)-induced LPA Production: Role of Phospholipase D and Phospholipase A2. Clinical Cancer Research. 2000; 6: 2482-2491

40- Ellies LG, Fıshman M, Hardison J, Kleeman J, Maglıone JE, Manner CK, Cardıff

RD, Macleod CL. Int. J. Cancer. 2003 ; 106 : 1-7 41- Erbaş D. Nitrik oksit: Fizyolojik önemi ve çeşitli hastalıklardaki rolü. Klinik Gelişim.

1998; 11: 376-380

101

42- Ethier D, Evans JF. Characterization of Monoclonal Antibodies Against Human Leukocyte 5-Lipoxygenase. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 1992; 45 :259-265

43- Filizola M, Perez JJ, Palomer A, Mauleon D. Comparative molecular modeling study

of the three-dimensional structures of prostaglandin endoperoxide H2synthase 1 and 2 ( COX-1 and COX-2 ). Journal of Molecular Graphics and Modelling. 1997 ; 15: 290-300

44- Fosslien E. Molecular Pathology of Cyclooxygenase-2 in induced Angiogenesis.

Annals of Clinical &Laboratory Science. 2001; 31: 325-348 45- Freitas I, Griffini P, Bertone R, Fenoglio C, Miliery R, Vairetti M. In situ detection of

reactive oxygen species and nitric oxide production in normal and pathological tissues:improvement by differential interference contrast. Experimental Gerontology.2002 ; 37 : 591-602

46- Fujimoto Y, Uno E, Sakuma S. Effects of reactive oxygen and nitrogen species on

cyclooxygenase-1 and -2 activities. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 2004; 71 : 335-340

47- Fukumura D, Yuan F, Endo M, Jain RK. Role of nitric oxide in tumor

microcirculation. Blood flow, vascular permeability, and leukocyte- endothelial interactions. Am J Pathol. 1997; 150( 2 ): 713-725

48- Furchgott RF, Vanhoutte PM. Endothelium-derived relaxing and contracting factors.

FASEB J. 1989; 3( 9)( Abst ):2007-2018 49- Furchgott RF, Zawadzki jv. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation

of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 1980; 288( 5789)( Abst ): 373-376

50- Gaffney BJ. Lipoxygenases: Structural principles and spectroskopy. Annu. Rev.

Biophys. Biomol. Struct. 1996; 25: 431-459 51- Gasparini G. Prognostic value of vascular endothelial growth factor in breast cancer.

Oncologist. 2000; 5: 37-44 52- Gatti G, Simsek S, Zurrida S, Kurne A, Gianetti I, Demirer S, Smeets A, Caldarella

P, Vento AR, Giraldo A, Luini A. Possible role of nitric oxide in the biology of breast carcinoma: review of the available literature. The Breast.2004; 13: 1-6

53- Gibanananda R, Sanjay B, Nootan KS, Suryanarayan D, Vinoid R, Seetharaman A,

Syed AH. Lipid peroxidation, free radical production and antioxidant status in breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 2000; 59:163-170

54- Gönenç A, Erten D, Aslan S, Akıncı M, Şimşek B, Torun M. Lipid peroxidation and

antioxidant status in blood and tissue of malignant breast tumor and benign breast disease. Cell Biology International. 2006; 30: 376-380

102

55- Granger DL, Taintor RR, Boockvar KS, Hibss JB Jr. Measurement of nitrate and nitrite in biological samples using nitrate reductase and Griess reaction. Methods Enzymol. 1996; 268: 142-151

56- Guevera I, Iwanejko J, Dembinska-Kiec A, Pankiewicz J, Wanat A, Anna P, Golabek

I, Bartus S, Malczewska-Malec M, Szczudlik A. Dtermination of nitrite/ nitrate in human biological material by the simple Griess reaction. Clinica Chimica Acta. 1998; 274: 177-188

57- Günel N, Coşkun U, Sancak B, Günel U, Hasdemir O, Bozkurt Ş. Clinical Importance

of Serum Interleukin-18 and Nitric Oxide Activities in Breast Carcinoma Patients. Cancer.2002; 95( 3): 663-667

58- Hajri A, Metzger E, Vallat F, Coffy S, Flatter E, Evrard S, Marescaux J, Aprahamian

M. Role of nitric oxide in pancreatic tumour growth: in vivo and in vitro studies. Br J Cancer. 1998;78:841-849

59- Haklar G, Sayin-Özveri E, Yüksel M, Aktan AÖ, Yalçin AS. Different kinds of

reactive oxygen and nitrogen species were detected in colon and breast tumors. Cancer Letters. 2001 ; 165: 219-224

60- Halliwell B, Gutteridge JM. Free Radicals in Biology and Medicine. Third edition.

Oxford University Pres, New York. 1999; 27-34, 73-122 61- Hanafy KA, Krumenacker JS, Murad F. NO, nitrotyrosine, and cyclic GMP in signal

transduction. Med Sci Monit. 2001; 7( 4): 801-819 62- Helliwell RJA, Adams LF, Mitchell MD. Prostaglandin synthases: recent

developments and a novel hypothesis. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 2004; 70 : 101-113

63- Hla Timothy, Bishop-Bailey D, Liu CH, Schaefers HJ, Trifan OC. Cyclooxygenase-1

and -2 isoenzymes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology . 1999 ;31 : 551-557

64- Howe LR, Dannenberg AJ. COX-2 Inhibitors fort he Prevention of Breast Cancer.

Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 2003 ; 8 : 31-40 65- Hughes MN. Relationships between nitric oxide, nitroxyl ion, nitrosonium cation and

peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1999; 1411( 2-3 ): 263-272 66- Hwang S, Scollard D, Byrne J, Levine E. Expression of cyclooxygenase-1 and

cyclooxygenase-2 in human breast cancer. J. Natl. Cancer Inst.1998;90: 455-460 67- Ikawa H, Kamitani H, Calvo BF, Foley JF, Eling TE. Expression of 15-

Lipoxygenase-1 in Human Colorectal Cancer. Cancer Research. 1999; 59: 360-366 68- Janero DR. Nitric oxide ( NO )-related pharmaceuticals: contemporary approaches to

therapeutic NO modulation. Free Radic Biol Med. 2000; 15 ( 28 ): 1495-1506

103

69- Jansson OT, Morcos E, Brundin L, Bergerheim US, Adolfsson J, Wiklund NP. Nitric oxide synthase activitity in human renal cell carcinoma. J Urol. 1998; 160(2): 556-60

70- Jenkins DC, Charles IG, Thomsen LL, Moss DW, Holmes LS, Baylis SA, Rhodes P,

Westmore K, Emson PC, Moncada S. Roles of nitric oxide in tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92( 10 ): 4392-4396

71- Jiang WG, Douglas-Jones A, Mansel RE. Levels of expression of lipoxygenases and

cyclooxygenase-2 in human breast cancer. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 2003; 69( 4 ) :275-281

72- Jiang Z-Y, Woollard ACS, Wolff SP. Lipid Hydroperoxide Measurement by

Oxidation of Fe in the Presence of Xylenol Orange. Comparison with the TBA Assay and an Iodometric Method. LIPIDS. 1991; 26( 10 ): 853-856

73- Jorgensen K, Davidsen J, Mouritsen OG. Biophysical mechanisms of phospholipase

A2 activation and their use in liposome-based drug delivery. FEBS Letters. 2002; 531: 23-27

74- Kalluri R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour

angiogenesis. Nat Rev Cancer. 2003; 3: 422-433 75- Kiechle FL, Malinski T. Nitric oxide. Biochemistry, pathophysiology, and detection.

Am J Clin Pathol. 1993; 100( 5): 567-575 76- Kim PKM, Zamora R, Petrosko P, Billiar TR. The regulatory role of nitric oxide in

apoptosis. International Immunopharmacology. 2001 ; 1: 1421-1441 77- Kobzik L, Reid MB, Bredt DS, Stamler JS.Nitric oxide in skeletal muscle. Nature.

1994 ; 372: 8 78- Koh E, Noh SH, Lee HY, Han JW, Lee HW, Hong S. Differential expression of nitric

oxide synthase in human stomach canxer. Cancer Lett. 1999; 146( 2): 173-180 79- Kökoğlu E, Tüter Y, Sandıkçı KS, Yazıcı Z, Ulakoğlu EZ, Sönmez H, Özyurt E.

Prostaglandin E2 levels in human brain tumor tissues and arachidonic acid levels in the plasma membrane of human brain tumors. Cancer Letters .1998; 132: 17-21

80- Kroncke KD, Fehsel K, Kolb-Bachofen V. Inducible nitric oxide synthase and its

product nitric oxide, a small molecule with complex biological activities. Biol Chem Hoppe Seyler. 1995; 376( 6): 327-343

81- Kumaraguruparan R, Subapriya R, Viswanathan P, Nagini S. Tissue lipid peroxidation

and antioxidant status in patients with adenocarcinoma of the breast. Clinica Chimica Acta. 2002 ; 325 :165-170

82- Lambeau G, Lazdunski M. Receptors for growing family of secreted phospholipases

A2. TİPS. 1999; 20: 162-170

104

83- Laye JP, Gill JH. Phospholipase A2 expression in tumours: a target for therapeutic intervention. DDT. 2003; 8: 710-715

84- Loibl S, Buck A, Strank C, Minckwitz GV, Roller M, Sinn H-P, Schini-Kerth V,

Solbach C, Strebhardt K, Kaufmann M. The role of early expression of inducible nitric oxide synthase in human breast cancer. European Journal of Cancer. 2005 ; 41: 265-271

85- Loibl S, Strank C, Minckwitz GV, Sinn HP, Buck A, Solbach C, Strebhardt K,

Kaufmann M. Immunohistochemical evaluation of endothelial nitric oxide synthase expression in primary breast cancer. The Breast. 2005; 14 : 230-235

86- Loibi S, Minckwitz GV, Weber S, Sinn H-P, Schini-Kerth VB, Lobysheva I, Nepveu

F, Wolf G, Strebhardt K, Kaufmann M. Expression of Endothelial and Inducible Nitric Oxide Synthase in Benign and Malignant Lesions of the Breast and Measurement of Nitric Oxide Using Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. American Cancer Society. 2002; 95( 6): 1191-1198

87- Longo LD. Approach to the patient with cancer In: Brounwald, Faucci, Kasper,

Hauser, Longo, Jameson( eds), Harrison’s Principles of Internal Medicine. Ed 15; 491-497. McGraw-Hill Companies, USA 2001

88- Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with phenol

reagent. J Biol Chem. 1951; 193: 265-275 89- Ma X, Yang Q, Wilson KT, Kundu N, Meltzer SJ, Fulton AM. Promoter methylation

regulates cyclooxygenase expression in breast cancer. Breast Cancer Research. 2004; 6: 316-321

90- MacMicking J, Xie QW, Nathan C. Nitric oxide and macrophage function. Annu Rev

Immunol. 1997; 15( Abst): 323-350 91- Mansour EG, Radvin PM, Dressler L. Prognostic factors in early breast carcinoma.

Cancer. 1994; 74: 381-400 92- Margolase RG, Fisher B, Hortobaygi GN, Bloomer WD. Neoplasm of the breast. In:

Holland, Frei, Bast, Kufe, Pollock, Weichselbaum( eds ), Cancer Medicine. Ed 5, 1733-1822, B.C.Decker Inc, Canada 2000

93- Marletta MA. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J Biol Chem. 1993;

268( 17): 12231-12234 94- Masuda S, Murakami M, Ishikawa Y, Ishii T, Kudo I. Diverse cellular localizations

of secretory phospholipase A2 enzymes in several human tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 2005 ; 1736: 200-210

95- McNamara DA, Harmey JH, Walsh TN, Redmond HP, Bouchier-Hyes DJ.

Significance of angiogenesis in cancer therapy. Br J Surg. 1998; 85: 1044-1055

105

96- Moochhala S, Chhatwal VJ, Chan ST, Ngoi SS, Chia YW, Rauff A. Nitric oxide synthase activity and expression in human colorectal cancer. Carcinogenesis.1996;17: 1171-1174

97- Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Biosynthesis of nitric oxide from L-arginine. A

pathway for the regulation of cell function and communication. Biochem Pharmacol. 1989 ; 38( 11 ): 1709-15

98- Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide physiology, pathophysiology, and

pharmacology. Pharmacol Rev. 1991; 43( 2): 109-142 99- Moncada S, Higgs A. The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med. 1993;

329( 27 ): 2002-2012 100- Morioka Y, Ikeda M, Saiga A, Fujii N, Ishimoto Y, Arita H, Hanasaki K. Potential

role of group X secretory phospholipase A2 in cyclooxygenase-2-dependent PGE2 formation during colon tumorigenesis. FEBS Letters. 2000; 487: 262-266

101- Murakami M, Kudo I. Recent advances in molecular biology and phsiology of the

prostaglandin E2-biosynthetic pathway. Progress in Lipid Research. 2004 ; 43: 3-35 102- Myer RE, Shan S, DeAngelo J, Dodge RK, Bonaventura J, Ong ET, Dewhirst MW.

Nitric oxide synthase inhibition irreversibly decreases perfusion in the R3230 Ac rat mammary adenocarcinoma. Br J Cancer.1995; 71(6)( Abst): 1169-74

103- Nabemoto M, Ohsawa K, Nakamura H, Hirabayashi T, Saito T, Okuma Y, Nomura

Y, Murayama T. Reversible activation of secretory phospholipase A2 by sulfhydryl reagents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 2005 ; 436: 145-153

104- Natarajan R, Esworthy R, Bai W, Gu J-L, Wilezynski S, Nadler J. Increased 12-

Lipoxygenase Expression in Breast Cancer Tissues and Cells.Regulation by Epidermal Growth Factor. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 1997 ; 82: 1790-1798

105- Nie D, Hann KV. Cyclooxygenase, lipoxygenase and tumor angiogenesis. Cell

Mol Life Sci. 2002; 59( 5): 799-807 106- Offer S, Eliraz A, Fink G, Stark AH, Madar Z. Interactions between Nitric Oxide and

Arachidonic Acid in Lung Epithelial Cells: Possible Roles for Peroxynitrite and Superoxide. Pharmacology. 2005; 73: 155-161

107- Ortiz de Montellano PR, Nishida C, Rodriquez-Crespo I, Gerber N. Nitric oxide

synthase structure and electron transfer. Drug Metab Dispos. 1998; 26( 12): 1185-1189

108- Österström A, Dimberg J, Fransen K, Söderkvist P. Expression of cytosolic and group

X secretory phospholipase A2 genes in human colorectal adenocarcinomas. Cancer Letters. 2002; 182: 175-182

106

109- Özuysal S. Tümöral Anjiogenesis. Türk Patoloji Derneği. 2001; 17: 90-93 110- Page DL. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favorable prognostic

types. Am J Surg Pathol. 1991;15: 334-349 111- Park D-W, Kim J-R, Kim S-Y, Sonn J-K, Bang O-S, Kang S-S, Kim J-H, Baek S-H.

Akt as a Mediator of Secretory Phospholipase A2 Receptor-Involved Inducible Nitric Oxide Synthase Expression. The Journal of Immunology. 2003; 170: 2093-2099

112- Park JY, Pillinger MH, Abramson SB. Prostaglandin E2 synthesis and secretion: The

role of PGE2 synthases. Clinical Immunology. 2006; 119: 229-240 113- Patrignani P, Tacconelli S, Sciulli MG, Capone ML. New insights into COX-2

biology and inhibition. Brain Reserch Reviews. 2004 ; 20 : 1-6 114- Poweel WS, Rokach J. Biochemistry, biology and chemistry of the 5-lipoxygenase

product 5-oxo-ETE. Progress in Lipid Research. 2005 ; 44: 154-183 115- Prasad NS, Raghavendra R, Lokesh BR, Naidu A. Spice phenolics inhibit human

PMNL 5-lipoxygenase. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 2004; 70( 6 ) :521-528

116- Rahman MA, Toi M. Anti-angiogenic therapy in breast cancer. Biomedicine&

Pharmacotherapy. 2003; 57 : 463-470 117- Redrejo-Rodriquez M, Tejeda- Cano A, Pinto M del C, Macias P. Lipxygenase

inhibition by flavonoids: semiempirical study of the structure-activity relation. Journal of Molecular Structure. 2004; 674( 1-3): 121-124

118- Richards JA, Petrel TA, Brueggemeier RW. Signaling pathways regulating aromatase

and cyclooxygenases in normal and malignant breast cells. Journal of Steroid Biochemistry &Molecular Biology. 2002 ; 80: 203-212

119- Robbıns KC. Basic Pathology.1994; 19: 607-642 120- Robbins RA, Grisham MB. Nitric oxide. Int J Biochem Cell Biol. 1997; 29: 857-860 121- Rosen PP, Groshen S, Kine DW, Norton L. Factors influencing prognosis in node-

negative breast carcinoma: analysis of 767 T1N0M0/T2N0M0 patients with long-term follow-up. J Clin Oncol. 1993; 11: 2090-2100

122-Rubbo H, O’Donnell V. Nitric oxide,peroxynitrite and lipoxygenase in

atherogenesis:mechanistic insights. Toxicology. 2005; 208 :305-317 123- Sak SD. Meme Kanserlerinin histopatolojik özellikleri. Klinik Gelişim. 1999; 12:

708-712 124- Salvemını D, Mısko TP, Masferrer JL, Seıbert K, Currıe MG, Needleman P. Nitric

oxide activates cyclooxygenase enzymes. Proc. Natl.Acad. Sci. 1993 ; 90 : 7240-7244

107

125- Samoszuk M, Brennan M-L, To V, Leonor L, Zheng L, Fu X, Hazen SL. Association

between nitrotyrosine levels and microvascular density in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 2002; 74: 271-278

126- Sanganahalli BG, Joshi PG, Joshi NB. Xanthine oxidase, nitric oxide synthase and

phospholipase A2 produce reactive oxygen species via mitochondria. Brain Research. 2005 ; 1037 : 200-203

127- Schneider C, Brash AR. Lipoxygenase –catalyzed formation of R-confıguration

hydroperoxides. Prostaglandins & other Lipid Mediators . 2002 ; 68-69 : 291-301 128- Singh B, Lucci A. Role of Cyclooxygenase-2 in Breast Cancer. Journal of Surgical

Research. 2002 ; 108 : 173-179 129- Soslow RA, Dannenberg D, Rush D, Woerner BM, Khan KN, Masferrer J. COX-2 is

expressed in human pulmonary, colonic and mammary tumors.Cancer. 2000; 89: 2637-2645

130- Stuehr DJ. Mammalian nitric oxide synthases. Biochim Biophys Acta. 1999; 1411

( 2-3 ): 217-230 131- Sved P, Scott KF, Mcleod D, King NJC, Singh J, Tsatralis T, Nikolov B, Boulas J,

Nallan L, Gelb MH, Sajinovic M, Graham GG, Russell PJ, Dong Q. Oncogenic Action of Secreted Phospholipase A2 in Prostate Cancer. Cancer Research.2004; 64: 6934-6940

132- Szabo C. Multiple pathways of peroxynitrite cytotoxicity. Toxicol Lett. 2003 ; 140-

141: 105-112 133- Tamir S, Burney S, Tannenbaum SR. DNA Damage by Nitric Oxide. Chem. Res.

Toxicol. 1996;9: 821-827 134- Tang TC-M, Poon RT-P, Fan ST. The significance of cyclooxygenase-2 expression in

human hepatocellular carcinoma. Biomedicine & Pharmacotherapy.2005; 59: 311-316 135- Tapiero H, Ba GN, Couvreur P, Tew KD. Polyunsaturated fatty acids ( PUFA ) and

eicasanoids in human health and pathologies. Biomed Pharmacother. 2002; 56: 215-222

136- Thomsen LL, Lawton FG, Knowles RG, Beesley JE, Riveros-Moreno V, Moncada S.

Nitric Oxide Synthase Activity in Human Gynecological Cancer. Cancer Research. 1994; 54: 1352-1354

137- Thomsen LL, Miles DW. Role of nitric oxide in tumour progression: Lessons from

human tumours. Cancer and Metastasis Reviews. 1998 ; 17 : 107-118 138- Tijssen P, in “Practice and Theory of Enz.Immunoassays”, ( 1985), Elsevier,

Amsterdam

108

139- Timoshenko AV, Xu G, Chakrabarti S, Lala PK, Chakraborty C. Role of prostaglandin E2 receptors in migration of murine and human breast cancer cells. Experimental Cell Research. 2003 ;289 : 265-274

140- Tonini T, Rossi F, Claudio PP. Molecular basis of angiogenesis and cancer.

Oncogene. 2003; 22: 6549-6556 141- Vakkala M, Kahlos K, Lakari E, Paakkö P, Kinnula V,Soini Y. Inducible Nitric Oxide

Synthase Expression, Apoptosis, and Angiogenesis in in situ and Invasive Breast Carcinomas. Clinical Cancer Research. 2000; 6: 2408-2416

142- Vanegas H, Schaible H-G. Prostaglandins and cyclooxygenases in the spinal cord.

Progress in Neurobiology. 2001 ; 64 : 327-363 143- Vernooy-Gerrıtsen M, Bos ALM, Veldınk GA, Vlıegenthart JFG. Affınıty

chromatography of antıbodıes dırected against soybean lıpoxygenase-1 and -2 and an enzyme-lınked ımmunosorbent assay ( ELISA ) for antibodies and lıpoxygenases. Biochimica et Biophysica Acta. 1983; 748: 148-152

144- Waslidge NB, Hayes DJ. A Colorimetric Method fort he Determination of

Lipoxygenase Activity Suitable for Use in a High Throughput Assay Format. Analytıcal Bıochemıstry. 1995; 231: 354-358

145-Winer EP, Morrow M, Osborne CK, Haris JR. Malignant Tumors of the Breast In: De

Vita VT, Hellman S, Rosenberg ( eds ), Cancer Principles and Practice of Oncology. Ed 6, 1651-1717. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia 2001

146-Wu J, Xia HHX, Tu SP, Fan DM, Kung HF, Lam SK, Wong BCY. 15-LO-1 mediates

cyclooxygenase-2 inhibitor induced apoptosis in gastric cancer. Carcinogenesis. 2003; 24( 2 ): 243-247

147-Wu T. Cyclooxygenase-2 in hepatocellular carcinoma. Cancer Treatment Revıews.

2006; 32: 28-44 148-Wu T. Cyclooxygenase-2 and prostaglandin signaling in cholangiocarcinoma.

Biochimica et Biophysica Acta. 2005 ; 1755: 135-150 149- Wülfing P, Diallo R, Müller C, Wülfing C, Poremba C, Heinecke A, Rody A, Greb

RR, Böcker W, Kiesel L. Analysis of cyclooxygenase-2 expression in human breast cancer :high throughput tissue microarray analysis. J Cancer Res. Clin Oncol. 2003; 129: 375-382

150-Yamamoto S. Mammalian lipoxygenases: Molecular structures and functions.

Biochim. Biophys. Acta. 1992; 1128: 117-131 151- Yamashita S-İ, Yamashita J-İ, Sakamoto K, Inada K, Nakashima Y, Murata K,

Saishoji T, Nomura K, Ogawa M. Increased Expression of Membrane-Associated Phospholipase A2 Shows Malignant Potential of Human Breast Cancer Cells. Cancer . 1993; 71: 3058-64

109

152- Yuan B, Ohyama K, Bessho T, Toyoda H. Contribution of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 to apoptosis induction in smooth chorion trophoblast cells of human fetal membrane tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006; 341: 822-827

110

9.ÖZGEÇMİŞ Doğum Tarihi ve Yeri : 10 / 09 / 1975 – İslahiye / Gaziantep Medeni Durum : Evli, 1 çocuk annesi Orta Öğrenim : 1986 -1989 İslahiye Ortaokulu Lise : 1989 – 1992 İslahiye İbni Sina Lisesi Yüksek Öğrenim : 1993 – 1999 İ.Ü Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Uzmanlık Eğitimi : 13.11. 2002 İ.Ü C.T.F Biyokimya A.D’da Başlangıç Yabancı Dil : İngilizce Üyesi Olduğu Dernekler : Türk Klinik Biyokimya Derneği

Katıldığı Kongreler : 1-) I. Ulusal Moleküler Tıp Kongresi Hilton – İSTANBUL, 16-19 Nisan 2005

2-) 31st FEBS Congress 24- 29 June 2006 İstanbul, Turkey

Katıldığı Sempozyumlar : 1-) II. Ulusal HPLC ve diğer Seperasyon Teknikleri Sempozyumu, 7 Ekim 2004

Katıldığı Kurslar : 1-) Laboratuar Organizasyonu Yönetimi ve Kalite Kursu İ.Ü İstanbul Tıp Fakültesi 1933 Reform Anfisi İSTANBUL, 3- 4 Nisan 2004 2-) HPLC Temel Bilgileri Kursu Gülhane Askeri Tıp Akademisi – ANKARA – 7 Ekim 2004

111

Yayın : -Mammaglobin ve Meme Kanseri. Ö. Çiftçi, E. Kökoğlu. Endokrinolojide Yönelişler. 2006; 15: 3 -Comparison of platelet fibronectin, ADP-induced platelet aggregation and serum total nitric oxide (NOx) levels in angiographically determined coronary heart disease. H. Ekmekçi, İ. İşler, H. Sönmez, Ç. Gürel, Ö. Çiftçi, T. Ulutin, E. Kökoğlu, N. Domaniç.Thrombosis Research. 2006; 117: 249-254 Kongreler : - Koroner Arter Hastalarında Tıkalı Damar Sayısı Yönünden Nitrik Oksit Son Ürünleri Ve

Lipid Peroksidasyonunun İrdelenmesi. İ. İşler Bütün, Ö. Çiftçi, H. Ekmekçi, H. Sönmez,

N. Domaniç, A. Kahveci, E. Kökoğlu. IV. Ulusal Klinik Biyokimya Kongresi. Program ve

Özet Kitabı, 2004.

- Platelet Fibronectin, Sialic acid and Aggregation Levels in Coronary Heart Disease. İ.

İşler Bütün, Ö. Çiftçi, H. Ekmekçi, H. Sönmez, Ç. Gürel, T. Ulutin, E. Kökoğlu, N.

Domaniç. I. Ulusal Moleküler Tıp Kongresi. Konuşma Metinleri ve Poster Özetleri, 2005.

- Evaluation Of Nitric Oxide, Platelet Fibronectin And Platelet Aggregation Levels In

Coronary Heart Disease. İ. İşler, N.Domaniç, H. Ekmekçi, H. Sönmez, Ö. Çiftçi, Ç.

Gürel, T. Ulutin, E. Kökoğlu, V. A. Vural. 75th EAS Congress. Abstract Book, 2005.

- Nitric oxide levels in patients with breast cancer. Ö. Çiftçi, İ. Bütün, H. Sönmez, V.

Çelik, E. Kökoğlu. 31st FEBS Congress. Abstract Book, 2006

- Effects of melatonin on lipid parameters of diet-induced hypercholesterolemic rats. İ.

Bütün, H. Sönmez, M. Caner, Ö. Çiftçi, T. Altuğ, E. Kökoğlu. 31st FEBS Congress. Abstract Book, 2006